WO2006093082A1 - サブトラクション・ポリヌクレオチドの取得方法 - Google Patents

サブトラクション・ポリヌクレオチドの取得方法 Download PDF

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WO2006093082A1
WO2006093082A1 PCT/JP2006/303585 JP2006303585W WO2006093082A1 WO 2006093082 A1 WO2006093082 A1 WO 2006093082A1 JP 2006303585 W JP2006303585 W JP 2006303585W WO 2006093082 A1 WO2006093082 A1 WO 2006093082A1
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tester
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derived
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Yukinobu Hayashida
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Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining and amplifying a polynucleotide whose abundance in one sample (tester) is larger than that in another sample (driver).
  • This cDNA subtraction method is performed according to the following procedure.
  • RNA or cDNA prepared from cancer cell tissue force and an excess of single-stranded RNA or cDNA or double-stranded cDNA (driver) prepared from normal cell tissue force. Let's make a noisy decision. At this time, genes expressed in both the tester and the driver (such as ⁇ and Usukiping genes) form double-stranded cDNA, RNA-DNA, and hybrids, but are specifically expressed in the tester. The gene-derived RNA or cDNA does not form a hybrid and is in the state of single-stranded RNA or cDNA.
  • RNA or cDNA derived from a gene that is specifically expressed in a powerful tester that does not form a hybrid is expressed by, for example, a hydroxyapatite chromatography method (Hendrick, SM, Cohen , DI, Nielsen, EL and Davis, MM (1984) Nature. 308, 149—153), avidin-piotine binding method (Duguin, JR and Dinauer, MC (1990) Nucleic Acid Research. 18, 2789-2792, special table Hei 9-507021), oligo (dT) solid phase method using latex, beads, columns, etc. (Hara, E "Kato T.
  • any of the above methods utilizes physical binding or adsorption, and double-stranded cDNA or RNA hybridized with single-stranded RNA or cDNA derived from a gene specifically expressed in the tester. Since they were separated from -DNA hybrids, they could not be separated strictly, and there was a problem that double-stranded cDNAs or RNA-DNA hybrids that had formed were mixed. As a result, in the above method, the gene expressed by both the tester and the driver is concentrated (acquired) with high efficiency and high tester-specific expression. I could't do it. In addition, the above method has a problem in that the operation is complicated and the work process requires a lot of time and skill.
  • the present invention relates to a method for easily obtaining and amplifying a polynucleotide having a larger amount in one sample (tester) than that in another sample (driver) easily and in a short time, A polynucleotide obtained by the method (amplified), a method for identifying a gene mutation in a tester, and a kit used therefor are provided.
  • the present invention has the following configuration.
  • a method of amplifying a polynucleotide having an abundance in one sample (tester) greater than that in another sample (driver), comprising the following steps:
  • a single-stranded polynucleotide derived from a 0 tester and a single-stranded polynucleotide derived from the tester and a single-stranded polynucleotide derived from a driver that is a complementary strand are mixed for hybridization, or GO
  • a tester-derived single-stranded polynucleotide may be mixed with a single-stranded polynucleotide derived from a tester and a double-stranded polynucleotide derived from a driver, followed by heat denaturation and hybridization.
  • a polynucleotide obtained by the above method 1 (specifically present in a tester) or a polynucleotide amplified by the above method 2 (specifically present in a tester) is characterized.
  • a polynucleotide obtained by the above method 1 or amplified by the above method 2 (specifically present in the tester).
  • a kit for obtaining or amplifying a polynucleotide comprising a double-strand-specific DNA nuclease and an enzyme for making the polynucleotide derived from the tester into a single strand.
  • the present inventors have made a tester-derived single-stranded polynucleotide and a single-stranded polynucleotide derived from the tester, formed by subtractive hybridization.
  • FIG. 1 is a chart showing the acquisition method or amplification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a process for preparing a single-stranded tester cDNA of the present invention.
  • Fig. 3 is a diagram schematically showing a process for preparing the double-stranded driver cDNA of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a hybridization step [Step (1)] between a tester cDNA of the present invention and a driver cDNA.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing a step of removing the hybridized double-stranded cDNA of the present invention [step (2)].
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing an amplification step [step (3)] of a single-stranded tester-specific cDNA that has been capable of hybridizing according to the present invention.
  • FIG. 7 The process of removing a single-stranded driver cDNA that is not hybridized according to the present invention [process (a)
  • FIG. 8 Human liver cancer-derived HepG2 cell cDNA (tester cDNA), human normal liver tissue-derived cDNA (driver cDNA), and subtraction cDNA (tester-specific cDNA) obtained in the Examples Each as a cocoon-shaped glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (tester cDNA), human normal liver tissue-derived cDNA (driver cDNA), and subtraction cDNA (tester-specific cDNA) obtained in the Examples Each as a cocoon-shaped glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (tester cDNA), tester-specific cDNA) obtained in the Examples Each as a cocoon-shaped glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (tester cDNA), human normal liver tissue-derived cDNA (driver cDNA), and subtraction cDNA (tester-specific cDNA) obtained in the Examples Each as a cocoon-shaped glycer
  • a sample (tester)” and “another sample (driver)” mean that they are different from each other, for example: (1) Although the type of sample is different, the origin of the sample [living body (individual) ('Group), location, etc.) are the same, (2) the sample type is the same, The case is different, (3) the sample type and sample origin are different, and (4) the sample type and sample origin are the same.
  • the type of the sample to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it is used in this field.
  • samples include cells, tissues, organs, body fluids (blood, serum, plasma, spinal fluid, synovial fluid, knee fluid, lymph fluid, etc.), excrement (urine, saliva, feces, etc.), sputum, pus
  • Biological samples such as skin-derived substances; microorganisms (fungi, bacteria, viruses, etc.); for example, environmental samples (food, beverages, tap water, seawater, lake water, river water, factory wastewater, semiconductor wash water, medical Washing solution after washing instruments, etc.); Extract solution obtained from these; and these and water and buffers usually used in this field (Tris buffer, glycine buffer, phosphate buffer, veronal buffer, etc.) Liquid, borate buffer solution, Good buffer solution, etc.), and processed products obtained by reconstitution.
  • Tris buffer, glycine buffer, phosphate buffer, veronal buffer, etc. Liquid, borate buffer solution, Good buffer
  • the phrase "the amount present in one sample (tester) is greater than the amount present in another sample (driver)” is (1) present in the tester but not present in the driver Or (2) It exists in both the tester and the driver, but the abundance in the tester is larger than the abundance in the driver. “Existing specifically in a tester” and “specific to a tester” have the same meaning.
  • Polynucleotide that is obtained and amplified by the method of the present invention (ie, “Polynucleotide that is present in one sample (tester) more than in another sample (driver))
  • RNA such as mRNA
  • cDNA derived from the mRNA DNA such as genomic DNA, etc. It is.
  • the method of the present invention is effective for obtaining and amplifying DNA such as cDNA and genomic DNA derived from mRNA, and in particular, the abundance in the tester is greater than that in the driver. It is extremely effective for obtaining and amplifying cDNA.
  • the present invention relates to a method for obtaining or amplifying a polynucleotide (hereinafter abbreviated as “tester-specific polynucleotide”) whose abundance in one sample (tester) is larger than that in another sample (driver). .
  • tester-specific polynucleotide a polynucleotide whose abundance in one sample (tester) is larger than that in another sample (driver).
  • a tester-derived single-stranded polynucleotide is used for hybridization with a single-stranded or double-stranded polynucleotide derived from a driver, and the tester-derived Forming a double-stranded polynucleotide between the single-stranded polynucleotide of the tester and the single-stranded polynucleotide derived from the driver and the single-stranded polynucleotide complementary to the tester, and (2) by enzymatic treatment, It is characterized by removing the hybridized double-stranded polynucleotide.
  • a single-stranded polynucleotide derived from a tester that does not form a hybrid has been amplified, so that the polynucleotide present in the tester is larger than the amount present in the driver. Can be obtained in large quantities.
  • the method for amplifying nucleotides of the present invention comprises (1) performing a hybridization with a single-stranded or double-stranded polynucleotide derived from a driver using a single-stranded polynucleotide derived from a tester to obtain a single tester-derived single-stranded polynucleotide.
  • the tester-derived polynucleotide in the present invention is a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide may be either DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • genomic DNA and testers In particular, cDNA derived from mRNA present in the above (in other words, cDNA synthesized using mRNA extracted from a tester as a cocoon) is particularly preferred.
  • the single-stranded tester polynucleotide of the present invention can be appropriately prepared from the sample as described above.
