CN102834527A - 用纳米孔的分析物测序 - Google Patents

Abstract

本文提供属于使用纳米孔测序分析物单元的方法和系统。一般而言，阻拦构建体用于修饰分析物使得修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。该中止期间，获得对应于分析物单元的离子电流水平。在改变修饰的分析物使得修饰的分析物通过开口前进之后，另一阻拦构建体再次中止分析物，允许获得代表第2分析物单元的第2离子电流水平。此过程可重复直到对各分析物单元测序。也公开实施该方法的系统。

Description

用纳米孔的分析物测序

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2010年2月23日提交的美国临时申请系列No.61/307,441，和2010年8月20日提交的美国临时申请系列No.61/375,707的权利，各通过引用以其整体并入本文。

【有关序列表的声明】

与本申请关联的序列表以文本形式代替纸拷贝提供及通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称是36172_SEQ_Final_2011-02-23.txt。文本文件是12KB；创建于2011年2月23日；及经EFS-Web随着说明书的提交而提交。

【政府许可证权利的声明】

本发明在由美国健康学会颁发的资金号5R21HG004145和R01H6005115的政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。

【背景技术】

DNA中编码的信息对医学及生命科学具有至上重要性。人基因组的标位革命化遗传病症理解和疾病的预测，及会辅助发展治疗。快速和不昂贵地测序DNA的能力是个别化的医学及科学研究所必要的。需要超过原Sanger测序的新测序技术的开发来达到这些目标。甚至更优选的是可应用于除了核酸之外的聚合物的新测序技术。

【发明概述】

因此，一些实施方式提供对2个或更多用至少第1阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。

也提供的是对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括：（a）提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=1～1,000,000，且其中各X和各n可相同或不同；将第1插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；（c）提供在包含第1导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；（d）使第1插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1Xn；（e）改变第1插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；（f）使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开口后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；及（g）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。

也提供的是将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第1已知的分析物单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）用含有全部单元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。

还提供的是减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开口转位的速度的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔；（b）使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；及（c）改变至少修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开口平均转位速度。

系统也在本文提供，诸如包含具有开口的纳米孔的系统，其中纳米孔定位在第1导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少一个液体介质包含定义为修饰的核酸的修饰的分析物。

【附图说明】

本发明的上述方面和许多伴随优势会变得更容易被同意，如通过参考以下详述结合附图变得更佳明白。

图1描绘MspA的晶体结构。使用空间填充模型的通过M1-NNN-MspA的结构的交叉-截面图显示氨基酸类：红是带正电的；蓝是带负电的；紫是极性的；黄是疏水-脂肪族；橙是疏水-芳族。见Science 303:1189（2004）。

图2A，2B，2C和2D描绘通过纳米孔MspA的DNA转位。卡通描绘通过MspA的DNA转位和得到的残余电流。图2A：正电压吸引带负电的发卡DNA进入孔隙。图2B：DNA穿过孔隙直到更宽发卡双链体防止进一步转位。图2C：几个ms之后，发卡解离允许完全转位。图2D：得到的与以上卡通关联的电流迹显示，存在于孔隙的发卡DNA允许残余电流，I_res，直到发卡双链体解离。

图3A和3B提供平均的残余离子电流，<I_res>的例直方图，其显示14bp发卡（hp）的不同″同聚物″单链尾。在（a）180mV及（b）140mV取数据。包括在图3A的转位具有相比1ms更长的持续时间及揭示可区分的和良好-解析的电流水平。许多实验的拟合的高斯平均值的平均提供于下例。有用各发卡DNA的至少4个实验重复。在140mV宽度减小是由于作为解离时间平均增加的时间是相比在180mV的解离时间的几乎30×更长。附加信息可见于表A。

图4A，4B，4C和4D提供由于在另外聚-dA发卡尾中单核苷酸取代的残余电流直方图。图4A：为比较目的，图4A总结在180mV同聚物发卡尾I_res的平均的高斯平均值和宽度（在下例中描述拟合值）。黑色，蓝色，红色和绿色的颜色用于辅助分离分别由于dA，dG，dC和dT对I_res的效应。残余电流随着在另外聚-dA同聚物发卡（hp）尾内单核苷酸dN_x的位置，x而显著变化。图4B：当核苷酸取代与双链末端相邻，x=1，残余电流偏离以模拟与取代的核苷酸关联的同聚物值。dT₁取代最接近地模拟I_dT。图4C：在x=2，核苷酸取代也导致残余电流更接近与取代的核苷酸关联的同聚物。dC₂取代最接近I_dC。图4D：随着在x=3的任何取代，I_res仅稍微不同于I_dA，提示MspA在发卡双链体之后主要敏感于2nt。在x=1，2，或3的dG_x取代不显著影响电流，如给定I_dG和I_dA的相对接近可预期的。

图5A，5B和5C描绘使用MspA的双链体间断的（DI）纳米孔测序的展示。将模拟分析物DNA的合成的DNA转化为具有携带信息的核苷酸之间的双链体。各这些双链必需依次熔解，或解离，如拉DNA通过孔隙，致使残余电流测定序列。采用选择以代表不同分析物序列的DNA：3′-ATGC-5’［SEQ ID NO:1］（图5A）；3′-TACG-5’［SEQID NO:2］（图5B）和″盲″序列测定为3′-GTCAC-5’［SEQ ID NO:3］（图5C）。残余电流的例迹显示在各图5A，5B和5C的左侧。残余电流中的各步骤是由14bp DNA双链体把持的MspA的收缩之内的3个核苷酸的代表。对于各这些步骤，对于N转位，各水平的直方图在各图5A，5B和5C的右侧显示。这些结果从3个或更多实验在140mV产生。在更高电压，转位数增加（见图10～12中的表），但由于减少的时间平均而水平特异性减小（见表A和B和图10～12中的表）。

图6A，6B，6C和6D是对于在同聚物发卡尾中，在远离发卡双链体的位置x的核苷酸dN插入，表示为dNx的平均残余电流，<Ires>的代表性的直方图。垂直虚线指示指示的同聚物残余电流的高斯平均值。由N给各直方图的计数。注意同聚物背景对核苷酸取代的效应的效应。

图7A，7B和7C呈现来自对于分析物DNA，3′ATGC5′［SEQ IDNO:1］（左栏）3’TACG 5’［SEQ ID NO:2］（中栏）及盲DNA测定为3’GTCAC 5’［SEQ ID NO:3］（右栏），在140mV的施加的电压的DI-测序例的数据。各组图含：（a）含有4（或5）个水平的一例电流迹，（b）对于自具有4（或5）个水平的多个事件的各水平的各平均电流的直方图，及（c）指示对于直方图中的多个事件的电流水平之间的转变的密度标绘图。未阻断的孔隙电流是237.0±1.0pA（平均值±标准误差）。用各DI-DNA进行3或更大个体实验。

图8A，8B和8C代表以类似于图7A，7B和7C的形式，但对于160mV的施加的电压的数据。未阻断的孔隙电流是294.7±0.8pA（平均值±标准误差）。

图9A，9B和9C代表以类似于图8A，8B和8C的形式，但对于180mV的施加的电压的数据。未阻断的孔隙电流是325.1±1.8pA（平均值±标准误差）。在更高电压，区别电流迹中的独特水平变得更难，因为电流水平的减少的时间-平均。

图10～12在以上图5A，5B和5C的图标及以下实施例中所述。

【发明详述】

本文提供用于测序分析物单元的方法和系统。一般而言，测序可如下发生。在天然状态，分析物单元能通过纳米孔的开口转位。分析物通过孔隙的转位可对于溶解分析物单元的组合物太快。阻拦构建体用于修饰分析物，使得修饰的分析物不再能通过开口拟合。各阻拦构建体允许修饰的分析物在开口中止，使得可检测离子电流水平及与特定单元关联。然后可改变阻拦构建体，以提供现在能通过开口前进的修饰的分析物。修饰的分析物包含至少第2阻拦构建体，其导致开口中修饰的分析物的第2次中止，使得可检测相关于下一单元的下一离子电流水平。第2阻拦构建体的改变允许修饰的分析物再次通过开口前进。修饰的分析物中有多少阻拦构建体就可重复几次过程，使得对各分析物单元测序。

因此，一些实施方式提供对2个或更多用至少第1阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1单元，其可为修饰的分析物中的第1单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。本文中的此或任何其他方法可根据需要通过使用修饰的分析物中第3，第4，第5，等，阻拦构建体来重复修饰的分析物中的序列第3，第4，第5，等，单元。

在一些实施方式中，修饰的分析物包含修饰的核酸，修饰的肽或修饰的蛋白。在一些实施方式中，修饰的分析物包含修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的核酸包含修饰的DNA，修饰的RNA，修饰的PNA或其组合。在一些实施方式中，修饰的分析物包含使分析物与阻拦构建体接合的接头。修饰的分析物可还被定义为包含使核酸与阻拦构建体接合的接头的修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的分析物包含具有1MDa或更小分子量的无机部分。在其他实施方式中，修饰的分析物包含具有1MDa或更小分子量的有机部分。

任选地，至少一个阻拦构建体是插入物阻拦构建体。在一些实施方式中，插入物阻拦构建体是双链核酸。在其他实施方式中，至少一个阻拦构建体是悬吊物阻拦构建体。各阻拦构建体可相同或不同。在一些实施方式中，2个或更多阻拦构建体不同。在一些实施方式中，修饰的分析物包含转位起始尾。任选地，修饰的分析物是用至少2个各还被定义为双链DNA的插入物阻拦构建体修饰的ssDNA，其中各双链体可相同或不同，且其中各单元是单核苷酸（例如,C）或重复核苷酸（例如,CCC）。

本文公开的方法可用于鉴定分析物中的重复单元，诸如重复核苷酸。在一些实施方式中，一个阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性和另一阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何单元-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。在一些实施方式中，分隔物水平区别分析物的连续单元。在一些实施方式中，分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。在一些实施方式中，周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平提供校验位。

当对一个或更多修饰的分析物测序多次时，测序保真度可改善，以产生允许平均及共有读数的多个电流图案。

电场的施加可导致修饰的分析物进入开口或另外导致修饰的分析物移动，诸如修饰的分析物在改变之后通过纳米孔的开口移动。在一些实施方式中，物理压力导致修饰的分析物进入开口或另外导致修饰的分析物移动。在一些实施方式中，磁珠附接于反式侧上的修饰的分析物，及改变由导致修饰的分析物进入或通过开口行进的磁力所导致，或另外导致修饰的分析物移动。例如，磁珠不通过孔隙拟合，但一旦转位起始尾使其通过孔隙，则其可使用。

在一些实施方式中，改变由电压脉冲，电压渐变，光脉冲，或机械力脉冲所导致。改变可还被定义为阻拦构建体的解离。改变可还被定义为阻拦构建体的构象变化。

一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第1或第2导电液体介质的pH来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第1或第2导电液体介质的离子强度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第1或第2导电液体介质的离子类型来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第1或第2导电液体介质的温度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第1或第2导电液体介质的粘度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过采用双链-结合剂来改变测序灵敏度。

一些实施方式还包含获得修饰的分析物。

纳米孔可包含固态材料，诸如氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合。在一些实施方式中，纳米孔是在插入双层，膜，薄膜，或固态孔后形成隧道的蛋白。在一些实施方式中，纳米孔包含在脂质双层中。在一些实施方式中，纳米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。纳米孔可为具有定义隧道的前庭和收缩区域的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白（Msp）孔蛋白。Msp孔蛋白可为突变MspA孔蛋白。在一些实施方式中，突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。一些实施方式可包含通过移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少一个氨基酸来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。纳米孔可为α-溶血素或其变体。一些实施方式可包含通过移出，添加或取代α-溶血素或其变体的至少一个氨基酸来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

也提供的是对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括：（a）提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=1～1,000,000，且其中各X和各n可相同或不同；将第1插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；（c）提供在包含第1导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；（d）使第1插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1Xn；（e）改变第1插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；（f）使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开口后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；及（g）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。在一些实施方式中，一个插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以允许离子电流水平测定核苷酸的同一性，和另一插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以产生不同于任何核苷酸-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。在一些实施方式中，分隔物水平区别核酸的连续核苷酸。在一些实施方式中，分隔物水平区别核酸的连续及重复的核苷酸。在一些实施方式中，周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平提供校验位。

还提供的是将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第1已知的分析物单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）用含有全部单元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。可重复此或任何其他方法，以通过使用第3，第4，第5，等，阻拦构建体来对修饰的分析物的第3，第4，第5，等，已知的单元进行测序。在一些实施方式中，各阻拦构建体相同，及在一些实施方式中，各阻拦构建体不同。

还提供的是减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开口转位的速度的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔；（b）使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；及（c）改变至少修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开口平均转位速度。

也在本文提供系统，诸如包含具有开口的纳米孔的系统，其中纳米孔定位在第1导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少一个液体介质包含修饰的分析物，诸如修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的核酸还被定义为修饰的DNA，且修饰的DNA的各阻拦构建体是含有相同的数的核苷酸的双链DNA，且各双链DNA相同。在一些实施方式中，系统运作以使修饰的核酸的阻拦复合物在进入开口后解离。系统可运作以对修饰的核酸进行测序。包含在系统中的纳米孔可包含在双层，膜，薄膜，或固态孔中。在一些实施方式中，纳米孔还被定义为耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白（Msp）孔蛋白或α-溶血素或其变体。系统可还包含膜片钳放大器，光学膜片钳，数据获取装置，或一个或更多与第1液体介质，第2液体介质，或其任何组合交通的温度调控装置。关于光学膜片钳，电流可翻译为荧光，其可读取及以类似样式作为电流关联。

