JP2006346613A - 反応チップ及び分注方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の反応部を有する反応チップにおいて、各反応部に試薬を分注する際、試薬の存在を簡便に確認でき、精度の高い分析を行うことができる反応チップを提供することを目的とする。
【解決手段】複数の反応部を備える反応チップであって、該反応部に着色物質または蛍光物質を含む試薬が存在することを特徴とする反応チップとする。また、複数の反応部を備える反応チップの各反応部に試薬を注入する工程を有する試薬の分注方法であって、該試薬が着色物質または蛍光物質を含み、かつ着色物質又は蛍光物質の有無により反応部内の試薬の有無を確認する工程を有することを特徴とする分注方法とするものである。
【選択図】 図１

Description

本発明は、化学又は生化学などの分野に用いられる、多数の反応部を有する反応チップ及び反応部への試薬の分注方法に関する。

バイオや化学の分野で、基板に複数のウェル状反応部を有するチップを用いて、様々な反応を行うことやさらにはその反応の有無を蛍光物質などを用いて検出する方法が知られている（特許文献１参照）。
また、ＤＮＡの検出などで、基板上の反応スポット領域にスポッティングによりプローブを固定し、血液等から採取した検体ＤＮＡを加え、ハイブリダイゼーション法によりＤＮＡの分析を行う方法が知られている。
いずれにしても試薬を反応部に供給する場合、手動または自動の分注装置で各ウェルに試薬を供給するが、手動の場合でも自動の分注装置を用いる場合でも、入れ忘れ又は装置の誤動作などにより、供給不良が起こることがある。

通常、このような反応用のチップ、容器は無色なプラスチック樹脂又はガラスなどを用いて形成されており、試薬も無色透明なものが多い。そのため、各ウェル状反応部に試薬を微量分注した後、簡単には試薬を入れ忘れた空のウェル状反応部があるかどうかがわからないという問題がある。
そして、試薬のない状態で反応環境下におき、反応の有無を検出しようとすると、試薬の供給されていない反応部からは試薬がないため、当然反応の有無を検出することができず、精度の良い分析が困難になる。

ＷＯ２００３／０３１９７２号公報

本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、複数の反応部を有する反応チップにおいて、各反応部に試薬を分注する際、試薬の存在を簡便に確認でき、精度の高い分析を行うことができる反応チップを提供することを目的とする。

請求項１の発明は、複数の反応部を備える反応チップであって、該反応部に着色物質または蛍光物質を含む試薬が存在することを特徴とする反応チップである。

請求項２の発明は、前記反応部がウェル状であることを特徴とする請求項１記載の反応チップである。

請求項３の発明は、前記複数の反応部が基板に設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の反応チップである。

請求項４の発明は、基板に、試薬が収容されているウェル状の試薬収容部と複数のウェル状の反応部を備える反応チップであって、少なくとも一方の試薬が着色物質または蛍光物質を含むことを特徴とする反応チップである。

請求項５の発明は、基板に、試薬が収容されているウェル状の試薬収容部と複数のウェル状の反応部を備える反応チップであって、双方の試薬が異なる色の着色物質または異なる蛍光ピーク波長を有する蛍光物質を含むことを特徴とする反応チップである。

請求項６の発明は、前記試薬が収容されている試薬収容部が複数あり、試薬収容部毎に異なる色の着色物質または異なる発光波長のピークを有する蛍光物質を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の反応チップである。

請求項７の発明は、複数の反応部を備える反応チップの各反応部に試薬を注入する工程を有する試薬の分注方法であって、該試薬が着色物質または蛍光物質を含み、かつ着色物質又は蛍光物質の有無により反応部内の試薬の有無を確認する工程を有することを特徴とする分注方法である。

本発明によれば、複数の反応部を有する反応チップにおいて、試薬を入れた後反応を行う前に、簡便に試薬の存在を確認できるため、無駄のない、精度の高い分析を行うことができる。

以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。

本発明の複数の反応部を有する反応チップとしては、図１に示すようなマイクロプレートや図２に示すような基材にウェル状の反応部を有する反応チップや、図３に示すような基材上に反応スポットを有する反応チップを用いることができる。