  • a single-stranded polynucleotide can be prepared by appropriately selecting a method known per se usually used in this field, and can also be performed using a commercially available kit.
  • Such a method is not particularly limited as long as it is a method usually used in this field, and a method for directly preparing a single-stranded polynucleotide as described above (for example, Vieira J, Messing J. Methods). 1987; 153: 3-11; Krieg PA, Melton DA.Methods in Enzymology. 1987; 155: 397-415; Davanloo P, Rosenberg AH, Dunn JJ, Studier FW.Proc Natl Acad Sci US A.
  • the prepared single-stranded polynucleotide and double-stranded polynucleotide may be the polynucleotide itself present in the tester, or the polynucleotide as a saddle, for example, polymerase chain reaction (PCR). It may be a polynucleotide complementary to Z or homologous to the polynucleotide amplified by a known amplification method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method for preparing a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment or the like after preparing a double-stranded polynucleotide for example, Higuchi RG , Ochman H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25; 17 (14): 5865; Guo LH, Wu R.Methods in Enzymology. 1983; 100: 60-96 etc.
  • polys present in testers for example, Higuchi RG , Ochman H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25; 17 (14): 5865; Guo LH, Wu R.Methods in Enzymology. 1983; 100: 60-96 etc.
  • the method for obtaining the single-stranded tester nucleotide of the present invention comprises the steps of (1 ′) preparing a tester-derived double-stranded polynucleotide and then converting the double-stranded polynucleotide into a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment.
  • the method comprising the steps of: (1) amplifying a double-stranded polynucleotide derived from a tester and then converting the double-stranded polynucleotide into a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment; I prefer the method
  • the enzyme used in the enzyme treatment is not particularly limited as long as it is usually used in this field, but for example, a nucleic acid chain on one side of a double-stranded polynucleotide such as lambda exonuclease.
  • Enzymes for example, restriction enzymes that can generate 5 'protruding ends, restriction enzymes that can generate 3' protruding ends, and combinations of enzymes with 3 ' ⁇ 5' Exonuclease activity that recognize 5 'protruding ends such as Exomi clease III Etc.
  • the origin of these enzymes is not particularly limited, and any of those obtained by a method known per se and those commercially available can be used.
  • Reagents and reaction conditions used in the method as described above may be performed according to a method known per se.
  • the amount of the decomposing enzyme used is not particularly limited as long as it is an amount capable of sufficiently decomposing one strand of the double-stranded polynucleotide to form a single-stranded polynucleotide. Specifically, it differs depending on the type of degrading enzyme to be used, so it cannot be said unconditionally. For example, when lambda exonuclease is used as an enzyme, 0.1 unit to 100 units is usually preferable for 2 ⁇ g of DNA. Preferably, it is 0.5 units to 50 units, more preferably 1 units to 1 Ounits.
  • Condition of the enzyme treatment i.e., a double-stranded polynucleotide and lambda - conditions at the time of the E Kisonukurea one peptidase reaction (contact) is usually 25 ° C ⁇ 60 ° C, Preferably 30 ° C to 50 ° C, more preferably 35 ° C to 40 ° C, usually pH 7 to ll, preferably pH 8 to 10.5, more preferably 9 to 10, usually 0.1 min to 60 min, preferably Is treated for 0.5 minutes to 45 minutes, more preferably 1 minute to 30 minutes.
  • a buffer agent usually used in this field can be used.
  • a buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffer capacity in the pH range as described above.
  • Tris-HCl buffer solution, glycine buffer solution, good buffer solution (eg, HEPES, PIPES, etc.) Is mentioned.
  • the concentration used is also appropriately selected from a concentration range usually used in this field, for example, usually lmM to 500 mM, preferably 5 mM to 250 mM, more preferably 10 mM to 100 mM.
  • the reaction terminator is contained in water or a buffer as described above, and this reaction terminator-containing solution is mixed with a reaction solution obtained by performing an enzyme treatment.
  • the reaction terminator may be present in the reaction solution obtained by the enzyme treatment.
  • the reaction solution obtained by performing the enzyme treatment is usually 60 ° C to 95 ° C, preferably 70 ° C to 90 ° C, more preferably 80 ° C.
  • the treatment may be performed at C to 85 ° C.
  • the reaction time and the heat treatment time with the reaction terminator are usually 5 minutes to 60 minutes, preferably 10 minutes to 30 minutes, more preferably 15 minutes to 20 minutes.
  • reaction termination methods it is preferable to use both a method using a reaction terminator and a method using heat treatment.
  • an activator usually used in this field eg, magnesium chloride, magnesium sulfate, etc.
  • Metal ions such as magnesium ions derived from magnesium salts), surfactants (eg Triton-XlOO (polyoxyethylene (10) octylphenol ether), etc.), stabilizers (dithiothreitol, mercaptoethanol, etc.) Thiol compounds, etc.), preservatives, etc. may be present.
  • the presence of magnesium salt and surface activity is preferred. The amount of these used can be selected appropriately from the range usually used in this field.
  • the amount of magnesium salt used is usually 0.1 mM to 100 mM, preferably 0.5 mM to 50 mM, more preferably.
  • the amount of the surfactant used is usually 0.001 to 1% (w / v), preferably 0.005 to 0.5% (w / v), more preferably 0.01 to 0.1% (w / v). ).
  • an adapter having a known sequence power is preferably attached (added) to the 5 ′ end or the Z and 3 ′ ends.
  • the adapter is preferably attached (added) to both the 5 ′ end and the 3 ′ end.
  • the adapter may contain any sequence, but the number of bases is preferably such that it itself can function as a primer alone. Therefore, the number of bases of the adapter is usually 15 bp to 60 bp, preferably 20 bp to 35 bp, more preferably 25 bp to 30 bp.
  • an adapter hybrid may be formed in the single-stranded tester polynucleotide. Therefore, it is preferable that the adapter is attached to both ends, not complementary. In addition, the adapter is not present in the polynucleotide derived from the driver!
  • the polynucleotide obtained by the method for obtaining a tester-specific polynucleotide of the present invention can be derived from a driver-derived (one This strand can be easily isolated and purified from a polynucleotide.
  • the adapter as described above is obtained from the polynucleotide obtained by the method for obtaining a tester-specific polynucleotide of the present invention (derived from a tester that has not been able to form a hybrid) in accordance with the polynucleotide amplification method of the present invention described later.
  • This is useful for amplifying a single-stranded polynucleotide). That is, the amplification reaction such as PCR performed in the step (3) described later is performed on the adapter.
  • the tester-specific polynucleotide can be easily amplified using the primer that binds to the adapter.
  • the adapter is bound to the single-stranded tester polynucleotide (addition).
  • a method known per se usually used in this field can be appropriately selected and used, or a commercially available kit can be used.
  • Such a method is not particularly limited as long as it is a method usually used in this field.
  • An adapter is bound to a single-stranded polynucleotide prepared by the method as described above (1 ⁇ ⁇ addition).
  • uligo capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides, Kazuo Maruyama and Sumio Sugano, Gene, 138 (1994) 171-174; SMART method described in L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • an adapter is attached to the prepared double-stranded polynucleotide (addition) And then converting it into a single-stranded polynucleotide (e.g., Determination of 5 ends of specinc mRNAs by DNA iigase-dependent amplification, Bertling WM, Beier F, Reichenberger E., PCR Methods Appl. 1993 Oct; 3 (2): RACE method described in 95-9, etc.), (3) In the above method, a polynucleotide designed in a tester is used as a saddle, for example, a primer designed based on an adapter sequence is used.
  • a method of amplifying a polynucleotide complementary or Z and homologous to the polynucleotide to which the adapter (primer) is bound (added) by a known amplification method such as PCR method, LAMP method, ICAN method, etc.
  • the double-stranded polynucleotide needs to be converted into a single-stranded polynucleotide by the method as described above.
  • the amplified double-stranded polynucleotide is converted into the 5'-end phosphorylated DNA strand of the double-stranded DNA.
  • the cDNA strand on the 5 'end phosphate primer side can be removed, and the adapter is easily attached (added) single-stranded tester polynucleotide. Can be obtained.
  • the polynucleotide present in the tester is designed as a saddle, for example, based on the adapter sequence.
  • a polynucleotide complementary or Z and homologous to the polynucleotide to which the adapter (primer) is bound (added) is amplified. The method is preferred.
  • a method for obtaining a single-stranded tester nucleotide to which an adapter is bound (added) is designed by (1 '") a double-stranded polynucleotide derived from a tester based on the adapter sequence! / And a step of converting the double-stranded polynucleotide into a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment, for example, by the following method: I) A single-stranded tester poly tide can be obtained.
