CN116949154B - 一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及宏转录组测序和病原检测技术领域。本发明提供了一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，包括如下步骤：使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；使用KAPAmRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定病原菌的种类。本发明应用宏转录组方法，将样本中所有RNA作为研究对象，通过对样本进行RNA的提取，可以对样本中微生物进行分析。不仅可以得到微生物种类和RNA病毒的信息，还可以评估微生物活性状态，很好地弥补了现有技术的不足。
Description
技术领域
本发明涉及宏转录组测序和病原检测技术领域，尤其涉及一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法。
背景技术
随着宠物行业的规模日益扩大，宠物诊疗行业市场需求也愈发旺盛。病原学检查是宠物临床诊疗重要的诊断方法之一，目前主要包括形态学检测、微生物培养、涂片镜检、抗原抗体检测和核酸检测等。但这些样本检测方法有一定的局限性。
涂片镜检和形态学检测，对微生物的载量要求很高，呼吸道和无菌体液样本很难满足。微生物培养作为诊断的金标准，其特异性较高，但其检测周期时间较长，对于样本的微生物载量同样有着一定的要求，在低微生物载量的样本中较难检测出结果。而且不同的微生物培养条件差异较大，无法在较短的时间内针对所有的微生物进行符合条件的检测。且微生物培养大部分针对细菌，在临床中宠物的感染是非常复杂的，细菌感染只是其中一部分；还包括病毒、真菌和寄生虫等病原，因此微生物培养技术虽然准确性最高，但是存在假阴性和检测范围较窄的缺陷。
抗原抗体检测主要用于检测血液中的抗体，操作简单方便，但体液中抗体的产生和消除都是迟滞于病原的变化的，并且存在交叉反应的情况，假阳性和假阴性情况严重。而核酸检测有检测速度快和准确性高的优点，但是病原检测谱受制于根据病原设计好的引物，存在病原谱窄的局限性。临床样本检验关乎诊断结果及治疗原则，因此样本检验的准确性至关重要。但由于宠物临床中无菌体液的微生物载量较低，故传统的病原微生物检测方法很难得出检验结果，从而在一定程度上导致了临床的诊断困难和用药困难。明确的病原学诊断有利于进行针对性治疗，减少医疗资源的消耗。因此，宠物临床亟待提出一种可以对宠物无菌体液进行检验的方法。
近年来，随着分子生物学技术的发展，病原分子诊断逐渐应用于临床，但由于病原谱较窄，病原分子诊断一般针对预设的病原，而对于混合感染、新发病原、罕见病原等复杂病例存在一定的局限性。宏转录组技术是一种不依赖于培养、无需预设病原的检测技术，可以直接从感染部位取样，提取核酸后进行宏基因测序，明确微生物种类，但却无法检测RNA病毒。基于此，提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，不仅可以得到微生物种类，还可以评估微生物活性状态，很好地弥补了现有技术的不足。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，包括如下步骤：
(1)使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；
(2)使用KAPAmRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；
(3)去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；
(4)对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定耐药基因所在病原菌的种类。
作为优选，步骤(1)中所述样本包括无菌体液、拭子样本或血液样品。
作为优选，步骤(1)中所述样本在进行RNA提取还含有前处理的步骤；
所述样品为无菌体液时的前处理的方法为：将无菌体液在8000～12000G的条件下离心8～12min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在25～35℃条件下反应8～12min；所述无菌体液、PBS溶液和溶菌酶的体积比为45～55：4～6：1；
所述样品为拭子样品时的前处理的方法为：将拭子样品和PBS溶液混合后震荡18～22min，取出拭子后得到含有样品的PBS溶液，将含有样品的PBS溶液在8000～12000G的条件下离心8～12min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在25～35℃条件下反应8～12min；所述震荡时用的PBS溶液、分散时用的PBS溶液和溶菌酶的体积比为45～55：4～6：1；
