WO2006018899A1 - 検出用器具を用いた検出方法 - Google Patents

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WO2006018899A1
WO2006018899A1 PCT/JP2004/012043 JP2004012043W WO2006018899A1 WO 2006018899 A1 WO2006018899 A1 WO 2006018899A1 JP 2004012043 W JP2004012043 W JP 2004012043W WO 2006018899 A1 WO2006018899 A1 WO 2006018899A1
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detection
substance
reaction solution
recess
reaction
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PCT/JP2004/012043
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English (en)
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Sachio Nomura
Masatoshi Kondo
Kazumi Kenmotsu
Makoto Nagano
Yukiko Sagehashi
Yoko Kimura
Toru Egashira
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Bml, Inc.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a biological detection method performed using a detection instrument having a fine structure.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • polymorphic markers 80 0 It is said that it is more than%.
  • expectations are high for the search for disease-related genes using this SNPs and the development of new drugs, that is, drug discovery.
  • microarray-like substrates are being provided for the purpose of improving the efficiency of various gene analyses, and by performing hybridization reactions on a very large number of nucleotide chains on a small chip. The functions of specific genes are being clarified. In this way, the use of a microarray-like substrate makes it possible to efficiently perform a hybridization reaction that requires a large number of combinations. Furthermore, compared to conventional methods, the amount of sample to be used can be significantly reduced. Can be small.
  • a microarray-like substrate currently used is a high-precipitation method in which a homogeneous solution derived from a sample is applied at once on a chip on which various probes and targets are arranged in a solid phase. Different sequences in different solutions at once It is an efficient analysis tool that can be analyzed.
  • a micro-dispensing machine that can dispense units is essential. (If the reaction reagent is only dispensed into a small number of recesses, it is possible to do it with a manual method. It is very difficult to handle).
  • An ink jet micro dispenser (such as Cartesian's synQUAD TM) can be used as the micro dispenser.
  • an ink jet type microdispensing machine is essential.
  • micro-dispensing machine when dispensing the same type of reagent in whole or over a wide area, a micro-dispensing machine has been essential until now. It is known that even insignificant factors can cause measurement errors in detection work using microarray-like substrates that require the use of such microdispensers. For example, when dispensing different types of specimens, etc. on a microarray-like substrate, a washing operation is performed before each different solution is aspirated in order to prevent mixing of different solutions in the nozzles and pipes of the dispenser. Takes time. The problem is that during this time, the volume difference due to evaporation increases between the first and last dispensed samples.
  • the specimens that were first dispensed into the recesses are dried, and then the same reaction solution is quickly dispensed together (second If this is done, the possibility of capacity change between the recesses can be greatly reduced.
  • second dispensing the dried specimen and the like after the first dispensing are dissolved and brought into contact with the reaction solution, and the desired detection reaction is started.
  • An object of the present invention is to provide a means for performing a liquid phase reaction in a detection instrument for performing a biological reaction, such as a microarray. Disclosure of the invention
  • the inventor of the present invention such as a microarray-like substrate in which minute concave portions are provided at a plurality of locations by subjecting a detection object such as a specimen to the first dispensing. It has been found that the above problem can be solved by adhering to the inner wall of the concave portion of the detection instrument and bringing the detection object into contact with the reaction solution in a short time.
  • the present invention attaches the detection target to the inner wall of the recess of the detection instrument having a plurality of recesses on the surface, and attaches the detection target to the reaction solution containing the reactive substance for the detection target.
  • a detection method using a detection instrument (hereinafter also referred to as the present detection method) that makes contact with the inner wall of the recessed portion of the detection instrument that has been detected, detects a signal generated by this contact, and evaluates the detection object. It is the invention which provides.
  • this detection method an embodiment in which a detection target and a specific substance are allowed to coexist on the inner wall of a minute recess can be mentioned.
  • the allowable operation time from the second dispensing to the detection is obtained. Can be extended to facilitate the detection of the desired biological response.
  • the present invention provides an inner wall of a recess of a detection instrument having a plurality of recesses on the surface,
  • a substance in which a phase change from solid to liquid is observed in the substance itself or in a mixture of the substance and a solvent at about 10 to 90 ° C together with the detection target (hereinafter also referred to as temperature responsive substance)
  • a substance that slowly dissolves in a solvent at room temperature (hereinafter also referred to as a slowly soluble substance) is allowed to coexist and adhere to the substance (1) and Z or (2) at the time of detection.
  • the temperature in the minute recesses is raised above the melting temperature of the fusible substance or lowered below the melting temperature
  • Poly (N-isopropyl acrylamide) has the property of solidifying with increasing temperature and liquefying with decreasing temperature. Therefore, when this is used as a temperature responsive substance, the temperature of the dispensing solution is lowered to the liquefaction temperature during the first dispensing, and the temperature of the recess is raised to the solidification temperature after the dispensing, while the second dispensing is performed. It is preferable to bring the reaction solution into contact by pouring and lower the temperature of the recess to the liquefaction temperature during detection]
  • the present invention is also an invention that provides a detection kit for carrying out the detection method (hereinafter also referred to as the detection kit).
  • FIG. 1 is a schematic view showing a detection substrate.
  • Fig. 2 shows the outline of the Invader Atsey method.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the detection substrate used in the examples.
  • Fig. 4 is a photograph showing a substrate surface image showing the results of the preliminary test of this detection method.
  • Fig. 5 is a photograph showing a substrate surface image that shows the usefulness of this detection method.
  • the detection target is attached to the inner wall of the concave portion of the detection instrument having a plurality of concave portions on the surface, and the reaction solution containing the reactive substance for the detection target is added to the detection solution.
  • the reaction solution containing the reactive substance for the detection target is added to the detection solution.
  • the “detection instrument having a plurality of recesses on the surface” means a detection instrument having a recess on the surface capable of performing a liquid phase reaction.
  • This detection instrument mainly means a microarray-like substrate, and its shape is mainly a substrate, but it is not necessarily limited to this shape.
  • FIG. 1 is a drawing showing an embodiment of a detection substrate suitable for use in the present detection method.
  • the detection substrate 10 can be manufactured by providing a large number (at least two or more) of the recesses 12 on the surface (only one side) 110 of the original substrate 11.
  • the volume of the recesses 12 should be freely selected according to the volume of the liquid phase required for detecting the liquid phase reaction performed in these recesses, and should not be particularly limited. That is, the concave portion 12 needs to have a volume that is moderately larger than the volume of the liquid phase necessary for detecting the liquid phase reaction. Specifically, the volume is preferably about 100 to 6800% with respect to the necessary volume of the liquid phase.
  • the volume of the required liquid phase is preferably smaller than ⁇ units.
  • Each volume of the part 12 is preferably about ⁇ or less, more preferably about 0.01 ⁇ or less.
  • a suitable minimum value of the volume of the recess 12 should be defined according to the measurement sensitivity of the liquid phase reaction and the technology for providing the recess 12.
  • the density per unit area of the recesses 12 in the detection substrate 10 is defined according to the size of each recess 12, the technology for providing the recesses 12, and the detection technology for the liquid phase reaction. Although it should be, and should not be particularly limited, in general, it is preferably about 1 to 400 000 Zcm 2 . In the case where the reaction performed on the detection substrate is an invader method, which will be described later, it is particularly preferably about 1 to 100 0 Zcm 2 . Invader's Atsy method is used for “low processing” [when the amount of DNA to be detected is small or the number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) to be detected is small, for example, Hundreds of individuals, for detection purposes
  • the reaction performed on the detection substrate is a low-density microarray method (for example, several hundred genes whose expression level is to be examined), or a liquid-phase reaction other than the low-density Invader's Atsy method (immune reaction).
  • Radioimmunoassay method, Homogeneous assay method, etc. (In the case of several types of detection target in each liquid phase reaction, etc.), particularly preferably 1 to 400 pieces / less than cm 2 .
  • the reaction performed on the detection substrate is not a high-density microarray method (for example, about several thousand to several tens of thousands of genes whose expression level is examined), or the above-described high-density Invader Atsey method.
  • liquid phase reactions in the case of several thousand to several tens of thousands of types of detection target in each liquid phase reaction
  • 4 0 0 to 4 0 00 0 0 Zcm 2 extremely Preferably,
  • the shape of the recess 12 is not particularly limited, and examples thereof include a hemispherical shape, a cylindrical shape having a hemispherical bottom, a cylindrical shape, a mortar shape, a conical shape, a pyramid shape, and a prismatic shape.
  • the size of the opening of the recess 12 is maintained such that the liquid phase can be easily injected. Specifically, a diameter of about 0.1 to 0.5 mm is preferable.