可制备系统以允许在多个纳米孔，诸如数千或数百万个纳米孔中并行读数。因此，任何系统的组分可功能性地重复，以倍增测序通量。任何系统也可与微流体学或自动化适应。

在一些实施方式中，用于分析物单元的离子电流水平，虽然必需彼此不同，不必需先验已知。由于电流水平可每个实验不同，可首先运行校准构建体。例如为DNA测序，会运行构建体修饰的分析物，其含有全部4种核苷酸和任选地非标准（修饰的）核苷酸，诸如甲基化的C（mC）。使用本文公开的方法，各修饰的分析物单元产生独特及鉴定的电流水平（例如,各离子电流水平的幅度或特征对于各分析物单元类型是独特的）。维持各该电流水平，直到修饰的分析物前进一个单元。分析物的序列是直接标位进离子电流记录。

在一些实施方式中，双链核酸可暴露于第1酶，其在一条核酸链的每nth核苷酸的位置选择性地切口，以暴露另一链的每nth核苷酸，以影响离子电流。得到的核酸可被认为是具有多个双链体的修饰的核酸，其中各双链体被认为是阻拦构建体。可导致双链体，以在进入纳米孔的开口后中止，以产生离子电流水平，其中各离子电流水平代表暴露的核苷酸。双链体可然后被解离以提供改变的核酸，其然后可通过开口前进，直到下一双链体中止移动，以允许待检测的另一离子电流水平与下一单元相关。各离子电流水平可然后与已知的核苷酸的已知的离子电流水平比较，而已知的双链终止，由此测序每nth核苷酸。与第1双链核酸具有同一性的第2双链核酸可然后暴露于第2（或相同的）酶，其选择性地在每nth核苷酸的位置切口，以暴露每nth核苷酸，但具有不同起始位置（nth+i,其中i是恒定偏移）。可对第2核酸执行如上相同的过程。此过程可根据需要用至少n切口的核酸（及可能n/2切口的核酸，由于也可鉴定终止的碱基对）重复，使得各核苷酸测序。

″分析物″指称具有2个或更多单元的序列的分子，其中各单元可相同或不同。分析物单元的尺寸是可通过纳米孔的开口转位，使得单元进入开口的一侧及移动通过及移动出另一侧。一般而言，分析物在与纳米孔接触的至少一个导电液体介质中是可溶性的或部分可溶性的。非限制性例包括核酸，肽和蛋白，以及各种烃聚合物（例如,聚乙烯,聚苯乙烯）及官能化的烃聚合物，其中聚合物主链包含碳链（例如,聚氯乙烯,聚甲基丙烯酸酯）。单元可为单一部分（例如,单核苷酸,T）或其可为是重复子或改变的多部分（例如,TTT三核苷酸或TGC三核苷酸）。在一些实施方式中，分析物是具有1～1,000,000个核苷酸长的单元的核酸。分析物也包括聚合物，诸如共聚物，嵌段共聚物及分支的聚合物诸如星状聚体和树状聚体。分析物可包含纳米粒子。可在本文实施方式中采用分析物的混合物。分析物可由阻拦构建体修饰，以产生以下描述的″修饰的分析物”。修饰的分析物可改变，如下文所述。

″阻拦构建体″是用来修饰分析物，使得修饰的分析物不再通过纳米孔的开口拟合的实体。由于阻拦构建体的一种或更多性质（例如,取向,尺寸或电荷），阻拦构建体导致转位期间修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。阻拦构建体可将插入一个或更多分析物单元之间（″插入物阻拦构建体″）或可用于修饰单元本身（″悬吊物阻拦构建体″）。由此，阻拦构建体可位于待测序的单元的相邻处，或其可盖（即,掩罩）所述单元，如下所述。阻拦构建体也可取代单元，其中阻拦构建体与单元关联。阻拦构建体可为单分子或分子组合（例如,双链DNA）。阻拦构建体可为蛋白。阻拦构建体可包含纳米粒子。如本文所用，″纳米粒子″指称具有一个或更多100nm或更小量级的尺度的粒子。另外的阻拦构建体在以下描述。

阻拦构建体也能被改变，或改变纳米孔的开口，或两者，使得转位持续前进修饰的分析物一个单元。改变可由各种手段发生。在一些实施方式中，改变通过施加刺激诸如电压（例如,电压脉冲或电压渐变），辐射（例如,光脉冲），温度变化（例如,温度脉冲）或物理运动（例如,超声波,使用磁珠以产生力脉冲）来诱导。在一些实施方式中，改变使承担阻拦构建体的部分或全部的解离，诸如双链核酸的一条链的解离。改变可使承担构象变化，诸如形状或取向的变化。构象变化可使承担手性反转。作为构象变化的一例，阻拦构建体可为施加刺激后变化形状的蛋白。改变可使承担取向变化，诸如由阻拦构建体的辐射导致的取向变化。阻拦构建体可导致纳米孔的开口形状或电荷的变化。相反，由纳米孔的开口提供的力可导致阻拦构建体的改变，诸如尺寸的变化。阻拦构建体也可涉及这些方面的任何组合（例如,阻拦构建体可变化形状，如其也变化开口形状;由纳米孔的开口提供的力可导致阻拦构建体的形状和取向的变化）。

插入物阻拦构建体位于与单元相邻处，及由可自彼此解离或另外改变的配对的部分组成。插入物阻拦构建体导致修饰的分析物在开口中中止，由此允许待检测的离子电流水平与相邻单元相关。在已检测离子电流水平之后，插入物阻拦构建体的改变导致变化（例如，配对之一解离），使得修饰的分析物的残留物可向反式侧前进。下一阻拦构建体的改变允许可检测的下一离子电流水平的产生，等等。

插入物阻拦构建体可由可解离的结合对组成。结合对具有对于彼此的亲和性。是结合对的插入物阻拦构建体的非限制性例包括核酸，诸如双链核酸（例如,双链DNA），可将其插入分析物单元，诸如核苷酸单元之间，以产生修饰的分析物。双链核酸可导致修饰的分析物由于双链体的尺寸而在纳米孔的开口中中止，其后解离导致双链体的一条链解离，使得修饰的分析物的残留物可向反式侧前进。双链核酸可，在一些实施方式中，含有1～100bp。插入物阻拦构建体可为与1-100bp双链核酸约相同的长度。可采用的其他已知的结合对包括单链DNA结合蛋白，RNA，PNA和RNA，PNA和DNA的组合。在一些实施方式中，一个或更多核苷酸形成插入物阻拦构建体。例如，可将一个或更多核苷酸插入分析物单元之间，以提供修饰的分析物，及液体介质中包含的与修饰的分析物接触的游离的核苷酸可与核苷酸原位结合，然后解离。

在一些实施方式中，作为插入物阻拦构建体可采用介电弹性体，光学机械材料或温度-响应聚合物。这些类为本领域熟知。见，例如，美国专利No.7,594,359和7,625,764，各通过引用以其整体并入本文，及J Mech Physics Solids 57:1103（2009）。

除了结合对之外，也可采用由光解键接合的分子，使得辐射自另一分子光切割一个分子。该光解键为本领域熟知。非限制性例包括补骨脂素和衍生物，DNA-测序策略中使用的光切割性染料，化合物1-(4,5-二甲氧基-2-硝基-苯基)乙基酯（Photochem Photobio 81:953（2005）），及光敏氨基酸，诸如L-光-亮氨酸。

其他插入物阻拦构建体包括肽，蛋白，纳米粒子和聚电解质（例如,硫酸葡聚糖和聚(丙烯酸)）。

悬吊物阻拦构建体涵盖单元及由可如上述改变的悬吊部分组成。悬吊物阻拦构建体一般修饰连续单元。悬吊物阻拦构建体导致修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。在悬吊物阻拦构建体改变之后，之前被悬吊物阻拦构建体覆盖的单元变得暴露。因为另一悬吊物阻拦构建体位于与现在-暴露的单元相邻处，现在-暴露的单元在开口中止，使得离子电流水平可检测。下一悬吊物阻拦构建体的改变允许产生可检测的下一离子电流水平，等等。

悬吊物阻拦构建体的非限制性例包括与上述插入物阻拦构建体相同的例和类的构建体。例如，悬吊物阻拦构建体可，与分析物单元一起，形成结合对。悬吊物阻拦构建体可，与分析物单元一起，构成介电弹性体，光学机械材料或温度-响应聚合物。悬吊物阻拦构建体可由光解键与单元接合。悬吊物阻拦构建体可包含肽，蛋白，纳米粒子或聚电解质。在一些实施方式中，核苷酸是悬吊物阻拦构建体。例如，在液体介质中包含的与分析物接触的游离的核苷酸可与核苷酸单元原位结合，然后解离。

用阻拦构建体修饰的分析物提供″修饰的分析物″。修饰的分析物由于阻拦构建体的性质（例如,取向,尺寸或电荷）而不随通过纳米孔的开口转位前进，除非修饰的分析物改变。而修饰的分析物一般会包含插入物阻拦构建体或悬吊物阻拦构建体，修饰的分析物也可包含两种类型。各插入物阻拦构建体可在相同的修饰的分析物之内相同或不同。各悬吊物阻拦构建体可在相同的修饰的分析物之内相同或不同。

修饰的分析物可以各种方式获得，包括获得分析物及要求商业实体制备修饰的分析物。DNA修饰方案起初开发以希望对自由地转位的扩展进许多相同的类型的核苷酸以产生足够长电流标记的DNA测序。此修饰一般使用DNA限制和连接酶的循环应用来实现。Meller等人假定了用由2个12聚体寡聚体组成的转变为特定二进制码的各核苷酸使用该DNA修饰方案的光学-纳米孔测序策略（″New HighThroughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics,″ed K.Mitchelson(Elsevier,Oxford,UK),pp 245264;Clin Chem 53:1996(2007);Nano Lett.10:2237(2010)）。自动化的，大规模-并行过程（见美国专利No.6,723,513和WO 2006/092582,各通过引用以其整体并入本文）需要~24h用于将完全人基因组转变为由片段，各对应于原基因组的24bp段组成的DNA混合物（Nat Biotechnol 26:1146（2008））。例如，LingVitae Corp.（Oslo,挪威）可制备具有是选择的双链核酸的插入物阻拦构建体的修饰的核酸。DI测序需要的DNA转变是欠需求的，因为各插入的DNA可相同和独立于分析物核苷酸。相比之前建议的涉及转变的DNA的测序方法，DI测序不需要另外的硬件诸如荧光检测或转变为二进制码。工作目前在进行中以开发用减少的转变时间的原基因组的长段的廉价，低-误差转变（Nano Lett 10:2237(2010)）。相比依赖于连接反应的通过连接技术的测序，通过大量并行化可达到转变成本和速度进一步减小。

接头可将阻拦构建体接合于分析物以提供修饰的分析物。一般而言，接头是无特定活性的二价分子，而非将阻拦构建体接合于分析物或保存该物种之间的一些最小距离或其他空间关系。但是，可选择接头，以影响连接的物种的一些性质，诸如3-维构象，净电荷，或疏水性。适合的接头为本领域所知，及包括在阻拦构建体和分析物之间形成键的接头，所述键选自：共价键（例如,二硫化物或碳-碳键），氢键（例如,Watson-Crick或Hoogstein碱基配对），离子键或其他静电诱导的键。

″纳米孔″指称具有其最窄点具有约0.3nm～约2nm的直径的开口的孔隙。例如，纳米孔可为固态纳米孔，石墨烯纳米孔，弹性体纳米孔，或可为在插入双层，薄膜，膜（例如,本文公开的膜），或固态孔后形成隧道的天然存在的或重组蛋白，也在本文称之为蛋白孔或蛋白纳米孔（例如,跨膜孔隙）。如果蛋白插入膜，则蛋白是隧通-形成蛋白。测定是否蛋白是隧通-形成蛋白的方法为本领域熟知。例如，可通过测定是否蛋白插入双层来测定是否Msp孔蛋白形成隧道，诸如描述于美国临时申请系列No.61/098,938和其相关的PCT申请，WO2010/034018，各通过引用以其整体并入本文，及Proc Natl Acad Sci105:20647（2008）。一般而言，隧通形成通过观察导电性的离散变化来检测。见，例如，Mol Microbiol 33:933（1999）。开口是一般处于与膜或纳米孔的顺式和反式侧液体或气体交通。纳米孔可包含固态材料，诸如氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合（例如,纳米孔可通过制造第1SiN孔来制备,将石墨烯片材放到其上,然后在石墨烯中制造纳米孔）。蛋白纳米孔的非限制性例包括α-溶血素和其变体（以下定义的），耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白（Msp）孔蛋白（以下定义的）或OmpATb。

″改变允许修饰的分析物向反式侧前进″—此短语指称修饰的分析物的阻拦构建体的改变允许修饰的分析物向反式侧前进的作用，使得（a）修饰的分析物的整个残留物可通过开口转位，如果无进一步阻拦构建体中止转位，或（b）另一阻拦构建体迎对开口及导致被改变，由此允许另一修饰的分析物单元产生离子电流水平。

由于修饰的分析物与纳米孔的开口相互作用，通过开口的电流变化。当阻拦的构建体暂时防止修饰的分析物单元免于通过开口转位，离子电流水平产生。即，离子电流水平关联于，或代表，分析物单元。对于具有双链DNA阻拦构建体的DNA分析物，用M1-NNN-MspA分析的，本文所述的简单分析揭示了被2pA分离的平均电流水平及延续大于1.5ms可鉴定分析物单元DNA序列。本领域技术人员能建立其他分析物单元的离子电流水平。离子电流水平一般是平均离子电流。在一些实施方式中，通过孔隙的离子电流幅度可转化为荧光光学系统，如本领域熟知。见，例如，J Amer Chem Soc 13:1652（2009）。

当一个阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性，和另一阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何单元-特异性离子电流水平的离子电流水平时，后来的离子电流水平定义为分隔物水平。分隔物水平可区别分析物的连续单元。分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。可设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平用于提供构成基本上校验位。

转位起始尾是可随附于修饰的分析物以起始通过纳米孔的开口转位的任何线性荷电的聚合物。由此，尾直径必需相比开口更小。尾可位于修饰的分析物的任一端或两端。尾的非限制性例包括多核苷酸诸如单链DNA。其他尾包括杂多聚体，同多聚体，碱性和/或碱性残基的核酸（例如,DNA或RNA）。在一些实施方式中，尾是聚腺嘌呤，诸如聚-dAm，其中m在1-100的范围［SEQ ID NO:53］。尾可包含聚(丙烯酸)。其他聚(酸)可包括酸基-COOH，-SO₃H或-PO₃H₂。尾也可包括荷电的聚-L赖氨酸或其他荷电的氨基酸。