所述样品为血液样品时的前处理的方法为：将血液样品和溶菌酶混合，在25～35℃条件下反应8～12min；所述血液样品和溶菌酶的体积比为45～55：1。
作为优选，步骤(2)中所述测序时采用NovaSeqPE150。
作为优选，步骤(3)中所述去除接头序列时采用cutadapt软件，最大错配比例定为0.1，去除宿主基因组序列时采用bowtie2和samtools。
作为优选，步骤(3)中所述对病原微生物进行识别并计算丰度时采用MetaPhlan3软件。
作为优选，步骤(4)中所述组装时采用Megahit软件，所述识别耐药基因丰度时采用ARG-OAP软件，所述识别耐药基因数据库时采用AMRFinder软件。
作为优选，步骤(4)中所述确定耐药基因所在病原菌的种类的方法为：先使用mmseqs2判断含有耐药基因的contig，如果失败，再使用Maxbin软件进行分箱，识别耐药基因所在的病原菌。
本发明提供了一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，包括如下步骤：(1)使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；(2)使用KAPAmRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；(3)去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；(4)对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定病原菌的种类。本发明应用宏转录组方法，将样本中所有RNA作为研究对象，通过对样本进行RNA的提取，可以对样本中微生物进行分析。不仅可以得到微生物种类和RNA病毒的信息，还可以评估微生物活性状态，很好地弥补了现有技术的不足。
附图说明
图1为检测的病毒组组成，长方形内的数字代表丰度，长条为属；
图2为检测的细菌组组成，长方形内的数字代表丰度，长条为属。
具体实施方式
本发明提供了一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，包括如下步骤：
(1)使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；
(2)使用KAPAmRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；
(3)去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；
(4)对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定耐药基因所在病原菌的种类。
在本发明中，所述RNA提取试剂盒为德国QIAGEN有限公司57704产品；
所述PBS缓冲液为北京索莱宝科技有限公司产品；
所述mRNA文库制备试剂盒为瑞士Rocheu有限公司K8441产品；
所述溶菌酶为上海希格玛高技术有限公司产品，纯度≥98％。
在本发明中，步骤(1)中所述样本优选包括无菌体液、拭子样本或血液样品。
在本发明中，步骤(1)中所述样本优选在进行RNA提取还含有前处理的步骤；
所述样品为无菌体液时的前处理的方法优选为：将无菌体液在8000～12000G的条件下离心8～12min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在25～35℃条件下反应8～12min，进一步优选为：将无菌体液在10000G的条件下离心10min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在30℃条件下反应10min；所述无菌体液、PBS溶液和溶菌酶的体积比优选为45～55：4～6：1，进一步优选为50：5：1；
所述样品为拭子样品时的前处理的方法优选为：将拭子样品和PBS溶液混合后震荡18～22min，取出拭子后得到含有样品的PBS溶液，将含有样品的PBS溶液在8000～12000G的条件下离心8～12min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在25～35℃条件下反应8～12min，进一步优选为：将拭子样品和PBS溶液混合后震荡20min，取出拭子后得到含有样品的PBS溶液，将含有样品的PBS溶液在10000G的条件下离心10min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在30℃条件下反应10min；所述震荡时用的PBS溶液、分散时用的PBS溶液和溶菌酶的体积比优选为45～55：4～6：1，进一步优选为50：5：1；
所述样品为血液样品时的前处理的方法优选为：将血液样品和溶菌酶混合，在25～35℃条件下反应8～12min，进一步优选为：将血液样品和溶菌酶混合，在30℃条件下反应10min；所述血液样品和溶菌酶的体积比优选为45～55：1，进一步优选为50：1。