  • a cDNA library prepared by using a method known per se [Gubler et al. (Gulber, U. and Hoffman, BJ (1983) Gene. 25, 263-269) etc.] Using a library of libraries or a commercially available cDNA library, create two types of primers: a 5'-end phosphorylated primer and a non-phosphorylated V and primer designed with a known sequence derived from the vector at both ends of the cDNA insert. This is then inserted into the vector! Double-stranded cDNA derived from the tester gene is amplified by PCR, LAMP, ICAN, etc. using the cDNA as a saddle.
  • the amplified primer (adapter) double-stranded cDNA is then treated with an enzyme that removes the 5′-terminal phosphorylated DNA strand of double-stranded DNA, such as lambda exonuclease, and the 5′-end.
  • an enzyme that removes the 5′-terminal phosphorylated DNA strand of double-stranded DNA such as lambda exonuclease, and the 5′-end.
  • the cDNA strand on the phosphate primer side is removed to obtain a single-stranded tester cDNA to which the adapter is bound (attached) [Higuchi RG, Ochman H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25; 17 ( 14): 5865 etc.].
  • the obtained single-stranded tester polynucleotide can be extracted with, for example, phenol Z black mouth form mixture, phenol / black mouth form / isoamyl alcohol mixture or / and black mouth form / isoamyl alcohol mixture, alcohol precipitation, column It is preferable to purify by a known purification method such as purification or filter filtration.
  • driver polynucleotide may be either a single-stranded polynucleotide or a double-stranded polynucleotide, but is preferably a double-stranded polynucleotide. It is.
  • the driver polynucleotide is a single strand, it is understood that the single strand driver polynucleotide can be a complementary strand to the single strand tester polynucleotide.
  • the driver polynucleotide when the tester polynucleotide is a sense strand, the driver polynucleotide is an antisense strand, and when the tester polynucleotide is an antisense strand, the driver polynucleotide is a sense strand.
  • the driver polynucleotide may be either DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • CDN derived from genomic DNA and mRNA present in the tester A (in other words, cDNA synthesized by using mRNA extracted from a tester as a saddle type) is preferred, and cDNA is particularly preferred.
  • the driver polynucleotide of the present invention is usually used in this field, such as a method for preparing a double-stranded polynucleotide used for preparing a tester polynucleotide and a method for preparing a single-stranded polynucleotide. It can be obtained using a method known per se used in, or a commercially available kit.
  • a polynucleotide present in a driver is used as a saddle type, and a polynucleotide complementary or Z and homologous to the polynucleotide is amplified by a known amplification method such as PCR method, LAMP method, ICAN method, etc. Preferred method.
  • the driver polynucleotide used in the present invention binds to the 5 'end or the Z and 3' ends with an adapter having a known sequence ability (addition).
  • the adapter is different from a known sequence to which a primer for PCR performed in step (3) described later, which is included in at least a single-stranded test polynucleotide, binds. It is.
  • an adapter consisting of a known sequence that does not bind to the PCR primer used in step (3) described below may be bound (added) to the driver polynucleotide.
  • Nucleotides do not include known sequences, including adapters that are attached (added) to single-stranded tester nucleotides, or include sequences that are part of the adapters that are themselves capable of functioning as primers. It is preferred that [that is, do not bind (add) the adapter]. It is also preferable to attach non-complementary adapters to both ends.
  • a driver polynucleotide can be obtained by the following method.
  • the primer (adapter) that amplified both ends of the insert cDNA was also multicloned on both sides of the insert. Cleave with an appropriate restriction enzyme using the restriction enzyme site on the site to obtain a double-stranded driver cDNA (a double-stranded driver cDNA to which the adapter can be bound (added) does not bind) with only the inserted fragment.
  • This method can be used when the tester polynucleotide and the driver-derived cDNA library are in the same sequence (for example, when both are pUC plasmids). Useful when the same primer is used in the driver polynucleotide (when the same adapter is bound).
  • the tester-derived cDNA library and the driver-derived cDNA library consist of the same series of vectors (for example, both are pUC plasmids), the tester polynucleotide and the driver polynucleotide
  • the same primer when used (when the same adapter is bound), the length from the end of the inserted cDNA fragment to the primer, in other words, the inserted fragment is bound from the end of the primer.
  • the chain length including the primer is longer than lOObp, it is difficult to remove the fragment from the cleaved insert fragment cDNA to the amplified primer (adapter) by the purification method described later. .
  • the cleaved fragment hybridizes with a complementary portion present in the tester to form a double-stranded oligonucleotide, and in the step (2) of the present invention described later, the adapter region of the tester (PCR primer) Region is removed, which hinders the amplification of the target single-strand tester-specific polynucleotide in step (3). Therefore, in such a case, cleavage to the primer (adapter) with both ends of the insert cDNA amplified so that the chain length to the primer (adapter) with both ends of the insert cDNA amplified is less than lOObp. It is preferable to carry out the above step using a plurality of restriction enzymes, or to cleave the fragment up to the amplified primer (adapter) from both ends of the cleaved insert fragment cDNA using another restriction enzyme.
  • treatment with an enzyme that removes the 5'-terminal phosphorylated DNA strand of double-stranded DNA such as lambda exonuclease, removes the 5'-terminal phosphate-primer primer side cDNA strand, Obtain a cDNA that is complementary to the tester cDNA (ie, a single-stranded driver cDNA to which the adapter is bound (added)).
  • the obtained single-stranded or double-stranded driver polynucleotide can be extracted with, for example, phenol Z chloroform form mixed solution, phenol Z black mouth form Z isoamyl alcohol mixed solution or Z and black mouth form Z isoamyl alcohol mixed solution, It is preferable to purify by a publicly known purification method such as alcohol precipitation, column purification or filter filtration.
  • a single-stranded tester polynucleotide in which a complement is present in the driver polynucleotide ie, a tester polynucleotide that is present in both the tester and the driver (tester non-specific polynucleotide)
  • a double-stranded polynucleotide (hybrid) of a tester polynucleotide and a complementary driver polynucleotide ie, tester-specific polynucleotides
  • driver polynucleotides that do not have complementary (or low abundance) in driver polynucleotides are not single-stranded without forming a hybrid. It exists as it is.
  • the hybridization is usually used in this field, and can be carried out using a known hybridization method or a commercially available kit.
  • a buffer containing a single-stranded tester polynucleotide prepared as described above and a single-stranded or double-stranded driver polynucleotide in excess of the tester polynucleotide in an appropriate amount of sodium salt is prepared.
  • hybridization is performed at an appropriate temperature for an appropriate time, and a double-stranded polynucleotide (no, hybrid) of a tester polynucleotide and a complementary driver polynucleotide is prepared. ) Is formed.
  • the amount of driver polynucleotide used is larger than the amount of tester polynucleotide, but it depends on the target polynucleotide (gene) and purpose of use.
  • the amount of polynucleotide is usually 10 to 5000 times, preferably 50 to 1000 times, more preferably 100 to 500 times the amount of tester polynucleotide (nucleic acid amount). It is.
  • the amount of polynucleotide is usually 20 to 10,000 times, preferably 100 to 2000 times the amount of tester polynucleotide (nucleic acid amount). More preferably, it is 200 to 1000 times.
  • the sodium salt used is usually used in this field, for example, sodium chloride salt, sodium quenate, etc., and the concentration used is usually in the concentration range used in this field, for example, usually 20 mM to 2 M. , Preferably 50 mM to 1.5 M, more preferably 100 mM to 1 M.
  • a buffer having a buffer capacity in the range of usually pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, more preferably pH 6.5 to 7.5 such as Tris-HCl buffer, glycine buffer, Good buffer (eg HEPES, PIPES, etc.) can be mentioned.
  • the concentration used is also appropriately selected from a concentration range usually used in this field, for example, usually lmM to 1M, preferably 5 mM to 500 mM, more preferably 10 mM to 100 mM.
  • heat denaturation is usually 90 ° C to 105 ° C, preferably 93 ° C to 103 ° C, more preferably 95 ° C to 100 ° C, usually 0.1 min to 15 min, preferably 0.5 min to 10 minutes, more preferably 1 minute to 5 minutes.
  • the heat denaturation is simultaneously performed in the presence of the tester polynucleotide and the driver polynucleotide, but these may be separately heat denatured.
  • the sodium salt is not particularly necessary.
  • the conditions for hybridization are not particularly limited as long as they are usually performed in this field, and are not particularly limited.