図１に示すような反応チップの材質又は図２、図３に示すような反応チップの基材に用いる材料は、反応系に悪影響を与えないものであればよい。また、反応を検出する際、基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が好ましい。
このようなものとして、ガラス、石英、樹脂などを用いることができ、例えば、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からシクロオレフィン系樹脂（ゼオノア（日本ゼオン株式会社製））やメチルペンテン系樹脂（ＴＰＸ（三井化学株式会社製））を用いることが好ましい。

図２に示すような形状である場合、ウェル状の反応部は、基材がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。

ウェルの形状は、特に限定はなく、円錐状、角錐状、円柱状、角柱状などいずれの形でもかまわない。また、ウェル状反応部底面側から試薬の存在の有無または反応の有無を検出する場合、底部が平坦であり、またウェル開口部から底面まで壁面が傾斜している円錐台形状であることが好ましい。
また、ウェルの大きさは、特に限定はしないが、ライフサイエンス分野では極微量での反応、検出が行われることが多く、開口部の直径及び深さが０．０１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であればよい。また、本発明ではこの大きさの範囲内の時に特に効果を発揮するものである。
また、ウェル状の反応部内の内壁には親水性又は撥水性の表面処理を施しても良い。

本発明では、反応部に試薬を入れる際、試薬に着色または蛍光物質を加えておくことで、試薬を入れ終わった時、図４に示すように目視または蛍光検出等で各反応部の試薬の有無を確認できる。
また、蛍光検出であれば、試薬の存在の有無だけでなく、強度測定より、どのぐらいの量が存在するかを確認することができる。
着色物質、蛍光物質としては、反応系に悪影響のないものであることが好ましい。

着色物質としては、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノールＦＦ、オレンジＧなどが挙げられる。

なお、着色物質を用いて試薬の存在の有無を確認し、その後反応させた後、蛍光により反応の有無を検出する場合、着色物質は反応の有無を確認するための蛍光物質の励起光、蛍光の吸収が小さいものであることが好ましい。また、２種類以上の試薬の存在の有無を確認する場合、一方の試薬のみに着色物質を入れておくことも可能であるが、２種の試薬に異なる着色物質を入れておき、それぞれの試薬を反応部に分注する際、確認することが好ましい。この場合、異なる色の着色物質または、混合したときに認識できる程度に変色するものであることが好ましい。

着色物質を用いて試薬の存在の有無を確認する場合、目視で確認するか、もしくは分光器などで反応部の色度を確認することにより行っても良い。

蛍光物質としては、生化学分野で使用される蛍光物質を用いることができ、例えばテキサスレッド、Ｃｙ５、スルフォローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などが挙げられる。

なお、蛍光物質を用いて試薬の存在の有無を確認し、その後反応させた後、蛍光により反応の有無を検出する場合、試薬の存在の有無を確認するための蛍光物質と、反応の有無を確認するための蛍光物質は異なるものを用いる。具体的には、発光波長のピーク波長が異なる必要がある。また、２種類以上の試薬の存在の有無を確認する場合、一方の試薬のみに蛍光物質を入れておくことも可能であるが、２種の試薬に異なる蛍光ピーク波長を有する蛍光物質を入れておき、それぞれの試薬を反応部に分注する際、確認することが好ましい。

また、蛍光により試薬の存在の有無を確認する場合、反応チップの上部または下部から励起光を照射し、反応チップの上部または下部に位置する検出器で検出すればよい。

また、基板上に、ウェル状の反応部を有する場合、同一基板上に試薬収容部を設けても良い（図５参照）。試薬収容部はウェル状に形成することができ、大きさなどに特に制限はない。試薬収容部は用いる試薬の種類などに応じて複数設けることができる。また試薬収容部にはバッファー、希釈液などを入れておくことができる。

また、目的とするＤＮＡ配列の検出に用いる場合、同一チップ上にＰＣＲ反応部を設けても良い。
ＰＣＲ反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調製、ＤＮＡの検出を行うことができる。
ＰＣＲ反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。
また、その他の反応部を設けても良い。