双链体结合剂用于增强双链核酸的形成。该试剂增加产生成功的双链体的频度，其，当双链体用作阻拦构建体时，可改善测序灵敏度。非限制例包括二价阳离子诸如Mg²⁺，主要和少数DNA凹槽结合蛋白和化学品，链间DNA交联剂，及DNA嵌入剂。

″液体介质″包括水性，有机-水性和仅有机液体介质。有机介质包括，例如，甲醇，乙醇，二甲基亚砜和其混合物。在本文所述的方法中可采用的液体为本领域熟知。该介质，包括导电液体介质的描述和例提供于美国专利No.7,189,503，例如，通过引用以其整体并入本文。可将盐，去污剂或缓冲剂加入该介质。可采用该剂来改变液体介质的pH或离子强度。粘度-改变物质，诸如甘油或其各种聚合物（例如,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙二醇,聚乙烯基醇,纤维素聚合物）和混合物，可包括在液体介质中。测量粘度的方法为本领域熟知。可加入液体介质的任何剂也可变化待研究的修饰的分析物的速度。如此，速度-改变剂可为盐，去污剂，缓冲剂，粘度-改变物质，或添加到液体介质的增加或降低分析物或修饰的分析物的速度的任何其他剂。

任何实施方式中采用的第1和第2液体介质可相同或不同，及任意者或两者可包含一种或更多盐，去污剂，或缓冲剂。的确，本文所述的任何液体介质可包含一种或更多盐，去污剂，或缓冲剂。任选地，至少一个液体介质是导电的。任选地，至少一个液体介质不是导电的。液体介质可包含本文所述的任何分析物。

如本文所用，″氨基酸″指称见于蛋白的20种天然存在的氨基酸的任何，天然存在的氨基酸的D-立体异构体（例如,D-苏氨酸），非天然的氨基酸，及化学修饰的氨基酸。氨基酸的各这些类型不是相互排他的。α-氨基酸包含氨基，羧基，氢原子，及称之为″侧链″的特征性的基团所键合的碳原子。天然存在的氨基酸的侧链为本领域熟知及包括，例如，氢（例如,如在甘氨酸），烷基（例如,如在丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸），取代的烷基（例如,如在苏氨酸,丝氨酸,甲硫氨酸,半胱氨酸,天冬氨酸,天冬酰胺,谷氨酸,谷氨酰胺,精氨酸和赖氨酸），芳基烷基（例如,如在苯丙氨酸和色氨酸），取代的芳基烷基（例如,如在酪氨酸），及杂芳基烷基（例如,如在组氨酸）。

以下缩写用于20种天然存在的氨基酸：丙氨酸（Ala;A），天冬酰胺（Asn;N），天冬氨酸（Asp;D），精氨酸（Arg;R），半胱氨酸（Cys;C），谷氨酸（Glu;E），谷氨酰胺（Gln;Q），甘氨酸（Gly;G），组氨酸（His;H），异亮氨酸（Ile;I），亮氨酸（Leu;L），赖氨酸（Lys;K），甲硫氨酸（Met;M），苯丙氨酸（Phe;F），脯氨酸（Pro;P），丝氨酸（Ser;S），苏氨酸（Thr;T），色氨酸（Trp;W），酪氨酸（Tyr;Y），及缬氨酸（Val;V）。

非天然的氨基酸（即，不天然地见于蛋白的那些）也为本领域熟知，如见于，例如，Mol Cell Biol 9:2574（1989）；J Amer Chem Soc112:4011-4030（1990）；J Amer Chem Soc 56:1280-1283（1991）；JAmer Chem Soc 113:9276-9286（1991）；及该文引用的全部参考文献。β-及γ-氨基酸为本领域所知及也涵盖在本文为非天然的氨基酸。以下表显示在本文涵盖的非天然的氨基酸的非限制性例。

表1．例示非天然的氨基酸

缩写	氨基酸	缩写	氨基酸
				Aad	2-氨基己二酸	EtAsn	N-乙基天冬酰胺
Baad	3-氨基己二酸	Hyl	羟基赖氨酸
				Bala	β-丙氨酸，β-氨基-丙酸	AHyl	别-羟基赖氨酸
Abu	2-氨基丁酸	3Hyp	3-羟脯氨酸
				4Abu	4-氨基丁酸，哌啶酸	4Hyp	4-羟脯氨酸
Acp	6-氨基己酸	Ide	异锁链素
				Ahe	2-氨基庚酸	AIle	别-异亮氨酸
Aib	2-氨基异丁酸	MeGly	N-甲基甘氨酸，肌氨酸
				Baib	3-氨基异丁酸	MeIle	N-甲基异亮氨酸
Apm	2-氨基庚二酸	MeLys	6N-甲基赖氨酸
				Dbu	2,4-二氨基丁酸	MeVal	N-甲基缬氨酸
Des	锁链素	Nva	正缬氨酸
				Dpm	2,2′-二氨基庚二酸	Nle	正亮氨酸
Dpr	2,3-二氨基丙酸	Orn	鸟氨酸
				EtGly	N-乙基甘氨酸

如本文所用，″化学修饰的氨基酸″指称侧链已化学修饰的氨基酸。例如，可将侧链修饰为包含信号传导部分，诸如荧光团或放射性标记。可将侧链修饰为包含新官能团，诸如氢硫基，羧酸，或氨基。翻译后修饰的氨基酸也包括在化学修饰的氨基酸的定义中。

氨基酸，及，更特别，它们的侧链，可特征在于它们的化学特征。例如，氨基酸侧链可为带正电的，带负电的，或中性。溶液的pH影响特定侧链的荷电的性质，如本领域技术人员知道。可为带正电的侧链的非限制性例包括组氨酸，精氨酸和赖氨酸。可为带负电的侧链的非限制性例包括天冬氨酸和谷氨酸。可特征在于中性的侧链的非限制性例包括甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸和色氨酸。

侧链的立体化学也可用于表征氨基酸。原子直径的表可辅助测定是否一种侧链相比另一种更大。计算机模型也可辅助此确定。

氨基酸可特征在于它们的侧链的极性。极性侧链，其一般相比非-极性侧链更亲水，包括，例如，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺的那些。非-极性侧链，其一般相比极性侧链更疏水，包括，例如，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸和色氨酸的那些。可使用本领域中已知的涉及侧链的原子电负性确定和3-维结构评定的常规技术测定侧链的极性。也可使用本领域中已知的常规技术比较侧链的疏水性/亲水性，诸如比较各氨基酸的辛醇/水分配系数。见Sangster,In:″Octanol WaterPartition Coefficients:Fundamentals and Physical Chemistry,″WileySeries in Solution Chemistry,Chichester:John Wiley & Sons Ltd.,2:178(1997)。

如本文所用，″肽″指称由酰胺键（即,″肽键″）接合在一起的2个或更多氨基酸。肽包含达或包括50个氨基酸。肽可为线性或环状。肽可为α，β，γ，δ或更高，或混合的。肽可包含本文定义的氨基酸的任何混合物，诸如包含D，L，α，β，γ，δ或更高氨基酸的任何组合。

如本文所用，″蛋白″指称具有51个或更多氨基酸的氨基酸序列。

术语″核酸″指称单-或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，及除非另外限制的，包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然的核苷酸的已知的类似物，诸如肽核酸（PNA）和硫代磷酸酯DNA。除非另外指示的，特定核酸序列包括其互补序列。核苷酸包括，但不限于，ATP，dATP，CTP，dCTP，GTP，dGTP，UTP，TTP，dUTP，5-甲基-CTP，5-甲基-dCTP，ITP，dITP，2-氨基-腺苷-TP，2-氨基-脱氧腺苷-TP，2-三磷酸硫代胸苷，吡咯并-三磷酸嘧啶，及2-硫代胞苷，以及以上全部的α硫代三磷酸酯，及全部以上碱基的2’-O-甲基-核糖核苷酸三磷酸酯。修饰的碱基包括，但不限于，5-Br-UTP，5-Br-dUTP，5-F-UTP，5-F-dUTP，5-丙炔基dC TP，及5-丙炔基-dUTP。

″分子发动机″为本领域熟知且指称与分析物，诸如聚合物（例如,多核苷酸）物理学相互作用及能相对固定的位置，诸如纳米孔的开口（例如,Msp孔蛋白的隧道）物理学移动分析物的分子（例如,酶）。尽管不旨在被理论束缚，分子发动机利用化学能量以产生机械力。在一些实施方式中，分子发动机可以连续方式与聚合物的各单元（或”聚体”）相互作用。分子发动机的非限制性例包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，解螺旋酶，核糖体和外切核酸酶。也知道非-酶促发动机，诸如包装DNA的病毒发动机。见Nature 413:748（2001）。各种分子发动机和该发动机的期望性质描述于美国专利No.7,238,485，通过引用以其整体并入本文。分子发动机可布置在膜的顺式侧或反式侧和可任选地固定，诸如描述于′485专利。可使用将分子发动机合并入纳米孔的方法，例如，进行描述于’485专利的方法。关于包含本文也所述的纳米孔的膜可采用描述于’485专利的系统和设备。分子发动机也讨论于，例如，J Amer Chem Soc 130:818（2008）；Nature Nanotech 2:718（2007）；及ACS Nano 3:1457（2009）。分子发动机如描述于WO2010/034018，通过引用以其整体并入本文，也可采用在本文所述的纳米孔和膜的情景中。

可采用的珠包括磁珠。例如，可使用链霉亲和素-包被的磁珠来施加与拉修饰的分析物通过纳米孔的开口的静电力相反的力。例如，磁珠附接于生物素化的DNA，及使用强磁场梯度施加与静电驱动力可比较的力（～10pN）。见Biophys J 82:3314（2002）。以此方式，阻断-电流读数会未受影响，但对DNA的力可独立地控制。几十或几百的各DNA的完全，独立读数可然后关联及组装以重构精确的DNA序列。在一些实施方式中，磁珠不拟合通过孔隙，但一旦转位起始尾使得其通过孔隙，则其可使用。

如本文所用，″顺式″指称分析物或修饰的分析物通过其进入开口或分析物或修饰的分析物穿过其面移动的纳米孔开口侧。

如本文所用，″反式″指称分析物或修饰的分析物（或其片段）通过其出开口或分析物或修饰的分析物不穿过其面移动的纳米孔开口侧。

如本文所用，″转位″和语法变体是指进入纳米孔的开口的一侧及移动到及移动出开口的另一侧。特别涵盖包含转位的本文的任何实施方式可指称电泳转位或非-电泳转位，除非特别提及。电场可移动分析物或修饰的分析物。说到“相互作用”，其是指分析物或修饰的分析物移动入及，任选地，通过开口，其中″通过开口″（或″转位″）是指进入开口的一侧及移动到及移动出开口的另一侧。任选地，涵盖不采用电泳转位的方法。在一些实施方式中，物理压力导致修饰的分析物与开口相互作用，通过开口进入或转位（在改变后）。在一些实施方式中，磁珠附接于分析物或反式侧上的修饰的分析物，及磁力导致修饰的分析物与开口相互作用，通过开口进入或转位（在改变后）。

″耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白(Msp)″或″Msp孔蛋白″指称包含2个或更多Msp单体的多聚体复合物。Msp单体由耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）基因编码。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）具有4种鉴定的Msp基因，表示为MspA，MspB，MspC和MspD。Msp孔蛋白可，例如，包含野生型MspA单体，突变MspA单体，野生型MspA旁系同原物或同源物单体，或突变MspA旁系同原物或同源物单体。任选地，Msp孔蛋白是单-链Msp孔蛋白或是几个单-链Msp孔蛋白的多聚体。单-链Msp孔蛋白可，例如包含由2个或更多由一种或更多氨基酸接头肽连接的Msp单体（例如,8单体）形成的多聚体。部分单链Msp孔蛋白指称必需二聚化，三聚化等而形成孔蛋白的单-链多聚体复合物。全单-链Msp孔蛋白指称无需二聚化，三聚化等来形成孔蛋白的形成孔蛋白的单-链多聚体复合物。Msp孔蛋白为本领域所知，作为制造突变Msp孔蛋白的方法。国际申请WO 2010/034018，通过引用以其整体并入本文，描述许多这些孔蛋白和制造这些孔蛋白的方法。

″前庭″指称其直径通常从一端到另一端沿着中心轴减小的Msp孔蛋白的内部锥-形部分，其中前庭的最窄的部分连接于收缩区域。前庭也可被称为″杯状体″。见WO 2010/034018的图1，野生型MspA孔蛋白的前庭的一例。前庭和收缩区域一起定义Msp孔蛋白的隧道。

当指称Msp孔蛋白的前庭的直径时，需知，因为前庭是锥样形状，直径沿着中心轴路径变化，其中直径是在一端相比相对端更大。直径可在约2nm～约6nm范围。任选地，直径为约，至少约，或至多约2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9或6.0nm，或可来源于它们的任何范围。中心轴的长度可在约2nm～约6nm范围。任选地，长度为约，至少约，或至多约2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9或6.0nm，或可来源于它们的任何范围。当本文指称″直径″时，可通过测量中心-到-中心距离或原子表面-到-表面距离来测定直径。

″收缩区域″指称Msp孔蛋白的隧道的最窄的部分（关于直径），其连接于前庭。野生型MspA孔蛋白的收缩区域显示于WO2010/034018的图1（标记为″内部收缩″）。收缩区域的长度可在约0.3nm～约2nm范围。任选地，长度为约，至多约，或至少约0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2或3nm，或可来源于它们的任何范围。收缩区域的直径可在约0.3nm～约2nm范围。任选地，直径为约，至多约，或至少约0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2或3nm，或可来源于它们的任何范围。

