KR20210049572A - 역류 원심분리를 이용한 ctc 분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법은 복잡한 전처리 과정 없이 비교적 간단한 방법만으로 혈액 중의 CTC를 분리할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법은 세포 손실 없이 CTC를 분리할 수 있어 CTC 검사의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있다.

Description

역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법{CTC Separation Method Using Counterflow Centrifugation}
본 발명은 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PBMC(말초 혈액 단핵 세포, peripheral blood mononuclear cell) 중 CTC(혈중순환 종양 세포, Circulating Tumor Cell)를 세포 손실 없이 효율적으로 분리할 수 있는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법에 관한 것이다.
암의 전이는 혈액을 타고 도는 혈중순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell, 이하 CTC)로 인해 발생한다. 처음 암이 발생한 곳에서 떨어져 나와 혈관 내로 침입한 CTC는 혈류와 순환하다 다른 조직에 침투해 암을 전이시킨다. 이런 CTC는 암 진단의 대표적인 마커로 최근 다양한 연구가 이뤄지고 있다.
CTC를 검출하는 검사법은 액상 조직검사(Liquid biopsy)에 해당한다. 액상 조직검사는 기존 암 진단에 쓰는 조직검사(tissue biopsy)와는 다르게 혈액, 소변, 침 등의 생체 유체를 활용한다. 조직검사는 자주 시행할 수 없으며 환자에게 부담이 되는 단점이 있었다. 액상 조직검사는 비교적 간단한 방법으로 암을 조기에 진단할 수 있어 새로운 대안으로 주목받고 있다.
하지만 같은 양의 혈액 속에 수십억 개의 적혈구, 수백만 개의 백혈구와 대조적으로 CTC는 수십 개 미만으로 존재해 검출이 매우 어려웠다. 혈액내 적혈구 109개중에 한 개의 비율로, 극히 미량으로 존재하는 CTC를 세포 손실 없이 정확하게 찾아내서 분리하는 기술이 필요한 실정이다.
기존의 CTC 검출은 혈액에 복잡한 전처리 과정을 해야 하고, 검출 과정에서 세포 손실이 발생하여 정확도 및 신뢰도가 저하되는 한계점이 있었다. 또한, CTC 표면에 있는 특정 단백질을 이용하는 방식은 정확도가 낮으며, 필터로 CTC를 걸러내는 기술의 경우에는 필터가 자주 막혀 분리 효율이 떨어지는 한계점이 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비교적 간단한 방법으로 세포 손실 없이 CTC를 정확하게 분리할 수 있는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법에 관한 것이다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 (1) 전혈 샘플로부터 PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플을 분리하는 단계; (2) 상기 PBMC 샘플에 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 마그네틱 비드를 투입하는 단계; (3) 상기 PBMC 샘플을 역류 원심분리가 수행되는 분리 챔버 내에 주입하는 단계; (4) 상기 분리 챔버 내에서 상기 PBMC 샘플이 무게에 따라 다층 분리되는 단계; 및 (5) 상기 다층 분리 중 CTC 층을 선택적으로 분리 취득하는 단계;를 포함하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계는 상기 전혈 샘플에 적혈구 응집성 시약을 첨가하여 PBMC 외의 세포들이 적혈구와 상호 응집되도록 함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (2)단계에서 상기 마그네틱 비드에 고정된 항체가 혈구 세포에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 이전 또는 동시에, 상기 PBMC 샘플의 주입 방향과 역방향으로 버퍼 용액을 주입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (4)단계에서 상기 CTC 층은 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 혈구 세포와 상이한 층을 이룰 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분리 챔버는 원추형 분리 챔버이며, 상기 원추형 분리 챔버는 원추부 및 상기 원추부와 연결되는 넥부로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분리 챔버는 복수개의 원추부가 넥부에 의해 연결되는 형태로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분리 챔버는, 상기 원추부의 꼭지부와 연결되도록 형성되는 버퍼용액 유입부; 및 상기 넥부를 관통하여 분리 챔버의 외부에서 내부로 형성된 PBMC 샘플을 주입하는 인렛부;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 인렛부를 통해서 PBMC 샘플이 주입 및 CTC 층 배출이 모두 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (5) 단계는 자기장치를 이용하여 상기 마그네틱 비드를 자기력에 의하여 분리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법은 복잡한 전처리 과정 없이 비교적 간단한 방법만으로 혈액 중의 CTC를 분리할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법은 세포 손실 없이 CTC를 분리할 수 있어 CTC 검사의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버의 구조도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버의 구조도이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버 내에서 수행되는 역류 원심분리의 모식도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 기존의 CTC 검출은 혈액에 복잡한 전처리 과정을 해야 하고, 검출 과정에서 세포 손실이 발생하여 정확도 및 신뢰도가 저하되는 한계점이 있었다. 또한, CTC 표면에 있는 특정 단백질을 이용하는 방식은 정확도가 낮으며, 필터로 CTC를 걸러내는 기술의 경우에는 필터가 자주 막혀 분리 효율이 떨어지는 한계점이 있었다.