また、ウェル状反応部同士を接続する流路を設けてもよい。またウェル状反応部と試薬収容部、ＰＣＲ反応部、その他の反応部を接続する流路を設けてもよい。これら流路を形成することにより、連続した反応を行わせることが可能となる。

本発明の反応チップは、様々な生化学系の反応用として用いることができ、例えば抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
この場合、必要に応じ、試薬に着色物質または蛍光物質を混ぜておけばよい。

以下に、目的とするＤＮＡ配列の検出の一例を示す。
複数の反応領域上に着色または蛍光物質とプローブを含む試薬を供給し、プローブを固定し、目視または蛍光検出によりプローブの有無を確認する。次に、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調製して検体ＤＮＡとし、この検体ＤＮＡに蛍光物質を結合させる。
この蛍光物質が結合している検体ＤＮＡを前記反応領域に供給し、ハイブリダイゼーション環境下に置き、洗浄後、未反応の検体を除去し、検体ＤＮＡに結合している蛍光物質により、ハイブリダイゼーション反応の有無の検出が可能となる。この場合、プローブ試薬に含まれる着色または蛍光物質と検体ＤＮＡに結合している蛍光物質は、目視または蛍光検出時に互いに影響を与えないものであることが必要である。
また、プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検体ＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。

なお、上記方法に限られるものではない。
例えば、プローブを固定した後に、洗浄工程を入れても良い。このようにすることで、プローブ試薬に含まれる着色または蛍光物質と検体ＤＮＡに結合している蛍光物質の影響を考慮せずに、着色、蛍光物質を選定できる。
また、ハイブリダイゼーション反応の有無の検出に用いる蛍光標識として、インタカレーターを用いることができる。この場合、試薬の有無の確認のための着色または蛍光物質は、プローブ、検体ＤＮＡと結合していても良いし、していなくても良い。なお、前記蛍光標識、プローブ、検体ＤＮＡの確認のための着色または蛍光物質は、目視または蛍光検出時に互いに影響を与えないものであることが必要であるが、洗浄工程などで着色または蛍光物質を除去すれば、その除去された着色または蛍光物質による影響は考慮しなくて良い。

なお、前記プローブを抗原に、検体ＤＮＡを抗体に置き換えれば、抗原抗体反応に応用できる。

また、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、検体ＤＮＡを特定するための試薬は複数あってもよく、検体ＤＮＡが蛍光標識されていない場合には、試薬のひとつが標識されていればよい。

また、多段階反応を行ってＳＮＰまたはＤＮＡを検出してもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。

インベーダー反応により検体ＤＮＡのＳＮＰを検出する例を挙げる。インベーダー反応は、アレルプローブ及びインベーダープローブというプローブ、ＦＲＥＴと呼ばれる消光物質及び蛍光標識つきの核酸、ＦＲＥＴの消光物質を切り離すための酵素などの試薬を用いて多段階反応を行う。
ウェル状反応部を有する反応チップを用いた例として、例えば、ウェル状反応部に着色または蛍光物質を含むプローブを供給し、その後、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調製した検体ＤＮＡ及びＦＲＥＴと酵素などを含むインベーダー試薬と着色または蛍光物質を含む試薬をウェル状反応部に供給し、インベーダー反応を行うことにより、ＤＮＡの検出を行うことができる。
なお、この場合、プローブ試薬に含まれる着色または蛍光物質、検体ＤＮＡ及びインベーダー試薬を含む試薬に含まれる着色または蛍光物質、ＦＲＥＴに含まれる蛍光物質はそれぞれ識別できるようなものを選択する必要がある。

