CN116590436B - 鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT‑PCR试剂盒，包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对SEQ ID NO:1‑2和探针SEQ ID NO:3，以及用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对SEQ ID NO:4‑5和探针对SEQ ID NO:6‑7。本发明利用比较基因组分析Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌基因组差异核酸突变位点，结合RT‑PCR方法构建MGB探针检测方法，通过探针的扩增曲线及Ct值判断是否为布鲁氏菌Rev.1疫苗株。本方法无需经过测序，通过判断不同探针的扩增曲线和Ct值即可将Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌区分。该方法可用于布鲁氏菌疫苗株和野毒株感染鉴别，为布病防控提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生菌，能引起世界范围内的人畜共患病—布鲁氏菌病(以下简称布病)。因布病造成的患者劳动力丧失和母畜繁殖障碍每年造成数亿美元的损失，严重危害公共卫生安全和经济发展。我国的布病新增病例出现在全年各个季节，但与牛、羊的生产关联性较强，高峰期为3-8月份，存在明显的流行季节性；任何年龄组的人群均对布病敏感；同时，布病对性别无明显差异，感染率的高低主要取决于接触机会。
目前布病最有效的防控方式就是疫苗接种。国际上成功应用的动物布病疫苗有RB51、S19和Rev.1，国内常用的动物布病疫苗为A19、M5和S2。Rev.1疫苗株免疫后宿主可以长时间抵抗布鲁氏菌野毒的感染，是目前世界上公认的用于小反刍动物布病防控最有效的疫苗。Rev.1疫苗株在世界上许多布病严重流行的国家和地区(如蒙古、塔吉克斯坦)进行接种用于布病防控，效果显著。布鲁氏菌病防控过程中尚缺少将疫苗株Rev.1免疫与野毒感染进行准确区分的有效手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒。
本发明的另一目的是提供布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR检测方法。
本发明构思如下：通过全基因组比对，发明人获得了布鲁氏菌中均存在的核心基因。以公布的Rev.1基因组(GCA_000158695.1)为参考序列，与其他测序布鲁氏菌基因组全基因组比对后发现存在差异SNP位点。将SNP位点所在的序列扩增后筛选获得位于NZ_EQ999573.1序列的326296位点存在可供检测的A/G基因多态性位点。因此，本发明根据核心基因(NCBI：CUC12_RS13500，以公布的Rev.1基因组为参考)设计布鲁氏菌检测引物SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2以及探针SEQ ID NO:3，针对Rev.1疫苗株与其他布鲁氏菌存在的差异SNP位点所在序列设计引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，根据SNP位点设计MGB探针对SEQID NO:6-7。布鲁氏菌引物和探针的检测结果，结合MGB探针荧光信号收集结果，可以鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌感染。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对，包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和如SEQ ID NO:5所示的下游引物。
第二方面，本发明提供用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的引物和探针组合，包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和如SEQ ID NO:5所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:6和7所示的探针。
第三方面，本发明提供用于检测布鲁氏菌的特异性引物对，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。
第四方面，本发明提供用于检测布鲁氏菌的引物和探针组合，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:3所示的探针。
第五方面，本发明提供含有引物对SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、或者引物和探针组合SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:4-7的检测试剂或试剂盒。
第六方面，本发明提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3，以及用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及探针对SEQ ID NO:6-7，分别为：
SEQ ID NO:1：5’-ACAGTGACCATCCTCCTGAT-3’
SEQ ID NO:2：5’-TGTTGCGGTAAAGTGTGTAGAG-3’
SEQ ID NO:3：5’-Cy5-CCGTGTCATGACGGCGATGGAA-BHQ-1-3’
SEQ ID NO:4：5’-AGCACCAGGGCCTGCAT-3’
SEQ ID NO:5：5’-GGGCGACAAGGATTTTTCC-3’