  • the material of the detection substrate 10 is not particularly limited as long as it has rigidity enough to withstand practical use. In particular, when the liquid phase reaction detection means is a detection means using fluorescence, the substrate is used. It is preferable that the material itself does not have autofluorescence in order to prevent the occurrence of pack ground at the time of measurement. Therefore, the detection substrate in such a case 1
  • zero materials include glass, ceramics, metal, and plastic.
  • plastics include thermoplastic resins.
  • olefin-based polymers such as propylene polymers (polypropylene, etc.), 4-methylenopentene 1-based polymers, etc .
  • Cycloolefin-based polymers such as ethylene nonolebonolene copolymers
  • metholenic methacrylate polymers isobonolinole methacrylate copolymers
  • acrylic polymers such as dipentapentanyl methacrylate copolymers
  • cyclohexylmalate-based polymers dimethylolitaconate-based polymers, cured butyl
  • thermoplastic resins examples include polyacetal resins, polycarbonates, polysulfones, aromatic polyester polyamides, polyurethanes, polyphenylene etheres, polyphenylene norides, polyimide resins, Examples include triacetyl cellulose.
  • thermosetting resins include unsaturated polyesters, epoxy resins (especially alicyclic epoxy resins), three-dimensional curable polyurethanes, unsaturated acrylic resins (including epoxy acrylate resins), melamine resins. And three-dimensional styrene resin, three-dimensional silicone resin, and aryl resin (diaryl phthalate resin, diethylene glycol diallyl carbonate resin, etc.).
  • surface treatment such as silicon treatment or fatty acid treatment can be performed on the detection substrate 10 made of glass or plastic according to a conventional method.
  • the silicon treatment is often suitable for preventing the detection substrate 10 from adsorbing the materials and reagents used for detection to the substrate surface.
  • Silicone treatment can be performed according to a conventional method. For example, by applying sol-gel method, etc., colloidal silica and other silicone raw materials are hydrolyzed. It is prepared by adding a curing catalyst, solvent, leveling agent, and UV absorber if necessary.
  • the silicone coating material can be applied by a conventional method, for example, preferably, a dip method, a vapor deposition method, a spray method, a roll coat method, a flow coat method, a spin coat method, or the like.
  • the detection substrate 10 can be colored to prevent, for example, autofluorescence when fluorescence is used for detection, or to prevent adverse effects caused by fluorescence emission between adjacent recesses.
  • coloring saturation, hue, lightness, etc. can be selected as necessary, but generally black is preferable.
  • black pigment such as carbon is mixed with the base material for coloring. It can be carried out.
  • the specific size and shape of the detection substrate 10 can be freely specified, and are not particularly limited. However, a design based on a standard widely used as a microarray is suitable as an actual usage mode. .
  • the detection substrate 10 is also designed to have a size and shape that match these standards. It is preferable. Specifically, it is preferable to use a plate-like shape in the vicinity of “length 26 mm ⁇ width 76 mm ⁇ thickness l mm”, which is the size of a slide glass normally used in Japan.
  • the detection substrate 1 is used in accordance with the microarray shape and size standards in the region where the detection substrate 10 is used (for example, the United States (vertical 1 inch x 3 inches wide), Europe, etc.). It is preferable to design a shape and size of zero. Alternatively, it should be suitable for dispensing and detection equipment. Microarray scanners that can analyze even a microtiter plate size have been sold, and that size can be used.
  • the manufacturing method of the detection substrate 10 is not particularly limited, but is usually manufactured by a method in which a concave portion is provided directly on a single substrate.
  • a thin film of a material such as vinyl chloride provided with a large number of through-holes corresponding to the recesses 12 is used as a mask, and is pasted on the surface of the substrate before processing.
  • Methods of forming recesses on the substrate surface by causing fine particles to collide with the substrate surface at high speeds embossing methods using molds with fine irregularities, die cutting methods, processing with fine drills, etc.
  • the detection substrate 10 provided with a large number of recesses 12 on the surface can be manufactured.
  • the die pressing method and the die cutting method are suitable when the material of the detection substrate 10 is plastic.
  • the detection substrate 10 can be manufactured.
  • the detection target is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is a target that can be detected by a liquid phase reaction.
  • a nucleic acid DNA and DNA or RNA to be analyzed
  • It may be double-stranded or single-stranded, and may have a specific three-dimensional structure such as a hairpin structure), polypeptide, antibody, bacterium, Viruses, various clinical specimens (blood specimens, urine specimens, lymph fluid specimens, synovial fluid specimens, saliva specimens, etc.) are not particularly limited.
  • the detection target is preferably contained in a dispensing solution (hereinafter also referred to as the first dispensing solution) in which the first dispensing is usually performed.
  • a dispensing solution hereinafter also referred to as the first dispensing solution
  • the first dispensing solution includes a stabilizer according to the type of detection object, Treatment agents, immobilizing agents, and the like can be included in the solution as necessary.
  • the content of the detection target in the first dispensing solution should be selected according to the type and purpose of the detection target and is not limited at all. At least, it should be more than the amount that can generate a detectable signal by contact with the reactant and less than the amount that noise can be seen.
  • the reaction solution can be appropriately selected according to the type of detection target to be used and the liquid phase reaction to be selected.
  • the liquid phase reaction carried out in the present invention is not particularly limited.
  • a catalytic reaction of a protein such as an enzyme reaction, an antigen-antibody reaction, an interaction between proteins, a specific affinity between substances (nucleotide strands) (Including high-pridition).
  • the detection of the liquid phase reaction can be performed by utilizing the means currently used in the microarray technology. Specifically, for example, the fluorescence in each small hole can be detected by using a highly sensitive fluorescence scanner on the substrate after the liquid phase reaction obtained by this detection method. In addition, detection by radioisotope, detection by EIA method, and homogenous detection such as AlphaScreen TM (manufactured by PerkinElmer (USA)) can be performed.
  • Fig. 2 is a schematic diagram of the overview of the Invader Atsey method.
  • the first nucleotide chain 2 2 is first hybridized with the cocoon-shaped nucleotide chain (wild type gene) 21.
  • the first nucleotide chain 22 is the base complementary to the mutation detection base [in this figure, the wild type is T (thymine)] in the vertical nucleotide chain 21 [in this figure, A (adenine) ] Is the nucleotide strand complementary to the ⁇ -type nucleotide strand 21 located at the 3 'end (in this example, the 3rd and base ends of the first nucleotide strand 2 2
  • the base may interfere with the association reaction between the target base of the mutation detection and the second nucleotide chain, thereby forming a partial tribasic structure.
  • the second nucleotide chain 23 is further hybridized to the partial double strand of the saddle-shaped nucleotide chain 21 and the first nucleotide chain 22.
  • the second nucleotide strand 2 3 is on the “complementary part” 2 3 1 3 ′ side, which is complementary to the saddle-shaped nucleotide strand 2 1, and is continuously provided with a detection element.
  • the “detection moiety” 2 3 2 that is non-complementary to the saddle-shaped nucleotide chain is the 5′-side complex nucleotide chain, and the “complementary part” 2 3 1's 5 ′ most base Is a base (A) that is complementary to the base to be detected (T).
  • the target nucleotide part (T) for the detection of mutation in the vertical nucleotide chain 21 is “complementary to the 3 ′ terminal base of the first nucleotide chain 22 2 and the second nucleotide chain.
  • a partial three-base overlap structure is formed with the most 5 ′ base (A) of “part 2” 2 3 1.
  • the nuclease 24 having an activity of specifically cleaving this partial three-base overlap structure on its 3 ′ side is allowed to act to detect the second nucleotide strand 23 3 cleaved by this nuclease.
  • 2 3 2 '[3' end is a base complementary to the mutation detection base (T) (A)] to detect the nucleotide chain 2 1 force wild type Can be detected.
  • a hairpin probe (nucleotide chain) 2 5, labeled with a fluorescent dye 2 5 1 near the end and a fluorescent quencher (Quencher 1) 2 5 2 near the 3 'end, is shown above.
  • the above wild-type can be detected by coexisting with the hybrid system.
  • the single-stranded part of the 3 ′ side of the hairpin probe 25 is designed to be complementary to the detection part 23 2 of the second nucleotide chain 23 and the most of the single-stranded part.
  • the 5′-side base adjacent to the 5′-side base is the mutation detection target base (T).
  • nuclease 2 4 acts again, and the hairpin probe 2 5 is cleaved between fluorescent dye 2 5 1 and fluorescent quenching substance 2 5 2, releasing fluorescent dye 2 5 1, and fluorescence quenching. It is released from the fluorescence quenching action of substance 2 5 2, and the original fluorescence can be detected. By detecting this fluorescence, it is possible to detect that the mirror-type nucleotide chain 21 is a wild-type gene in which no mutation is observed in the mutation detection target base.