″中性收缩区域″指称包含当浸渍到水溶液中时累积呈现无净电荷的氨基酸侧链的收缩区域。与收缩区域接触的液体介质（例如,缓冲的水溶液）的pH可影响是否收缩区域特征在于中性或非中性。

″隧道″指称被定义为前庭和收缩区域的Msp孔蛋白的中心，空部分，气体，液体，离子或分析物可通过其经过。隧道是纳米孔的开口的一例。

″突变MspA孔蛋白″是与其对应野生型MspA孔蛋白具有至少或至多70，75，80，85，90，95，98或99%或更高同一性，或可来源于它们的任何范围，但小于100%及保留隧通-形成能力的多聚体复合物。突变MspA孔蛋白可为重组蛋白。任选地，突变MspA孔蛋白是在野生型MspA孔蛋白的收缩区域或前庭具有突变的蛋白。任选地，突变可在野生型MspA孔蛋白的边缘或周质环之外发生。突变MspA孔蛋白可在本文所述的任何实施方式中采用。

认为MspA孔蛋白尤其是，任选地，作为由8个184-氨基酸MspA单体组成的八聚体的MspA孔蛋白。一个或更多突变可在野生型MspA孔蛋白的MspA单体的一个或更多氨基酸发生，以产生突变MspA孔蛋白。此外，MspA孔蛋白可具有少于或多于8个单体，其中任何一个或更多可包含突变。

野生型MspA孔蛋白包含由13个氨基酸组成且与收缩区域直接相邻的周质环。见J.Biol.Chem.284:10223（2009）。野生型MspB，C和D孔蛋白也含有周质环。一个或更多突变可在野生型Msp孔蛋白的周质环中发生以产生突变Msp孔蛋白。例如，达全部13个氨基酸的缺失可在野生型MspA孔蛋白的周质环中发生。一般而言，周质环中的缺失不影响Msp孔蛋白的隧通-形成能力。

Msp孔蛋白或Msp单体也可为化学或生物学修饰的。例如，可用化学品修饰Msp孔蛋白或Msp单体以产生二硫桥，如本领域技术人员知道。

Msp孔蛋白可包含核苷酸结合位点。如本文所用，″核苷酸结合位点″指称Msp孔蛋白中的位点，其中核苷酸与氨基酸保持接触，或处于与氨基酸接触长于可归因于扩散移动的时间，诸如大于1ps或1ns。可采用分子动力学计算来评定这些临时静止时间。

Msp孔蛋白中的一个或更多突变可在蛋白的前庭或收缩区域发生。任选地，突变Msp孔蛋白相比野生型Msp孔蛋白，在其周质环，前庭或收缩区域氨基酸序列中具有至少一个差异（例如,缺失,取代,添加）。任选的突变在本文所述。

本文的任何实施方式的Msp孔蛋白可为本文所述的任何Msp孔蛋白，诸如野生型MspA孔蛋白，突变MspA孔蛋白，野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，或突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白。Msp孔蛋白可由编码单-链Msp孔蛋白的核酸序列编码。这里的任何Msp孔蛋白可包含本文所述的任何Msp单体，诸如突变Msp单体。

营养经过分枝杆菌属（Mycobacterium）的野生型孔蛋白。野生型MspA孔蛋白，野生型MspB孔蛋白，野生型MspC孔蛋白，及野生型MspD孔蛋白是野生型隧道-形成孔蛋白的例。Msp孔蛋白可还被定义为本文所述的任何Msp孔蛋白，包括旁系同原物，同源物，突变体和单-链孔蛋白。

例示野生型MspA旁系同原物和同源物提供于表2。提供的是野生型MspA旁系同原物，其包括野生型MspB，野生型MspC和野生型MspD。本文定义的“旁系同原物”是自具有类似结构和功能的相同的细菌物种的基因。本文定义的“同源物”是自具有类似结构和进化来源的另一细菌物种的基因。作为一例，提供的是野生型MspA同源物，其包括MppA，PorM1，PorM2，PorM1和Mmcs4296。

表2．例示野生型MspA和野生型MspA旁系同原物和同源物单体

n.d.：″未测定的″

*Mol.Microbiol.40:451(2001)

＊＊Biochim.Biophys.Acta 1667:4755(2004)

仅包括在蛋白全长上具有显著氨基酸相似性的蛋白。数据由PSI-Blast算法（BLOSUM62矩阵）使用www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi上的NIH GenBank数据库获得。

″突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白″是与其对应野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白具有至少或至多70，75，80，85，90，95，98或99%或更高同一性，或可来源于它们的任何范围，但小于100%，及保留隧通-形成能力的多聚体复合物。突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白可为重组蛋白。任选地，突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白是在野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白的收缩区域或前庭中具有突变的蛋白。任选地，突变可在野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白的边缘或周质环之外发生。任何突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白可在本文所述的任何实施方式中采用，及可包含本文所述的任何突变。

Msp孔蛋白可包含2个或更多Msp单体。″Msp单体″是野生型MspA单体，突变MspA单体，野生型MspA旁系同原物或同源物单体，或突变MspA旁系同原物或同源物单体，及当与一个或更多其他Msp单体关联时保留隧通-形成能力的蛋白单体。本文所述的任何Msp孔蛋白可包含一个或更多本文所述的任何Msp单体。任何Msp孔蛋白可包含，例如，2～15Msp单体，其中各单体可相同或不同。

″突变MspA单体″指称与野生型MspA单体具有至少或至多70，75，80，85，90，95，98或99%或更高同一性，或可来源于它们的任何范围，但小于100%，及当与一个或更多其他Msp单体关联时保留隧通-形成能力的Msp单体。任选地，突变MspA单体还被定义为在贡献于完全-形成的，隧通-形成孔蛋白的前庭或收缩区域的形成的序列部分中包含突变。突变Msp单体可为重组蛋白，例如重组MspA单体可包含本文所述的任何突变。

在本文中的任何实施方式中，Msp单体可为野生型MspA旁系同原物或同源物，诸如MspA/Msmeg0965，MspB/Msmeg0520，MspC/Msmeg5483，MspD/Msmeg6057，MppA，PorM1，PorM2，PorM1，Mmcs4296，Mmcs4297，Mmcs3857，Mmcs4382，Mmcs4383，Mjls3843，Mjls3857，Mjls3931Mjls4674，Mjls4675，Mjls4677，Map3123c，Mav3943，Mvan1836，Mvan4117，Mvan4839，Mvan4840，Mvan5016，Mvan5017，Mvan5768，MUL_2391，Mflv1734，Mflv1735，Mflv2295，Mflv1891，MCH4691c，MCH4689c，MCH4690c，MAB1080，MAB1081，MAB2800，RHA1ro08561，RHA1ro04074和RHA1ro03127。

″突变MspA旁系同原物或同源物单体″指称与野生型MspA旁系同原物或同源物单体具有至少或至多70，75，80，85，90，95，98或99%或更高同一性，或可来源于它们的任何范围，但小于100%，及保留隧通-形成能力的MspA旁系同原物或同源物单体。任选地，突变MspA旁系同原物或同源物单体还被定义为在贡献于完全-形成的，隧通-形成孔蛋白的前庭和/或收缩区域的形成的序列部分包含突变。突变MspA旁系同原物或同源物单体可为重组蛋白，例如任何突变MspA旁系同原物或同源物单体可任选地在本文中的任何实施方式中采用。

Msp孔蛋白可作为2个或更多野生型MspA单体，突变MspA单体，野生型MspA旁系同原物或同源物单体，或突变MspA旁系同原物或同源物单体的组合表达。如此，Msp孔蛋白可为或包含二聚体，三聚体，四聚体，五聚体，六聚体，七聚体，八聚体，九聚体，等。例如，Msp孔蛋白可包含野生型MspA单体和野生型MspB单体的组合。Msp孔蛋白可包含1～15个单体，其中各单体相同或不同。的确，本文所述的任何Msp孔蛋白可包含至少或至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个单体，或可来源于它们的任何范围，其中各单体相同或不同。例如，Msp孔蛋白可包含相同或不同的一个或更多突变MspA单体。作为另一例，Msp孔蛋白可包含至少一个突变MspA单体和至少一个MspA旁系同原物或同源物单体。

如上定义，单-链Msp孔蛋白包含由一种或更多氨基酸接头肽连接的2个或更多Msp单体。包含2个Msp单体的单-链Msp孔蛋白，其中Msp单体由氨基酸接头序列连接，可被称为单-链Msp孔蛋白二聚体。包含8个Msp单体的单-链Msp孔蛋白，其中Msp单体由氨基酸接头序列连接，可被称为单-链Msp孔蛋白八聚体。单-链Msp孔蛋白可包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多Msp单体，或可来源于它们的任何范围，由氨基酸接头序列连接。任选地，单-链Msp孔蛋白可，例如，包含2个或更多单-链Msp孔蛋白二聚体，2个或更多单-链Msp孔蛋白三聚体，2个或更多单-链Msp孔蛋白四聚体，2个或更多单-链Msp孔蛋白五聚体，1个或更多单-链Msp孔蛋白六聚体，1个或更多单-链Msp孔蛋白七聚体，1个或更多单-链Msp孔蛋白八聚体，或其组合。例如，单-链Msp孔蛋白可包含单-链Msp孔蛋白二聚体和2个单-链Msp孔蛋白三聚体。作为另一例，单-链Msp孔蛋白可包含单-链Msp孔蛋白四聚体和2个单-链Msp孔蛋白二聚体。

野生型单-链Msp孔蛋白包含野生型Msp单体。任选地，单-链Msp孔蛋白中的一个或更多突变存在于单-链Msp孔蛋白的前庭或收缩区域。相比野生型单-链Msp，突变体单-链Msp孔蛋白，例如，在周质环，前庭或收缩区域的氨基酸序列中具有至少一个突变（例如,缺失,取代或添加）。单链的多聚体也可形成孔蛋白，其中各单链包括2，3，4，5，6，7个或更多Msp单体。

突变MspA序列的非限制性例提供于表3。任选地，突变MspA包含在氨基酸138的A到P取代，在氨基酸139的E到A取代，或其组合。任选地，突变MspA包含在氨基酸90的D到K或R取代，在氨基酸91的D到N取代，在氨基酸93的D到N取代，或其任何组合。任选地，突变MspA包含在氨基酸90的D到Q取代，在氨基酸91的D到Q取代，在氨基酸93的D到N取代，或其任何组合。任选地，突变MspA包含在氨基酸88的L到W取代，在氨基酸105的I到W取代，在氨基酸91的D到Q取代，在氨基酸93的D到N取代，或其任何组合。任选地，突变MspA包含在氨基酸105的I到W取代，在氨基酸108的N到W取代，或其组合。任选地，突变MspA包含在氨基酸118的D到R取代，在氨基酸139的E到K取代，在氨基酸134的D到R取代，或其任何组合。对于以下所列的突变MspB单体序列，参照MspB序列是本领域知道的成熟野生型MspB单体序列。任选地，突变MspB包含在氨基酸90的D到K或R取代，在氨基酸91的D到N取代，在氨基酸93的D到N取代，或其任何组合。

表3：MspA突变

MspA单体可在任何以下氨基酸位置包含一个或更多突变：88，105，108，118，134或139。MspA单体可包含一种或更多以下突变：L88W，D90K/N/Q/R，D91N/Q，D93N，I105W，N108W，D118R，D134R或E139K。MspA单体可包含以下突变：D90N/D91N/D93N。MspA单体可包含以下突变：D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K。MspA单体可包含以下突变：D90Q/D91Q/D93N。MspA单体可包含以下突变：D90Q/D91Q/D93N/D118R/D134R/E139K。MspA单体可包含以下突变：D90(K,R)/D91N/D93N。MspA单体可包含以下突变：(L88，I105)W/D91Q/D93N。MspA单体可包含以下突变：I105W/N108W。而且，MspA单体可包含本文所述的任何其他突变。

在本文中的任何实施方式中，突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物，可包含，分别相比野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域，至少一个另外的带正电的氨基酸；分别相比野生型MspA孔蛋白的前庭或收缩区域，至少一个另外的带负电的氨基酸；分别相比野生型MspA孔蛋白的前庭或收缩区域，至少一个欠带正电的氨基酸；或分别相比野生型MspA孔蛋白的前庭或收缩区域，至少一个欠带负电的氨基酸。

任选地，野生型Msp孔蛋白的前庭和收缩区域中各带正电的氨基酸用带负电的氨基酸取代，及各带负电的氨基酸相同或不同；或野生型Msp孔蛋白的前庭和收缩区域中各带负电的氨基酸用带正电的氨基酸取代，及各带正电的氨基酸相同或不同。

任选地，突变Msp孔蛋白的前庭或收缩区域，分别相比野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域，包含更大数的带正电的残基；或前庭或收缩区域，分别相比野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域，包含更大数的带负电的残基；或野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域中的至少一个带正电的氨基酸，诸如野生型MspA孔蛋白或野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白被删除或被带负电的氨基酸取代；或野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域中的至少一个带负电的氨基酸被删除或被带正电的氨基酸取代。

野生型Msp孔蛋白的前庭或收缩区域中的至少一个氨基酸，诸如野生型MspA孔蛋白或野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，可被具有立体地更大侧链的氨基酸；具有立体地更小侧链的氨基酸；具有更极性侧链的氨基酸；具有欠极性侧链的氨基酸；或具有更疏水侧链的氨基酸；具有欠疏水侧链的氨基酸取代。

在本文中的任何实施方式中，突变Msp孔蛋白的前庭或收缩区域中的至少一个氨基酸可包含非天然的氨基酸或化学修饰的氨基酸。

突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，可包含中性收缩区域。突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，可包含相比其对应野生型Msp孔蛋白的通过隧道的传导率更高，诸如2倍更高的通过隧道的传导率。突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，可包含小于其对应野生型Msp孔蛋白的通过隧道的传导率的通过隧道的传导率。