SEQ ID NO:6：5’-VIC-ACAGGAGACCACC-MGB-3’
SEQ ID NO:7：5’-FAM-AGGAGACCGCCTTC-MGB-3’
进一步地，所述试剂盒还包括反应缓冲液、probe taq酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品等。
其中，所述阳性质控标准品由布鲁氏菌疫苗株Rev.1调整比浊度，其菌含量为3.0×105-9.0×105CFU/mL(以保证扩增Ct值范围)，经80℃-热灭活60min或100℃热灭活15min制成。
所述阴性质控标准品可以是灭菌双蒸水。
第七方面，本发明提供布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR检测方法(含非诊断目的)，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用所述的RT-PCR试剂盒，进行扩增并收集FAM、VIC和Cy5信号；
(3)结果判定：阳性质控标准品FAM和Cy5信号存在扩增曲线，VIC信号不存在扩增曲线，Ct值为31-35之间，阴性质控标准品未存在扩增曲线；否则试验失败，需重做；
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号不存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为布鲁氏菌Rev.1疫苗株；
对于待测样本而言，FAM信号不存在扩增曲线或Ct值>35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为除Rev.1疫苗株外的其他布鲁氏菌菌株；
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号且Ct值<35存在扩增曲线，则待测样本为混合Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌菌株；
对于待测样本而言，Cy5信号不存在扩增曲线，或Ct值>35，无论FAM和VIC信号是否有扩增曲线，则待测样本均为非布鲁氏菌。
优选地，扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火及延伸30s，45个循环，每个循环结束时收集荧光信号。
所述待测样本包括但不限于菌体培养物、血液、血清、奶样、组织、气溶胶。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用比较基因组分析Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌基因组差异核酸突变位点(SNP)，结合RT-PCR方法构建MGB探针检测方法，通过探针的扩增曲线及Ct值判断是否为布鲁氏菌Rev.1疫苗株。本方法无需经过测序，通过判断不同探针的扩增曲线和Ct值即可将Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌区分。该方法可应用于布鲁氏菌疫苗株和野毒株感染鉴别，切实为我国布病防控提供技术支持。
本发明提供的RT-PCR试剂盒特异性强，可重复性好，能够准确鉴别样品中是否含有的布鲁氏菌疫苗株Rev.1，可有效解决布鲁氏菌病防控过程中疫苗株Rev.1免疫与野毒感染难以区分的问题。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中试剂盒检测梯度稀释布鲁氏菌Rev.1疫苗株布鲁氏菌株。A为FAM信号检测结果，扩增曲线从左至右分别为104-102CFU/μL；B为Cy5信号检测结果，扩增曲线从左至右分别为104-102CFU/μL。
图2为本发明较佳实施例中试剂盒检测Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌菌株。检测样品分别为羊种布鲁氏菌1-3型，牛种布鲁氏菌1-7型和9型，猪种布鲁氏菌1-5型，犬种布鲁氏菌，沙林鼠种布鲁氏菌，绵羊种布鲁氏菌，疫苗株Rev.1，A19和S2。A为VIC探针检测结果，B为FAM信号检测结果，C为FAM和VIC探针同时检测结果。
图3为本发明较佳实施例中试剂盒检测其他细菌和布鲁氏菌菌株。检测样品分别为大肠杆菌ATCC 25922，沙门氏菌H9812，耶尔森菌O9，单增李斯特菌ATCC 19115，炭疽杆菌Sterne，多杀巴氏杆菌(分离株)和布鲁氏菌Rev.1疫苗株。除阳性对照和布鲁氏菌Rev.1疫苗株外，其余细菌均无扩增曲线。
具体实施方式
本发明旨在提供一种能够鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌感染的方法，用于解决布病防控中Rev.1疫苗株和野毒株感染鉴别的问题，该试剂盒能够有效鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒，该RT-PCR试剂盒由A液(缓冲液和probe taq酶)、B液(引物对、探针对和灭菌双蒸水)、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成。
其中，B液包括灭菌双蒸水，用于检测布鲁氏菌的特异性引物对SEQ ID NO:1和SEQID NO:2以及探针SEQ ID NO:3，以及检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5以及探针对SEQ ID NO:6-7，分别为：
SEQ ID NO:1：5’-ACAGTGACCATCCTCCTGAT-3’
SEQ ID NO:2：5’-TGTTGCGGTAAAGTGTGTAGAG-3’
SEQ ID NO:3：5’-Cy5-CCGTGTCATGACGGCGATGGAA-BHQ-1-3’