이에 본 발명은 (1) 전혈 샘플로부터 PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플을 분리하는 단계; (2) 상기 PBMC 샘플에 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 마그네틱 비드를 투입하는 단계; (3) 상기 PBMC 샘플을 역류 원심분리가 수행되는 분리 챔버 내에 주입하는 단계; (4) 상기 분리 챔버 내에서 상기 PBMC 샘플이 무게에 따라 다층 분리되는 단계; 및 (5) 상기 다층 분리 중 CTC 층을 선택적으로 분리 취득하는 단계;를 포함하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법을 제공하여 상술한 한계점의 해결책을 모색하였다.
이에 따라 본 발명은 복잡한 전처리 과정 없이 비교적 간단한 방법만으로 혈액 중의 CTC를 분리할 수 있고, 분리 과정에서 세포 손실 없이 CTC를 효율적으로 분리할 수 있어 CTC 검사의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법의 순서도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명의 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법은 전혈 샘플로부터 PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플을 분리하는 단계(S1), 상기 PBMC 샘플에 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 마그네틱 비드를 투입하는 단계(S2), 상기 PBMC 샘플을 역류 원심분리가 수행되는 분리 챔버 내에 주입하는 단계(S3), 상기 분리 챔버 내에서 상기 PBMC 샘플이 무게에 따라 다층 분리되는 단계(S4) 및 상기 다층 분리 중 CTC 층을 선택적으로 분리 취득하는 단계(S5)를 포함하여 수행된다.
먼저, (1) 전혈 샘플로부터 PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플을 분리하는 단계(S1)에 대하여 설명한다.
전혈 샘플(Whole blood sample)은 모든 성분을 그대로 포함하는 혈액 샘플을 의미하는 것으로, 혈장, 적혈구(RBC, Red blood cell) 등을 모두 포함하는 생물학적 샘플을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 전혈 샘플은 사람으로부터 일정량으로 채취된 혈액 샘플이다.
PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플은 PBMC만을 선택적으로 포함하는 샘플을 의미하는 것으로, PBMC는 둥근 핵을 가진 말초 혈액 세포로 림프구(B세포, T세포, NK세포)와 단핵구로 구성될 수 있다.
전혈 샘플로부터 PBMC 샘플을 분리하는 과정은 피콜(Ficoll)과 원심분리를 이용하여 밀도와 크기에 따른 침전 속도 차이에 의하여 분리하는 방법 등의 해당 기술 분야 내 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전혈 샘플로부터 PBMC 샘플을 분리하는 과정은, 상기 전혈 샘플에 적혈구 응집성 시약을 첨가하여 적혈구와 PBMC 외의 세포들이 상호 응집되도록 함으로써 수행될 수 있다.
이 경우 적혈구와 목적하는 분리 대상인 PBMC 외의 세포들이 상호 응집되어 응집체를 형성하게 되므로, 상기 응집체를 분리함으로써 전혈 샘플로부터 PBMC를 용이하게 분리할 수 있게 된다. 특히, 적혈구는 혈구 세포 중 가장 많은 비율을 차지하므로 효과적인 제거가 필요하다. 상기 적혈구 응집성 시약을 첨가함으로써, 본 발명은 복잡한 전처리 과정 없이 비교적 간단한 방법만으로 전혈로부터 PBMC를 분리할 수 있고, 세포 손실을 최소화할 수 있어 분리 효율 및 정확도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
한편, 상기 적혈구 응집성 시약은 전혈 샘플에 첨가되는 경우에 적혈구에 PBMC 외의 세포들이 응집되도록 하여 응집체를 형성할 수 있는 시약으로 상용화된 제품을 사용할 수 있으며, 예를 들어 콜산계 계면활성제 및 산을 포함하는 용액 등을 사용할 수 있다.