  • the lower limit is usually 30 ° C. or higher, preferably Is 37 ° C or higher, more preferably 50 ° C or higher, still more preferably 55 ° C or higher, particularly preferably 60 ° C or higher, most preferably 65 ° C or higher
  • the upper limit is usually 80 ° C or lower, preferably Is 75 ° C. or lower, more preferably 70 ° C. or lower, and usually 1 minute to 30 hours, preferably 30 minutes to 20 hours, more preferably 1 hour to 16 hours.
  • the hybridization may be repeated by adding a driver polynucleotide selected from the concentration range as described above, thereby allowing hybridization under more stringent conditions. It is possible to perform a dialysis.
  • the double-stranded polynucleotide hybridized by the step (1) of the present invention (that is, the double-stranded polynucleotide of the tester non-specific polynucleotide and the complementary driver polynucleotide) is enzyme. Remove by processing. Thereby, among the tester polynucleotides, non-tester-specific polynucleotides that are not specific to the tester but also exist in the driver can be removed.
  • the double-stranded polynucleotide (hybrid) of the driver polynucleotide and the driver polynucleotide that are re-associated in the step (1) is also removed.
  • the enzyme used in the enzyme treatment in the above step (2) of the present invention has a property capable of preferentially degrading a hybridized double-stranded polynucleotide without degrading a single-stranded polynucleotide.
  • a degrading enzyme having a property capable of preferentially degrading the DNA-RNA hybrid is used.
  • an RNase having a property capable of preferentially degrading double-stranded RNA is used.
  • double-stranded polynucleotides (and reassembled driver polynucleotides and driver polynucleotides) formed by the above-described step (1) of the present invention are formed.
  • the resulting double-stranded polynucleotides i.e., non-tester-specific polynucleotides that are not specific to the tester but are also present in the driver. I can do it.
  • the tester polynucleotide strength is NA (cDNA) and the driver polynucleotide is RNA
  • a DNA-degrading enzyme having the property of preferentially degrading DNA in the DNA-RNA hybrid can be used.
  • the driver polynucleotide is RNA (DNA) in RNA
  • an RNA degrading enzyme such as RNase H
  • the enzyme treatment is performed using these degrading enzymes, the double-stranded polynucleotide hybridized by the step (1) of the present invention as described above (and the reassociated driver polynucleotide).
  • the double-stranded polynucleotide of the driver and the driver polynucleotide itself (the whole) cannot be degraded, but the tester polynucleotide in the hybridized double-stranded polynucleotide can be degraded.
  • Non-tester-specific polynucleotides that are not specific to the tester but also present in the driver can be removed.
  • DNA degrading enzymes having the property of preferentially degrading double-stranded DNA are preferred.
  • degrading enzymes include double-strand-specific DNA nuclease (Duplex-specific nuclease: DSN) and the like.
  • the origin of the enzyme is not particularly limited, and examples thereof include marine crustaceans (shrimp, force-etc.), Marine invertebrates such as sea urchins.
  • the marine crustaceans, especially the double-strand-specific DNA nuclease from Kamchatka power-(Paralithodes camtschaticus) is preferred!
  • the double-strand-specific DNA nuclease can be obtained by a method known per se [for example, Shagin DA, Rebri kov DV, Kozhemyako VB, Altshuler IM, Sncneglov AS, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Staroverov DB, Rasskazov VA, Lukyanov S .: Genome Research. 2002 Dec 2 (12): 1935-42], and it is possible to use commercially available products (eg Evrogen).
  • the amount of the decomposing enzyme used is not particularly limited as long as it is an amount capable of sufficiently degrading the double-stranded polynucleotide formed in a hybrid form. Specifically, since it differs depending on the type of degrading enzyme used, it cannot be said unconditionally.
  • the degrading enzyme when a double-strand-specific DNA nuclease is used as the degrading enzyme, it is usually used for the total polynucleotide l; zg. O.Olu / l to 10u / jl, preferably O.lu/ ⁇ l to 5u / ⁇ 1, more preferably 0.5u / ⁇ l to lu / ⁇ 1.
  • the conditions for the enzyme treatment (temperature, time, ⁇ , etc.), that is, the conditions for contacting the hybridized double-stranded polynucleotide with the degrading enzyme differ depending on the type of degrading enzyme to be used. Although it cannot be said, it should be treated for a time that can sufficiently decompose the formed hybrid (or the tester polynucleotide in the hybrid) in the vicinity of the optimum temperature and optimum ⁇ ⁇ of the normally used degrading enzyme.
  • the lower limit is usually 20 ° C or higher, preferably 30 ° C or higher, more preferably 50 ° C or higher, still more preferably. 55 ° C or higher, particularly preferably 60 ° C or higher, most preferably 65 ° C or higher
  • the limit is usually 80 ° C or lower, preferably 75 ° C or lower, more preferably 70 ° C or lower, and usually pH 6 to 9, preferably 6.5 to 8.5, more preferably? To 8, usually 0.5 minutes to 60 minutes, preferably 1 minute to 45 minutes, more preferably 5 minutes to 30 minutes.
  • a buffer agent usually used in this field can be used.
  • a buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffer capacity in the pH range as described above.
  • Tris-HCl buffer solution, glycine buffer solution, good buffer solution (eg, HEPES, PIPES, etc.) Is mentioned.
  • the concentration used is also appropriately selected from a concentration range usually used in this field, for example, usually from lmM to 500 mM, preferably from 5 mM to 100 mM, more preferably from 10 mM to 50 mM.
  • reaction stopper such as a chelating agent such as EDTA is added to the reaction solution obtained by the enzyme treatment.
  • reaction terminator In order to allow such a reaction terminator to be present in the reaction solution, for example, the reaction terminator is contained in water or a buffer as described above, and this reaction terminator-containing solution is obtained by enzyme treatment. If mixed with the reaction solution.
  • the time for stopping the reaction is usually 0.1 minutes to 30 minutes, preferably 0.5 minutes to 20 minutes, more preferably 1 minute to 10 minutes.
  • the temperature at which the reaction is stopped is not particularly limited, but it is preferably 50 to 90 ° C, preferably 60 to 80 ° C, more preferably 65 to 75 ° C.
  • the enzyme treatment is carried out by bringing the double-stranded polynucleotide hybridized in step (1) of the present invention as described above into contact with the decomposing enzyme as described above.
  • a method is not particularly limited as long as it can contact the finally hybridized double-stranded polynucleotide and the degrading enzyme.
  • the process of the present invention as described above is used. This is performed by adding and mixing a solution containing the degrading enzyme to the hybridization solution obtained by carrying out (1).
  • examples of the solution containing the decomposing enzyme include those usually used in this field, such as water or a buffer as described above, as long as they do not inhibit the decomposing action of the decomposing enzyme.
  • Use concentration etc. can be selected from the concentration range as described above.
  • sodium salts, activators usually used in this field metal ions such as magnesium ions
  • stabilizers glycerol, dithiothreitol, mercaptoethanol, etc.
  • Thiol compounds, etc. preservatives and the like may be contained.
  • These sodium salts, activators, stabilizers, preservatives, etc. may be contained in a solution as described above other than the solution containing the degradation enzyme.
  • the solution containing the degrading enzyme and one or more solutions containing sodium salts, activators, stabilizers or preservatives will be added separately to the neutralization solution.
  • the sodium salt used is usually used in this field, for example, sodium chloride salt, sodium quenate, etc., and the concentration used is usually in the concentration range used in this field, for example, usually 20 mM to 2 M. , Preferably 50 mM to 1.5 M, more preferably 100 mM to 1 M.
  • step (2) of the present invention is carried out as follows.
  • a double-strand-specific DNA nuclease-containing solution and a solution containing an activator and a stabilizer are added and mixed.
  • double-stranded polynucleotides that are formed in the hybridization solution and formed into hybrids tester polynucleotides and complementary driver polynucleotides
  • the double-stranded polynucleotide of the double-stranded polynucleotide or the double-stranded polynucleotide of the driver polynucleotide and the driver polynucleotide that re-associates with the double-stranded polynucleotide is removed.
  • magnesium ion is preferable as the activator.
  • examples of the origin thereof include magnesium salts such as magnesium chloride and magnesium sulfate, among which magnesium chloride is preferred.
  • the amount of magnesium salt used is usually 0.1 mM to 100 mM, preferably 0.5 mM to 50 mM, more preferably lmM to an amount that can sufficiently activate double-strand-specific DNA nuclease. 10mM.
  • stabilizers include dithiothreitol and mercaptoethanol.
  • dithiothreitol is preferred.
