JP5831867B2 - 物質相互作用をリアルタイムに可視化する技術 - Google Patents
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(I-1)被験物質と標識物質との結合を検出するために用いられる顕微鏡観察用プレートであって、光透過性を有しかつ非発光性の樹脂材料により形成された平板状のものであり、一方の表面に、被験物質を結合させたビーズ及び標識物質を含む溶液の流路、又は、被験物質を結合させたビーズを含む溶液及び標識物質を含む溶液の流路、を構成する凹部を少なくとも1つ備え、前記凹部の底面には、前記ビーズを捕捉するための窪み部が複数形成されている顕微鏡観察用プレート。
(I-2)前記凹部を2つ以上備え、各凹部が互いに並行に延びることを特徴とする(I-1)に記載の顕微鏡観察用プレート。
(I-3)前記ビーズが球状であり、前記窪み部の深さが前記ビーズの直径の1/2よりも小さいことを特徴とする(I-1)または(I-2)に記載の顕微鏡観察用プレート。
(I-4)上記樹脂材料が親水加工処理されてなるものである、(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
(I-5)親水加工処理が、プラズマ放電処理またはコロナ放電処理である(I-4)に記載する顕微鏡観察用プレート。
(I-6)上記樹脂材料がポリジメチルシロキサンである、(I-1)乃至(I-5)のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
(II-1)内部に(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載の顕微鏡観察用プレートを載置可能な試料容器と、前記試料容器を収容可能な収容具と、前記収容具を保持可能であり顕微鏡ステージに載置される支持ユニットと、前記支持ユニットの上面側開口を覆う蓋とを有し、
前記試料容器は、上面が開口した本体と前記本体の上面を塞ぐ蓋体とを備えており、前記蓋体の上面または前記本体の側面には、少なくとも2つのホース接続部が一体に形成されており、前記ホース接続部には、前記試料容器内に反応液または洗浄液を供給もしくは排出するためのホースを挿通可能なホース挿入穴が形成されている顕微鏡観察用プレート載置装置。
(III-1)被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記(a)、(b)及び(c)の工程を行う方法:
(a)反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
(b)顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
(c)標識物質に由来する標識を検出する工程。
(III-2)被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記(a’)、(b)及び(c)の工程を行う方法:
(a’)顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程、
(b)顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
(c)標識物質に由来する標識を検出する工程。
(III-3)被験物質または標識物質が、ペプチド、タンパク質、核酸、糖類、脂質、酵素、酵素基質、受容体、リガンド、抗体、抗原、レクチン、ハプテン、その他の低分子または高分子化合物からなる群から選択される少なくとも一種である、(III-1)または(III-2)に記載する方法。
(III-4)被験物質または標識物質が、ペプチドまたはタンパク質である、(III-1)または(III-2)に記載する方法。
(III-5)被験物質がタグ付き物質である、(III-1)乃至(III-4)のいずれかに記載する方法。
(III-6)タグ付き物質のタグが、GSTタグ、MBPタグ、Hisタグ、Strep(II)タグ、FLAGタグ、HAタグ、mycタグ、及びBCCPタグからなる群から選択される少なくとも1つである、(III-5)に記載する方法。
(III-7)被験物質または標識物質の一方の物質として、核移行シグナルを有するタンパク質を用い、他方の物質として、核移行シグナルを認識し結合するタンパク質を用いることを特徴とする、(III-1)乃至(III-6)のいずれかに記載する方法。
(III-8)核移行シグナルが、NAC-1(nucleus accumbens-associated protein 1)の核移行シグナル、またはnucleoplasmin の核移行シグナルである(III-7)に記載する方法。
(III-9)核移行シグナルを認識し結合するタンパク質が、importin αである、(III-7)または(III-8)に記載する方法。
(III-10)被験物質と標識物質との相互作用を評価する方法である、(III-1)乃至(III-9)のいずれかに記載する方法。
(III-11)被験物質と標識物質とのアフィニティーを評価する方法である、(III-1)乃至(III-9)のいずれかに記載する方法。
図1は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用プレート1の外観構成を示している。また、図2は、図1の顕微鏡観察用プレート1のA−A線に沿う断面図を、図3は、図1の顕微鏡観察用プレート1(以下、単に「プレート1」とも称する)のB−B線に沿う断面図を、それぞれ示している。
顕微鏡観察用プレート載置装置5は、図6に示すように、支持ユニット6、収容具7および蓋8によって構成されている。支持ユニット61は、略長方形型の枠状に形成された本体部60を有している。この本体部60は、外壁61、内壁62および底壁63によって構成されており、上面には上面側開口64が、下面には下面側開口65が、それぞれ形成されている。内壁62の内側面の下端部には、内側へ突き出す支持部66が形成されている。本体部60の底壁62の裏面には、ヒータ74が設けられている。このヒータ74は、金属板にニクロム線が埋設状に備えられた構成のものであり、底壁62の裏面に密着した状態に貼り付けられ、底壁62の下面側開口65はこのヒータ74によって覆われている。ヒータ74には長方形状の孔75が形成されている。なお、図6中、67は電気コードであり、電気コード67はヒータ74のニクロム線に電気的に接続されている。
本発明は、上記(I)顕微鏡観察用プレートまたは当該プレートを備えた(II)顕微鏡観察用プレート載置装置を用いて、顕微鏡を用いて、物質と物質との結合をリアルタイムに検出する方法である。
