JP2006508668A - 磁性ベースの迅速な細胞分離 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、細胞、細胞小器官またはウイルスを単離する分野に関係する。本発明は特に、サンプルから標的とする細胞、細胞小器官またはウイルスを単離するためのプロセスおよびキットを提供し、本プロセスおよびキットは、とりわけ目的細胞、細胞小器官またはウイルスと磁性マイクロビーズとの間の非特異的もしくは特異性の低い結合を使用する。
生物学の発達水準は、生体サンプルの穏やかかつ効率的な調製に依存している。標的分子を包含する生体物質(例えば細胞、ウイルス、およびバクテリオファージ)のサンプルからの分離は、しばしば律速段階となる。従来の分離手法は、時間が掛かるか、または遠心分離およびクロマトグラフィーのような拡張的もしくは複雑な手順を含むかのいずれかである。このため従来の分離手法の自動化、微量化および汎用化の実現は困難である。
本発明は、非特異的なまたは特異性の低い吸収と磁性マイクロビーズの常磁性とを利用して、標的とする生体分子(核酸、タンパク質等)を含む標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルス(白血球、ウイルス、上皮細胞、培養細胞等)を様々な源(例えば全血、唾液、血清、骨髄、唾液、尿、細胞および組織の培養液)から分離することに関係する。適当な緩衝液下で、磁性マイクロビーズを生体物質結合体から分離することができる。分離した細胞は、細胞培養、薬物スクリーニング、生化学反応、および生物学的分析に用いることができる。この簡単迅速な分離方法は、様々な量のサンプルの(特に少量および微量のサンプルの)調製に使用することができ、そして自動化デバイスならびに微量化デバイスをを作製することも容易である。
開示を明確にするため本発明の詳細な説明を以下の小節に分けるが、これは限定のためではない。
他に定義されない限り、本明細書で使われる全ての科学・技術用語は本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を持つ。本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、公開された出願、および他の刊行物は、参考のためその全体が、参考として援用される。この節で示されている定義が、本明細書で参考のため援用される特許、特許出願、公開された出願、および他の刊行物の定義に反するかまたは矛盾する場合、この節で示されている定義は、本明細書で参考のため援用される定義に優先する。
一局面において、本発明は、サンプルから標的とする細胞、細胞小器官またはウイルスを単離するための方法に関し、この方法は以下を包含する:a)標的細胞、標的細胞小器官もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズに接触させる工程であって、この磁性マイクロビーズは、この標的細胞、この標的細胞小器官またはこの標的ウイルスに高特異的に結合する部分を含まない、工程;b)この標的細胞、この標的細胞小器官またはこの標的ウイルスを、このサンプル中に存在する場合、この磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、この標的細胞、この標的細胞小器官またはこの標的ウイルスとこの磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに、c)この結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、このサンプルから、この標的細胞、この標的細胞小器官またはこの標的ウイルスを単離する工程。
さらに別の局面では、本発明は、サンプルからウイルスまたはバクテリオファージを単離するためのプロセスに関し、このプロセスは以下を包含する:a)標的ウイルスまたは標的バクテリオファージを含むか、または含むと疑われるサンプルから、細胞を除去する工程;b)この細胞を含まないサンプルを磁性マイクロビーズと接触させる工程であって、この磁性マイクロビーズは、この標的ウイルスまたはこの標的バクテリオファージに高特異的に結合する部分を含まない、工程;c)この標的ウイルスまたはこの標的バクテリオファージを、このサンプル中に存在する場合、この磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、この標的ウイルスまたはこの標的バクテリオファージとこの磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに、c)この結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、このサンプルから、この標的ウイルスまたはこの標的バクテリオファージを単離する工程。
本明細書で記載される実施形態は、磁性マイクロビーズの非特異的または低特異的な吸収ならびに常磁性を利用して、全血、唾液、血清、骨髄、唾液、尿、ならびに細胞および組織培養液からの、標的生体分子(例えば、核酸およびタンパク質)を含む細胞ならびに生体物質(例えば、白血球、ウイルス、上皮細胞、および培養細胞等)の分離に関係する。適切な緩衝液中で、磁性マイクロビーズは、生体物質結合体から分離され得る。分離された細胞は、細胞培養、薬物スクリーニング、生化学反応、および生物学的分析に使用することができる。