다음으로, (2) 상기 PBMC 샘플에 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 마그네틱 비드를 투입하는 단계(S2)에 대하여 설명한다.
본 발명에서 표적 세포란 분리 및 획득 대상인 CTC를 의미할 수 있으며, 비표적 세포란 PBMC 샘플 내에 존재하는 세포 중 분리 대상인 CTC 이외의 세포를 의미할 수 있다.
또한, 마그네틱 비드란 평균 직경이 수~수십 마이크로미터(㎛) 사이즈의 자성을 가지는 비드 내지 칩으로, 상기 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정되어 있다. 이에 따라 상기 비표적 세포와 마그네틱 비드에 결합된 항체가 항원-항체 반응을 통해 결합한다. 즉, 비표적 세포와 마그네틱 비드의 항원-항체 반응에 의하여 타겟이 아닌 입자(non-target)가 자성을 가지도록 할 수 있고, 이에 따라 후술하는 바와 같이 자기장치를 이용하여 타겟 입자(target)와의 구별을 뚜렷하게 할 수 있다. 이를 통해 역류 원심분리 수행을 통해 목적하는 표적 세포를 용이하게 분리하여 자기장치를 통해 분리 효율 및 순도를 보다 높일 수 있는 효과가 있다.
구체적으로, 백혈구의 평균 입경은 약 7 ~ 20㎛이고, CTC의 평균 입경은 약 13 ~ 26㎛이므로 크기 면에서 특성이 겹치고, 핵이 있어 유전자 분석 등에도 어려움을 줄 수 있으므로 백혈구를 효과적으로 분리하는 것이 중요하다. 이를 위해 본 발명은 백혈구에 특이적으로 발현하는 항원에 결합하는 항체를 마그네틱 비드에 고정시켜 선택적으로 자성을 띤 세포만을 구별하여 제거할 수 있는 효과가 있다.
한편, 마그네틱 비드에 활용할 수 있는 항원-항체 반응은 특이적 반응을 통해서 혈구 세포와 마그네틱 비드가 특이적으로 결합하여 이들을 용이하게 분리할 수 있는 것으로, 통상적으로 알려진 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 백혈구에 특이적으로 발현하는 CD45 항원에 결합하는 Anti-CD45 항체를 마그네틱 비드 내부에 고정시켜 백혈구와 선택적으로 결합할 수 있다. 이를 통해 CTC와 크기가 비슷했던 백혈구들이 현저히 큰 크기를 갖게 되고, 후술하는 단계를 통해 CTC만을 용이하게 분리할 수 있는 것이다.
마그네틱 비드는 해당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있고, 철을 함유한 것을 사용할 수 있으며, 상기 철은 감마산화제이철(γ-Fe2O3) 또는 자철석(Fe3O4)인 것이 바람직하다. 또한, 철 위에 실리카 또는 폴리스티렌 등이 코팅된 코어-쉘 형태의 비드를 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 마그네틱 비드의 평균 직경은 1 ~ 100 ㎛일 수 있다. 보다 바람직하게는, 2 ~ 10㎛일 수 있다. 상기 범위 내의 마그네틱 비드를 사용하는 경우에는 비표적 세포와 표적 세포의 분리가 보다 용이한 장점이 있다
내에 주입하는 단계(S3)에 대하여 설명한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 (3) 단계의 이전 또는 동시에, 상기 PBMC 샘플의 주입 방향과 역방향으로 버퍼 용액을 주입할 수 있다. 이 때, 상기 PBMC 샘플의 주입 방향은 버퍼용액의 주입 방향과 역방향인 것이 바람직하다. 이 경우 분리 챔버 내에서 역류 원심분리에 의하여 PBMC가 보다 용이하게 무게 내지 크기에 따라 분리되어 분리층을 이룰 수 있게 된다.