  • the detection target base of the ⁇ -type nucleotide chain 21 is not a wild-type base (T) but an SNP base that is G (guanine), for example.
  • the complementary base is C (cytosine) complementary to G from the above A
  • the sequence of the detection portion 2 3 2 and the 25 sequence is set as a separate sequence, and the fluorescent dye 2 5 1 and the fluorescence quencher 2 5 2 in the hairpin probe 25 are combined with a fluorescent dye that emits fluorescence different from the above-mentioned system.
  • a fluorescence quencher for SNPs it is possible to detect SNPs in the cage nucleotide chain 21 by fluorescence of different fluorescent dyes.
  • nucleotide having a wild-type base and a mutant base when mixed (hetero-type), it can be detected positively as a mixed fluorescence of the above two types of fluorescence. It is.
  • the detection portion 2 3 2 is directly subjected to fluorescent labeling and isotope labeling for direct detection.
  • SNP s etc. can be detected by detecting the part.
  • labeling such as fluorescence It is also possible to perform negative detection where no is detected.
  • the Invader Atsey method described above is technically in the stage where a nuclease that specifically cleaves a partial trinucleotide overlap structure cuts out the “detection part” of the second nucleotide chain as the reaction proceeds (
  • a hairpin type probe When using a hairpin type probe, it works continuously even at the stage of separating the labeled fluorescent substance from the fluorescent quenching substance), so that the label used in the Invader'Azey method such as fluorescence is sensitized.
  • This is the most suitable liquid phase reaction when a small amount liquid phase reaction as in the present invention is performed.
  • this method is very useful as a method that can efficiently detect SNP s, which is the key to customized medicine. By applying the present invention to this method, it is easy and efficient. In particular, the industrial significance of detecting SNP s is enormous.
  • the above-described chain-type nucleotide chain 21 is a detection target to be contained in the first dispensing solution, and other detection elements of the above-described invader method A solution containing is selected as the reaction solution.
  • the first dispensing solution is dispensed into the minute recesses of the detection instrument and then dried, and the detection object is placed on the inner wall of the recess of the detection instrument having a plurality of recesses.
  • a reaction solution containing a reactive substance for the detection target is brought into contact with the inner wall of the recess of the detection instrument to which the detection target is attached, and a signal generated by this contact is detected and detected.
  • An object can be evaluated.
  • the process of sealing and detection work is started quickly from the second dispensing, and if it is not performed correctly, the content components leak from the respective recesses onto the surface of the detection instrument, and these Mixing them may adversely affect the evaluation of the detection object.
  • a specific substance that is, a temperature-responsive substance, and Z or a slowly-dissolving substance are allowed to coexist on the detection object and the inner wall of the recess, thereby detecting after the second dispensing. Even a normal engineer can secure enough time for the object to remain in the recess.
  • the temperature-responsive substance is not particularly limited, but it is 10 to 90 without any additives such as salts.
  • a substance that causes a phase change from a solid (gel) to a liquid in a temperature range of about 40 ° C., preferably about 40 to 70 ° C. is preferable.
  • Specific examples include gelatin, agar, DPPC (Dipalmitoyl phosphati dylcholine), poly (N-isopropyl acrylamide), poly ( ⁇ -force prolatathone), etc., and gelatin is particularly preferred. It is.
  • Examples of the slowly-dissolving substance include polyhydric alcohols, for example, polysaccharides such as dextran, syrup components such as maltose and trehalose, and polyethylene glycol and xylitol. Trehalose is particularly preferable. It is.
  • the temperature-responsive substance and the slow-dissolving substance are selected, usually the first dispensing It can be used by being contained in a solution.
  • the content of the retained substance in the first dispensing solution must be at least enough to retain the detection target in a dry, moisturized or swollen state.
  • the reaction solution is dispensed (second dispensing), and the retained substance swells or swells.
  • the amount of retained substance is not sufficient, It will not be completely retained in the retained substance and will be released.
  • the liberated detection object is not preferable because it can be immediately mixed into the adjacent recess when the recess communicates with the reaction solution.
  • the temperature-responsive substance is gelatin, it is preferably contained in the range of 0.05 to 2% by mass with respect to the first dispensing solution. 0.05 for the solution
  • the first dispensing solution is usually preferably prepared by adding the detection target to an aqueous solution of the retained substance in a liquefied (sol) state and dissolving it. It is not limited and other preparation methods may be used. In addition, the first dispensing solution can be prepared immediately before dispensing into the recess of the detection substrate, or can be prepared in advance several days to several hours before dispensing.
  • the storage period of the first dispensing solution is preferably selected according to the stability of the detection target. Also, at least during dispensing, the first dispensing solution needs to be liquid. Furthermore, after adding the detection target, it is not preferable to set the temperature at which the detection target denatures.
  • the liquid first dispensing solution can be used for each recess of the detection device described above, but preferably a microdispensing machine (inkjet type microdispensing machine, etc.)
  • the first dispensing solution in the recess is dried (preferably when the retention substance is a slowly soluble substance or when the retention substance is not used) or cooled (room temperature standing) (This is suitable when the holding substance is a temperature-responsive substance.)
  • After being attached to the concave portion of the detection device, etc. it contains a reactive substance for the object to be detected in the first dispensing solution.
  • the reaction solution is brought into contact with the inner wall of the recess where the first dispensing solution has been attached, and the temperature rises or falls.
  • the poly (N-isopropyl atalyl amide) described above solidifies as the temperature rises. It has the property of liquefying when the temperature drops. Therefore, when this is used as a temperature-responsive substance, during the first dispensing, the temperature of the dispensing solution is lowered to the liquefaction temperature, and after the dispensing, the temperature of the recess is increased to the solidification temperature. It is preferable to bring the recess into contact with the solution and lower the temperature of the recess to the liquefaction temperature at the time of detection.] The object to be detected is released by dissolving it by leaving it, and the signal generated is detected by detecting the generated signal. Evaluation can be made.
  • the reaction solution As a contact mode between the first dispensing solution attached to the wall surface of the recess and the reaction solution, the reaction solution is applied to the substrate surface after the first dispensing solution is attached. In this way, it is efficient and preferable to overlay the reaction solution.
  • This detection kit is a detection kit for carrying out this detection method, comprising the following a, b and c as constituent elements. a. Temperature responsive substance, and Z or slowly dissolving substance.
  • reaction solution or solute of reaction solution b.
  • a detection device having a plurality of recesses.
  • the collected detection object is added to a mixture of a temperature-responsive substance and Z or a slowly-dissolving substance (holding substance) and a solvent such as water.
  • a solvent such as water.
  • Prepare the first dispensing solution dispense the first dispensing solution into the recess of the detection substrate attached to the kit, solidify it, and follow the procedure for this detection method described above to attach the attached reaction solution.
  • the detection reaction can be performed and the detection target can be evaluated.
  • This detection kit should contain other necessary elements, such as the solvent used for dissolving the above-mentioned retention substances (purified water, 2-propanol, etc.), the preservative for the detection target, and the stabilizer. Is possible.
  • the detection target is a nucleic acid
  • the reaction solution is a solution that can perform an invader reaction on the nucleic acid.
  • a detection substrate used in the present invention was prepared.
  • the outline is shown in Fig. 3.
  • the detection substrate shown in FIG. 3 is a slide made of polycarbonate and composed of high-density recesses.
  • This detection board has 5040 openings of 0.45x0.45 mm (mm) and 0.45 mm depth on a 22x76 x 1 size plastic slide.
  • the area of the entire upper surface of the recess is 21 X 60 (mm), and the capacity of one recess is 44-nl.
  • the upper part is cut with a 0.05 mm partition between the recesses.
  • the dispensing object was dispensed into each recess using an inkjet microdispensing machine (Cartesian's synQUAD TM).
  • the stained shape was different depending on the concentration of gelatin mixed with DNA. That is, in the recess where the DNA did not dissolve into the solution from the inner wall surface of the recess, the DNA stuck to the inner wall surface of the recess was stained in an angular donut shape (with a gelatin concentration of 0.05% or more). In addition, the DNA was dissolved in the recesses with a concentration of 0.025% or less, and a fluorescence signal was observed in the recesses other than the inner wall, and a fluorescence signal was also observed in the recesses adjacent to the dispensing recesses.
  • the fluorescent scanner is ScanArray5000 (currently
  • reaction solution can be dispensed with genomic DNA mixed with gelatin at a concentration of 0.05% or more without affecting the adjacent recesses.