  • the amount used is usually O.OlmM to 10 mM, preferably 0.1 mM to 5 mM, more preferably 0.5 mM to lmM, as long as it can stabilize the double-strand-specific DNA nuclease.
  • the lower limit is preferably 50 ° C or higher, more preferably 55 ° C or higher, particularly preferably 60 ° C or higher, most preferably 65 ° C or higher
  • the upper limit is usually 80 ° C or lower, preferably 75 ° C or lower, more preferably 70 ° C or lower.
  • the temperature range force as described above is temporarily lowered, and the temperature is temporarily lowered from the temperature range while maintaining the temperature range as described above. It is preferable that it be implemented.
  • Step (1) and Step (2) of the present invention among the polynucleotides present in the tester, the non-tester-specific polynucleotide is decomposed and removed, and the tester-specific polynucleotide is removed. Can be obtained.
  • a single-stranded driver polynucleotide that did not form a hybrid was used.
  • Single-stranded driver polynucleotides that coexist with nucleotides but did not form coexisting hybrids can be removed by known isolation (separation) or purification treatments, and are specific to single-stranded testers. Only polynucleotides can be isolated.
  • a single-stranded tester-specific polynucleotide is used by using a primer designed based on an adapter sequence existing only in the tester-specific polynucleotide such as a primer obtained by amplifying the tester cDNA.
  • tester-specific polynucleotide cDNA
  • Primers designed based on adapter sequences that exist only in tester-specific polynucleotides such as primers that have amplified cDNA are labeled with piotin, annealed with tester-specific polynucleotides (cDNA), and then solid phase such as streptavidin beads. For isolating tester-specific polynucleotides by binding to the And the like.
  • the single-stranded driver polynucleotide that does not form a nano- or hybrid is a single-stranded polynucleotide that is specific to the driver when a single-stranded driver polynucleotide complementary to the tester polynucleotide is used.
  • single-stranded driver polynucleotides that exist in both testers and drivers that have not formed hybrids with non-tester-specific polynucleotides, and when double-stranded driver polynucleotides are used, A single-stranded polynucleotide specific to the driver that exists as a single strand (two types of complementary strand and homologous strand to the tester polynucleotide) and one that exists in both the tester and driver that exist as a single strand without reassociation. Double-stranded driver polynucleotide (complementary strand and tester polynucleotide) Homologous two of the chain).
  • the tester-specific polynucleotide By amplifying the tester-specific polynucleotide obtained by force, the tester-specific polynucleotide can be concentrated.
  • a large amount of the single-stranded tester-specific polynucleotide obtained by the obtaining method of the present invention can be obtained.
  • step (2) of the present invention only the single-stranded tester-specific polynucleotide remaining after step (2) of the present invention is substantially amplified.
  • the single-stranded tester-specific polynucleotide is isolated (separated) or purified after the step (2) of the present invention, it coexists with the single-stranded tester-specific polynucleotide. Only the single-stranded tester-specific polynucleotides are enriched because the single-stranded driver polynucleotides that have not formed hybrids are not substantially amplified.
  • a single-stranded tester-specific polynucleotide (1) when only a complementary strand of a single-stranded tester-specific polynucleotide is amplified or (2) a single-stranded tester and a single-specific polynucleotide This means a case where a double strand of the complementary strand is amplified.
  • the amplification is performed by using a single-stranded tester-specific polynucleotide obtained by the obtaining method of the present invention [(1) a complementary strand of a single-stranded tester-specific polynucleotide or (2) a single-stranded test]. Any one capable of amplifying a ter-specific polynucleotide and its complementary strand, etc.] can be carried out in accordance with a generally known polynucleotide amplification method used in this field.
  • Such polynucleotide amplification methods known per se include, for example, PCR (01igo-capping: a simple metnod to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides, Kazuo Maruyama and Sumio Sugano, Gene, 138 (19 94) 171.
  • PCR 01igo-capping: a simple metnod to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides, Kazuo Maruyama and Sumio Sugano, Gene, 138 (19 94) 171.
  • amplification conditions temperature, time, pH, cycle number, etc.
  • Enzymes and reagents used are also used in a method known per se. What can be used.
  • the amplification can also be performed using a commercially available kit.
  • the primer used for the amplification was a single-stranded tester-specific polynucleotide obtained by the obtaining method of the present invention [(1) a complementary strand of a single-stranded tester-specific polynucleotide alone or (2) a single-stranded tester. There is no particular limitation as long as it can amplify a specific polynucleotide and its complementary strand double strand, etc.].
  • the primer may be appropriately designed and produced according to, for example, the target amplification method and its conditions, and in consideration of the dissociation temperature (Tm value).
  • Tm value the dissociation temperature
  • bra It is considered the number of bases necessary to maintain the specificity as a single sequence, and the length is 15 bases to 60 bases, preferably 20 bases to 35 bases, more preferably 25 bases to 30 bases. What you have is good.
  • the single-stranded tester-specific polynucleotide is isolated by the isolation (separation) process or the purification process as described above after performing the step (2) of the present invention, other testers are not used. Any primer can be used, since no specific polynucleotide or hybrid driver polynucleotide that has formed a hybrid does not coexist.
  • a primer for example, when a tester polynucleotide to which an adapter is bound (added) as described above is used, a primer designed and produced based on the adapter sequence is exemplified.
  • a primer designed and produced based on the adapter sequence is exemplified.
  • When preparing a tester cDNA from the library use one or more primers designed based on the vector-derived sequences at both ends of the cDNA insert (ie, a driver-derived polynucleotide as described above).
  • An adapter sequence that is not present in the sequence and has an ability to align, or an oligonucleotide containing a part or all of its complementary sequence).
  • the single-stranded tester-specific polynucleotide is not isolated after performing the step (2) of the present invention and without performing isolation (separation) processing or purification processing, although specific polynucleotides coexist, single-stranded driver polynucleotides that do not form hybrids coexist.
  • primers designed and created based on V and sequences that are present only in single-stranded tester-specific polynucleotides and not in driver-derived polynucleotides Only single-stranded tester specific polynucleotides can be amplified.
  • a primer for example, one or more kinds of primers designed or produced based on an adapter having sequence ability not existing in a polynucleotide derived from a driver as described above (that is, as described above). And an adapter sequence that is not present in the driver-derived polynucleotide or an oligonucleotide containing a part or all of its complementary sequence).
  • two or more types of primers for use in PCR and the like contain part or all of a non-complementary adapter sequence, or part or all of its complementary sequence. Oligonucleotides, that is, two or more different primers are preferred.
  • the primer as a labeling substance used to label the Yogu primer be labeled with a labeling substance with a labeling substance, a radioactive isotope (32 p, 33 P, 35 s , etc.) or enzyme
  • the method of labeling a primer with a labeling substance is also a method of labeling a primer by, for example, incorporating nucleotides labeled with a radioisotope or a fluorescent substance when synthesizing a primer, or after synthesizing a primer, Radiolabeling method (random primer method, nick translation method, 5'-end labeling method using T4 polynucleotide kinase, 3'-end labeling method using terminal deoxynucleotide transferase, RNA labeling Method), a method of labeling a nucleotide with a fluorescent substance by substituting a nucleotide having a linker arm as a member of an oligonucleotide of the sequence, such as a direct labeling method that directly covalently binds to a primer for labeling an enzyme molecule, and emitting a nucleotide Usually in this field, such as labeling or piotin labeling Yo, it is carried out
  • the single-stranded tester-specific polynucleotide can be amplified (concentrated) by the step (3) of the present invention, but after the step (2) of the present invention is performed, the single-stranded tester-specific polynucleotide is amplified.
  • the oxide is not isolated (separated) or purified, that is, a hybrid is formed with a single-strand tester-specific polynucleotide that is not hybridized and is obtained by carrying out step (2) of the present invention.
  • step (3) of the present invention is performed.
  • single-stranded driver molecules that did not form a hybrid were included in the reaction solution obtained. Renucleotides coexist.
  • the amplified single-stranded tester-specific polynucleotide can be isolated by the step of removing the single-stranded polynucleotide in step (4) of the present invention described later.
  • the step of removing the single-stranded polynucleotide in the step 1S of the present invention is the step of removing the single-stranded polynucleotide by the 1S enzymatic treatment.
  • the tester-specific polynucleotide amplified in step (3) of the present invention is double-stranded because it can be easily isolated and the isolated tester-specific polynucleotide can be easily isolated. Is preferred.
  • an amplified double-stranded tester-specific polynucleotide for example, among the known amplification methods such as those described above, a single-stranded tester-specific polynucleotide and its complementary strand are used. A method of amplification is mentioned.