在本发明中，步骤(2)中所述测序时优选采用NovaSeqPE150。
在本发明中，步骤(3)中所述去除接头序列时优选采用cutadapt软件，最大错配比例定为0.1，去除宿主基因组序列时优选采用bowtie2和samtools。
在本发明中，步骤(3)中所述对病原微生物进行识别并计算丰度时优选采用MetaPhlan3软件。
在本发明中，步骤(4)中所述组装时优选采用Megahit软件，所述识别耐药基因丰度时优选采用ARG-OAP软件，所述识别耐药基因数据库时优选采用AMRFinder软件。
在本发明中，步骤(4)中所述确定耐药基因所在病原菌的种类的方法为：先使用mmseqs2判断含有耐药基因的contig，如果失败，再使用Maxbin软件进行分箱，识别耐药基因所在的病原菌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
表1耐药基因及其宿主
| 耐药基因 | 宿主菌 |
| ant(2”)-Ia | Haemophilusparainfluenzae |
| aph(6)-Id | Gammaproteobacteria |
| dfrA14 | Gammaproteobacteria |
| sul2 | Gammaproteobacteria |
| blaROB-10 | Gammaproteobacteria |
| aph(3')-Ia | Enterobacteriaceae |
实施例1
1.对样本进行保存：无菌体液/拭子样本/血液应立即送检，若无法立即送检，应保存在4℃及以下的环境中，并在24h以内送检；血液样本应避免离心，用无菌洁净的EP管存储在4℃的环境中，因为无法知道血液样本中病原在血浆和血清中的分布，因此选择全血提取，避免离心。同时保证在4℃环境下存储，避免RNA的降解。若时间间隔在24h以上，无菌体液/拭子样本均应保存在-80℃冰箱。
2.提取RNA前处理：无菌体液样本在室温环境中，应取出1ml，进行10000G离心，离心时间为10分钟，这样可以将细胞进行聚集，提高RNA浓度。离心后去上清，加入100μlPBS溶液，(PBS溶液可以最大程度上的保护细胞)震荡混匀后加入20μl溶菌酶30℃反应10分钟，可以更好的将革兰氏阳性菌的细胞壁进行分解，从而更好的提取RNA。对于拭子样品，应加入1mlPBS溶液，震荡20min，保证拭子上的微生物被完全震荡到PBS中。随后进行10000G离心，离心时间为10分钟，这样可以将细胞进行聚集，提高RNA浓度。离心后去上清，加入100μlPBS溶液，(PBS溶液可以最大程度上的保护细胞)。震荡混匀后加入20μl溶菌酶30℃反应10分钟，可以更好地将革兰氏阳性菌的细胞壁进行分解。对于血液样品，加入20μl溶菌酶30℃反应10分钟。
3.提取RNA：使用RNA提取试剂盒Qiagen Blood RNA mini Kit(No.52304)进行RNA提取。首先使用Buffer RLT 250ul对细胞进行重悬，其次可使用Qiacube核酸提取仪或手动按照说明书提取其Total RNA。其中应避免加入Carrier RNA，因为Carrier RNA会占据大量的测序数据；第一次洗脱体积选择30ul、第二次洗脱体积选择20ul；最大程度上对TotalRNA进行富集，提高其RNA浓度。
4.文库构建及测序：在不去除rRNA的情况下，按照说明书对Toatl RNA使用KAPAmRNA文库制备试剂盒(Roche，KK8441和KK8544，瑞士巴塞尔)构建宏转录组文库。使用NovaSeq(PE150)进行测序。
5.测序数据处理：使用cutadapt软件去除接头序列，最大错配比例定为0.1。随后使用bowtie2和samtools去除宿主基因组序列(犬NCBI登陆号GCF_014441545.1，猫ENSEMBL数据号GCA_000181335.4)，其中使用Bowtie2时加入“--very-sensitive”参数，确保完整去除宿主基因组。然后使用fastQC软件对测序数据进行质控可视化，确保测序数据的质量符合要求。
6.病原微生物识别：首先，使用MetaPhlan3软件对测序数据进行分析，该软件具有一个包含1000000+参考基因的数据库，其中包括99500+细菌、1.1M+标记基因、3500+病毒和500+真核生物。通过该软件，我们可以对病原微生物进行识别，并计算它们在样本中的丰度。这一步骤有助于确定样本中存在的病原微生物种类及其相对数量。