상기 분리 챔버는 역류 원심분리에 의하여 PBMC 샘플의 층분리가 발생하는 공간을 형성하고 있는 챔버로, 해당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태 및 재질로 형성될 수 있다.
바람직하게는 상기 분리 챔버는 원추형 분리 챔버이며, 상기 원추형 분리 챔버는 원추부 및 상기 원추부와 연결되는 넥부로 이루어질 수 있다. 이 경우 역류 원심분리에 의하여 층분리가 용이하게 발생할 수 있다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버의 구조도이다. 도 2를 참조하면, 분리 챔버(1)는 원추부(10) 및 넥부(20)로 이루어진다. 상기 분리 챔버(1)의 원추부(10)는 원뿔 형태 및 원기둥 형태가 결합된 형태이며, 상기 분리 챔버(1)의 넥부(20)를 관통하여 분리 챔버(1)의 외부에서 내부로 형성된 인렛부(30)를 통해서 PBMC 샘플이 분리 챔버(1) 내부로 주입될 수 있다. 또한, 상기 인렛부(30)는 딥튜브(31)를 포함하여, 딥튜브(31)를 통해 PBMC 샘플이 주입될 수 있다. 원추부(10)의 꼭지부와 연결되도록 버퍼용액 유입부(40)가 형성될 수 있고, 넥부(20)와 연결되도록 폐기물 배출부(50)가 형성될 수 있다. 또한, 원추부(10)의 꼭지부로부터 O라인까지 원추부(10)는 공간이 점차적으로 넓어지는 구조로 형성되고, O라인으로부터 넥부(20)까지 점차적으로 공간이 점차적으로 좁아지는 구조로 형성된다. 상기 O라인은 후술하는 바와 같이 분리되는 층 간의 경계가 형성되는 지점일 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 분리 챔버는 복수개의 원추부(10)가 넥부(20)에 의해 연결되는 형태로 이루어질 수 있다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버의 구조도이다. 도 3을 참조하면, 분리 챔버(1)는 복수개의 원추부(10A, 10B) 및 넥부(20)를 포함한다. 복수개의 원추부(10A, 10B) 사이에 넥부(20)가 형성되어 이들을 연결하는 형태로 형성되어 있다.
이와 같이 복수개의 원추부(10)가 넥부(20)에 의해 연결되는 형태로 분리 챔버(1)가 형성되는 경우, 분리 챔버(1) 내의 공간이 점차적으로 넓어졌다가 좁아졌다가 다시 넓어지는 구조를 이루게 되어 역류 원심분리에 의한 층분리가 보다 명확하게 이루어질 수 있는 효과가 있다 .
다음으로, 상기 분리 챔버 내에서 상기 PBMC 샘플이 무게에 따라 다층 분리되는 단계(S4)에 대하여 설명한다.
분리 챔버(1) 내로 주입된 PBMC 샘플은 역류 원심분리에 의하여 무게 내지 크기에 따라 다층으로 분리될 수 있다. 이와 같이 층분리가 일어남으로써 PBMC 샘플로부터 CTC만을 용이하게 분리해낼 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (4)단계에서 상기 CTC 층은 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 혈구 세포와 상이한 층을 이룰 수 있다. 상술한 바와 같이, 마그네틱 비드가 혈구 세포에 특이적으로 결합하게 되면 크기 내지 무게가 증가하게 되는데, 이에 따라 층 분리가 원활하고 명확하게 수행될 수 있는 효과가 있다.
이와 관련하여 도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 분리 챔버 내에서 수행되는 역류 원심분리의 모식도이다. 도 4를 참조하면, 버퍼용액은 버퍼용액 유입부(40)를 통해 분리 챔버(1) 내로 유입(A)되고, PBMC 샘플은 인렛부(30)를 통해 분리 챔버(1) 내로 주입(B)된다. 이 때, X 방향대로 원심력이 작용하하고 버퍼용액이 역방향인 Y방향으로 주입됨에 따라, O라인을 기준으로 점차적으로 공간이 넓어지는 좌측부는 역류 속도가 감소하게 되고, O라인을 기준으로 점차적으로 공간이 좁아지는 우측부는 역류 속도가 증가하게 된다. 이에 따라 층분리가 일어나게 되고, 비교적 무게가 무겁거나 크기가 큰 세포들은 O라인을 기준으로 좌측부에 존재하고, 비교적 무게가 가볍거나 크기가 작은 세포들은 O라인을 기준으로 우측부에 존재하게 된다.