本文讨论的任何Msp孔蛋白可包含具有长度约2～约6nm和直径约2～约6nm的前庭，及具有长度约0.3～约3nm和直径约0.3～约3nm的收缩区域，其中前庭和收缩区域一起定义隧道。本文提供的也是突变MspA孔蛋白，其包含具有长度约2～约6nm和直径约2～约6nm的前庭，及具有长度约0.3～约3nm和直径约0.3～约3nm的收缩区域，其中前庭和收缩区域一起定义隧道，及还包含至少第1突变MspA旁系同原物或同源物单体。

突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物的收缩区域的直径，可小于其对应野生型Msp孔蛋白，诸如野生型MspA孔蛋白或野生型MspA旁系同原物或同源物的收缩区域的直径。突变Msp孔蛋白，诸如突变MspA孔蛋白或突变MspA旁系同原物或同源物，可在前庭或收缩区域中包含突变，其允许分析物或修饰的分析物具有小于分析物或修饰的分析物与其对应野生型Msp孔蛋白，（例如,野生型MspA孔蛋白,野生型MspA旁系同原物或同源物）的隧道相互作用的速度或平均速度的其与隧道相互作用的速度或平均速度。

本文讨论的野生型Msp单体的序列公开于GenBank，位于www.pubmed.gov，及这些序列和其他通过引用以它们的整体并入本文，如该文含有的个体亚序列或片段。例如，野生型MspA单体的核苷酸和氨基酸序列可分别见于GenBank登录No.AJ001442和CAB56052。野生型MspB单体的核苷酸和氨基酸序列可例如分别见于GenBank登录No.NC_008596.1（核苷酸600086～600730）和YP_884932.1。野生型MspC单体的核苷酸和氨基酸序列可例如分别见于GenBank登录No.AJ299735和CAC82509。野生型MspD单体的核苷酸和氨基酸序列可例如分别见于GenBank登录No.AJ300774和CAC83628。由此提供的是MspA，MspB，MspC和MspD单体的核苷酸序列，其包含与上述的核苷酸GenBank登录号的核苷酸序列具有至少约70，75，80，85，90，95，98，99%或更高，或可来源于它们的任何范围的同一性的核苷酸序列。MspA，MspB，MspC和MspD单体的氨基酸序列可见于WO 2010/034018的图18，其包含与上述的氨基酸GenBank登录号的序列具有至少约70，75，80，85，90，95，98，99%或更高，或可来源于它们的任何范围的同一性的氨基酸序列。

也提供的是MspA旁系同原物和同源物单体的氨基酸序列，其包含与野生型MspA旁系同原物或同源物单体具有至少约70，75，80，85，90，95，98，99%或更高，或可来源于它们的任何范围的同一性的氨基酸序列。野生型MspA旁系同原物和同源物单体为本领域熟知。见表2。

α-溶血素孔隙由7个相同亚基形成（七聚体）。编码α-溶血素的一个亚基的多核苷酸序列显示于美国专利申请公开No.2010/0196203的SEQ ID NO:1，通过引用以其整体并入本文。α-溶血素的一个亚基的全长氨基酸序列显示于美国专利申请公开No.2010/0196203的SEQID NO:2。SEQ ID NO:2的头26个氨基酸对应于信号肽。无信号肽的α-溶血素的一个成熟亚基的氨基酸序列显示于美国专利申请公开No.2010/0196203的SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3代替显示于SEQID NO:2的26个氨基酸信号肽而在第1位具有甲硫氨酸残基。

变体是七聚体孔隙，其中7个亚基中的1个或更多具有自SEQ IDNO:2或3变化而来的氨基酸序列及保留孔隙活性。突变α-溶血素中亚基的1，2，3，4，5，6或7个可具有自SEQ ID NO:2或3变化而来的氨基酸序列。突变孔隙之内的7个亚基一般相同但可不同。

突变体可为由生物，例如由葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌表达的天然存在的变体。变体也包括由重组技术产生的非-天然存在的变体。跨SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的全长，变体可基于氨基酸同一性至少50%同源于该序列。亚基多肽可跨整个序列基于氨基酸同一性至少80%，至少90%，至少95%，至少98%，至少99%同源于SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。

可对SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如，可进行单氨基酸取代或可进行2个或更多取代。在一些实施方式中，将在SEQ ID NO:2中的第34位和SEQ ID NO:3中的第9位的赖氨酸用半胱氨酸取代（即,K34C或K9C）。可进行的非-保守性取代的另一例是将在SEQ ID NO:2的第43位或SEQ ID NO:3的第18位的天冬酰胺残基用半胱氨酸取代（即,N43C或N17C）。在SEQ ID NO:2或3中包括这些半胱氨酸残基在关联位置提供氢硫基附接点。可在全部其他位置，及在相同的亚基上的多个位置进行类似变化。

在一些实施方式中，SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的一个或更多氨基酸残基可替代性地或另外地删除。达50%的残基可删除，由于贯穿氨基酸链长度分布的连续的区或多更小区。

变体可包括由SEQ ID NO:2或3的片段组成的亚基。该片段保留它们的插入双层的能力。片段可为至少100，诸如150，200或250，氨基酸长。该片段可用于产生嵌合孔隙。片段可包含SEQ ID NO:2或3的β-桶结构域。

变体包括包含SEQ ID NO:2或3的片段或部分的嵌合蛋白。嵌合蛋白由各包含SEQ ID NO:2或3的片段或部分的亚基形成。嵌合蛋白的β-桶部分一般由SEQ ID NO:2或3的片段或部分形成。

一个或更多氨基酸残基可替代性地或另外地插入，或在氨基酸序列SEQ ID NO:2或3的一端或另一端或两端。1个，2个或更多另外的氨基酸插入肽序列的C末端是欠可能扰乱蛋白的结构和/或功能，及这些添加可为实质性的，但达10，20，50，100或500个氨基酸或更多的肽序列可使用。在单体的N末端的添加也可为实质性的，具有添加的1个，2个或更多另外的残基，但也添加10，20，50，500或更多残基。也可将附加序列加入跨膜区内的蛋白，SEQ ID NO:3的氨基酸残基119和139之间。更精确地，附加序列可添加在SEQ ID NO:3的残基127和130之间，在移出残基128和129后。添加可在SEQ IDNO:2中的相当的位置进行。载体蛋白可融合到本发明的氨基酸序列。

其他任选的突变在本文所述。

在以下描述可关于本文提供的Msp孔蛋白，Msp单体，α-溶血素和其他蛋白进行的另外的任选的取代的描述。

在以下描述可关于本文提供的Msp孔蛋白，Msp单体，及其α-溶血素和变体，及其他蛋白进行的另外的任选的取代的描述。

本文所述的蛋白修饰包括氨基酸序列修饰。氨基酸序列的修饰可作为等位基因变异天然地出现（例如,由于遗传多态性），可由于环境影响（例如,由于暴露于紫外线辐射）而出现，或可由人干预（例如,由克隆的DNA序列的诱变）产生，诸如诱导的点，缺失，插入和取代突变体。这些修饰可导致氨基酸序列的变化，提供沉默突变，修饰限制性位点，或提供其他特定突变。氨基酸序列修饰一般落入3类中的一类或更多：取代，插入或缺失修饰。插入包括氨基和/或末端融合以及单或多氨基酸残基的内序列插入。插入通常会相比氨基或羧基末端融合的那些是更小插入，例如，以1～4个残基的量级。缺失特征在于一个或更多氨基酸残基自蛋白序列移出。一般而言，在蛋白分子之内的任何一个位点删除不多于约2～6个残基。氨基酸取代一般是单残基，但可在许多不同位置立即发生；插入通常会在约1～10个氨基酸残基的量级；及缺失会在约1～30个残基的范围。缺失或插入可在相邻配对内进行，即，2个残基的缺失或2个残基的插入。可组合取代，缺失，插入或其任何组合以到达最终构建体。突变可或可不将序列放置在阅读框外和可或可不创建可产生二级mRNA结构的互补区。取代修饰是移出至少一个残基及在其位置插入不同残基的那些。

通过已知的方法进行修饰，包括特定氨基酸取代。例如，修饰通过编码蛋白的DNA中核苷酸的定点诱变来进行，由此产生编码修饰的DNA，及然后在重组细胞培养中表达DNA。熟知在具有已知的序列的DNA中预定的位点制造取代突变的技术，例如，M13引物诱变和PCR诱变。

本文所述的肽，多肽，单体，多聚体，蛋白，等可还修饰及改变，只要期望的功能维持或增强。需知，限定本文公开的基因和蛋白的任何已知的修饰和衍生物或可出现的那些的一种方式是通过就特定已知的序列的同一性限定修饰和衍生物。特别公开的是与野生型MspA和野生型MspA旁系同原物或同源物（例如,野生型MspB,野生型MspC,野生型MspD,MppA,PorM1,Mmcs4296）和突变体以及α-溶血素和其变体具有至少70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，本文提供的99%同一性的多肽。

本领域技术人员容易明白如何测定2个多肽的同一性。例如，同一性可在2个序列对齐之后计算，从而同一性在其最高水平。例如，为测定2个氨基酸序列或2个核酸的”百分率同一性”，为最佳比较目的将序列对齐（例如,为与第2氨基或核酸序列最佳比对，可将间隔导入第1氨基酸序列或核酸序列）。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第1序列中的位置被与第2序列中的对应的位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置同一。2个序列之间的百分率同一性是由序列共享的相同位置数的函数（即,百分率同一性=相同位置数/位置总数（例如,重叠位置）x100）。在一实施方式中，2个序列是相同的长度。

存在测定百分率同一性的几种方法。可用以下方式测定百分率同一性。将靶核酸或氨基酸序列使用来自含有BLASTN 2.0.14版和BLASTP 2.0.14版的独立版本的BLASTZ的BLAST 2Sequences（Bl2seq）程序与鉴定的核酸或氨基酸序列比较。此独立版本的BLASTZ可从美国政府的National Center for BiotechnologyInformation网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）得到。解释如何使用Bl2seq程序的使用说明可见于伴随BLASTZ的readme文件。

Bl2seq进行使用BLASTN或BLASTP算法在2个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为了比较2核酸序列，选项可设置如下：-i设置为含有待比较的第1核酸序列的文件（例如,C:\seq1.txt）；-j设置为含有待比较的第2核酸序列的文件（例如,C:\seq2.txt）；-p设置为blastn；-o设置为任何期望的文件名（例如,C:\output.txt）；-q设置为-1；-r设置为2；及全部其他选项保持它们的默认设置。以下命令会产生含有2个序列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-oc:\output.txt-q-1-r 2。如果靶序列与鉴定的序列的任何部分共享同源性，则指定的输出文件会作为对齐的序列呈递那些同源性区。如果靶序列不与鉴定的序列的任何部分共享同源性，则指定的输出文件会不呈递对齐的序列。

一旦对齐的，长度通过计数来自靶序列供与自始于任何匹配的位置及结束于任何其他匹配的位置的鉴定的序列的序列比对的连续核苷酸数来测定。匹配的位置是同一核苷酸存在于靶及鉴定的序列的任何位置。由于间隔不是核苷酸，不计数存在于靶序列中的间隔。同样，由于计数靶序列核苷酸，而非自鉴定的序列的核苷酸，不计数存在于鉴定的序列中的间隔。

跨特定长度的百分率同一性可通过计数跨该长度的匹配的位置数及用该数除以长度，之后是将得到的值乘以100来测定。例如，如果（1）将50个核苷酸靶序列与编码野生型MspA的序列比较（2）Bl2seq程序呈现45个核苷酸，其来自与该45个核苷酸区的第1和最后核苷酸匹配的编码野生型MspA的序列区对齐的靶序列，及（3）在那些45个对齐的核苷酸上匹配数是40，则50个核苷酸靶序列含有45的长度，而跨该长度上的百分率同一性是89（即,40/45×100=89）。

另一计算同一性的方式可由出版的算法实施。用于比较的序列的最佳比对可由下列方法进行：由Smith和Waterman，Adv Appl Math2:482（1981）的局部同一性算法，由Needleman和Wunsch，J Mol Biol48:443（1970）的同一性比对算法，由搜索Pearson和Lipman，ProcNatl Acad。sci USA 85:2444（1988）的相似性方法，由这些算法的计算机化的实现（Wisconsin遗传学软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI）或由检查。

可对于核酸获得相同的类型的同一性，其算法，例如，公开于Science 244:48-52（1989）；Proc Natl Acad Sci USA 86:7706-10（1989）；及Methods Enzymol 183:281-306（1989），对于至少与核酸比对相关的材料通过引用并入本文。需知，一般可使用任何方法及在特定实例中，这些各种方法的结果可不同，但本领域技术人员明白，如果用至少这些方法之一发现同一性，序列会被认为具有陈述的同一性及在本文公开。

也公开编码本文公开的蛋白序列，以及变体和其片段的核酸。这些序列包括与特定蛋白序列相关的全部简并序列，即，具有编码一种特定蛋白序列的序列的全部核酸以及全部核酸，包括简并核酸，其编码蛋白序列的公开的变体和衍生物。由此，即便各特定核酸序列可不在本文写出，需知，各和每序列通过公开的蛋白序列实际上在本文公开及描述。

蛋白的片段和部分序列可在本文所述的方法中有用。如同全部肽和蛋白，包括其片段，需知，可发生不改变肽和蛋白的性质或功能的本文公开的蛋白的另外的氨基酸序列的修饰。需知，对于这些的唯一限制是实践，它们必需包含用于在关联实施方式中使用的必需功能元件（例如,隧通-形成能力）。该修饰包括保守性氨基酸取代及在下文进一步详细讨论。