SEQ ID NO:4：5’-AGCACCAGGGCCTGCAT-3’
SEQ ID NO:5：5’-GGGCGACAAGGATTTTTCC-3’
SEQ ID NO:6：5’-VIC-ACAGGAGACCACC-MGB-3’
SEQ ID NO:7：5’-FAM-AGGAGACCGCCTTC-MGB-3’。
所述阳性质控标准品由布鲁氏菌疫苗株Rev.1调整比浊度，其菌含量约为3.0×105-9.0×105CFU/mL，经80℃热灭活60min或100℃热灭活15min制成；
所述阴性质控标准品由灭菌双蒸水。
特异性引物对SEQ ID NO:1-2扩增序列如下(5′-3′)：
特异性引物对SEQ ID NO:4-5扩增序列如下(5′-3′)：
本发明还提供所述特异性引物对和探针对用于制备检测布鲁氏菌RT-PCR试剂盒、芯片中的应用。
本发明还提供所述特异性引物对和探针对用于制备检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒、芯片中的应用。
本发明中，用于标记所述探针的荧光基团包括但不限于FAM，VIC，HEX，ROX，Cy5，BHQ1，BHQ2，MGB等。
本发明还提供包含所述特异性引物对和探针对的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括：缓冲液、probe taq酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品。
本发明还提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本的基因组DNA，以提取的DNA为模板，将模板、A液和B液按比例混合，进行扩增并收集FAM、VIC和Cy5信号。
PCR扩增体系为25μL，具体包括：12μL A液，11μL B液，2μL提取的DNA模板。
扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火及延伸30s，45个循环，每个循环结束时收集荧光信号。
(2)结果判定：阳性质控标准品FAM和Cy5信号存在扩增曲线，VIC信号不存在扩增曲线，Ct值为31-33之间，阴性质控标准品未存在扩增曲线；否则试验失败，需重做。
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号不存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为布鲁氏菌Rev.1疫苗株。
对于待测样本而言，FAM信号不存在扩增曲线或Ct值>35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为除Rev.1疫苗株外的其他布鲁氏菌菌株。
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号且Ct值<35存在扩增曲线，则待测样本为混合Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌菌株。
对于待测样本而言，Cy5信号不存在扩增曲线，或Ct值>35，无论FAM和VIC信号是否有扩增曲线，则待测样本均为非布鲁氏菌。
本发明提供的试剂盒及其使用方法，其直接目的是鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌，而非获取疾病诊断结果。
本发明的目的是提供一种能够鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌感染的方法，用于解决布病防控中Rev.1疫苗株和野毒株感染鉴别的问题，该试剂盒能够有效鉴别Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌。该试剂盒完全可以推广应用，有助于推动布病的诊断和防控。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的试验材料：
羊种布鲁氏菌1-3型，牛种布鲁氏菌1-7型和9型，猪种布鲁氏菌1-5型，犬种布鲁氏菌，沙林鼠种布鲁氏菌，绵羊种布鲁氏菌，疫苗株Rev.1，A19和S2菌株均在中国疾病预防控制中心传染病预防控制所内复苏、传代并灭活；大肠杆菌ATCC 25922，沙门氏菌H9812，耶尔森菌O9，单增李斯特菌ATCC 19115，炭疽杆菌Sterne，多杀巴氏杆菌(分离株)均在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所内复苏、传代并灭活。
荧光定量用的Buffer(含有Mg2+)、dNTP Mixture(2.5mM)，探针用probe taq聚合酶均购自宝生物(大连)有限公司；扩增引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；荧光定量用八联排管购自爱思进公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
试验仪器：荧光定量PCR扩增仪(西安天隆科技有限公司)；细菌比浊仪(梅里埃诊断公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；干热灭菌器(Thermo公司)；小型离心机(Thermo公司)；微型离心机(Thermo公司)。
实施例1鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒的组装
(1)配制RT-PCR扩增体系
a.设计特异性扩增引物及探针，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列为：
SEQ ID NO:1：5’-ACAGTGACCATCCTCCTGAT-3’
SEQ ID NO:2：5’-TGTTGCGGTAAAGTGTGTAGAG-3’