이와 같이 분리 챔버(1) 내에서 PBMC 샘플의 다층 분리가 용이하게 수행될 수 있고, 그 결과 분리의 순도를 높일 수 있어 수득하는 CTC 세포들의 순도가 높아지는 효과가 있다.
다음으로, (5) 상기 다층 분리 중 CTC 층을 선택적으로 분리 취득하는 단계(S5)에 대하여 설명한다.
상술한 과정을 통해 분리 챔버(1) 내에서 PBMC 샘플이 다층으로 분리되고, 이 중 CTC층만을 선택적으로 분리 취득함으로써 세포 중 존재하는 CTC를 효과적으로 분리 획득할 수 있게 된다.
또한, CTC층의 분리 취득은 상기 인렛부(30)를 통해서 수행될 수 있으며, 상기 인렉부(30)에 포함된 딥튜브(31)를 통해 수행될 수 있다. 또한, 그 밖의 폐기물(waste)은 폐기불 배출부(50)를 통해서 외부로 배출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (5) 단계는 자기장치를 이용하여 상기 마그네틱 비드를 자기력에 의하여 분리함으로써 수행될 수 있다. 자기장치는 자력을 인가할 수 있는 수단이면 제한없이 사용될 수 있고, 이용의 편의성을 위해 바람직하게는 영구적인 자석을 사용할 수 있다.
또한, 이와 같이 자기장치를 이용하여 마그네틱 비드가 결합한 세포와 그렇지 않은 세포를 분리하는 과정은 상기 분리 챔버(1) 외부에서 수행될 수 있다.
이와 같이 자기장치를 이용하여 마그네틱 비드가 결합한 세포와 자성에 반응하지 않는 세포들을 분리해낼 수 있고, 이 경우 분리 효율 및 순도를 높일 수 있다. 이에 따라 복잡한 전처리 과정 없이 비교적 간단한 방법만으로 혈액 중의 CTC를 분리할 수 있고, 세포 손실 없이 CTC를 분리할 수 있어 CTC 검사의 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있다.

Claims (10)

  1. (1) 전혈 샘플로부터 PBMC(말초 혈액 단핵세포, peripheral blood mononuclear cell) 샘플을 분리하는 단계;
    (2) 상기 PBMC 샘플에 비표적 세포와 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 마그네틱 비드를 투입하는 단계;
    (3) 상기 PBMC 샘플을 역류 원심분리가 수행되는 분리 챔버 내에 주입하는 단계;
    (4) 상기 분리 챔버 내에서 상기 PBMC 샘플이 무게에 따라 다층 분리되는 단계;및
    (5) 상기 다층 분리 중 CTC 층을 선택적으로 분리 취득하는 단계;를 포함하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계는 상기 전혈 샘플에 적혈구 응집성 시약을 첨가하여 PBMC 외의 세포들이 적혈구와 상호 응집되도록 함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 상기 마그네틱 비드에 고정된 항체가 혈구 세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 이전 또는 동시에, 상기 PBMC 샘플의 주입 방향과 역방향으로 버퍼 용액을 주입하는 것을 특징으로 하는 CTC 분리방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 (4)단계에서 상기 CTC 층은 상기 마그네틱 비드가 특이적으로 결합된 혈구 세포와 상이한 층을 이루는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 분리 챔버는 원추형 분리 챔버이며,
    상기 원추형 분리 챔버는 원추부 및 상기 원추부와 연결되는 넥부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 분리 챔버는 복수개의 원추부가 넥부에 의해 연결되는 형태로 이루어지는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 분리 챔버는,
    상기 원추부의 꼭지부와 연결되도록 형성되는 버퍼용액 유입부;및
    상기 넥부를 관통하여 분리 챔버의 외부에서 내부로 형성된 PBMC 샘플을 주입하는 인렛부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 인렛부를 통해서 PBMC 샘플이 주입 및 CTC 층 배출이 모두 수행되는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (5) 단계는 자기장치를 이용하여 상기 마그네틱 비드를 자기력에 의하여 분리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 역류 원심분리를 이용한 CTC 분리방법.
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