以下表提供可在测定如何选择用于本文所述的蛋白（例如,蛋白孔）的修饰的氨基酸中辅助本领域技术人员的氨基酸性质的非限制性例。

表4．氨基酸性质

a此栏代表待在蛋白内部埋藏的氨基酸趋势（定义为<5%的溶剂中可利用的残基）及基于9个蛋白的结构（研究总~2000个体残基,这些中587个（29%）被埋藏）。值指示各氨基酸被发现埋藏的频度，相对于见于蛋白的此氨基酸的残基总数。括弧中的值指示相对于蛋白中全部埋藏残基发现的此氨基酸的埋藏残基数。自BioTechnology8:308（1990）的数据；对于具有类似结果的其他计算方法，见Nature277:491（1979）；及Science 229:834（1985）。

b埋藏残基的平均体积（Vr），由侧链的表面积计算。Annu RevBiophys Bioeng 6:151（1977）；Protein Eng 2:329（1989）。

c自Darby N.J.and Creighton T.E.Protein structure.In In focus(ed.D.Rickwood),p.4.IRL Press,Oxford,United Kingdom(1993)的数据。

d具有延伸的构象中的主链的Gly-X-Gly三肽中残基X的氨基酸侧链的总可接近的表面积（ASA）。J Mol Biol 196:641（1987）。

e显示的值代表根据它们在用于38个公开的疏水性尺度的各序列排序上发生的频度的氨基酸平均值排序。Protein Eng 11:153（1998）。尽管大多数这些疏水性尺度源于分离的氨基酸的化学行为或物理化学性质的实验测量（例如,水中的溶解度,水和有机溶剂之间的分隔部,层析迁移或对表面张力的效应），包括几个“操作”疏水性尺度基于蛋白中氨基酸的已知的环境特征，诸如它们的溶剂可接近性或它们占据蛋白核心的倾向性（基于在由x-射线晶体学或NMR观察的三级结构中残基的位置）。更低排序代表最疏水氨基酸，及更高值代表最亲水氨基酸。为比较性目的，Radzicka和Wolfenden，Biochem 27:1664（1988）的疏水性尺度显示于括弧。该尺度源于氨基酸的测量的水合势，其基于它们的自蒸汽相转移到环己烷，1-辛醇和中性水溶液的自由能。

或者，可考虑氨基酸的亲水性指数。各氨基酸已基于它们的疏水性和/或荷电特征分配亲水性指数，这些是：异亮氨酸（+4.5）；缬氨酸（+4.2）；亮氨酸（+3.8）；苯丙氨酸（+2.8）；半胱氨酸/胱氨酸（+2.5）；甲硫氨酸（+1.9）；丙氨酸（+1.8）；甘氨酸（-0.4）；苏氨酸（-0.7）；丝氨酸（-0.8）；色氨酸（-0.9）；酪氨酸（-1.3）；脯氨酸（-1.6）；组氨酸（-3.2）；谷氨酸（-3.5）；谷氨酰胺（-3.5）；天冬氨酸（-3.5）；天冬酰胺（-3.5）；赖氨酸（-3.9）；和/或精氨酸（-4.5）。对蛋白赋予相互作用生物学功能的亲水性氨基酸指标的重要性为本领域通常所知。已知，特定氨基酸可被具有类似亲水性指数和/或评分和/或仍保留类似生物学活性的其他氨基酸取代。在基于亲水性指数进行变化中，氨基酸的取代，其亲水性指数可在±2之内；在±1之内，或在±0.5之内。

本领域也明白，可基于亲水性有效进行相似氨基酸的取代。如详述于美国专利4,554,101，通过引用并入本文，以下亲水性值已分配到氨基酸残基：精氨酸（+3.0）；赖氨酸（+3.0）；天冬氨酸（+3.0±1）；谷氨酸（+3.0±1）；丝氨酸（+0.3）；天冬酰胺（+0.2）；谷氨酰胺（+0.2）；甘氨酸（0）；苏氨酸（-0.4）；脯氨酸（-0.5±1）；丙氨酸（-0.5）；组氨酸（-0.5）；半胱氨酸（-1.0）；甲硫氨酸（-1.3）；缬氨酸（-1.5）；亮氨酸（-1.8）；异亮氨酸（-1.8）；酪氨酸（-2.3）；苯丙氨酸（-2.5）；色氨酸（-3.4）。在基于类似亲水性值进行变化中，其涵盖氨基酸的取代，其亲水性值可在±2之内，在±1之内或在±0.5之内。

任何突变蛋白可相比野生型Msp孔蛋白或单体，包含保守性氨基酸取代。任何取代突变是以最低限度破坏蛋白的生物化学性质的保守性。导入以代替保守性氨基酸残基的突变的非限制性例包括：带正电的残基（例如,H,K和R）取代为带正电的残基；带负电的残基（例如,D和E）取代为带负电的残基；中性极性残基（例如,C,G,N,Q,S,T和Y）取代为中性极性残基；及中性非-极性残基（例如,A,F,I,L,M,P,V和W）取代为中性非-极性残基。保守性取代可根据以下表5进行。非保守的取代也可进行（例如,脯氨酸为甘氨酸）。

表5：例示氨基酸取代

氨基酸	取代
		Ala	Ser，Gly，Cys
Arg	Lys，Gln，Met，Ile
		Asn	Gln，His，Glu，Asp
Asp	Glu，Asn，Gln
		Cys	Ser，Met，Thr
Gln	Asn，Lys，Glu，Asp
		Glu	Asp，Asn，Gln
Gly	Pro，Ala
		His	Asn，Gln
Ile	Leu，Val，Met
		Leu	Ile，Val，Met
Lys	Arg，Gln，Met，Ile
		Met	Leu，Ile，Val
Phe	Met，Leu，Tyr，Trp，His
		Ser	Thr，Met，Cys
Thr	Ser，Met，Val
		Trp	Tyr，Phe
Tyr	Trp，Phe，His
		Val	Ile，Leu，Met

纳米孔一般能插入脂质双层或其他薄膜，及这些技术为本领域熟知，如本文解释。此外，美国专利No.6,746,594，通过引用并入本文，描述各种脂质双层和薄膜，包括可关于本文讨论的纳米孔采用的无机材料。方法，设备和技术描述于美国专利No.6,267,872，通过引用以其整体并入本文，也可关于本文讨论的纳米孔采用。

可在一些实施方式中采用的任选的脂质膜是包含分枝菌酸的人工膜，如描述于在2011年2月23日由Jens H.Gundlach，Ian M.Derrington和Kyle W.Langford提交到美国受理局的名称为″Artificial Mycolic Acid Membranes”的美国申请系列No.61/307,441和其相关的国际申请，各通过引用以其整体并入本文。分枝菌酸是高分子量α-分支的，β-羟基脂肪酸是全部分枝杆菌属（Mycobacterium）的细胞包膜的组分。分枝菌酸含有具有不等的长度的2个疏水尾的羧酸头基。分枝菌酸具有基本结构R₂CH(OH)CHR₁COOH，其中R₁是C₂₀～C₂₄线性烷，和R₂是可含有各种数的碳-碳双键，环丙烷环，甲基枝或氧官能诸如羰基，羧酸和甲氧基的30～60个碳原子的更复合结构。分枝菌酸的结构根据家族和物种而改变。

在分枝杆菌细胞包膜中，分枝菌酸作为游离的脂质，诸如二分枝菌酸海藻糖（TDM）或索状因子和单分枝菌酸海藻糖（TMM）存在。它们也可酯化为阿拉伯糖半乳聚糖，肽聚糖-连接的多糖的末端五-阿拉伯糖呋喃糖基单元。在本文中，分枝菌酸可还被定义为任何这些变体。在一些实施方式中，分枝菌酸还被定义为可为本领域知道的天然存在的或合成的海藻糖-修饰的分枝菌酸。见，例如，美国专利No.4,307,229，4,720,456，5,006,514和5,049,664，各通过引用以其整体并入本文。该长-链脂肪酸的存在大大地负责分枝杆菌细胞包膜的高疏水性和非常低通透性。分枝菌酸已报道于非分枝杆菌属（Mycobacterium）的细菌物种，例如，棒杆菌属（Corynebacterium）和诺卡菌属（Nocardia）。因而，3种主要类别的分枝菌酸是区别的（The Merck Index,1989），即：

（i）白喉菌酸（C₂₈～C₄₀酰基链长度）

（ii）诺卡分枝菌酸（C₄₀～C₆₀酰基链长度）及

（iii）分枝杆菌分枝菌酸（C₆₀～C₉₀酰基链长度）。

MA的结构，基序和变异的详述提供于Prog.Lipid Res 37:143（1998）。MA可购买，诸如自Sigma Aldrich，或如本领域已知制备。见，例如，美国专利No.6,171,830，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，分枝菌酸源于结核分枝杆菌（M.tuberculosis）。

分枝菌酸的定义也包括修饰的分枝菌酸。因此，人工膜可包含一种或更多修饰的分枝菌酸。例如，分枝菌酸可由交联分枝菌酸修饰。人工分枝菌酸膜可通过端基聚合或通过分枝菌酸的内部基团的交联制成更凝胶-样和稳定。可采用类似于交联二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPhPC）或其他脂质的方法的交联方法，如本领域知道，来制备修饰的分枝菌酸。见，例如，A.Singh and J.M.Schnur,Polymerizable Phospholipidsin Phospholipids Handbook,C.Cevc,ed.,Marcel Dekker Inc.,NY,pp233-287（1993）。膜可包含一种或更多类型的分枝菌酸（即,分枝菌酸的混合物）。在一些实施方式中，膜包含约，至少约，或至多约1%，2%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99%或更高多分枝菌酸，或可来源于它们的任何范围。在一些实施方式中，膜包含100%分枝菌酸。包含分枝菌酸的人工膜也可包含非分枝菌酸的脂质，包括合成和天然存在的脂质。美国专利No.7,514,267，通过引用以其整体并入本文，描述各种脂质。

如本文所用，″未支持的膜″是跨在沿着膜表面的任意侧上无支持物的孔的开口的膜。膜在任意侧或两侧具有液体，气体或真空，但不与任意侧上的固体（基材）接触。如本文所用，″栓系的膜″是分枝菌酸的头基附接，或栓系到基材（例如,塑料,玻璃,芯片,珠）的膜。通过头基的化学修饰将脂质附接到基材而形式栓系的膜的方法为本领域熟知，及该方法可用于类似地修饰及附接分枝菌酸的头基。说到“人工”，其是指膜不是天然存在的，而是人造的。

在本文中的任何实施方式中，包含分枝菌酸的人工膜可为未支持的或栓系的。分枝菌酸可还被定义为修饰的分枝菌酸。修饰的分枝菌酸可为交联的分枝菌酸。分枝菌酸可还被定义为不修饰的分枝菌酸。在一些实施方式中，膜具有平均厚度约5～约22nm。测量膜厚度的方法为本领域熟知。在一些实施方式中，膜当施加穿过膜的电压以约100mV/s渐变时具有约2.0V的平均破裂电压在用10mM HEPES缓冲到pH8.0±0.05的用去离子水制备的1.0M KCl溶液存在下。在一些实施方式中，膜具有在用10mM HEPES缓冲到pH8.0±0.05的用去离子水制备的1.0M KCl溶液存在下抵御大于1V的电压大于几小时的能力。在一些实施方式中，膜具有在用10mM HEPES缓冲到pH8.0±0.05的用去离子水制备的1.0M KCl溶液存在下抵御大于1V的电压至少约2，3，4或5或更小时，或可来源于它们的任何范围的能力。在一些实施方式中，膜当除去顺式或反式侧上的缓冲剂时具有对破裂的抗性。当暴露于提供于其顺式侧的pH2～pH9缓冲剂时，膜可形成及改性。在一些实施方式中，膜可在超过55℃的温度形成及改性。

也提供的是制造包含分枝菌酸的人工未支持的膜的方法，其包括：（a）用一个或更多分枝菌酸-己烷混合物的包被预处理直径约500nm～约500μm的孔及移出己烷以提供干分枝菌酸；（b）将烃溶剂应用于干分枝菌酸，之后是加热以促进烃溶剂掺入以提供分枝菌酸-烃溶剂组合物；（c）在第1液体导电介质和第2液体导电介质之间放置孔；（d）将分枝菌酸-烃溶剂组合物应用于孔，同时监控离子电流通过孔直到孔电阻增加到1TΩ以上，之后是迫使液体导电介质之一从反式侧通过孔以根据需要消除离子电流阻断；及（e）在孔上放置气泡，之后是气泡收缩，其中由孔电阻增加到1TΩ以上指示膜形成，且其中如果纳米孔可在膜内形成，则指示双层膜形成。烃溶剂可为十六碳烷或十六碳烯或可掺入膜的任何其他烃溶剂。采用的烃溶剂类型依赖于想要制备膜的温度。

在一些实施方式中，多个纳米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。例如，2，3，4，5，10，20，200，2000或更多可包含在膜中。

任选地，2，3，4，5，10，20，200，2000或更多纳米孔包含在膜，双层或薄膜中。的确，任意2～1010纳米孔可在本文所述的实施方式中采用。该多个纳米孔可为纳米孔簇的形式。簇可随机组装或可设置成图案。如本文所用，″簇″指称分组在一起及作为单元移动，但不彼此共价结合的分子。

任选地，纳米孔不自发选通。″选通（gate）″或″选通（gating）″指称通过蛋白开口的电传导率的自发变化，其通常是临时的（例如,延续少至1-10ms～达1s）。持久的选通事件可常常通过改变极性而被逆转。在多数环境下，选通概率随着更高电压的施加而增加。通过开口的传导率的选通及程度变化在纳米孔之中高度可变，依赖于，例如，开口的组成（例如,Msp孔蛋白的前庭和收缩区域）以及蛋白所浸没的液体介质的性质。一般而言，蛋白在选通期间成为欠导电，及作为结果传导可永久停止（即,开口可永久闭合），使得过程不是可逆。任选地，选通指称通过纳米孔的开口的传导率自发变化到小于其开放状态电流的75%。

诸如接触纳米孔的轻和液体介质的各种条件，包括其pH，缓冲剂组成，去污剂组成，及温度，可影响纳米孔的行为，特别关于其通过隧通的传导率以及关于隧道的分析物的移动，暂时或永久。