全血から白血球を分離する従来の技術には、以下が含まれることが多い:(1)密度勾配遠心;(2)最初に化学薬品で赤血球を破壊し、次に遠心によって白血球を抽出する;(3)白血球表面にある抗原に結合する特異的抗体である、誘導体固形物質によるアフィニティクロマトグラフィー。しかし、これらの手法は高価で自動化および微量化の実現が難しい。
コーティング磁性マイクロビーズは、例えばCN 01/109870.8またはWO 02/075309で開示されている方法等、あらゆる適切な手法によって調製することができる。磁性マイクロビーズの調製方法および直径は、抽出された白血球にさほど影響しない。しかし、ヒドロキシル基、カルボキシル基、およびエポキシ基で改変された磁性マイクロビーズはよりよい分離効果を有する。この磁性マイクロビーズを他の化学的処理法で処理する必要はない。
(1)小さな磁性マイクロビーズ(pH6.0のTris−EDTA緩衝液に懸濁)を全血サンプルに加える。その混合物をボルテックスで穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートする。
分離用緩衝液:TE(pH7.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl、Tween20:0.1%。別の分離用緩衝液:Tris−EDTA(pH7.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl、Tween20:0.1%。
この方法にはいくつかの主な利点がある:(1)簡単迅速な操作、1〜3分しか要しない;(2)エッペンドルフチューブのみが必要であり、沈殿がない;(3)得られる生成物は、続いて行う生物学的操作に適する;(4)自動操作の実現が容易である;(5)有毒な薬剤を使用しない、安全な操作;(6)室温での操作;(7)磁性マイクロビーズは保存が容易であり、保存状態によって分離の効果にさほど影響しない。
(2.1.操作プログラム)
(1)小さな磁性マイクロビーズ(pH6.0のTris−EDTA緩衝液に懸濁)を生物サンプルに加える。その混合物をボルテックスで穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートする。
分離用緩衝液:Tris−EDTA(pH7.0):10mM EDTA/25mM Tris−HCl、Tween20:0.1%
(2.3.主な利点)
本方法にはいくつかの主な利点がある:(1)簡単迅速な操作、約20分しか要しない;(2)エッペンドルフチューブのみが必要であり、沈殿がない;(3)得られた生成物は、続いて行う生物学的操作に適する;(4)自動操作の実現が容易である;(5)有毒な薬剤を使用しない、安全な操作;(6)室温での操作;(7)磁性マイクロビーズは保存が容易であり、保存状態によって分離の効果にさほど影響しない。
(3.1.操作プログラム)
(1)小さな磁性マイクロビーズ(pH6.0のTris−EDTA緩衝液に懸濁)とサンプルの0.2体積の吸収用緩衝液を生物サンプルに加える。その混合物をボルテックスで穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートする。
(1)吸収用緩衝液:NaCl 2.5M、PEG 20%(W/V)。
本方法にはいくつかの主な利点がある:(1)簡単迅速な操作、約20分しか要しない;(2)エッペンドルフチューブのみが必要であり、沈殿がない;(3)得られた生成物は、続いて行う生物学的操作に適する;(4)自動操作の実現が容易である;(5)有毒な薬剤を使用しない、安全な操作;(6)室温での操作;(7)磁性マイクロビーズは保存が容易であり、保存状態によって分離の効果にさほど影響しない。
(実施例1.磁性マイクロビーズを用いた全血からの白血球の単離)
健康なドナーからのヒト全血を、ACDで抗凝固処理した。白血球単離の手順は以下の通りである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した15μg/μLの磁性マイクロビーズ30μLを含む1.5mL EppendorfTMチューブに、300μLの抗凝固処理した血液を加えた。この混合物を、15秒間ボルテックスで穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートした。次に、この磁性マイクロビーズ−白血球結合体を、磁性スタンド上で固定化し、上清を捨てた。この磁性マイクロビーズ−DNA結合体を、70%エタノール溶液で2回洗浄した。インタクトな構造の白血球を保つべき場合には、エタノールのかわりにPBS緩衝液(pH7.4)を使用してマイクロビーズを洗浄した。室温でエタノールを完全に蒸発させた後、50μLのTris−EDTA−Tween20溶液(pH7.0,10mM/L Tris−HCl,1mM/L EDTAおよびTween20:0.1%)を結合体に加えて室温で10分間インキュベートし、白血球を溶出させた。次に磁性マイクロビーズを、磁性スタンドを通して分離し、溶出液を回収した。得られた白血球を大きな生体分子(例えば、核酸ならびにタンパク質)の抽出に使用することができる。全プロセスに要するのはわずか15分である。
プラスミドを持たないE.coliをサンプルとした。手順は以下のとおりである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した15μg/μLの磁性マイクロビーズ50μLを含む1.5mL EppendorfTMチューブに、300μLの細胞培養物を加えた。この混合物をボルテックスで15秒間穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートした。次に、この磁性マイクロビーズ−細胞結合体を磁性スタンド上で固定化し、上清を捨てた。細胞はマイクロビーズ表面上に選択的に吸収された。