  • a double-stranded tester-specific polynucleotide can be obtained by the following method.
  • the method of amplifying a double strand of a single-stranded tester-specific polynucleotide and its complementary strand is preferred.
  • the obtained double-stranded tester-specific polynucleotide is usually 30 ° C to 80 ° C, preferably 37 ° C to 75 ° C, more preferably 50 ° C to 70 ° C. .
  • a single-stranded tester-specific polynucleotide and the same are used. It is preferable to amplify the double strand of the complementary strand.
  • the method for amplifying a tester-specific polynucleotide of the present invention comprises a (3 ′) single-stranded polynucleotide derived from a tester that has not been hybridized and its complementary strand to amplify a double-stranded DNA derived from the tester.
  • a method comprising the step of obtaining a stranded polynucleotide is preferred.
  • the following method can amplify a single-strand tester-specific polynucleotide that does not hybridize.
  • step (2) of the present invention (a) a reaction solution obtained by carrying out step (2) of the present invention, and if necessary, a solution containing a single-stranded tester-specific polynucleotide isolated by further isolation or purification.
  • two different primers as described above and deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) were added in appropriate amounts, and the resulting solution was heated at an appropriate temperature for an appropriate time. Heat denature.
  • the primer is annealed to the single-stranded tester-specific polynucleotide (or the single-stranded tester-specific polynucleotide and the amplified complementary polynucleotide).
  • the complementary strand (or the single-stranded tester-specific polynucleotide against the single-stranded tester-specific polynucleotide) is obtained by extending the primer by allowing an appropriate polymerization enzyme to act at an appropriate temperature for an appropriate time.
  • a complementary strand and a complementary strand to a polynucleotide complementary to the amplified single-stranded tester-specific polynucleotide are synthesized (amplified).
  • the amount of reagents used, the type and amount of the polymerization enzyme, the reaction conditions, etc. should be appropriately selected according to a method known per se as described above.
  • the heat denaturation in the step (a) is usually 90 ° C to 105 ° C, preferably 93 ° C to 103 ° C, more preferably 95 ° C to 100 ° C, usually 0.01 minutes to 10 minutes, Preferably it is performed for 0.05 minute to 5 minutes, more preferably for 0.1 minute to 2 minutes.
  • the annealing in step (b) is usually 30 ° C to 75 ° C, preferably 40 ° C to 72 ° C, more preferably 50 ° C to 68 ° C, usually 0.01 minutes to 10 minutes, preferably 0.05 minutes to 5 minutes, more preferably 0.1 minutes to 2 minutes.
  • the polymerization enzyme used in the above step (c) is not particularly limited, and an enzyme used in this field can be used.
  • DNA polymerase I Ribonucleic acid
  • T4 DNA polymerase for example, thermophilic enzymes such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Pfo DNA polymerase, reverse transcriptase and the like.
  • thermophilic enzymes such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Pfo DNA polymerase, reverse transcriptase and the like.
  • the conditions (temperature, time, etc.) when the polymerizing enzyme is allowed to act vary depending on the type of polymerizing enzyme used, etc., but cannot be generally stated.
  • a non-thermostable enzyme such as DNA polymerase I
  • 20 ° C to 50 ° C preferably 25 ° C to 45 ° C, more preferably 30 ° C to 37 ° C
  • 1 minute to 24 hours preferably 5 minutes to 12 hours
  • thermostable enzyme such as TaqDNA polymerase
  • it is 0.01 to 20 minutes, preferably 0.05 to 15 minutes, and more preferably 0.1 to 10 minutes.
  • deoxyribonucleotide triphosphate primer, reagents, polymerization enzyme and the like may be newly added.
  • thermostable enzyme such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, or Pfo DNA polymerase
  • deoxyribonucleotide triphosphate, primer, reagents, polymerization enzyme it is especially preferable because all reagents and polymerization enzymes can coexist at the beginning without the need to add a new one.
  • the resulting double-stranded tester-specific polynucleotide can be extracted with, for example, phenol Z chloroform extract mixture, phenol, chloroform extract Z isoamyl alcohol mixture, or chloroform Z isoamyl alcohol mixture, alcohol precipitation, column purification. It is preferable to purify by a known purification method such as filter filtration.
  • the tester-specific polynucleotide amplified (concentrated) by step (3) of the present invention one In the case of coexisting with the 1S single-stranded driver polynucleotide, that is, after the step (2) of the present invention is performed, the single-stranded tester-specific polynucleotide is isolated (separated) or Do not purify!
  • the amplified tester-specific polynucleotide [one that did not form a hybrid in the step (2) was used.
  • a single-stranded driver polynucleotide that does not form a hybrid and coexists is present.
  • the amplified tester characteristics can be obtained by removing the single-stranded driver polynucleotide.
  • Different polynucleotides single stranded or double stranded can be isolated.
  • Examples of the method for removing the single-stranded driver polynucleotide include known isolation (separation) methods and purification methods as described above.
  • the amplified tester-specific polynucleotide is a double-stranded polynucleotide
  • the single-stranded polynucleotide (single-stranded driver polynucleotide) that coexists with the double-stranded tester-specific polynucleotide is specifically decomposed and removed by the enzyme treatment using a single-stranded tester-specific polynucleotide.
  • single-stranded polynucleotide single-stranded driver polynucleotide
  • the method of removing (decomposing) single-stranded polynucleotides by enzymatic treatment is preferable.
  • the method for removing the single-stranded driver polynucleotide includes (4 ′) a method comprising removing the single-stranded polynucleotide derived from a driver that has not formed a hybrid by enzymatic treatment. preferable.
  • the enzyme used in the enzyme treatment has a property capable of preferentially degrading a single-stranded polynucleotide without degrading a hybridized double-stranded polynucleotide, and is used as a tester polynucleotide. It depends on the type of driver polynucleotide.
  • tester polynucleotide and driver polynucleotide are both DNA (cDNA)
  • cDNA DNA
  • single strands such as single strand specific DNA nuclease (exonuclease I, exonuclease IX, etc.) are not degraded.
  • RNA-degrading enzyme having the property of preferentially degrading strand DNA
  • the tester polynucleotide and driver polynucleotide are both RNA
  • RNA for example, single-strand-specific RNA endonuclease (ribonuclease) (RNaseA ⁇ RNase IV, RNaseTl, RNaseT2, RNase II, RNase III, Rnas e I, etc.) and other RNA lytic enzymes that have the property of preferentially degrading single-stranded RNA without degrading them. used.
  • the double-stranded polynucleotide obtained in the step (3) of the present invention as described above coexists.
  • Single-stranded driver polynucleotides single-stranded driver-specific polynucleotides and single-stranded driver-nonspecific polynucleotides
  • double-stranded polynucleotides double-stranded tester-specific polynucleotides
  • exonuclease I is preferred, which is preferably a DNA degrading enzyme having the property of preferentially degrading single-stranded DNA without degrading double-stranded DNA.
  • the origin of the degrading enzyme as described above is not particularly limited, and any enzyme that is usually used in this field can be used.
  • the decomposing enzyme can be produced according to a method known per se [eg Lehm an, IR., Nussbaum, A ⁇ ., J. Bio. Chem., 239, 2628-2636, 1964] Commercially available products (for example, New England Biolabs) can also be used.
  • the amount of the degrading enzyme used is not particularly limited as long as it is an amount capable of sufficiently degrading the single-stranded polynucleotide. Specifically, it differs depending on the type of degrading enzyme to be used, so it cannot be generally stated.For example, when single-strand specific DNA nuclease is used as the degrading enzyme, it is usually O. lu / ⁇ l to 100u / ⁇ 1, preferably 0 • 5u / ⁇ l to 50u / ⁇ 1, more preferably lu / ⁇ l to 10u / ⁇ 1.
  • the conditions for the enzyme treatment (temperature, time, ⁇ , etc.), that is, the conditions for bringing the single-stranded polynucleotide into contact with the degrading enzyme are different depending on the type of degrading enzyme to be used. What is necessary is just to process for the time which can decompose
  • a single-strand-specific DNA nuclease when used as a degrading enzyme, it is usually 20 ° C to 60 ° C, preferably 25 ° C to 50 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C, usually pH 7 to ll, preferably pH 8 to 10.5, more preferably 9 to 10, usually 0.1 to 60 minutes, preferably 0.5 to 45 minutes, more preferably 1 to 30 minutes .
  • a buffer agent usually used in this field can be used.
  • a buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffer capacity in the pH range as described above.
  • Tris-HCl buffer solution, glycine buffer solution, good buffer solution (eg, HEPES, PIPES, etc.) Is mentioned.