(a)反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
(b)顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
(c)標識物質に由来する標識を検出する工程。
(a’)顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程。
(a)工程
当該(a)工程は、反応液中で物質と物質とを接触させる工程である。
本発明において、一方の物質は、発色性または化学発光性の可視化プローブにより予め標識し、標識物質として調製しておくことが好ましい。可視化プローブとしては、好ましくは蛍光プローブを挙げることができる。なお、標識化は、定法に従って行うことができる。
当該(a’)工程は、物質と物質との接触反応を顕微鏡観察用プレート上で行う上記(a)工程とは異なり、予め被験物質を結合させたビーズ(被験物質結合ビーズ)と標識物質を試験管やペトリ皿などに入れた反応液中で混合して、当該被験物質結合ビーズと標識物質を含む反応液を、顕微鏡観察用プレート1の流路内(凹部2内)に供し、その目に並行して通液する工程である。反応液の条件や接触させる時間は、上記(a)工程に関して説明した通りである。
当該(b)工程は、上記(a)工程で標識物質を接触させた被験物質結合ビーズを洗浄する工程である。被験物質に対するアフィニティーが弱い標識物質は、(a)工程において、被験物質を介して一旦はビーズに結合しているものの、当該(b)工程により当該ビーズから解離する。
当該(c)工程は、標識物質に由来する標識を検出する工程である。当該工程は、前述する(a)と(b)の工程または(a’)と(b)の工程と同時並行して行われるか、少なくとも(b)の工程と同時並行して行われる。
(1)実験方法
(1-1)GST融合importin α3タンパク質の調製
importin αは細胞の核膜に存在し、タンパク質に存在する核移行シグナル(NLS)を認識し結合するタンパク質で、NLS依存的にタンパク質を核内へ運び込むことが知られている。当該importin αは、C末端領域のアルマジロ反復配列に存在する、種を超えて高度に保存されているアミノ酸を変異させることでその結合能が消失することが知られている(Goldfarb D. et al., Trends Cell Biol., 14: 505-514, 2004 および Lange A., et al., J. Biol. Chem., 282: 5101-5105, 2007)。中でもヒトimportin α3は、N末端側から179番目のトリプトファン(W)と183番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)に変異することでその結合能が消失する(Conti, E. et al., Cell 94: 193-204, 1998)。
ヒトimportin α3 (GenBank: AAC25605.1、GI:1928975)のcDNA(アミノ酸配列では65-521)を組み込んだGST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1(GEヘルスケア・ジャパン社)(Kosugi S. et al., J. Biol. Chem., 284: 478-485, 2008)を用いて、大腸菌の形質転換を行った。イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)誘導されたGST融合importin α3(野生型)タンパク質を含む大腸菌溶解液から、グルタチオンアガロースビーズ(Sigma社)を用いて、GST融合importin α3(野生型)タンパク質を精製した。
ヒトimportin α3のcDNA を鋳型として、下記のプライマーを用いて常法に従ってoverlap PCR 法を行い、ヒトimportin α3(W179A、N183A)cDNAを作成した。ヒトimportin α3(W179A、N183A)のcDNA(アミノ酸配列では65-521)を組み込んだGST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1(GEヘルスケア・ジャパン社)を用いて、大腸菌の形質転換を行った。イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)誘導されたGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を含む大腸菌溶解液から、グルタチオンアガロースビーズ(Sigma社)を用いて、GST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を精製した。
W179A N183A-S:
5′-TGT GAG CAA GCA GTG GCG GCA TTG GGA GCT ATC ATA GGT GAT GGG- 3’(配列番号3)
W179A N183A-AS:
5′-CCC ATC ACC TAT GAT AGC TCC CAA TGC CGC CAC TGC TTG CTC ACA- 3’(配列番号4)。
テストサンプルとして、赤色蛍光タンパク質mCherryを融合させた「NAC-1(180-207)」、赤色蛍光タンパク質mCherryを融合させた「nucleoplasmin-NLS」、及び対照例として赤色蛍光タンパク質mCherryを調製した。
上記で調製したGST融合importin α3(野生型)タンパク質、及びGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を、それぞれ定法に従ってグルタチオンビーズに結合させ、次いでこれらを各テストサンプル(mCherry融合NAC-1(180-207)、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry)と混合した。得られたビーズを遠心処理して沈降させ、1% Triton X-100を含むPBSで複数回洗浄した後、SDSサンプル緩衝液を加え加熱してビーズから各タンパク質を遊離した。ビーズから遊離したタンパク質を、SDS-PAGE法により分離し、クマシー染色してタンパク質を同定した。
結果を図11に示す。図11中、「input」のレーンは、各テストサンプル(mCherry融合NAC-1(180-207)、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry)の標品そのものをSDS-PAGEに供したstandard結果を示す。