唾液は健康なドナーから提供された。手順は以下のとおりである。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した15μg/μLの磁性マイクロビーズ30μLを含む1.5mL EppendorfTMチューブに、300μLの細胞培養物を加えた。この混合物をボルテックスで15秒間穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートした。次に、この磁性マイクロビーズ−細胞結合体を磁性スタンド上で固定化し、上清を捨てた。細胞は、マイクロビーズ表面上に選択的に吸収された。
手順は以下のとおりである。M13バクテリオファージを含む300μLのブロスブイヨン2xTYを、5分間遠心分離する。この上清を、Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した15μg/μL の直径200nmの磁性マイクロビーズ30μLを含む、1.5mLのEppendorfTMチューブに加える。次に、この混合物の0.2体積の20%ポリエチレングリコール(NaCl:2.5M)を、この混合物に加える。この混合物をボルテックスで15秒間穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートする。次に、マイクロビーズ−バクテリオファージ結合体を磁性スタンド上で固定化し、上清を捨てる。
手順は以下のとおりである。300μLの血清をインフルエンザ菌と混合する。Tris−EDTA緩衝液(pH6.0)に懸濁した15μg/μLの直径200nmの磁性マイクロビーズ30μLを含む1.5mLのEppendorfTMチューブに、この混合物を加える。次に、この混合物の0.2体積の、20%ポリエチレングリコール(NaCl:2.5M)を加える。この混合物をボルテックスで15秒間穏やかに撹拌し、室温で3分間インキュベートする。次に、マイクロビーズ−ウイルス結合体を磁性スタンド上で固定化し、上清を捨てる。
Claims (55)
- サンプルから、標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルスを単離するためのプロセスであって、該プロセスは、以下:
a)標的細胞、標的細胞小器官もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルを、磁性マイクロビーズに接触させる工程であって、該磁性マイクロビーズは、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスに高特異的に結合する部分を含まない、工程;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに
c)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、該サンプルから、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスを単離する工程、
を包含する、プロセス。 - 前記標的細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、組み換え細胞、および培養細胞からなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞小器官が、核、ミトコンドリア、葉緑体、リボソーム、ER、ゴルジ装置、リソソーム、プロテアソーム、分泌小胞、液胞、およびミクロソームからなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的ウイルスが、真核生物細胞ウイルスまたはバクテリオファージである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、常磁性物質、強磁性物質、およびフェリ磁性物質からなる群より選択される、磁化可能な物質を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁化可能な物質が、金属成分を含む、請求項5に記載のプロセス。
- 前記金属成分が、遷移金属成分またはそれらの合金である、請求項6に記載のプロセス。
- 前記遷移金属が、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル、ジルコニウム、およびコバルト−タンタル−ジルコニウム(CoTaZr)合金からなる群より選択される、請求項7に記載のプロセス。
- 前記金属成分が、Fe3O4である、請求項6に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、約5ナノメートル〜約50,000ナノメートルの範囲の直径を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、未処理であるか、または有機分子で改変されている、請求項1に記載のプロセス。