  • the concentration used is usually used in this field.
  • the concentration range to be used is, for example, appropriately selected from lmM to 500 mM, preferably 5 mM to 250 mM, more preferably 10 mM to 100 mM.
  • the reaction terminator is contained in water or a buffer as described above, and this reaction terminator-containing solution is mixed with a reaction solution obtained by performing an enzyme treatment.
  • the reaction terminator may be present in the reaction solution obtained by the enzyme treatment.
  • the reaction solution obtained by performing the enzyme treatment is usually 60 ° C to 90 ° C, preferably 65 ° C to 85 ° C, more preferably 70 ° C.
  • the treatment may be performed at C to 80 ° C.
  • the reaction time and heat treatment time with the reaction terminator are usually 1 minute to 60 minutes, preferably 5 minutes to 30 minutes, and more preferably 10 minutes to 20 minutes.
  • reaction termination methods it is preferable to use both a method using a reaction terminator and a method using heat treatment.
  • the enzyme treatment comprises the tester monospecific polynucleotide amplified (concentrated) by the step (3) of the present invention as described above and the single-stranded driver polynucleotide coexisting therewith and the decomposing enzyme as described above. It is carried out by contact.
  • Such a method is not particularly limited as long as it can contact the finally amplified (concentrated) tester-specific polynucleotide, the coexisting single-stranded driver polynucleotide, and the degrading enzyme.
  • it is carried out by adding and mixing a solution containing the decomposing enzyme to the reaction solution obtained by carrying out the step (3) of the present invention as described above.
  • examples of the solution containing the decomposing enzyme include those usually used in this field, such as water or a buffer as described above, as long as they do not inhibit the decomposing action of the decomposing enzyme.
  • Use concentration etc. can be appropriately selected from the concentration range as described above.
  • an activator metal ion such as magnesium ion
  • a stabilizer dithiothreitol, thiol compound such as mercaptoethanol
  • preservatives and the like may be contained.
  • These activators, stabilizers, preservatives, etc. may be contained in a solution as described above, which is different from the solution containing the decomposing enzyme.
  • One or more solutions containing an agent, stabilizer, or preservative will be added separately to the reaction solution.
  • the enzyme treatment [step (4) of the present invention] is carried out as follows.
  • a solution containing a single-strand-specific DNA nuclease and a solution containing an activator and a stabilizer are added and mixed.
  • the single-stranded driver polynucleotides single-stranded driver-specific polynucleotides and single-stranded driver-nonspecific polynucleotides that were not hybridized and that existed in the reaction solution were decomposed. Remove.
  • magnesium ion is preferable as the activator.
  • Examples of its origin include magnesium salts such as magnesium chloride and magnesium sulfate, and among these, magnesium chloride is preferred.
  • the amount of magnesium salt used is usually 0.1 mM to 100 mM, preferably 0.5 mM to 50 mM, more preferably lmM to 10 mM, as long as it can sufficiently activate the single-strand specific DNA nuclease.
  • dithiothreitol is preferred, among which preferred are thiol compounds such as dithiothreitol and mercaptoethanol.
  • the amount used is usually O. Olm to 100 mM, preferably 0.05 to 50 mM, more preferably 0.1 to 10 mM, as long as the single-strand-specific DNA nuclease can be stabilized.
  • the amplification method of the present invention [the steps (1) to
  • the tester-specific polynucleotide amplified in (3)] can be easily isolated.
  • the single-stranded tester-specific polynucleotide obtained in step (2) without the amplification in step (3) is complementary to the single-stranded tester-specific polynucleotide as a saddle.
  • a single-strand tester specific poly- mer using a primer and a polymerization enzyme such as a talenow fragment After the complementary strand to the nucleotide is primer-extended to obtain a double strand by a method such as obtaining a single strand tester-specific polynucleotide and a double strand of the complementary strand, perform step (4) of the present invention.
  • the tester-specific polynucleotide is not amplified (concentrated), but it does not form a hybrid that coexists with the single-stranded tester-specific polynucleotide obtained in step (2).
  • the single-stranded driver polynucleotide can be decomposed and removed, and only the tester-specific polynucleotide can be easily isolated.
  • the acquisition method or amplification method of the present invention can be performed according to the chart shown in FIG. 1 using a single-stranded tester polynucleotide and a single-stranded or double-stranded driver polynucleotide.
  • a method known per se preferably a tester-derived double-stranded polynucleotide is prepared from a target sample, and then converted into a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment [step (1 ′) of the present invention.
  • step (1 ") of the present invention by a method of amplifying a double-stranded polynucleotide derived from a tester and then converting the double-stranded polynucleotide into a single-stranded polynucleotide by enzymatic treatment [step (1 ") of the present invention]
  • a tester polynucleotide preferably a single-stranded tester polynucleotide to which an adapter has been added, is prepared, while another sample force is applied to the double-stranded driver polynucleotide or the single-stranded tester polynucleotide by a method known per se.
  • complementary single-stranded driver polynucleotides, then V for example, the following procedure can be used to obtain the present invention. Law or amplification method is carried out.
  • Hybridization is performed between the double-stranded polynucleotide of the tester non-specific polynucleotide and a complementary driver polynucleotide (driver non-specific polynucleotide), or the hybrid and the hybrid.
  • a double-stranded polynucleotide of the associated driver polynucleotide and the driver polynucleotide is hybridized [Step (1)], and then the hybridized double-stranded polynucleotide is decomposed and removed by enzymatic treatment, so that the tester is non-specific.
  • Polynucleotide Alternatively, the driver single-stranded polynucleotide reassociated with this is removed [step (2)]. Further, if necessary, the single-stranded driver polynucleotide that does not form coexisting cells and hybrids is removed by an isolation (separation) method or a purification method known per se [isolation step].
  • a single-stranded tester-specific polynucleotide can be obtained or isolated by the above procedure. (Acquisition method 1 of the present invention)
  • the obtained or isolated single-stranded tester-specific polynucleotide is amplified [step (3)]. Thereby, it is possible to substantially amplify only the tester-specific polynucleotide and to obtain only a large amount of the tester-specific polynucleotide. (Amplification method 1 of the present invention)
  • the obtained single-stranded tester-specific polynucleotide is amplified [step (3)].
  • the single-stranded driver polynucleotide that does not form a hybrid and coexists with the amplified tester-specific polynucleotide is removed [step (4)]. As a result, the amplified tester-specific polynucleotide can be isolated. (Amplification method 2 of the present invention)
  • the tester-specific polynucleotide can be amplified (concentrated) and isolated more easily by the following procedure. (Amplification method 3 of the present invention)
  • the obtained single-stranded polynucleotide and its complementary strand are amplified to obtain a double-stranded tester-specific polynucleotide [step (3 ') ]
  • the single-stranded driver polynucleotide that coexists with the amplified double-stranded tester-specific polynucleotide and does not form a hybrid is decomposed and removed by enzymatic treatment, and the double-stranded tester-specific polynucleotide is removed. Isolate [step (4 ')].
  • the obtained single-stranded tester-specific polynucleotide is used as a saddle and a complementary strand is synthesized to obtain a double-stranded tester-specific polynucleotide [two Main chain step].
  • step (4 ′) the double-stranded tester-specific polynucleotide is By coexisting with the nucleotides, the single-stranded driver polynucleotides that form strong, strong and weak molecules are decomposed and removed by enzymatic treatment. In this case, the tester monospecific polynucleotide obtained in step (2) can be easily isolated. (Acquisition Method 2 of the Present Invention) [0071] (Procedure 6)
  • the double-stranded step is used to form a single-stranded tester-specific polynucleotide as a saddle and synthesize a complementary strand to the double-stranded strand.
  • a tester specific polynucleotide is obtained.
  • the acquisition method of the present invention the above-mentioned procedure 1 is preferable. Further, as the amplification method of the present invention, the procedure 3 which is preferable to the procedures 2 and 3 is particularly preferable.
  • a primer that is phosphated at the end is phosphated at the end and a phosphate that has a different sequence.
  • a primer that is phosphated at the end is amplified by PCR using the two primers prepared.
  • mRNA is extracted from the target sample by a method known per se.
  • Two types of primers are prepared: a 5 'terminal force S-phosphorylated primer designed with a known sequence and a different sequence phosphorylated.
  • cDNA with adapter sequences added to the 5 'end and 3' end is prepared using the prepared two primers according to the oligo cabbing method.
  • a primer is prepared with adapter sequences at the 5 ′ end and 3 ′ end, and double-stranded cDNA is amplified by PCR or the like. If necessary, the amplified adapter-capped double-stranded cDNA is subjected to an extraction treatment with an alcohol mixture of phenol Z, black form, and isoamyl alcohol, an alcohol precipitation treatment, or the like.