  • the detection method using this detection method requires special equipment. Therefore, it is not necessary to finely adjust the position of the discharge outlet tip for each recess when dispensing, and the dispensing volume is a method that fills the entire volume of the recess, so there is little error and it should be a quick, simple, and inexpensive method. There was found. Industrial applicability

Abstract

　表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を、好適には、特定の保持物質と共存させて付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行う、検出用器具を用いた検出方法である。この方法において、サンプルが、微小な凹部同士の間で混合することなく、また、気泡が、同凹部内に形成され難く、効率的に、マイクロアレイ等の、生物学的な反応を行うための検出器具における液相反応を行うことができる。

Description

明細書 検出用器具を用いた検出方法 技術分野
本発明は、 特に、 微細構造を有する検出用器具を用いて行う、 生物学的な検出 方法に関する発明である。 背景技術
2 0世紀における、 医学 ·生物学分野における、 最も輝かしい成果の一つとし て、 ヒ ト ·ゲノム一次構造の解読が挙げられる。
このゲノム解析の成果は、 多くの産業分野において活用され、 飛躍的な発展が なされることが期待されている。
ヒ ト ·ゲノムの中には、 様々な多型マーカーとなるものが認められ、 その中で も、 一塩基多型 (Single Nucleotide Polymorphisms ： S N P s ) 、 最も多く 存在し、 多型マーカーの 8 0 %以上であるともいわれている。 現在、 この S N P sを活用した、 疾患関連遺伝子の採索や、 これに続く新薬の開発、 すなわち、 ゲ ノム創薬に期待が高まっている。
また、 個人のレベルで見れば、 体質の把握等に、 S N P sの検出を応用するこ とも期待され、 いわゆる、 オーダーメード医療への途が開かれようとしている。 現在、 種々の遺伝子解析の効率化を目的とした、 いわゆるマイクロアレイ様基 板が提供されており、 微小なチップ上で、 非常に数多ぐのヌクレオチド鎖に対す るハイブリダイズ反応等を行うことにより、 特定の遺伝子の機能等が明らかにさ れつつある。 このように、 マイクロアレイ様基板を用いることにより、 数多くの 組み合わせが必要なハイプリダイズ反応を、 効率良く行うことが可能となり、 さ らに、 従来の方法に比べて、 用いる試料の量を、 格段に少量にすることができる。 現在用いられているマイクロアレイ様基板は、 基板上に、 多種のプローブゃタ ーゲットを固相配置したチップ上で、 サンプル由来の均一な溶液を一度にかけて、 ハイプリダイゼーシヨンを行うもので、 その均一な溶液中の異なる配列を一度で 解析可能な、 効率的な解析手段である。
個々の凹部において液相反応を行うことが可能な、 高密度の極めて小さい凹部 が基板表面に集約したマイクロアレイ様基板を使用するにあたっては、 マイクロ メートル （/ m) 単位の精度で、 ナノリットル （nl) 単位の分注が可能な微量分 注機が必須のものとなる （少数の凹部へ反応試薬を分注するだけなら用手法で行 うことも可能であるが、 多数の凹部を用手法で処理することは非常に困難である ) 。 微量分注機には、 インクジヱット型の微量分注機 （Cartesian社の synQUAD™ 等） が使用可能である。 特に、 個々の反応容器に別々の種類の試薬を分注する際 には、 インクジェット型の微量分注機は必須となる。 また、 同一種類の試薬を全 面もしくは広範囲に分注する場合にも、 これまでは微量分注機が必須であった。 このような微量分注機を用いることが必要なマイクロアレイ様基板を用いる検 出作業にあたっては、 非常に些細な要因でも、 測定誤差の原因となってしまうこ とが知られている。 例えば、 マイクロアレイ様基板上に、 種類の異なる検体等を 分注するにあたっては、 分注機のノズルや配管内において、 異なる溶液の混入を 防ぐために、 各々の異なる溶液を吸引する前に、 洗浄操作が入り時間がかかる。 この時間の間に最初の分注サンプルと最後の分注サンプルでは蒸発による容量差 が大きくなつてしまうことが問題となる。
この問題を解決する方法としては、 最初に凹部内に分注 （第 1の分注） した検 体等を乾燥させ、 その上から、 同一の反応溶液をまとめて迅速に分注 （第 2の分 注） するようにすれば、 凹部間の容量変化の可能性を大きく減らすことができる。 この第 2の分注により、 第 1の分注後に乾燥した検体等が溶け出して反応液と接 触して、 所望する検出反応が開始することとなる。
この場合、 第 2の分注後の乾燥を防ぐために、 例えば、 蒸発防止のシールを、 微小凹部群上において行うこととなるが、 この場合、 微小凹部間の溶液の接触に よる混合がなくなるよう、 シールを基板面に密着させる必要がある。
問題は、 このシールの際に、 シールと各々の微小凹部内の液相反応系の間に気 泡が入り、 これが検出誤差となってしまう場合があることである。 例えば、 気泡 が全く入らないように、 微小な凹部の容量一杯に分注すれば、 隣接している微小 凹部の反応液同士が凹部から溢れて接触して混合する可能性が強くなる。 さらに、 この場合においても、 なお、 気泡が微小凹部内に残ってしまう可能性も強い。 そこで、 本発明が解決すべき課題は、 第 1の分注後に、 サンプルが、 微小な凹 部同士の間で混合することなく、 また、 気泡が、 同凹部内に形成され難く、 効率 的に、 マイクロアレイ等の、 生物学的な反応を行うための検出器具における液相 反応を行う手段を提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 検体等の検 出対象物を、 第 1の分注により、 微小な凹部を複数箇所に設けたマイクロアレイ 様基板等の検出器具の凹部の内壁に付着させ、 短時間のうちに、 検出対象物と反 応溶液を接触させることで、 上記の課題を解決し得ることを見出した。
すなわち、 本発明は、 表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、 検出対象物を付着させ、 この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、 前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、 この接触に より発生するシグナルを検出して、 検出対象物の評価を行う、 検出用器具を用い た検出方法 （以下、 本検出方法ともいう） を提供する発明である。
本検出方法の好適な態様として、 検出対象物と、 特定の物質を、 微小凹部の内 壁において共存させる態様を挙げることができる。 この態様においては、 内壁と 反応溶液の接触から、 内壁に付着した検出対象物と反応溶液が直接的に接触する までの時間を稼ぐことにより、 第 2の分注から検出までの操作の許容時間を延長 させ、 所望する生物学的反応の検出作業を容易化することが可能である。
すなわち、 本発明は、 表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、
( 1 ) 検出対象物と共に、 1 0〜9 0 °C程度で固体から液体への相変化が、 その 物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質 （以下、 温度 応答性物質ともいう） 、 およびノまたは、 （2 ) 室温で緩徐に溶媒中に溶解する 物質 （以下、 徐溶解性物質ともいう） 、 を共存させて付着させ、 検出時に前記の 物質 （1 ) および Zまたは （2 ) を、 反応溶液内で溶解させる態様の、 本検出方 法を提供する発明である。
本検出方法においては、 好適には、 第 2の分注後に、 微小凹部の上からシール を行い、 （1 ) 温度応答性物質を検出対象物と共存させる場合には、 微小凹部内 の温度を、 当該溶融性物質の溶融温度以上に上昇、 または、 溶融温度以下に下降 させ [後述するポリ （N-イソプロピルアクリルアミ ド） は、 温度上昇により固 ィ匕し、 温度下降により液化する性質がある。 よって、 これを温度応答物質として 用いる場合には、 第 1の分注時には液化温度まで分注溶液の温度を下げて、 当該 分注後に固化温度まで凹部の温度を上昇させつつ、 第 2の分注により反応溶液を 接触させ、 検出時に液化温度まで凹部の温度を下降させることが好適である] 、