- 前記磁性マイクロビーズが、改変されて、ヒドロキシル基、カルボキシル基またはエポキシ基を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記分離された結合体を洗浄して、望ましくない構成物を除去する工程をさらに包含する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記分離された結合体から、前記標的細胞、前記標的細胞小器官または前記標的ウイルスを回収する工程をさらに包含する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞、前記標的細胞小器官または前記標的ウイルスが、適切な緩衝液によって、分離された結合体から該緩衝液中に放出され、前記磁性マイクロビーズが、磁力を介して該溶液から除去される、請求項14に記載のプロセス。
- 前記サンプルが、臨床サンプルである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記サンプルが、血清、血漿、全血、痰、脳脊髄液、羊水、尿、胃腸管内容物、毛髪、唾液、汗、歯肉擦過標本、骨髄、組織、および細胞培養物からなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記単離された標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルスから生体物質を回収する工程をさらに包含する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記生体物質が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖類、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびそれらの複合体からなる群から選択される、請求項18に記載のプロセス。
- 前記回収されたオリゴヌクレオチドまたは核酸を増幅する工程をさらに包含する、請求項19に記載のプロセス。
- 自動化されている、請求項1に記載のプロセス。
- 約1分〜約20分の範囲の時間内に完了する、請求項1に記載のプロセス。
- エッペンドルフチューブ内で行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 沈殿手順なしで行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 有毒な薬剤なしで行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 約0℃〜約35℃の範囲の周囲温度で行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 全血、骨髄またはリンパから白血球を単離するために使用される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記全血、骨髄またはリンパが、新鮮であるか、または低温保存された全血、骨髄またはリンパである、請求項27に記載のプロセス。
- 以下の特徴:
a)約3〜約7の範囲のpH;および/または
b)適切な濃度の抗凝血剤、
を有する適切な化学環境において、前記白血球が、前記磁性マイクロビーズに接触される、請求項27に記載のプロセス。 - 前記抗凝血剤が、酸性クエン酸デキストロース(ACD)、クエン酸ナトリウム、およびヘパリンナトリウムからなる群から選択される、請求項29に記載のプロセス。
- 前記分離した白血球−磁性マイクロビーズ結合体を、洗浄緩衝液を用いて洗浄し、望ましくない構成物を除去する工程をさらに包含する、請求項27に記載のプロセス。
- 前記洗浄緩衝液が、約6.5のpHを有する生理的食塩水であるか、または約6.5のpHを有するリン酸緩衝液(PBS)である、請求項31に記載のプロセス。
- 前記白血球が、適切な分離用緩衝液によって、前記分離した白血球−磁性マイクロビーズ結合体から該緩衝液中に放出され、該磁性マイクロビーズが、磁力を介して該溶液から除去される、請求項27に記載のプロセス。
- 唾液、尿および組織培養物から、標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルスを単離するために使用される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記標的細胞が、上皮の脱落細胞または細菌細胞である、請求項34に記載のプロセス。
- 前記唾液、尿および組織培養物が、新鮮であるか、または低温保存された唾液、尿および組織培養物である、請求項34に記載のプロセス。
- 前記標的細胞、前記標的細胞小器官または前記標的ウイルスが、約3〜約7の範囲のpHを有する適切な化学環境において、前記磁性マイクロビーズと接触する、請求項34に記載のプロセス。
- 前記標的細胞、前記標的細胞小器官または前記標的ウイルスと前記磁性マイクロビーズとの間の、前記分離した結合体を、洗浄緩衝液で洗浄して、望ましくない構成物を除去する工程をさらに包含する、請求項34に記載のプロセス。
- 前記洗浄緩衝液が、約6.5のpHを有する生理的食塩水であるか、または約6.5のpHを有するリン酸緩衝液(PBS)である、請求項39に記載のプロセス。
- 前記標的細胞、前記標的細胞小器または前記標的ウイルスが、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスと前記磁性マイクロビーズとの間の、前記分離した結合体から、適切な分離用緩衝液によって、該緩衝液中に放出され、そして該磁性マイクロビーズが、磁力を介して該溶液から除去される、請求項34に記載のプロセス。
- 前記分離用緩衝液が、約6.5〜約8の範囲のpHおよび約1%(w/w)未満の濃度の界面活性剤を有するTris−EDTA緩衝液である、請求項41に記載のプロセス。
