CN104293931B - 一种定量RNaseH活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量RNaseH活性测定方法，所述方法包括如下步骤：以一段RNA模板为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA‑RNA杂合链；以该DNA‑RNA杂合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后测定DNA单链或DNA‑RNA杂合链的相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度。该方法与现有技术方法相比，无放射性污染，操作简单便利，逆转录方法得到的DNA‑RNA杂合链可直接用于RNaseH的测活，不需要再经过酚氯仿抽题、乙醇沉淀等步骤，并且可以RNaseH活性进行定量的检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种定量RNaseH活性测定方法。
背景技术
RNaseH，即核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H是基因工程技术中一种重要的工具酶，其应用包括cDNA第二条链合成前去除mRNA；通过互补的DNA序列实现对RNA的定点剪切；除去杂交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A)；体外多腺苷酸化反应(polyadenylation reaction)产物研究。此外，RNaseH在逆转录病毒中起着非常重要的作用，并且也是目前非转录病毒的重要药物靶标。因此，精确、快速、简便测定RNase H活性，可以保证RNase H作为工具酶的质量稳定性，且有助于促进抗病毒药物的开发，具有极大的理论和现实意义。
标准的RNaseH测活方法采用放射性同位素法。将RNaseH进行2倍连续梯度稀释，加入到含3H-poly(rA)、poly (dT) DNA和1× RnaseH缓冲液的50μL反应体系中，37℃条件下孵育，产物用TCA沉淀并加在whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记物的分离。再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定酸可溶性物质中放射性同位素的量，就可以计算出RNase H的活性。这种方法存在易产生放射性污染、步骤多、周期长的缺陷，难以实现高通量、自动化。
发明内容
本发明的目的在于建立一种简便、快速、非放射性且定量的RNaseH测活方法，其原理如图1所示。
具体来说，本发明采用了如下技术方案：
一种定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以一段RNA模板为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA-RNA杂合链；以该DNA-RNA杂合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后测定DNA单链或DNA-RNA杂合链的相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度。
优选地，DNA单链或DNA-RNA杂合链的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且该相对量是以荧光强度表示的。更优选，所用的荧光染料是双链特异性荧光染料。在一个实施方案中，所用的双链特异性荧光染料是商购的picogreen染料。
RNA模板可以采用任何适合长度的RNA单链，只要能方便地测定RNaseH酶活即可。在一个实施方案中，所用RNA模板为一段polyA RNA单链，所用的DNA引物为Oligo dT。
本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单，重复性好，稳定性强，反应迅速；
3. 逆转录方法得到的DNA-RNA杂合链可直接用于RNaseH的测活，不需要再经过酚氯仿抽题、乙醇沉淀等步骤；
4. 可以对RNaseH活性进行定量的检测分析，便于操作。
附图说明
图1为本发明测定方法的原理图。
图2为通过本发明方法测得的RNaseH活性-荧光强度曲线图。
图3为不同来源RNaseH的酶活-荧光强度曲线图。
具体实施方式
本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的RNaseH测活方法，其原理如图1所示。
如图1所示，本发明选择polyA作为RNA单链，以Oligo dT为引物，先用逆转录酶进行相匹配的cDNA链的合成，生成的DNA-RNA杂合链作为本测活方法中的底物。若加入RNaseH，则该酶会降解DNA-RNA杂合链中的RNA链，产生一条DNA单链，该单链不能被双链特异性的picogreen染料结合，不产生荧光；若不加入RNaseH，体系中仍是DNA-RNA杂合链的结构，则可以被双链特异性的picogreen染料结合，发出荧光。
由此可见，RNaseH的活性在一定范围内同DNA-RNA杂合链的量成反比，而DNA-RNA杂合链的量在一定情况下，同荧光强度成正比。因此，RNaseH的活性就可以用picogreen荧光强度来进行测定。
本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的RNaseH测活方法。
下面将结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1. 荧光法测定RNaseH活性方法的建立
1. 构建DNA+RNA杂合链体系：
逆转录酶为PrimeScript逆转录酶(TaKaRa 2680A)
| 组分 | 体积 |
| DEPC水 | 至50μl |
| 5x RT缓冲液 | 10 |
| PolyA（1mg/mL） | 5μl |
| Oligo dT 18（10μM） | 10μl |
| dTTP（10mM） | 2μl |
| 逆转录酶（TaKaRa） | 1 U |
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持 |
2. 降解DNA+RNA杂合链中RNA链的反应：
RNaseH为NEB M0297
| 组分 | 体积 |
| 上述制备的DNA+RNA杂合链 | 15μl |
| RNaseH | 0-1024 U |
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持 |
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
| RNaseH酶量 (U) | 荧光数值 |
| 1024 | 252. |
| 512 | 255. |
| 256 | 253. |
| 128 | 286. |
| 64 | 363. |
| 32 | 527. |
| 16 | 668. |
| 8 | 953. |
| 4 | 932. |
| 2 | 1027. |
| 1 | 1068. |
| 0 | 1097. |
这一结果表明：RNaseH可降解DNA+RNA杂合链中RNA链，且降解程度呈现剂量依赖性。
通过本实施例，我们可以实现对RNaseH的快速、简便的表征，为后续RNaseH活性的精确测定奠定了基础。
实施例2.RNaseH活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算
以1#-11#的RNaseH活性单位(U)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
| 实验 | EC50 (mU) |
| 1 | 19.55 |
| 2 | 20.08 |
| 3 | 19.74 |
| 4 | 19.39 |
| 5 | 20.21 |
| 平均值 (mU) | 19.79 |
| 标准差SD (U) | 0.35 |
| 变异系数 CV (%) | 1.75 |
实施例3. 荧光法测定不同来源的RNaseH活性，并进行单位标定
我们又选择了两种商品化RNaseH并自行表达纯化RNaseH。自制RNaseH克隆自T4噬菌体RNaseH基因，克隆至pET28a表达载体并转化大肠杆菌BL21进行表达。表达产物采用常规层析方法纯化至约95%的纯度。所有RNaseH均采用放射性同位素方式进行活性测定。国际单位（IU）定义为：37℃20分钟内，能够催化1nmol杂合双链中的RNA形成酸可溶性核糖核苷酸形式所需的酶量定义为1个活性单位。按照实施例1的方法，绘制活性-荧光强度标准曲线并计算EC50。结果如图3所示绘制成曲线并提供如下：
| 厂家 | 货号 | EC50 (mU) |
| NEB | M0297 | 18.29±1.97 |
| Takara | 2150A | 18.41±0.73 |
| Enzymatics | Y9220L | 16.73±1.02 |
| 自制 | -- | 16.16±0.86 |
| 平均 | 17.40±1.15 |
上述结果表明，不同来源的RNaseH的活性（用EC50表示）是一个恒定的值。因此，这一EC50值可作为本方法的RNaseH活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的RNaseH酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=17.40 mU（放射性法）。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (3)
1.一种定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以一段RNA模板为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA-RNA杂合链；以该DNA-RNA杂合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后利用双链特异性荧光染料，通过荧光法测定DNA单链或DNA-RNA杂合链的相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度，其中所用的双链特异性荧光染料是picogreen染料。
2.如权利要求1所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，通过荧光法测得的相对量是以荧光强度表示的。
3.如权利要求1所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所用RNA模板为一段polyA RNA单链，所用的DNA引物为Oligo dT。
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| CN201410502173.3A CN104293931B (zh) | 2014-09-28 | 2014-09-28 | 一种定量RNaseH活性测定方法 |
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