SEQ ID NO:3：5’-Cy5-CCGTGTCATGACGGCGATGGAA-BHQ-1-3’
SEQ ID NO:4：5’-AGCACCAGGGCCTGCAT-3’
SEQ ID NO:5：5’-GGGCGACAAGGATTTTTCC-3’
SEQ ID NO:6：5’-VIC-ACAGGAGACCACC-MGB-3’
SEQ ID NO:7：5’-FAM-AGGAGACCGCCTTC-MGB-3’
b.RT-PCR液的配制：
所述A液包括缓冲液、probe taq酶，所述B液包括灭菌双蒸水，用于检测布鲁氏菌的特异性引物对SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3，以及用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对SEQ ID NO:4-5和探针对SEQ ID NO:6-7。
扩增体系为25μL/样本，具体包括：12μL A液，11μL B液，2μL提取的DNA模板。
(2)阳性质控标准品的制备：
划线培养布鲁氏菌疫苗株Rev.1菌株3-5d后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为3.0×108CFU/mL)。经80℃热灭活60min，体积为200μL。
(3)阴性质控标准品的制备：
阴性质控标准品为灭菌双蒸水，体积为500μL。
实施例2布鲁氏菌Rev.1鉴别试剂盒检测最低检测值
(1)划线培养布鲁氏菌疫苗株Rev.1菌株3-5d后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为3.0×108CFU/mL)。取100μL菌液进行10倍梯度稀释，滴板计数，调整菌液浓度，最终检测样品中菌含量为3×104-3×101CFU/μL。
(2)将不同菌含量的待测菌液经80℃热灭活60min。
(3)定量的灭活菌液为模板，将模板、A液和B液按比例混合，同时进行阴性质控标准品对照，按如下程序和体系进行扩增检测。
扩增体系为25μL/样品，具体包括：12μL A液，11μL B液，2μL灭活的菌液模板。
荧光定量扩增程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，45个循环。
(4)结果判定。阴性质控标准品没有扩增曲线，阳性质控标准品有扩增曲线，试验成立。
(5)结果读取。由于检测样品为Rev.1疫苗株，因此VIC通道没有信号，FAM和Cy5通道均存在信号。图1结果显示，检测含菌量为102CFU/μL的样品时，FAM和Cy5信号检测Ct值均为34左右。以上结果表明，试剂盒中的FAM和Cy5探针检测含Rev.1疫苗株的样品最低检测菌含量为102CFU/μL。
实施例3试剂盒检测布鲁氏菌不同种型的标准菌株
利用本发明对不同种型的布鲁氏菌菌株进行检测，并设阳性和阴性对照。
(1)划线培养不同种型的布鲁氏菌3-5d后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为3.0×108CFU/mL)。取100μL稀释的待测菌液经80℃热灭活60min。
(2)定量的灭活菌液为模板，将模板、A液和B液按比例混合，同时进行阴性质控标准品对照，按如下程序和体系进行扩增检测。
扩增体系为25μL/样品，具体包括：12μL A液，11μL B液，2μL灭活的菌液模板。
荧光定量扩增程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，45个循环。
(3)结果判定。阴性质控标准品没有扩增曲线，阳性质控标准品有扩增曲线，试验成立。
(4)结果读取。试剂盒检测不同种型的布鲁氏菌可行性结果见图2。由于检测样品均为布鲁氏菌，因此Cy5通道均存在扩增曲线。其余通道的荧光扩增曲线及Ct值结果表明，阴性质控标准品未存在扩增曲线，阳性质控标准品FAM通道存在扩增曲线，且Ct值为32.16(符合Ct值在31-33之间)，表明本次试验对照成立。
检测结果表明，检测样品除Rev.1疫苗株外，其余菌株VIC通道均存在扩增曲线，FAM通道无扩增曲线或Ct值大于35；Rev.1疫苗株FAM通道存在扩增曲线，VIC通道无扩增曲线。
实施例4试剂盒的特异性考察
利用本发明试剂盒对大肠杆菌ATCC 25922，沙门氏菌H9812，耶尔森菌O9，单增李斯特菌ATCC 19115，炭疽杆菌Sterne，多杀巴氏杆菌(分离株)和布鲁氏菌Rev.1菌株进行特异性检测，并设阳性和阴性对照。
(1)划线培养不同细菌3-5d后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为3.0×108CFU/mL)。取100μL稀释的待测菌液经80℃热灭活60min。
(2)定量的灭活菌液为模板，将模板、A液和B液按比例混合，同时进行阴性质控标准品对照，按如下程序和体系进行扩增检测。
扩增体系为25μL/样品，具体包括：12μL A液，11μL B液，2μL灭活的菌液模板。
荧光定量扩增程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，45个循环。
(3)结果判定。阴性质控标准品没有扩增曲线，阳性质控标准品有扩增曲线，试验成立。
(4)结果读取。试剂盒检测不同种细菌的结果见图3。由于检测样品是否为布鲁氏菌，因此主要看Cy5通道是否存在扩增曲线及Ct值。结果表明，除布鲁氏菌Rev.1外，其余菌株Cy5通道均没有扩增曲线，表明探针特异性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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5.丁家波,冯忠武.动物布鲁氏菌病疫苗应用现状及研究进展[J].生命科学,2013,25(1):9.