( 2 ) 徐溶解性物質を共存させる場合には、 室温で放置をするが、 器具の微小凹 部面上には、 反応溶液が上層された状態になるので、 上記シールを行っても、 シ ール内に気泡が入りにくく、 かつ、 反応溶液を媒介して、 他の検出対象物同士が 接触して、 謝った結果をもたらしたり、 検出感度が低下するリスクを回避するこ とが可能となり、 簡単な操作で、 精度良く、 マイクロアレイ様基板上等における 液相反応を行うことができる。
また、 本発明は、 本検出方法を行うための検出用キット （以下、 本検出用キッ トともいう） を提供する発明でもある。 図面の簡単な説明
第 1図は、 検出用基板についての概略を示した図面である。
. 第 2図は、 インベーダー .アツセィ法の概略を示した図面である。
第 3図は、 実施例で用いた検出用基板についての概略を示した図面である。 第 4図は、 本検出方法の予備試験の結果を表す、 基板面像を示した写真である。 第 5図は、 本検出方法の有用性を表す、 基板面像を示した写真である。 発明を実施するための最良の形態
A . 本検出方法
本検出方法は、 上述したように、 表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部 の内壁に、 検出対象物を付着させ、 この検出対象物に対する反応物質を含有する 反応溶液を、 前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、 この接触により発生するシグナルを検出して、 検出対象物の評価を行う、 検出用 器具を用いた検出方法である。
(1)検出用器具
ここで、 「表面に複数の凹部を有する検出用器具」 とは、 液相反応を行うこと が可能な凹部を表面に有する検出用器具を意味するものである。 この検出用器具 は、 主としてマイクロアレイ様基板を意味するものであり、 形状は主に基板状で あるが、 必ずしもこの形状に限定されるものではない。
第 1図は、 本検出方法において用いることが好適な検出用基板の一実施態様を 表した図面である。 検出用基板 1 0は、 原基板 1 1の表面 （片面のみ） 1 1 0上 に、 凹部 1 2を、 多数 （少なくとも 2個以上） 設けることにより製造され得る。 凹部 1 2の容積は、 これらの凹部において行う、 液相反応の検出に必要な液相 のポリュームに応じて自由に選択されるべきものであり、 特に限定されるべきも のではない。 すなわち、 凹部 1 2は、 液相反応の検出に必要な液相のボリューム よりも、 適度に大きな容積であることが必要である。 具体的には、 この必要な液 相のボリユームに対して、 1 0 0 〜 6 8 0 0 %程度の容積であることが好適であ る。
検出用基板 1 0は、 本来、 必要な液相のボリュームが、 ； ΐ 単位より小さいこ とが好適な、 液相反応の検出を、 各々の凹部 1 2において行うための基板である から、 回部 1 2の、 各々の容積は、 好適には Ι μ ΐ 以下、 さらに好適には、 0 . 0 1 ΐ 以下程度である。 この凹部 1 2の容積の好適な最低値は、 液相反応の測 定感度と、 凹部 1 2を設ける技術に応じて規定されるべきものである。
また、 検出用基板 1 0における、 凹部 1 2の、 基板単位面積当りの存在密度は、 各々の凹部 1 2の大きさ、 凹部 1 2を設ける技術、 液相反応の検出技術に応じて 規定されるべきものであり、 特に限定されるべきものではないが、 概ね、 好適に は、 1 〜 4 0 0 0 0個 Zcm2程度である。 検出用基板において行われる反応が、 後述するインベーダー 'アツセィ法である場合、 特に好適には、 1 〜 1 0 0 0 0 個 Zcm2程度である。 また、 インベーダー 'アツセィ法を、 「低処理向け」 〔検 出対象となる D N Aの量が少ない場合や、 検出目的となる一塩基多型 （S N P ) の数が少ない場合、 例えば、 検出対象となる個人数が数百人で、 検出目的となる
S N Pが、 数個程度である場合等〕 として分類される態様で行う場合、 極めて好 適には、 1〜4 0 0個 /cm2未満であり、 「高処理向け」 〔検出目的となる一塩 基多型 （S N P ) の数が多い （例えば、 数万個以上） 場合〕 として分類される態 様で行う場合、 極めて好適には、 4 0 0〜1 0 0 0 0個 Zcm2程度である。 また、 検出用基板において行われる反応が、 低密度のマイクロアレイ法 （例えば、 発現 量を調べるべき遺伝子が数百個程度） 、 または、 低密度のインベーダー 'アツセ ィ法以外の液相反応 （免疫反応、 ラジオィムノアッセィ法、 ホモジーニアスアツ セィ法等） （各々の液相反応において、 検出対象の種類が数個の場合等） である 場合、 特に好適には、 1〜4 0 0個 /cm2 未満である。 さらに、 検出用基板にお いて行われる反応が、 高密度のマイクロアレイ法 （例えば、 発現量を調べる遺伝 子が数千〜数万個程度） 、 または、 高密度の上記のインベーダー ·アツセィ法以 外の液相反応 （各々の液相反応において、 検出対象の種類が数千〜数万個の場合 等） である場合、 特に好適には、 4 0 0〜 4 0 0 0 0個 Zcm2 、 極めて好適には、
4 0 0〜： 1 0 0 0 0個 Zcm2 である。
また、 凹部 1 2の形状は、 特に限定されず、 例えば、 半球面状、 底が半球面状 の円筒状、 円筒状、 すり鉢状、 円錐状、 角錐状、 角柱状等が挙げられる。 また、 凹部 1 2の開口部の大きさは、 液相を容易に注入可能な大きさが保たれているこ とが好適である。 具体的には、 0 . 0 1〜0 . 5 mm程度 （直径） が好適である。 検出用基板 1 0の素材は、 実用に耐えられる程度の剛性を有していれば特に限 定されないが、 特に、 液相反応の検出手段が、 蛍光を用いる検出手段である場合 には、 基板自体が自家蛍光を有さない素材であることが、 計測時のパックグラウ ンドの発生を防御する上で好適である。 よって、 このような場合の検出用基板 1
0の素材は、 ガラス、 セラミックス、 金属、 プラスチック等が挙げられる。
プラスチックとしては、 熱可塑性樹脂の例を挙げると、 まず、 主鎖が殆ど炭素 からなるポリマーとして、 プロピレン.系ポリマー （ポリプロピレン等） 、 4ーメ チノレペンテン 1系ポリマー等のォレフィン系ポリマー； ノノレポノレネン系ポリマー (エチレンノノレボノレネンコポリマー等） のシクロォレフィン系ポリマー； メチノレ メタタリレート系ポリマー、 イソボノレニノレメタクリレートのコポリマー、 ジシク 口ペンタニルメタクリル系コポリマー等のァクリル系ポリマー；非結晶のスチレ ン系ポリマー、 シンジオタクチックスチレン系ポリマー、 パラ t—ブチノレスチレ ン系ポリマー、 ァノレファメチルスチレンーメチノレメタクリ レートコポリマー、 A B S樹脂等のスチレン系ポリマー；シクロへキシルマレート系ポリマー、 ジメチ ルイタコネート系ポリマー、 硬化塩化ビュル樹脂、 フッ素系ポリマー （ビニリデ ンフルオライ ド系ポリマー、 テトラフルォロエチレン系ポリマー等） のその他の ビュル系ポリマー等を挙げることができる。
また、 熱可塑性樹脂のうち、 主鎖の骨格にヘテロ原子を含むポリマーとして、 ポリアセタール樹脂、 ポリカーボネート、 ポリスルフォン、 芳香族ポリエステル ポリアミ ド、 ポリ ウレタン、 ポリフエ二レンエーテノレ、 ポリフエ二レンスノレフィ ド、 ポリイミ ド樹脂、 トリアセリルセルロース等が挙げられる。
さらに、 熱硬化性樹脂の例としては、 不飽和ポリエステル、 エポキシ樹脂 （特 に、 脂環族エポキシ樹脂） 、 三次元硬化型ポリウレタン、 不飽和アクリル樹脂 （ エポキシァクリレート樹脂を含む） 、 メラミン樹脂、 三次元化スチレン樹脂、 三 次元化シリ コーン樹脂、 ァリル樹脂 （ジァリルフタレート樹脂、 ジエチレングリ コールジァリルカーボネート樹脂等） 等が挙げられる。
また、 必要に応じて、 ガラスやプラスチック製の検出用基板 1 0において、 シ リコーン処理、 脂肪酸処理等の表面処理を、 常法に従い行うことができる。 特に. シリ コーン処理は、 検出用基板 1 0における、 検出に用いる材料、 試薬等の基板 表面への吸着を防御するために好適である場合が多い。
シリコーン処理は、 常法に従い行うことができる。 例えば、 ゾル ·ゲル法等を 応用することにより、 コロイダルシリカ、 その他のシリコーン原料を加水分解し. 硬化触媒、 溶剤、 レべリング剤、 必要に応じて紫外線吸収剤等を添加して調製さ れるシリコーンコート材を、 常法、 例えば、 好適には、 ディップ法や蒸着法、 そ の他、 スプレー法、 ロールコート法、 フローコート法、 スピンコート法等により 行うことができる。