（実施例１）
ポリプロピレン製９６穴プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の各ウェル状反応部内にインベーダーアッセイキット（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて３種類のＳＮＰタイピングを行った。
まず、インベーダーアッセイキットに含まれる、アレル特異的プローブ０．１５μｌと試薬の有無の確認のための着色物質としてブロモフェノールブルー０．００３％水溶液０．１５μｌを混合し各０．３μｌ分注し、その後乾燥させた。乾燥後に、目視により全ての反応部に試薬があることを確認できた。
次にインベーダーアッセイキットに含まれる、シグナルバッファー０．１５μｌ、ＦＲＥＴプローブ０．１５μｌ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素０．１５μｌを加え、反応体積を３μｌに調製した。ＦＲＥＴプローブは異なる蛍光色素（ＦＡＭ，ＶＩＣ）で標識され、異なるフラップ相補的配列を有する２種を用いる。一対のプローブは２種類のＦＲＥＴプローブに対応するフラップ部分を有する。
この反応液をＡＢＩ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて９５℃、５分、続いて６３℃、３０分インキュベートし、蛍光発光を同機を用いて検出した結果、図６に示すように目的の反応による蛍光検出に影響を及ぼさず、３種類のＳＮＰタイピングを行うことができた。
（実施例２）
ポリプロピレン製９６穴プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の各ウェル内にインベーダーアッセイキット（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて３種類のＳＮＰタイピングを行った。
まず、インベーダーアッセイキットに含まれる、アレル特異的プローブ０．１５μｌと試薬の有無の確認のための蛍光物質としてＣｙ５ ０．１５μｌを混合し各０．３μｌ分注し、その後乾燥させた。乾燥後に、励起源として励起波長６３５ｎｍの赤色ダイオードを有する蛍光検出器モレキュラーイメージャーＦＸ Ｐｒｏ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を用いて蛍光測定した結果、全ての反応部から蛍光が検出され、また強度も一定であり、各反応部への分注量が一定であることが確認できた。
次にインベーダーアッセイキットに含まれる、シグナルバッファー０．１５μｌ、ＦＲＥＴプローブ０．１５μｌ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素０．１５μｌを加え、反応体積を３μｌに調製した。ＦＲＥＴプローブは異なる蛍光色素（ＦＡＭ，ＶＩＣ）で標識され、異なるフラップ相補的配列を有する２種を用いる。一対のプローブは２種類のＦＲＥＴプローブに対応するフラップ部分を有する。
この反応液をＡＢＩ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて９５℃、５分、続いて６３℃、３０分インキュベートし、蛍光発光を同機を用いて検出した結果、上記の実施例１と同様に目的の反応による蛍光検出に影響を及ぼさず、３種類のＳＮＰタイピングを行うことができた。

本発明に用いるウェル状反応部を有する反応チップの一例を示す概要図である。 本発明に用いる基板上に複数のウェル状反応部を設けた反応チップの一例を示す概要図である。 本発明に用いる反応チップの一例を示す概要図である。 本発明の試薬の有無を目視にて確認する場合の一例を示す概要図である。 本発明に用いる基板上に複数のウェル状反応部及び試薬収容部、ＰＣＲ反応部を設けた反応チップの一例を示す概要図である。

符号の説明

１ 反応チップ
２ ウェル状反応部
２ａ 着色又は蛍光物質の入っているウェル状反応部
２ｂ 着色又は蛍光物質の入っていないウェル状反応部
３ 基板
４ 反応部
５ ＰＣＲ反応部
６ 試薬収容部

Claims (7)

1. 複数の反応部を備える反応チップであって、該反応部に着色物質または蛍光物質を含む試薬が存在することを特徴とする反応チップ。
2. 前記反応部がウェル状であることを特徴とする請求項１記載の反応チップ。
3. 前記複数の反応部が基板に設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の反応チップ。
4. 基板に、試薬が収容されているウェル状の試薬収容部と複数のウェル状の反応部を備える反応チップであって、少なくとも一方の試薬が着色物質または蛍光物質を含むことを特徴とする反応チップ。
5. 基板に、試薬が収容されているウェル状の試薬収容部と複数のウェル状の反応部を備える反応チップであって、双方の試薬が異なる色の着色物質または異なる蛍光ピーク波長を有する蛍光物質を含むことを特徴とする反応チップ。
6. 前記試薬が収容されている試薬収容部が複数あり、試薬収容部毎に異なる色の着色物質または異なる発光波長のピークを有する蛍光物質を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の反応チップ。
7. 複数の反応部を備える反応チップの各反応部に試薬を注入する工程を有する試薬の分注方法であって、該試薬が着色物質または蛍光物質を含み、かつ着色物質又は蛍光物質の有無により反応部内の試薬の有無を確認する工程を有することを特徴とする分注方法。