作为“包含”的替代或附加，本文的任何实施方式可叙述“由...组成”。过渡短语″由...组成″排除权利要求中不特定的任何要素，步骤或成分。

本文的任何实施方式可任选地排除本文中的任何其他实施方式。

权利要求中术语”或”的使用用于表示″和/或″除非明确地指示指称仅替代或替代是相互排他的，尽管公开支持指称仅替代和”和/或”的定义。

贯穿本申请，术语″约″用于指示包括待采用以测定值的装置或方法的误差的标准偏差的值。在结合术语”约”使用的数值的情景中讨论的任何实施方式中，特别涵盖术语约可忽略。

根据长期专利法，词汇″a″和″an”，当在权利要求或说明书中结合词汇”包含”使用时，表示1个或更多，除非特别提及。

公开的是可用于，可联用于，可用于制备的物质，组合物和组分，或是公开的方法和组合物的产物。这些和其他物质在本文公开，及应知，当公开这些物质的组合，子集，相互作用，组，等，而可不明确地公开这些化合物的各种个体及集体组合和置换的特定参照时，各在本文特别涵盖及描述。例如，如果公开及讨论方法及讨论可对许多包括方法的分子进行许多修饰，特别涵盖方法的各和每组合和置换，及可能的修饰，除非特别相反指示。同样，也特别涵盖及公开这些的任何子集或组合。此概念应用于本公开全部方面，包括但不限于使用公开的组合物的方法中的步骤。由此，如果有各种可进行的另外的步骤，需知，各这些另外的步骤可用任何特定方法步骤或公开的方法的方法步骤的组合进行，及特别涵盖组合的各该组合或子集及应被认为是公开的。因此涵盖，此说明书中讨论的任何实施方式可关于本文描述的任何方法，系统或组合物，等实施，及反之亦然。例如，本文所述的任何纳米孔可在本文所述的任何方法中采用。

【实施例】

【实施例1：实施例1～7的材料和方法】

除非另外提及，M1-NNN-MspA纳米孔用于下例。此纳米孔的制备描述于美国临时申请系列No.61/098,938和其相关的PCT申请，WO 2010/034018，各通过引用以其整体并入本文。也见Proc Natl AcadSci 105:20647（2008）。

DNA由Integrated DNA Technologies,Inc.合成，无另外的对发卡DNA的纯化，或对于一些DNA用PAGE纯化。DNA浓度为～10μM～100μM。为了防止自身-二聚化，通过将其加热到90℃保持1分钟，在-8℃冷冻器中冷却另外的分钟，然后使其在使用之前返回室温来制备发卡DNA。

检查MspA的核苷酸灵敏度的发卡DNA序列具有相同的14个碱基双链区和6nt环。5’GCTGGCTCTGTTGC TCTCTCGCAACAGAGCCAGC<尾>3’［SEQ ID NO:4］。加下划线指示互补碱基之间的双链形成。发卡尾序列显示于表A和B。如果残余电流足够类似于其他DNA链，用类似浓度的聚-dA或聚-dC运行实验，以提供残余电流校准。由于Nernst电势和缓冲剂蒸发，此校准减少电流水平中的少数实验变异。

DI测序中使用的DNA如下：

3′ATGC5′[SEQ ID NO:1]：5’GCAACAGAGCCAGC CCCGCAACAGAGCCAGC GGA GCAACAGAGCCAGC TTTGCAACAGAGCCAGC AAA A₃₂3’［SEQ ID NO:5］3′TACG5′[SEQ ID NO:2]：GCAACAGAGCCAGC GGAGCAACAGAGCCAGC CCC GCAACAGAGCCAGC AAAGCAACAGAGCCAGC TTT A₃₂3’［SEQ ID NO:6］

盲：5’GCAACAGAGC CAGC CCCGCAACAGAGCCAGC AAAGCAACAGAGCCAGC CCC GCAACAGAGCCAGC TTTGCAACAGAGCCAGC GGA A₁₅3’［SEQ ID NO:7］。

加下划线的区与序列5’GCTGGCTCTGTTGC 3’［SEQ ID NO:8］的寡核苷酸形成双链体。将寡核苷酸及合成的DI DNA以>32:1摩尔比掺入，通过加热到95℃保持5分钟来退火，然后逐渐冷却到23±1℃。

孔隙用之前描述的方法建立（美国临时申请系列No.61/098,938和其相关的PCT申请,WO 2010/034018,各并入本文以其整体）。简言之，由1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸酯（Avanti Polar Lipids,Inc.）或自其等同混合物形成脂质双层。双层跨水平～20μm直径特氟隆

孔。将M1-NNN-MspA以~2.5ng/ml的浓度加入双层的接地侧。Axopatch^TM-1B或200B膜片钳放大器（Axon Instruments,now of Molecular Devices,Inc.）跨双层施加电压，及测量离子电流。用4-极Bessel滤器以10，50或100kHz低通过滤模拟信号，然后以低通过滤频度的5倍数字化。用

/CVI写的自定义软件（National Instruments）控制数据获取。为显示目的，以2kHz数字地过滤残余电流迹。于23±1℃在1M KCl，10mM HEPES/KOH缓冲到pH8中进行全部实验。用

写的自定义软件

分析数据（见下实施例7）。

【实施例2：通过MspA的核苷酸鉴定】

用形成14bp发卡双链体及具有50个核苷酸ssDNA′尾′的DNA（见表A）进行转位实验。当穿过孔隙施加电压时，长单链尾辅助捕获及DNA插孔隙的收缩（图2A～2D）。以180mV的驱动电压，在～10ms后发卡双链体解离。在把持发卡尾的时间期间，测量的残余离子电流（I_res）强烈依赖于在孔隙的限制收缩的ssDNA段的组成。一旦双链体解离，DNA以相比1nt/μs更快的速度完全转位到更低电势室。

首先，通过使用M1-NNN-MspA中把持的′同聚物′DNA发卡尾(dA)₅₀［SEQ ID NO:10］，(dC)₅₀［SEQ ID NO:11］，(dT)₅₀［SEQ IDNO:12］，及(dG)₃，(dA)₄₇［SEQ ID NO:13］来测定与4个碱基关联的特征残余电流。注意到，代替(dG)₅₀［SEQ ID NO:14］，使用(dG)₃(dA)₄₇［SEQ ID NO:54］，因为G-四分体形成。对于各多核苷酸尾，平均残余电流的直方图揭示在180mV的施加的电压的独特值（图3A,3B）。由(dA)₅₀［SEQ ID NO:10］尾导致的残余离子电流的高斯平均值（μ）和半-宽度（σ）是I_dA=65.5±1.5pA（μ±σ,对N=用不同孔隙的7个实验平均的,n=3257总转位）。尾(dG)₃(dA)₄₇［SEQ ID NO:54］，(dC)₅₀［SEQ ID NO:11］和(dT)₅₀［SEQ ID NO:12］产生分别I_dG=59.4±1.2pA（N=5,n=2938），I_dC=48.4±1.1pA（N=7,n=1830）和I_dT＝41.9±1.2pA（N=4,n=2407）的残余离子电流。在140mV更低电压，在分布之内观察到更窄高斯宽度及减少的分离，用I_dA=43.6±0.4pA（n=117），I_dG=37.5±0.6pA（n=93），I_dC=29.2±0.3pA（n=87），及I_dT=24.4±0.5pA（n=169）。更大块的嘌呤，dA和dG，其相比嘧啶具有更大残余电流，dT和dC，指示立体限制不是残余电流值的主要决定子，如已在α-溶血素中注意到。

由于不同同聚物发卡尾的残余电流良好分离及良好溶解。例如，在1M KCl中，使用140mV驱动电压，聚-dA和聚-dC之间的残余离子电流差异是I_dA-I_dC=14.4±0.5pA。MspA提供相比α-溶血素，核苷酸特定电流的最小3.5-倍增强的分离。

【实施例3：探索M1-NNN-MspA中的灵敏度区】

探索影响残余电流的发卡尾之内的核苷酸位置。为此，使用在另外聚-dA尾中在各位置具有(dC)₄［SEQ ID NO:55］段的一系列发卡DNA。当(dC)₄［SEQ ID NO:55］与发卡双链体相邻时，电流与I_dC相同。当(dC)₄［SEQ ID NO:55］段位于离发卡双链体多于3个碱基时，残余电流无法与I_dA区分（表A）。为了测试与发卡相邻的头3个核苷酸的明显的重要性，使用具有(dA)₃或(dC)₃，之后是2个不同随机杂聚体的尾。残余电流发现独立于杂聚体段及无法分别与I_dA或I_dC区别（见表A）。给定MspA的几何，发卡双链体预期在收缩附近。由于少于4个核苷酸影响残余电流，其是管理残余电流的MspA的收缩之内和附近的核苷酸。

【实施例4：单核苷酸识别—测序的前奏】

个体核苷酸位点的识别和鉴定是纳米孔测序需要的。通过制造在ssDNA发卡尾中的单核苷酸取代来检查对个体核苷酸的MspA的灵敏度。单核苷酸的取代，另外聚-dA发卡尾中的dN，在自双链体计数的头3个位置，x=1,2,3，及表示为dN_x。例如，在双链体（x=1）后的第1位置的dC称之为dC₁。图4A～4D显示平均的I_res的直方图。随着dC₂取代，I_res接近与聚-dC关联的电流，I_dC。对于dC₁取代，测量的离子电流在使用同聚物发现的离子电流，I_dA和I_dC之间。发现dT₁，dT₂和dT₃的取代导致I_dA和I_dT之间的离子电流，对于dT₁取代的电流最接近I_dT。聚-dA之内的单dG不呈现自纯聚-dA的电流略微调节电流，如自I_dA和I_dG的相对接近可预期。随着杂核苷酸取代的趋向I_dA的残余电流还来自双链体，给出另外的证据，残余电流标记是主要的，由于双链体之后的头2个核苷酸，及部分由于第3核苷酸。见表A的这些发卡尾和它们的关联的残余电流值的附加信息。

同聚物背景可影响杂核苷酸取代对I_res的效应。通过使用在聚-dC背景中的dA取代检查此效应（图6A～6D）。残余电流受在x=1,2,3的这些取代的影响，但自I_dC的电流差异不如聚-dA中dC_x取代的影响那么大。类似地，单dA在聚-dT背景中被取代，及相比聚-dA背景中的dT_x取代，未产生对I_res一致的影响。这些观察未被与各核苷酸取代关联的电阻器模型良好描述。但是，观察的不对称可用对由能屏障导致的离子运输的速度限定性地明白（下实施例7）。

这些结果指示，MspA的短收缩区域的确负责核苷酸鉴定。相比α-溶血素，MspA在其收缩区域产生更大和更聚焦的离子电流密度。电流对核苷酸同一性最敏感的沿着收缩的长度为约2个核苷酸长度。核苷酸特异性和空间分离可用对MspA的另外的突变增强是可能的，尤其由于使用M1-NNN-MspA，第1MspA突变体取呈现的数据，以允许DNA转位。因为其对残余电流的重要性，收缩会可能是对位点-突变有希望的位置。如此，本文所述的其他MspA突变体，以及其他Msp孔蛋白，可对于本文所述的实施方式采用。

【实施例5：发卡末端对离子电流的效应】

由于发卡双链体静止在MspA的收缩附近，其也影响离子电流是可能的。为了探索此，用各种双链长度，但用相同的末端碱基研究发卡DNA。测量的电流发现是弱地依赖于发卡双链长度，相比较短双链长度，更长双链长度诱导更低I_res（见表B）。在进一步实验中，保留原14bp双链体及仅改变末端bp。发现，残余电流是强烈依赖于此末端bp（表B），改变I_res达～20%。为了比较发卡的尾的影响，用相同的14bp双链体获取以上呈表的实验。

【实施例6：双链体间断的（di）纳米孔测序】

在MspA的收缩中离子电流是独特地敏感于单链DNA核苷酸。而未阻碍的ssDNA转位的速度对于利用此灵敏度仍太快，可使用双链区控制DNA的转位速度。以下部分描述使用双链DNA段的DNA测序方法，以减慢DNA的转位。用存在的生物化学转变过程，双链DNA的短段可有效放置在分析物DNA的核苷酸之间。当通过MspA驱动此转变的DNA时，各双链体段依次暂停转位。由于分析物DNA的核苷酸由双链体段把持在限制的孔，残余离子电流可鉴定分析物核苷酸。在一个DNA双链体解离之后，DNA快速前进直到下一DNA双链体中止转位，允许下一分析物核苷酸被测定。发明人称此方法为双链间断的（DI）纳米孔测序。

DI测序依赖于修饰分析物DNA至具有各核苷酸之间的双链段，以产生″转变的″DNA。为了探索DI测序的可行性，使用合成的DNA，其中假定的分析物DNA的各核苷酸之后是14bp双链区。双链体段具有与以上检查的发卡的那些同一的序列，及由退火互补寡核苷酸形成。代之使用各双链体段之间的单核苷酸，选择三-核苷酸来容易比较离子电流与良好-表征的同聚物发卡实验。将聚-dA尾加入合成的序列的3’端，以起始DNA穿入MspA。例如，会将分析物序列3′-ATGC-5’［SEQID NO:1］转化为可分析的DI-序列：5′双链-CCC-双链-GGA-双链-TTT-双链-AAA-dA₃₂3’［SEQ ID NO:9］。含有三-核苷酸区的这些合成的序列也可为DNA转变的产物（见,例如,WO 2000/39333）。

使用M1-NNN-MspA，检查DNA构建体的分析物序列3′-ATGC-5′[SEQ ID NO:1]和3′-TACG-5’［SEQ ID NO:2］，均含有全部4种核苷酸。用于合成的序列的离子电流中观察到连续离散步骤，残余电流显示于图5A和5B。各水平与在同聚物发卡实验中观察到的水平之一一致。对具有<25%的开放孔隙电流的平均电流的转位使用边缘检测算法（见实施例7），~4%的转位发现以预期的顺序呈现全部4种电流水平，I_dA，I_dC，I_dT和I_dG。在图5A和5B中，显示在140mV记录的4-水平样品迹，结合对于许多转位发现的水平的平均电流的直方图。在其他电压的用于DI测序的另外的数据显示于图7A～7C，8A～8C和9A～9C。转位的大级分呈现3个或更少不同水平（见图10～12的表）。见于这些转位的水平也含有具有与分析物序列一致的量级的同聚物电流水平，但有一个或更多水平丢失。不被理论束缚，发明人相信，少于4个水平的转位是由于不完全退火的双链区或对于适当地鉴定太短（<1ms）的水平持续时间。