また、 検出用基板 1 0に、 着色を施して、 例えば、 検出に蛍光を用いる場合の 自家蛍光を防御したり、'隣接した凹部同士の蛍光発光による悪影響を防御するこ とが可能である。 かかる着色は、 必要に応じて、 彩度、 色相、 明度等を選択可能 であるが、 概ね、 黒色であることが好ましく、 この場合、 炭素等の黒色顔料を基 板材料に混合して着色を行うことができる。 検出用基板 1 0の具体的な大きさと形状は、 自由に規格可能であり、 特に限定 されないが、 マイクロアレイとして汎用されている規格に基づいた設計であるこ とが、 現実の使用態様として好適である。 すなわち、 各種のマイクロアレイ解析 機器、 解析ソフトや関連する分注機等が、 かかる規格に合わせて設計されており、 検出用基板 1 0も、 このような規格に合致させた大きさと形状に設計することが 好適である。 具体的には、 日本国で、 通常用いられているスライドガラスのサイ ズである、 「縦 2 6 mm X横 7 6 mmX厚さ l mm」 近傍の板状形状とすることが好適 である。 これと同様に、 検出用基板 1 0を用いる地域 〔例えば、 米国 （縦 1イン チ X横 3インチ程度） やヨーロッパ等〕 のマイクロアレイの形状と大きさの規格 に対応させて、 検出用基板 1 0の形状と大きさの設計を行うことが好適である。 もしくは分注、 検出用機器に適合した大きさであることが望ましい。 マイクロタ イタ一プレートサイズでも解析可能なマイクロアレイスキャナーが販売されてき ており、 そのサイズでもかまわない。
検出用基板 1 0の製造方法は、 特に限定されないが、 通常、 単一の基板上に、 直接、 凹部を設ける方法により製造される。
この製造方法では、 例えば、 凹部 1 2に対応する多数の貫通口を設けた、 塩化 ビニル等の素材の薄膜をマスクとして、 加工前の基板の表面上に貼り、 その上か ら、 サンドプラスト法 （微細粒子を高速で基板表面に衝突させることによって、 基板表面に凹部を形成する方法） 、 微細な凹凸を設けた型を用いる型押し法や型 抜き法、 微細なドリルによる加工等の、 微細凹部形成法により、 表面上に、 多数 の凹部 1 2が設けられた、 検出用基板 1 0を製造することができる。
また、 型押し法や型抜き法は、 検出用基板 1 0の素材がプラスチックである場 合に好適である。
このようにして、 検出用基板 1 0を製造することができる。
(2)検出対象物
検出対象物は、 特に限定されず、 液相反応で検出可能な対象物であれば、 特に 限定されない、 具体的には、 例えば、 遺伝子解析を行う対象となる核酸 （D N A およぴノまたは R N A、 2本鎖であっても 1本鎖であっても良い。 また、 ヘアピ ン構造等の特定の立体構造を有していてもよい） 、 ポリペプチド、 抗体、 細菌、 ウィルス、 各種の臨床検体 （血液検体、 尿検体、 リンパ液検体、 滑液検体、 唾液 検体等） 等、 特に限定されない。
検出対象物は、 通常、 第 1の分注を行う、 分注溶液 （以下、 第 1の分注溶液と もいう） 中に含有させることが好適である
また、 第 1の分注溶液には、 水、 2 -プロパノール （後述する D P P Cの溶媒と して好適である） 、 イソプロピルアルコール等の溶媒の他に、 検出対象物の種類 に応じた安定剤、 処理剤、 固定化剤等を、 必要に応じて、 当該溶液中に含有させ ることができる。
また、 第 1の分注溶液における検出対象物の含有量は、 検出対象物の種類、 目 的等に応じて選択されるべきもので、 全く限定されるものではない。 少なくとも、 反応物質との接触により、 検出可能な程度のシグナルを発生可能な程度より多く、 かつ、 ノイズが認められるほどの量より少ないことが必要である。
(3)反応溶液等
反応溶液は、 用いる検出対象物の種類と、 選択する液相反応に応じて適宜選択 することができる。
本発明において行われる液相反応は、 特に限定されず、 例えば、 酵素反応のよ うな蛋白質の触媒反応、 抗原抗体反応、 蛋白質間の相互作用、 物質間の特異的な ァフィ二ティー （ヌクレオチド鎖同士のハイプリダイゼーシヨンを含む） 等が挙 げられる。
液相反応の検出は、 現在、 マイクロアレイ技術で用いている手段を利用するこ とにより行うことができる。 具体的には、 例えば、 本検出方法により得られた液 相反応後の基板を、 高感度な蛍光スキャナーを用いることにより、 各小孔におけ る蛍光を検出することができる。 また、 ラジオアイソトープによる検出、 E I A 法による検出、 AlphaScreen™ 〔PerkinElmer社 （米国） 製〕 のようなホモジー 二ァスな検出等も行うことができる。
上述したように、 本使用方法において行われる液相反応の最も好適な態様の一 つとして、 いわゆる、 インベーダー 'アツセィ法 [Third Wave Technologies 社 (米国） 〕 が挙げられる。
第 2図は、 このインベーダー ·アツセィ法のあらましを略図化した図面である。 第 2図において、 鎵型ヌクレオチド鎖 （野生型遺伝子） 2 1に対して、 まず、 第 1のヌクレオチド鎖 2 2をハイブリダイズさせる。
第 1のヌクレオチド鎖 2 2は、 錶型ヌクレオチド鎖 2 1における、 変異検出対 象塩基 〔本図では、 野生型が T (チミン） 〕 に相補的な塩基 〔本図では、 A (ァ デニン） 〕 が 3 ' 末端に位置する、 鎳型ヌクレオチド鎖 2 1に対して相補的なヌ クレオチド鎖である （なお、 この例では、 第 1のヌクレオチド鎖 2 2の 3， 末端 の塩基は、 変異検出対象塩基に対して相補的ではないが、 その塩基が、 変異検出 対象塩基と第 2のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、 部分的三塩 基重複構造が形成され得る） 。
次いで、 この铸型ヌクレオチド鎖 2 1と第 1のヌクレオチド鎖 2 2との部分的 2本鎖に対して、 さらに、 第 2のヌクレオチド鎖 2 3をハイブリダイズさせる。 第 2のヌクレオチド鎖 2 3は、 錶型ヌクレオチド鎖 2 1に対して相捕的な 「相 補的部分」 2 3 1カ 3 ' 側にあり、 これと連続して、 検出要素が設けられた、 錶型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な 「検出用部分」 2 3 2が、 5 ' 側にある、 複合的ヌクレオチド鎖であり、 「相補的部分」 2 3 1の最も 5 ' 側の塩基は、 変 異検出対象塩基 （T ) に対して相補的な塩基 （A) となっている。
この第 2のハイプリダイズ反応によって、 鍚型ヌクレオチド鎖 2 1の変異検出 対象塩基部分 （T ) は、 第 1のヌクレオチド鎖 2 2の 3 ' 末端塩基と、 第 2のヌ クレオチド鎖の 「相補的部分」 2 3 1の最も 5 ' 側の塩基 （A) との、 部分的三 塩基重複構造が形成されることとなる。
次いで、 この部分的三塩基重複構造を、 その 3 ' 側で特異的に切断する活性を 有するヌクレアーゼ 2 4を作用させて、 このヌクレアーゼにより切断された、 第 2のヌクレオチド鎖 2 3の検出用部分 2 3 2 ' 〔 3 ' 末端が、 変異検出対象塩基 ( T ) に対して相補的塩基 （A) となっている〕 を検出することにより、 鍚型ヌ クレオチド鎖 2 1力 野生型であることを検出することができる。
本図においては、 5， 末端近傍に蛍光色素 2 5 1とその 3 ' 側の近傍に蛍光消 光物質 （クェンチヤ一） 2 5 2を標識した、 ヘアピン型プローブ （ヌクレオチド 鎖） 2 5を、 上記のハイブリダィズ系と共存させることにより、 上記の野生型の 検出が可能である。 ヘアピン型プローブ 2 5の 3 ' 側の一本鎖部分は、 第 2のヌクレオチド鎖 2 3 の検出用部分 2 3 2に対して相補的に設計されており、 かつ、 かかる一本鎖部分 の最も 5 ' 側の塩基に隣合うさらに 5 ' 側の一塩基は、 変異検出対象塩基 （T ) となっている。 そして、 検出用部分 2 3 2， 力 ヘアピン型プロープ 2 5の一本 鎖部分とハイブリダィズすると、 検出用部分 2 3 2 ' の 3， 末端の塩基 （A) 力 ヘアピン型プローブ 2 5の二本鎖部分の先端において、 再び、 部分的三塩基重複 構造を形成する。 これに対し、 再度、 ヌクレアーゼ 2 4が作用して、 ヘアピン型 プローブ 2 5における、 蛍光色素 2 5 1と蛍光消光物質 2 5 2の間が切断され、 蛍光色素 2 5 1が遊離し、 蛍光消光物質 2 5 2による蛍光消光作用から開放され て、 本来の蛍光が検出可能な状態となる。 この蛍光を検出することにより、 鏡型 ヌクレオチド鎖 2 1が、 変異検出対象塩基において変異が認められない野生型遺 伝子であることを検出することができる。
これに対して、 铸型ヌクレオチド鎖 2 1の変異検出対象塩基が、 野生型の塩基 ( T ) ではなく、 例えば、 G (グァニン） である S N P塩基であり、 これをポジ ティブに検出する場合には、 第 1のヌクレオチド鎖 2 2と第 2のヌクレオチド鎖 2 3における、 相補的塩基を、 上記の Aから、 Gに相補的な C (シトシン） とし て、 検出用部分 2 3 2の配列とそれに対する 2 5の配列を別配列のセットにし、 さらに、 ヘアピン型プローブ 2 5における蛍光色素 2 5 1と蛍光消光物質 2 5 2 を、 上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、 これに対する蛍光消光物質 とすることにより、 鎵型ヌクレオチド鎖 2 1における S N P sを、 異なる蛍光色 素の蛍光によって検出することが可能である。