(1)実験方法
市販のカバーガラスの上で、グルタチオンビーズ(実験例1で調製した、GST融合importin α3(野生型)タンパク質またはGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたグルタチオンビーズ)とテストサンプル(実験例1で調製したmCherry融合NAC-1(180-207)、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry)を、1% Triton X-100を含むPBS(反応溶液)中でそれぞれ混合し、蛍光顕微鏡(コンフォーカルレーザー顕微鏡;オリンパス社製)を用いて観察した。図11にアッセイの概略を示す。単に混ぜるだけで、1分もかけないでアッセイできる簡単な方法である。
実際の観察データを図12に示す。左図は蛍光観察結果であり、右図は透過光観察結果である。コンフォーカル顕微鏡を用いているため、グルタチオンビーズに結合させたタンパク質とテストサンプルのタンパク質との間にタンパク質相互作用がある場合、蛍光観察で、ビーズの周囲に円状に赤色蛍光タンパク質mCherryに起因するシグナルが観察される。ビーズ12個分の蛍光強度を測定し、統計処理した結果を図13に示す。ここでは、図11のレーン8に示すように実験例1のpull-downアッセイでは結合が見られなかったヒトimportin α3(W179A、N183A)とnucleoplasmin-NLSとの結合を示すシグナルが認められた(図12:右側の中段、図13:右から3番目)。
実験例2の実験において、顕微鏡観察用の市販のカバーガラス上の反応溶液(1% Triton X-100を含むPBS)を一部回収し、洗浄液(1% Triton X-100を含むPBS)をその容量分追加するという方法によって、反応溶液の希釈を繰り返し、顕微鏡観察を行った。
市販のカバーガラスに代えて、本発明の顕微鏡観察用プレート(マイクロ流路付きプレート)(図1参照)を用いて、グルタチオンビーズ(実験例1で調製したGST融合importin α3(野生型)タンパク質、またはGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたビーズ)とテストサンプル(実験例1で調製したmCherry融合nucleoplasmin-NLS)との相互作用を蛍光顕微鏡(コンフォーカルレーザー顕微鏡;オリンパス社製)を用いて観察した。
2 凹部
3 窪み部
5 顕微鏡観察用プレート載置装置
6 支持ユニット
7 収容具
8 蓋
9 試料容器
10 プレートの表面
22 凹部の底面
90 本体
91 蓋体
93 ホース接続部
94 ホース挿入穴
M ビーズ
Claims (10)
- 被験物質と標識物質との結合を検出するために用いられる顕微鏡観察用プレートであって、
光透過性を有しかつ非発光性の樹脂材料により形成された平板状のものであり、
一方の表面に、被験物質を結合させたビーズ及び標識物質を含む溶液の流路、又は、被験物質を結合させたビーズを含む溶液及び標識物質を含む溶液の流路、を構成する凹部を少なくとも1つ備え、
前記凹部の底面には、前記ビーズを捕捉するための窪み部が複数形成されている顕微鏡観察用プレート。 - 前記凹部を2つ以上備え、各凹部が互いに並行に延びることを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡観察用プレート。
- 前記ビーズが球状であり、前記窪み部の深さが前記ビーズの直径の1/2よりも小さいことを特徴とする請求項1または2に記載の顕微鏡観察用プレート。
- 前記樹脂材料が、表面が親水加工処理されてなる樹脂材料である、請求項1乃至3のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
- 親水加工処理された前記樹脂材料が、プラズマ放電処理またはコロナ放電処理により親水加工処理されたポリジメチルシロキサンである、請求項4に記載する顕微鏡観察用プレート。
- 内部に請求項1乃至5のいずれかに記載の顕微鏡観察用プレートを載置可能な試料容器と、前記試料容器を収容可能な収容具と、前記収容具を保持可能な顕微鏡ステージに載置される支持ユニットと、前記支持ユニットの上面側開口を覆う蓋とを有し、
前記試料容器は、上面が開口した本体と前記本体の上面を塞ぐ蓋体とを備えており、前記蓋体の上面または前記本体の側面には、少なくとも2つのホース接続部が一体に形成されており、前記ホース接続部には、前記試料容器内に反応液または洗浄液を供給もしくは排出するためのホースを挿通可能なホース挿入穴が形成されている顕微鏡観察用プレート載置装置。 - 被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、請求項1乃至5のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記(a)、(b)及び(c)の工程を行う方法:
(a)反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
(b)顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
(c)標識物質に由来する標識を検出する工程。 - 被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、請求項1乃至5のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記(a’)、(b)及び(c)の工程を行う方法:
(a’)顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程、
(b)顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
(c)標識物質に由来する標識を検出する工程。 - 被験物質または標識物質の一方の物質として、核移行シグナルを有するタンパク質を用い、他方の物質として、核移行シグナルを認識し結合するタンパク質を用いることを特徴とする、請求項7または8に記載する方法。
- 核移行シグナルが、NAC-1(nucleus accumbens-associated protein 1)の核移行シグナル、またはnucleoplasmin の核移行シグナルであるか、または
核移行シグナルを認識し結合するタンパク質が、importin αである、請求項9に記載する方法。
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