用通过分析DI序列3′-ATGC-5’［SEQ ID NO:1］和3′-TACG-5’［SEQ ID NO:2］调校的边缘检测算法，用源于未知的组成和长度的短序列的合成的DNA进行盲测试。测到，~3%的转位在电流迹中呈现对应于3′-GTCAC-5’［SEQ ID NO:3］的5个水平，其后来确认为未知的序列。图5C显示自盲测试的一例电流迹。这些DI实验提供自连续经过纳米孔的DNA分子提取的序列信息的首次展示。

纳米孔测序必需能使用残余电流区别重复核苷酸。用MspA中的DI测序，此需求可通过使用标记到下一分析物核苷酸的进展的′第5水平′（也称之为分隔物水平）实现。第5水平可由具有2个分离的互补寡聚体的分隔间断的-双链体制造。得到的第1双链体产生特异于分析物核苷酸的水平，和第2双链体产生不同水平。不同第5水平可通过选择第2双链体制造，以具有产生高于是（dG）的5’的残余电流的残余电流的末端5’（dC）（见表B）（见表A）。用此选择，使用180mV电压，残余电流会在~77pA之间，和分析物核苷酸-特异性电流在42pA和66pA之间反复。第5水平会分离每分析物核苷酸的电流水平，和会允许读数任何长度的核苷酸重复子。

虽然个体转位可指示序列，丢失的碱基可需要多个转位的统计学，以增强测序的保真度。电流-水平持续时间的统计学分析可提供有关序列及丢失的核苷酸的附加信息。

有通过改变操作参数诸如缓冲剂的pH和离子强度，使用双链-结合剂，改善寡聚体退火，及使用更复杂的数据分析技术来优化DI测序的速度和灵敏度的潜力（见,例如,BMC Bioinformatics B(Suppl7):S14（2007）。

【实施例7：转位分析方法和定性屏障模型】

在

自定义设计全部软件

使用电流-阈值首先鉴定DNA的转位，及由围绕的开放孔隙电流标准化，如描述于美国临时申请系列No.61/098,938和其相关的PCT申请，WO2010/034018，各通过引用以其整体并入本文。跨许多实验见到开放孔隙电流水平的少数变异，及可能由于影响导电性的缓冲剂条件的少数变化。通过各转位的残余电流除以围绕的未阻断的电流水平来最小化实验之间的波动。为了报道电流中的值，将这些标准化的电流对于180mV的施加的电压，乘以平均开放孔隙电流325.1±1.8pA（平均值±标准误差），和对于140mV施加的电压，乘以平均开放孔隙电流252.2+/-3.0。使用用平均I_res<0.5*I_OS转位及长于1ms的持续时间构建平均的残余电流的直方图。直方图选自个体实验，当对多个实验平均时，其紧密匹配最频繁的残余电流，如表A和B记载。

然后对残余电流以4kHz进行高斯过滤及以20kHz采样和用20-点中位滤器进一步处理。用自定义边缘检测软件利用检测独特水平之间的转变的梯度阈值来鉴定电流水平之间的转变。电流梯度的局部最大用于定位可能的转变。为了被认为是独特，需要残余电流迹之内的水平满足几个条件：水平持续时间必需长于1.5ms，各水平的平均电流必需通过自周围水平大于3.8pA，及由周围水平电流波动的和的大于1.5倍求积分开。如果这些需求未满足，将水平组合，直到可能的水平被测定为独特。发现具有4（或在盲3′-GTCAC-5’序列[SEQ ID NO:3]的情况中是5）个水平的残余电流迹跟随图7A～7C，8A～8C和9A～9C中见到的模式。这些水平的平均可见于图10～12的表。对于具有少于4（或5）个事件的事件的信息总结于图10～12的表。

数据，显示于图6A～6G，显示取代在发卡DNA的双链末端后位置x=1,2,3的核苷酸dN_x的效应。在聚-dA，聚-dC或聚-dT同聚物尾中取代核苷酸。观察到聚-dA中dC_x dT_x取代的存在导致残余电流分别向同聚物值I_dC和I_dT变化。聚-dC或聚-dT同聚物中dA核苷酸的取代不一贯地改变电流。定性模型可描述此数据是可能的。

可很自然地预期，各这些核苷酸如阻碍离子流的电阻器作用。数据不与此描述自身-一致，如已在α-溶血素中观察到。代之以电阻器模型，及不被理论束缚，发明人假定，与MspA的收缩内的核苷酸组合的收缩之内的各氨基酸残基形成对离子电流的独特屏障。特定核苷酸，诸如dC，dT的存在，可诱导对离子运输的速度-限。以下是对数据如何与此模型一致的讨论。

I_dC<I_dA的观察提示，相比dA核苷酸，任何dC核苷酸会对离子运输呈现更高屏障。当单dC_x放入聚-dA时，残余电流被由dC_x屏障诱导的速度-限减小。由于dC_x插入的电流的减小在x=2最强，及在x=1多少欠强，可能因为这些位置会将取代放入MspA的收缩的最窄的部分。当检查聚-dC尾中dA_x取代的影响时，观察到电流未略微增加。此是因为周围dA_x取代的高-屏障dC核苷酸诱导对离子运输的速度限，而由单dA呈表的更小屏障不可撤消此速度限。

当由dT导致的高屏障放入聚-dA尾时，观察到类似效应：电流显著减小，由于取代dT_x位于收缩之内，特别在x=1。由于I_dT<I_dA，这些观察支持特定核苷酸诱导对离子流的速度限的可能性。此模型的进一步解释表明，当在聚-dT中制造取代dA₁时，在第2位置的dT会是诱导对离子运输的速度-限的可利用的下一核苷酸。如会预期，观察到聚-dA中的dT₂取代用类似于由于聚-dT中的dA₁取代所致的电流的分布诱导速度-限制的电流。该位置的差异，取代dC_x和dT_x在聚-dA中最有影响（x=2,及x=1,分别），可归因于核苷酸与孔隙和发卡末端之间的特异性相互作用。

也提供的是包含具有限定隧道的前庭和收缩区域的Msp孔蛋白的系统，其中隧道定位在第1液体介质和第2液体介质之间，其中至少一个液体介质包含分析物，且其中系统用于检测分析物的性质。系统可运作以检测任何分析物的性质，包括使Msp孔蛋白经历电场，使得分析物与Msp孔蛋白相互作用。系统可运作以检测分析物的性质，包括使Msp孔蛋白经历电场，使得分析物通过Msp孔蛋白的隧道电泳转位。也提供的是包含具有限定隧道的前庭和收缩区域的Msp孔蛋白的系统，其中隧道定位在第1液体介质和第2液体介质之间的脂质双层中，且其中唯一的第1和第2液体介质之间的液体交通点存在于隧道中。而且，本文所述的任何Msp孔蛋白可包含在本文所述的任何系统中。

本文所述的任何系统可还包含膜片钳放大器或数据获取装置。系统可还包含与第1液体介质，第2液体介质，或两者交通的一个或更多温度调控装置。

本文所述的任何系统可运作以通过Msp孔蛋白隧道以电泳或以另外的方式转位分析物。

虽然已例证及描述例证性实施方式，需知，可对其进行各种变化而不离开本发明的精神和范围。

Claims (64)

1.对2个或更多用至少第1阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括：

（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；

（b)使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1单元；

（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；

（d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；以及

（e）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。

2.权利要求1的方法，其中修饰的分析物包含修饰的核酸，修饰的肽或修饰的蛋白。

3.权利要求2的方法，其中修饰的分析物包含修饰的核酸。

4.权利要求3的方法，其中修饰的核酸包含修饰的DNA，修饰的RNA，修饰的PNA或其组合。

5.权利要求1的方法，其中修饰的分析物包含使分析物与阻拦构建体接合的接头。

6.权利要求5的方法，其中修饰的分析物还被定义为包含使核酸与阻拦构建体接合的接头的修饰的核酸。

7.权利要求1的方法，其中修饰的分析物包含具有1MDa或更小分子量的无机部分。

8.权利要求1的方法，其中修饰的分析物包含具有1MDa或更小分子量的有机部分。

9.权利要求1的方法，其中至少一个阻拦构建体是插入物阻拦构建体。

10.权利要求9的方法，其中插入物阻拦构建体是双链核酸。

11.权利要求1的方法，其中至少一个阻拦构建体是悬吊物阻拦构建体。

12.权利要求1的方法，其中各阻拦构建体相同。

13.权利要求1的方法，其中2个或更多阻拦构建体不同。

14.权利要求1的方法，其中修饰的分析物包含转位起始尾。

15.权利要求1的方法，其中修饰的分析物是用至少2个各还被定义为双链DNA的插入物阻拦构建体修饰的ssDNA，且其中各单元是单核苷酸或重复核苷酸。

16.权利要求1的方法，其中

第1阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性，和

任选地与第1阻拦构建体连续的第2阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何单元-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。

17.权利要求16的方法，其中分隔物水平区别分析物的连续单元。

18.权利要求17的方法，其中分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。

19.权利要求16的方法，其中周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。

20.权利要求16的方法，其中至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。

21.权利要求20的方法，其中至少一个分隔物水平提供校验位。

22.权利要求1的方法，其中当对一个或更多修饰的分析物测序多次时测序保真度改善，以产生允许平均及共有读数的多个电流图案。

23.权利要求1的方法，其中电场的施加导致修饰的分析物进入开口。

24.权利要求1的方法，其中物理压力导致修饰的分析物进入开口。

25.权利要求1的方法，其中磁珠附接于反式侧上的修饰的分析物，及改变由导致修饰的分析物移动通过开口的磁力所导致。

26.权利要求1的方法，其中改变由电压脉冲，电压渐变，光脉冲，或机械力脉冲所导致。

27.权利要求1的方法，其中改变还被定义为阻拦构建体的解离。

28.权利要求1的方法，其中改变还被定义为阻拦构建体的构象变化。

29.权利要求1的方法，其还包括通过调整第1或第2导电液体介质的pH来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

30.权利要求1的方法，其还包括通过调整第1或第2导电液体介质的离子强度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

31.权利要求1的方法，其还包括通过调整第1或第2导电液体介质的离子类型来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

32.权利要求1的方法，其还包括通过调整第1或第2导电液体介质的温度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

33.权利要求1的方法，其还包括通过调整第1或第2导电液体介质的粘度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

34.权利要求1的方法，其还包括通过采用双链-结合剂来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。

35.权利要求1的方法，其还包括获得修饰的分析物。

36.权利要求1的方法，其中纳米孔包含固态材料。

37.权利要求36的方法，其中固态材料还被定义为氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合。

38.权利要求1的方法，其中纳米孔是在插入双层，膜，薄膜，或固态孔后形成隧道的蛋白。

39.权利要求1的方法，其中纳米孔包含在脂质双层中。

40.权利要求38的方法，其中纳米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。

41.权利要求38的方法，其中纳米孔是具有定义隧道的前庭和收缩区域的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白（Msp）孔蛋白。

42.权利要求41的方法，其中Msp孔蛋白是突变MspA孔蛋白。

43.权利要求42的方法，其中突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。

44.权利要求41的方法，其还包括随着其进入开口改变修饰的分析物速度或通过移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少一个氨基酸来改变测序灵敏度。

45.权利要求38的方法，其中纳米孔是α-溶血素或其变体。

46.权利要求45的方法，其还包括随着其进入开口改变修饰的分析物速度或通过移出，添加或取代α-溶血素或其变体的至少一个氨基酸来改变测序灵敏度。

47.对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括：

（a）提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=1～1,000,000，且其中各X和各n可相同或不同；

（b）将第1插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；

（c）提供在包含第1导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；

（d）使第1插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1Xn；

（e）改变第1插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；

（f）使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开口后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；以及

（g）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。

48.权利要求47的方法，其中

第1插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以允许离子电流水平测定核苷酸的同一性，和

任选地与第1插入物阻拦构建体连续的第2插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以产生不同于任何核苷酸-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。

49.权利要求48的方法，其中分隔物水平区别核酸的连续核苷酸。

50.权利要求49的方法，其中分隔物水平区别核酸的连续及重复的核苷酸。

51.权利要求48的方法，其中周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。

52.权利要求48的方法，其中至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。

53.权利要求48的方法，其中至少一个分隔物水平提供校验位。

54.将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括：

（a）提供在包含第1导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；

（b)使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第1已知的分析物单元；

（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；

（d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；以及

（e）用含有全部单元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，

由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。

55.减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开口转位的速度的方法，其包括：

（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔；

（b）使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；以及

（c）改变至少修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；

其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开口平均转位速度。

56.系统，其包含具有开口的纳米孔，其中纳米孔定位在第1导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少一个液体介质包含定义为修饰的核酸的修饰的分析物。

57.权利要求56的系统，其中修饰的核酸还被定义为修饰的DNA，且修饰的DNA的各阻拦构建体是含有相同的数的核苷酸的双链DNA，且各双链DNA相同。

58.权利要求56的系统，其中系统运作以使修饰的核酸的阻拦复合物在进入开口后解离。

59.权利要求56的系统，其中系统运作以对修饰的核酸进行测序。

60.权利要求56的系统，其中纳米孔包含在双层中。

61.权利要求56的系统，其中纳米孔还被定义为耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白（Msp）孔蛋白或α-溶血素或其变体。

62.权利要求56的系统，其还包含膜片钳放大器，光学膜片钳，数据获取装置，或一个或更多与第1液体介质，第2液体介质，或其任何组合交通的温度调控装置。

63.权利要求56的系统，其中功能性地重复系统组分以倍增测序通量。

64.权利要求56的系统，其中系统与微流体学或自动化适应。

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