また、 錶型ヌクレオチド 2 1力 野生型塩基と変異型塩基を有するものが、 混 在する場合 （ヘテロ型） は、 上記の 2種類の蛍光の混合型蛍光として、 ポジティ ブに検出することも可能である。
なお、 ここには、 ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、 こ れ以外にも、 例えば、 検出用部分 2 3 2に、 直接、 蛍光標識ゃァイソトープ標識 を行って、 直接、 検出用部分を検出することにより、 S N P s等を検出すること も可能である。 さらに、 ここでは、 S N P sを有する場合も、 そうでない場合も、 ポジティブに検出する例を示したが、 いずれかの場合においては、 蛍光等の標識 が検出されない、 ネガティブな検出を行うことも可能である。
上述したインベーダー ·アツセィ法は、 技術的には、 反応の進行に伴い、 部分 的三塩基重複構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、 第 2のヌクレオチド鎖の 「検出用部分」 を切り出す段階において （ヘアピン型プローブを用いる場合には、 標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても） 、 連続的に働く ため、 蛍光等の、 インベーダー 'アツセィ法において用いる標識が増感される、 極めて鋭敏な液相反応であり、 本発明のような微量液相反応を行う場合において は、 最も好適な液相反応である。 また、 この方法は、 オーダーメード医療の鍵と なる S N P sを効率良く検出可能な方法として、 非常に有用であり、 このアツセ ィ法に、 本発明を適用することにより、 平易かつ効率的 ·網羅的に、 S N P sを 検出することの、 産業上における意義は、 非常に大きい。
本使用方法において、 インベーダー法を検出手段として用いる場合には、 上記 の鎖型ヌクレオチド鎖 2 1が、 第 1の分注溶液に含有させる検出対象物であり、 上述したインベーダー法の他の検出要素を含有する溶液が、 反応溶液として選択 される。
上述したように、 第 1の分注溶液を、 検出器具の微小凹部に分注後、 乾燥させ て、 検出対象物を、 複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、 検出対象物 を付着させ、 この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、 前記の検 出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、 この接触により発生 するシグナルを検出して、 検出対象物の評価を行うことができる。 しかしながら、 この場合、 第 2の分注からシール、 検出作業の行程を急いで、 しかも、 正確に行 わないと、 各々の凹部から、 内容成分が検出器具の表面上に漏れだして、 これら が混ざり合って、 検出対象物の評価に悪影響を及ぼすことも考えられる。
そこで、 本発明においては、 特定の物質、 すなわち、 温度応答性物質、 および Zまたは、 徐溶解性物質を、 検出対象物と凹部の内壁において共存させることに より、 第 2の分注後、 検出対象物が凹部内に止まる時間を、 通常の技術者におい ても十分に確保することが可能になる。
(4)温度応答性物質と徐溶解性物質
温度応答性物質は、 特に限定されないが、 塩類等の添加剤なしに、 1 0〜9 0 °C程度、 好適には、 4 0〜7 0 °C程度の温度領域で、 固体 （ゲル） から液体への相 変化をもたらす物質であることが好適である。 具体的には、 ゼラチン、 寒天、 DPPC (Dipalmitoyl phosphati dylchol ine) 、 ポリ （N-イソプロピルアクリルァ ミ ド） 、 ポリ （ε -力プロラタ トン） 等を挙げることができるが、 特に、 ゼラチ ンが好適である。
また、 徐溶解性物質としては、 多価アルコール全般、 例えば、 デキストランな どの多糖や、 マルトース、 トレハロースなどの水飴成分、 さらには、 ポリエチレ ングリコール、 キシリ トール等があげられるが、 特に、 トレハロースが好適であ る。
温度応答性物質と徐溶解性物質 （これらを併せて、 保持物質ともいう） は、 そ れぞれ、 または、 共に、 1種または 2種以上を選択して、 通常は、 第 1の分注溶 液中に含有させて用いることができる。
保持物質の、 第 1の分注溶液における含有量は、 乾燥状態、 保湿状態若しくは 膨潤状態で、 検出対象物を十分保持できる量以上を必要とする。 すなわち、 乾燥 後、 反応溶液を分注 （第 2の分注） を行った後、 保持物質は、 保湿または膨潤す るが、 その際に保持物質の量が十分でないと、 検出対象物が、 保持物質の中に完 全に保持されず遊離することになる。 遊離した検出対象物は、 凹部間が反応液を 介して通じている場合には、 直ちに隣接凹部に混入し得るため、 好ましくない。 凹部内が反応溶液で満たされても、 検出対象物が十分保持される量の保持物質が 存在すれば、 隣接する凹部への混合が防がれ、 分注後のシールによって隔離され た凹部内では、 その後の加温または冷却による温度応答性物質の相変化による検 出対象物質の遊離、 または、 徐溶解性物質の、 室温での緩徐な徐溶解性物質の溶 解により、 他の凹部に影響を受けない、 単独凹部特異的な反応が生じる。
例えば、 温度応答性物質がゼラチンであれば、 第 1の分注溶液に対して 0 . 0 5〜2質量％の範囲で含有させることが好適である。 当該溶液に対して 0 . 0 5
%未満であると、 上述のように検出対象物が温度応答物質としてのゼラチン内に 保持されきらず、 反応溶液中に溶出して、 反応溶液を介して、 他の凹部内の検出 対象物同士が接触して、 検出感度が低下するおそれがあり、 2質量％を超えると、 第 1の分注溶液自体が、 過度に粘調となり、 分注に支障が生ずる傾向がある。 第 1の分注溶液は、 通常、 液状化 （ゾル化） している状態の、 保持物質の水溶 液に検出対象物を添加して溶解させて調製することが好適であるが、 この方式に 限定されるわけではなく、 他の調製方法でもよい。 また、 第 1の分注溶液は、 検 出基板の凹部への分注直前に調製することも可能であり、 分注の数日〜数時間前 に、 予め調製することも可能である。 この第 1の分注溶液としての保存期間は、 検出対象物の安定性等に応じて選択することが好適である。 また、 少なくとも分 注時には、 第 1の分注溶液は液状であることが必要である。 さらに、 検出対象物 を添加後は、 検出対象物が変性を起こす温度とすることは好適ではない。
(5)検出方法
本検出方法は、 液状の第 1の分注溶液を、 上述した検出用器具の凹部毎に、 用 手法も可能であるが、 好適には微量分注機 （インクジェット型の微量分注機等） を用いて注入し、 凹部中の第 1の分注溶液を、 乾燥処理 （保持物質が徐溶解性物 質の場合、 若しくは、 保持物質を用いない場合に好適である） または冷却処理 （ 室温放置を含む：保持物質が温度応答性物質の場合に好適である） 等により、 検 出用器具の凹部に付着させた後、 この第 1の分注溶液中の検出対象物に対する反 応物質を含有する反応溶液を'、 前記の第 1の分注溶液の付着処理を行った凹部の 内壁に接触させ、 温度上昇または下降 [上述したポリ （N-イソプロピルアタリ ルアミ ド） は、 温度上昇により固化し、 温度下降により液化する性質がある。 よ つて、 これを温度応答物質として用いる場合には、 第 1の分注時には液化温度ま で分注溶液の温度を下げて、 当該分注後に固化温度まで凹部の温度を上昇させつ つ、 反応溶液を接触させ、 検出時に液化温度まで凹部の温度を下降させることが 好適である] 、 放置等により溶解させることで検出対象物を遊離させ、 発生する シグナルを検出することにより、 検出対象物の評価を行うことができる。
なお、 上記の凹部の壁面に付着させた第 1の分注溶液と、 反応溶液の接触態様 として、 反応溶液を、 第 1の分注溶液を付着させた後、 基板面上に向けて、 一様 に反応溶液を上層することが、 効率的であり好適である。
B . 本検出用キット
本検出用キットは、 下記の a , bおよび cを構成要素として含む、 本検出方法 を行うための検出用キットである。 a . 温度応答性物質、 および Zまたは、 徐溶解性物質。
b . 反応溶液、 または、 反応溶液の溶質。
c 複数の凹部を有する検出用器具。
かかる構成の本検出用キットは、 例えば、 採取した検出対象物を、 温度応答性 物質、 および Zまたは、 徐溶解性物質 （保持物質） と、 水等の溶媒の混合物の中 に添加して、 第 1の分注溶液を調製して、 この第 1の分注溶液を、 キット付属の 検出用基板の凹部に分注して固化させ、 上述した本検出方法の要領に従って、 付 属の反応溶液で検出反応を行い、 検出対象物の評価を行うことができる。