- サンプルから標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルスを単離するためのキットであって、該キットは、同じもしくは異なる容器内に、以下:
a)標的細胞、標的細胞小器官もしくは標的ウイルスを含むか、または含むと疑われるサンプルと接触するための磁性マイクロビーズであって、該磁性マイクロビーズは、該標的細胞、該標的細胞小器官もしくは該標的ウイルスに高特異的に結合する部分を含まない、マイクロビーズ;
b)該サンプル中に存在する場合、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスを、該磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させるための、手段;ならびに
c)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、該サンプルから、該標的細胞、該標的細胞小器官または該標的ウイルスを単離するための手段、
を含む、キット。 - サンプルから標的細胞、標的細胞小器官または標的ウイルスを単離するために前記キットを使用するための、使用説明書をさらに含む、請求項43に記載のキット。
- サンプルからウイルスまたはバクテリオファージを単離するためのプロセスであって、該プロセスは、以下:
a)標的ウイルスまたは標的バクテリオファージを含むか、または含むと疑われるサンプルから、細胞を除去する工程;
b)該細胞を含まないサンプルを磁性マイクロビーズと接触させる工程であって、該磁性マイクロビーズは、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージに高特異的に結合する部分を含まない、工程;
c)該サンプル中に存在する場合、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージを、該磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させる工程;ならびに
c)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、該サンプルから、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージを単離する工程、
を包含する、プロセス。 - 前記サンプルが、唾液、尿、または血清である、請求項45に記載のプロセス。
- 前記唾液、尿、または血清が、新鮮であるか、または低温保存された唾液、尿、または血清である、請求項46に記載のプロセス。
- 前記ウイルスまたは前記バクテリオファージが、以下:
a)約10%(v/v)〜約100%(v/v)の範囲の濃度の、十分な濃度の高水和性化合物;および/または
b)約2.5M〜約5.0Mの範囲の濃度の塩、
の存在下で、前記磁性マイクロビーズと接触する、請求項45に記載のプロセス。 - 前記高水和性有機化合物が、エタノール、アセトン、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項48に記載のプロセス。
- 前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項48に記載のプロセス。
- 前記細胞が、上皮の脱落細胞または細菌細胞である、請求項45に記載のプロセス。
- 前記標的ウイルスまたは前記標的バクテリオファージと前記磁性マイクロビーズとの間の、前記分離した結合体を、洗浄緩衝液によって洗浄して、望ましくない構成物を除去する工程をさらに包含する、請求項45に記載のプロセス。
- 前記洗浄緩衝液が、約6.5のpHを有する生理的食塩水であるか、または約6.5のpHを有するリン酸緩衝液(PBS)である、請求項52に記載のプロセス。
- 前記標的ウイルスまたは前記標的バクテリオファージが、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージと前記磁性マイクロビーズとの間の、前記分離した結合体から、適切な分離用緩衝液によって、該緩衝液中に放出され、そして該磁性マイクロビーズが、磁力を介して該溶液から除去される、請求項45に記載のプロセス。
- 前記細胞が、遠心分離によって前記サンプルから除去される、請求項45に記載のプロセス。
- サンプルからウイルスまたはバクテリオファージを単離するためのキットであって、該キットは、同じもしくは異なる容器内に、以下:
a)標的ウイルスまたは標的バクテリオファージを含むか、または含むと疑われるサンプルから、細胞を除去するための手段;
b)該細胞を含まないサンプルと接触するための磁性マイクロビーズであって、該磁性マイクロビーズは、該標的細胞、該標的細胞小器官、または該標的ウイルスに高特異的に結合する部分を含まない、マイクロビーズ;
c)該細胞を含まないサンプル中に存在する場合、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージを、該磁性マイクロビーズに非特異的または低特異的に結合させて、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージと該磁性マイクロビーズとの間で結合体を形成させるための手段;ならびに
d)該結合体を、磁力を介して他の望ましくない構成物から分離して、該サンプルから、該標的ウイルスまたは該標的バクテリオファージを単離するための手段、
を含む、キット。
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