7.耐药基因定位及丰度计算：使用ARG-OAP软件对原始reads识别耐药基因丰度，接下来，我们使用Megahit软件对宏转录组数据进行组装，以获得高质量的基因组序列。通过组装，我们可以将碎片化的DNA序列重新组合成较长的连续片段，称为Contig。然后，我们使用NCBIAMRFinder软件的数据库对组装后的数据进行耐药基因的识别。该软件具有包含耐药基因信息的数据库，可以帮助我们确定Contig中是否存在耐药基因。一旦识别出含有耐药基因的Contig，我们将提取出这些Contig，以便后续分析。为了进一步确定耐药基因所在的宿主，我们使用MMSeqs2的easy-taxonomy模式对耐药基因Contig的宿主进行识别。通过将Contig序列与NCBI的NR数据库进行比对，我们可以确定耐药基因所在的病原菌。
最后，我们使用Maxbin软件进行分箱，对那些没有识别出宿主物种的耐药基因Contig进行进一步分析。对没有识别出物种的耐药基因contig进一步判断其所在的病原菌，而后进行合理的抗生素个性化治疗，避免耐药性的产生。
试验例
对一例有咳嗽症状的秋田犬进行了宏转录组诊断。该犬有咳嗽等呼吸道症状，在2022年7月前往中农大动物医院进行治疗。该秋田犬患有呼吸道症状，其检验结果显示犬瘟热、犬流感和犬副流感均为阴性，但波氏杆菌为阳性，提示该犬可能感染了波氏杆菌引起的疾病。然而，波氏杆菌并非唯一可能导致这些症状的病原体。针对这种情况，宏转录组技术具有更高的敏感性和特异性，它可以同时检测出多种可能引起症状的病原体。在这个例子中，宏转录组检测到该秋田犬体内存在波氏杆菌和Beta冠状病毒，这些病原体可能同时存在并协同作用导致了该犬的呼吸道症状。
结论：本发明的高通量测序技术的应用可以为兽医提供更加全面和准确的诊断结果，有助于更好地指导临床治疗和预后评估。因此，宏转录组技术在宠物病原检测中具有较大的潜在价值，可以为宠物健康管理提供更加有效和可靠的技术支持。
由以上实施例可知，本发明提供了一种非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，包括如下步骤：(1)使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；(2)使用KAPAmRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；(3)去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；(4)对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定病原菌的种类。本发明应用宏转录组方法，将样本中所有RNA作为研究对象，通过对样本进行RNA的提取，可以对样本中微生物进行分析。不仅可以得到微生物种类和RNA病毒的信息，还可以评估微生物活性状态，很好地弥补了现有技术的不足。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种非诊断和非治疗目的的基于宏转录组的病原检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用RNA提取试剂盒对样本进行RNA提取，得到RNA样品；
(2)使用KAPA mRNA文库制备试剂盒构建RNA样品的宏转录组文库并测序；
(3)去除接头序列和宿主基因组序列，对病原微生物进行识别并计算丰度；
(4)对宏转录组进行组装，识别耐药基因丰度和耐药基因数据库，确定耐药基因所在病原菌的种类；
步骤(1)中所述样本在进行RNA提取还含有前处理的步骤；
所述样品为拭子样品时的前处理的方法为：将拭子样品和PBS溶液混合后震荡18～22min，取出拭子后得到含有样品的PBS溶液，将含有样品的PBS溶液在8000～12000G的条件下离心8～12min，将沉淀用PBS溶液分散后加入溶菌酶，在25～35℃条件下反应8～12min；所述震荡时用的PBS溶液、分散时用的PBS溶液和溶菌酶的体积比为45～55：4～6：1；
步骤(2)中所述测序时采用NovaSeq PE150；
步骤(3)中所述去除接头序列时采用cutadapt软件，最大错配比例定为0.1，去除宿主基因组序列时采用bowtie2和samtools；
步骤(3)中所述对病原微生物进行识别并计算丰度时采用MetaPhlan3软件；
步骤(4)中所述组装时采用Megahit软件，所述识别耐药基因丰度时采用ARG-OAP软件，所述识别耐药基因数据库时采用AMRFinder软件；
步骤(4)中所述确定耐药基因所在病原菌的种类的方法为：先使用mmseqs2判断含有耐药基因的contig，如果失败，再使用Maxbin软件进行分箱，识别耐药基因所在的病原菌；
步骤(1)中所述样本为拭子样本。
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| Current trends in RNA virus detection through metatranscriptome sequencing data;Nakagawa, S等;《FEBS OPEN BIO》;第13卷(第6期);第992-1000页 * |
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