本検出用キットには、 他の必要な要素、 例えば、 上述した保持物質の溶解に用 いる溶媒 （精製水、 2 -プロパノール等） 、 検出対象物の保存剤、 安定化剤等を 含有させることが可能である。
本検出用キットを、 インベーダー法を用いて使用する場合には、 検出対象物を 核酸として、 かつ、 反応溶液を、 当該核酸に対するインベーダー反応を行うこと ができる溶液とすることになる。 実施例
以下に、 本発明をさらに具体的に説明するために、 本発明の実施例を記載する 力 本発明は、 この実施例の内容に限定されるべきものではない。
検出用基板
上述した製造方法に従って、 本発明に使用する検出用基板を作成した。 その概 略を第 3図に示す。 第 3図に示した検出用基板は、 ポリカーボネート製、 高密度 凹部で構成されたスライ ドである。 この検出用基板は、 22x76 x 1 のサイ ズのプラスチックスライド上に、 開口部 0. 45x0. 45 (mm) 、 深さ 0. 45mmの凹 部を 5040個設けたものである。 凹部部は、 上部全面の面積が 21 X 60 (mm) で あり、 1 凹部の容量は 44- nlである。 また、 凹部間は、 上部が 0. 05 mmの隔壁で仕 切られている。
各凹部への分注対象物の分注は、 インクジェット型の微量分注機 （Cartesian 社の synQUAD™ ) を用いて行った。
適切なゼラチン濃度の決定 室温下で、 第 3図の検出用基板の各凹部に、 GenomeDNA, 0. 1%ゼラチンを分注 後、 固化させ、 基板面上から、 1万倍希釈 OliGreen, 1% TritonX - 100溶液を反応 溶液として、 一度に上層することで、 当該反応溶液の分注を各凹部において行い、 DNA染色反応を実施した。 反応時の基板面の状態を、 第 4図に示す。 第 4図にお いて、 ％はゼラチン濃度である。 DNAが分注された凹部 （1, 3， 5列と、 H20,ゼラチ ン濃度が記載された行の交差した凹部） は、 Oligreen染色されて強い蛍光を発し ているのと共に、 隣接凹部に蛍光の観察された凹部も認められた。
染色形状は DNAに混在させたゼラチンの濃度によって異なっていた。 すなわち、 DNAが凹部内壁表面から溶液に溶け出さなかつた凹部では、 凹部内壁面に張り付 いた DNAが角張ったドーナツ形状で染色されているのに対し （0. 05%以上の濃度の ゼラチンの入った凹部） 、 0. 025%濃度以下の凹部では DNAが溶け出して、 内壁以 外の凹部内部でも蛍光シグナルが観察された他、 分注凹部の隣接した凹部でも蛍 光シグナルが観察された。 なお、 蛍光スキャナ一は ScanArray5000 (現在は
PerkinElmer社） を使用した。 焦点深度は、 表面から 0. lmmであった。 また、 ヒ ト ゲノム DNAは、 全て熱変性させたものであった。
このように 0. 05%以上の濃度でゼラチンを混在させたゲノム DNAでは、 隣接凹 部への影響を及ぼさずに、 反応溶液の分注が可能であることがわかった。
本検出方法
第 4図に示した結果を参考に、 本検出方法を行った。 すなわち、 0. 1%ゼラチン を共存させた、 別個の遺伝子型を持つ SOng/ μ 1ゲノム DNAを、 3種類、 20nlずつ別 々の凹部へ分注後、 室温にてゼラチンを固化させ、 第 3図に示した方法の要領で、 インベーダー試薬 [酵素、 プローブミックス （ABCA 1遺伝子の- 447C/T多型を判 別するためのもの） 、 FRET試薬、 マグネシウム溶液が混入したもの] を一括して、 基板上に上層して分注した。 反応後、 前記蛍光スキャナーを用いて解析を行った。 反応時の基板面の状態を、 第 5図に示す。 第 5図において、 緑が Tのホモ接合 体、 赤が Cのホモ接合体、 黄色がヘテロ接合体のゲノム DNAを分注した凹部である (本図は、 モノクロ像のため、 カラーの参考図面を提出する用意あり） 。 お互い の試薬等の混合による判定不良は認められなかった。
このように、 本検出方法を用いた、 検出用基板での検出は、 特別な機器を必要 とせず、 分注時の吐出口先端を 1凹部毎に微妙に位置調整する必要がなく、 分注 量は凹部容量を全量満たす方式のため誤差が少なく、 迅速、 簡便、 安価な方法で あることが判明した。 産業上の利用可能性
本発明により、 気泡が微小凹部内に形成される懸念なく、 効率的に、 マイクロ アレイ等の検出基板における液相反応を行う手段が提供される。

Claims

請求の範囲
1. 表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、 検出対象物を付着さ せ、 この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、 前記の検出対 象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、 この接触により発生 するシグナルを検出して、 検出対象物の評価を行う、 検出用器具を用いた検 出方法。
2. 表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、 （1 ) 検出対象物と 共に、 1 0〜9 0°C程度で固体から液体への相変化が、 その物質自体若しく はその物質と溶媒の混合物において認められる物質、 および/または、 （2
) 室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質、 を共存させて付着させ、 検出時に前 記の物質 （1) および または （2) を、 反応溶液内で溶解させる、 請求の 範囲第 1項記載の検出方法。
3. (1 ) 検出対象物と共に、 1 0〜9 0°C程度で固体から液体への相変化が、 その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質が、 ゼラチン、 寒天、 DPPC (Dipalmitoyl phosphatidylcholine) 、 ポリ （N— イソプロピルアクリルアミ ド） 、 および、 ポリ （ ε -力プロラタ トン） 、 力 らなる群から選ばれる 1種または 2種以上である、 請求の範囲第 2項記載の 検出方法。
4. ( 1 ) 検出対象物と共に、 1 0〜 9 0°C程度で固体から液体への相変化が、 その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質が、 ゼラチンである、 請求の範囲第 2項記載の検出方法。
5. (2) 室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質が、 デキストラン、 キシリ トール、 ポリエチレングリコール、 マルトース、 および、 トレハロースからなる群か ら選ばれる 1種以上である、 請求の範囲第 2項〜第 4項のいずれかに記載の 検出方法。
6. (2) 室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質が、 トレハロースである、 請求の 範囲第 2項〜第 4項のいずれかに記載の検出方法。
7. 検出用器具表面の凹部の内壁と反応溶液との接触が、 反応溶液を、 検出器具 の凹部の開口側面上に上層することによって行われる、 請求の範囲第 1項〜 第 6項のいずれかに記載の検出方法。
8. 検出対象物が核酸である、 請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載の検 出方法。
9. 反応溶液が、 核酸に対するインベーダー反応を行うことができる反応溶液で ある、 請求の範囲第 8項記載の検出方法。
1 0. 検出用器具における凹部が、 1〜40000個 Zcm2の密度で設けられて いる、 請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれかに記載の検出方法。
1 1. 検出用器具の形状が、 基板状である、 請求の範囲第 1項〜第 1 0項のいず れかに記載の検出方法。
1 2. 下記の A, Bおよび Cを構成要素として含む、 請求の範囲第 1項〜第 9項 のいずれかに記載の検出方法を行うための検出用キット。
A. (1) 検出対象物と共に、 1 0〜 90°C程度で固体から液体への相変化 力 その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる 物質、 および/または、 （2) 室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質。
B. 反応溶液、 または、 反応溶液の溶質。
C. 複数の囬部を有する検出用器具。
1 3. 検出対象物が核酸であり、 かつ、 反応溶液が核酸に対するインベーダー反 応を行うことができる反応溶液である、 請求の範囲第 1 2項記載の検出用キ ッ卜。
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