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7.BANAI M.Control of small ruminant brucellosis by use of Brucellamelitensis Rev.1vaccine:laboratory aspects and field observations[J].VetMicrobiol,2002,90(1-4):497-519.
Claims (10)
1.用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对，其特征在于，包括如SEQ IDNO:4所示的上游引物和如SEQ ID NO:5所示的下游引物。
2.用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的引物和探针组合，其特征在于，包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和如SEQ ID NO:5所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:6和7所示的探针。
3.用于检测布鲁氏菌的特异性引物对，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。
4.用于检测布鲁氏菌的引物和探针组合，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:3所示的探针。
5.含有权利要求1或3所述引物对、或者权利要求2或4所述引物和探针组合的检测试剂或试剂盒。
6.鉴别布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3，以及用于检测布鲁氏菌疫苗株Rev.1的特异性引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及探针对SEQ ID NO:6-7，分别为：
SEQ ID NO:1：5’-ACAGTGACCATCCTCCTGAT-3’
SEQ ID NO:2：5’-TGTTGCGGTAAAGTGTGTAGAG-3’
SEQ ID NO:3：5’-Cy5-CCGTGTCATGACGGCGATGGAA-BHQ-1-3’
SEQ ID NO:4：5’-AGCACCAGGGCCTGCAT-3’
SEQ ID NO:5：5’-GGGCGACAAGGATTTTTCC-3’
SEQ ID NO:6：5’-VIC-ACAGGAGACCACC-MGB-3’
SEQ ID NO:7：5’-FAM-AGGAGACCGCCTTC-MGB-3’。
7.根据权利要求6所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、probe taq酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品；
其中，所述阳性质控标准品由布鲁氏菌疫苗株Rev.1调整比浊度，其菌含量为3.0×105-9.0×105CFU/mL，经80℃热灭活60min或100℃热灭活15min制成；
所述阴性质控标准品为灭菌双蒸水。
8.非诊断目的布鲁氏菌疫苗株Rev.1的RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求6或7所述的RT-PCR试剂盒，进行扩增并收集FAM、VIC和Cy5信号；
(3)结果判定：阳性质控标准品FAM和Cy5信号存在扩增曲线，VIC信号不存在扩增曲线，Ct值为31-35之间，阴性质控标准品未存在扩增曲线；否则试验失败，需重做；
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号不存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为布鲁氏菌Rev.1疫苗株；
对于待测样本而言，FAM信号不存在扩增曲线或Ct值>35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号存在扩增曲线，则待测样本为除Rev.1疫苗株外的其他布鲁氏菌菌株；
对于待测样本而言，FAM信号存在扩增曲线且Ct值<35，VIC信号存在扩增曲线，且Cy5信号且Ct值<35存在扩增曲线，则待测样本为混合Rev.1疫苗株和其他布鲁氏菌菌株；
对于待测样本而言，Cy5信号不存在扩增曲线，或Ct值>35，无论FAM和VIC信号是否有扩增曲线，则待测样本均为非布鲁氏菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火及延伸30s，45个循环，每个循环结束时收集荧光信号。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括菌体培养物、血液、血清、奶样、组织、气溶胶。
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