  • Amplified double-strand cDNA with adapter for example, lambda exonuclease Phosphorylation at the 5 'end of the strand DNA Treated with an enzyme that removes the DNA strand, and then treated with a reaction terminator such as a chelating agent such as EDTA, or Z and heat treatment to react the enzyme. Stop and remove the cDNA strand on the 5 'end phosphate primer side to obtain a single-stranded tester cDNA to which the adapter is bound (added).
  • a reaction terminator such as a chelating agent such as EDTA, or Z and heat treatment
  • the obtained single-stranded tester cDNA is purified by column purification or the like. An outline of the above method is shown in FIG.
  • the amplified adapter-capped double-stranded cDNA is cleaved from both ends of the inserted fragment cDNA to the amplified primer (adapter) using the multicloning sites on both sides of the inserted fragment.
  • the obtained double-stranded driver cDNA is purified by column purification or the like. An outline of the above method is shown in FIG.
  • the prepared single-stranded tester cDNA and an excess amount of the double-stranded driver cDNA relative to the single-stranded tester cDNA are added to and mixed with a buffer containing an appropriate amount of sodium salt, and then at an appropriate temperature for an appropriate time. Heat denaturation by heating. Next, hybridization is performed at an appropriate temperature for an appropriate time to form a double-stranded cDNA consisting of a tester cDNA and a complementary driver cDNA.
  • a hybridization solution containing two single-stranded driver non-specific cDNAs (sense strand and antisense strand) is obtained.
  • a solution containing a DNA degrading enzyme having a property capable of preferentially degrading double-stranded DNA such as a double-strand-specific DNA nuclease, an activator and a stabilization is added and mixed, and usually 20 ° C to 80 ° C, preferably 30 ° C to 75 ° C, more preferably 50 ° C to 70 ° C, usually pH 6 to 9, preferably 6.5 to 8.5, what do you prefer? -8, usually 0.5 min to 60 min, preferably 1 min to 45 min, more preferably 5 min to 30 min.
  • the hybridized two contained in the hybridization solution Strand cDNA (—Double-stranded hybrid of non-single-strand tester-specific cDNA and complementary single-stranded driver cDNA, re-associated double-stranded driver-specific cDNA, and re-associated double-stranded driver non-specific (CDNA), and then, for example, by treatment with a reaction terminator such as a chelating agent such as EDTA, or treatment with a reaction terminator and heat treatment, the reaction of the DNA-degrading enzyme is stopped, Single-stranded tester-specific cDNA, single-stranded driver-specific cDNA that did not reassociate (two types of sense strand and antisense strand), and single-stranded driver-nonspecific cDNA that did not reassociate (sense strand and anti-sense cDNA) 2 types of sense strand) Get the liquid.
  • Strand cDNA Double-stranded hybrid of non-single-strand tester-specific
  • these cDNAs are subjected to an extraction treatment with a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture or an alcohol precipitation treatment.
  • the solution is cooled and the primer is annealed to the single-stranded tester-specific cDNA (after the second cycle, the single-stranded tester-specific cDNA and the amplified complementary strand).
  • the solution is treated at an appropriate temperature for an appropriate time, and the primer is extended by the action of the polymerization enzyme to complement the single-stranded tester-specific cDNA.
  • a complementary strand to the tester-specific cDNA and a complementary strand to the complementary strand of the amplified single-stranded tester-specific cDNA are synthesized (amplified).
  • the amplified single-stranded tester-specific cDNA and its complementary strand are amplified, and amplified double-stranded tester specific Obtain a reaction solution containing the target cDNA, single-stranded driver-specific cDNA (two types of sense strand and antisense strand) and single-stranded driver non-specific cDNA (two types of sense strand and antisense strand).
  • these cDNAs are subjected to an extraction treatment with a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture or an alcohol precipitation treatment.
  • a solution containing a stabilizer usually 20 ° C to 60 ° C, preferably 25 ° C to 50 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C, usually pH 7 to ll, preferably The pH is 8 to 10.5, more preferably 9 to 10, usually 0.1 min to 60 min, preferably 0.5 min to 45 min, more preferably 1 min to 30 min (reacted).
  • the obtained double-stranded tester-specific cDNA is purified by column purification or the like.
  • the tester-specific polynucleotide obtained, amplified or isolated by the method of the present invention is used for various identifications such as identification of genetic mutations in the tester and screening, for example, as follows.
  • the position of the mutant gene on the genomic DNA can be determined by comparing the total DNA sequence with the base sequence of the mutant gene using a database or the like. Can be identified. If the entire DNA sequence has not been decoded, the position of the mutated gene on the genomic DNA can be identified by a method known per se, such as the FISH method.
  • a tester-specific polynucleotide labeled with a labeling substance or an oligonucleotide containing a part or all of its complementary strand is used as a probe and immobilized on a DNA chip.
  • screening methods known per se such as hybridization with the above library [Beck MT, Holle L, Chen WY. Biotechniques. 2001 Oct; 31 (4): 782-4, 786]. .
  • the tester-specific polynucleotide (especially genomic DNA or cDNA) is cloned into a subtractive genomic DNA or cDNA library.
  • Genomic DNA or cDNA extracted from normal (healthy) samples and abnormal (morbid) sample power Hybridization is performed using the extracted genomic DNA or mRNA group as a probe, and genomic DNA or mRNA of abnormal (morbid) samples.
  • Genomic DNA or cDNA that reacts only to the group may be from an unknown pathogen. That is, this may detect unknown pathogens.
  • the tester-specific polynucleotide (especially cDNA) is inserted into an appropriate vector such as a plasmid vector, and transformed into E. coli or the like using the vector, for example. Can be cloned.
  • the method of the present invention includes various identification methods and screening methods as described above using the tester monospecific polynucleotide obtained, amplified or isolated by the method of the present invention.
  • the identification method and screening method may be carried out according to a method known per se except that a tester-specific polynucleotide obtained, amplified or isolated by the method of the present invention is used. Also, those used in a method known per se can be used.
  • the genetic mutation identification method of the present invention preferably includes at least one step selected from, for example, the following (1) to (9).
  • the obtained tester-specific polynucleotide (especially genomic DNA or cDNA) is cloned into a subtractive genomic DNA or cDNA library, and abnormal with genomic DNA or cDNA extracted from normal (healthy) samples.
  • Disease A step of performing hybridization using a genomic DNA or mRNA group extracted from a sample as a probe,
  • the obtained tester-specific polynucleotide (especially cDNA) is inserted into an appropriate vector such as a plasmid vector, and transformed into Escherichia coli, etc., using this vector.
  • an appropriate vector such as a plasmid vector
  • a probe primer comprising an oligonucleotide containing a part or all of a tester-specific polynucleotide or its complementary strand obtained, amplified or isolated by the method of the present invention, and obtained by the method of the present invention. It also includes cDNA libraries that can be used.
  • the kit of the present invention is used for carrying out the acquisition method, amplification method or identification method of the present invention as described above.
  • Such a kit includes: a) a double-stranded polynucleotide hybridized in step (2) of the present invention as described above (ie, a tester non-specific polynucleotide and a complementary driver polynucleotide).
  • a double-stranded polynucleotide an enzyme having a property capable of preferentially degrading a hybridized double-stranded polynucleotide without degrading the single-stranded polynucleotide, preferably a double-stranded polynucleotide.
  • An enzyme group preferably an enzyme having the property of removing a nucleic acid strand on one side of a double-stranded polynucleotide to form a single-stranded polynucleotide, more preferably comprising lambda exonuclease C)
  • the single-stranded polynucleotide (single-stranded driver polynucleotide) coexisting with the double-stranded tester-specific polynucleotide is selected in step (4) of the present invention as described above.
  • Double-stranded polys An enzyme having a property capable of preferentially degrading a single-stranded polynucleotide without degrading nucleotides, preferably a DNA degrading enzyme having a property capable of preferentially degrading single-stranded DNA without degrading double-stranded DNA, More preferably, it comprises a single-strand-specific DNA nuclease, and more preferably exonuclease I.
  • reagents other than those described above can be added to form the kit of the present invention.
  • reagents include, but are not limited to, for example, at least one selected from the following a) to i).
  • a buffer solution for an enzyme for example, sodium salt, magnesium salt and thiol salt if necessary
  • an enzyme for example, sodium salt, magnesium salt and thiol salt if necessary
  • Good buffer such as HEPES containing the compound
  • a ') Stops the reaction of the enzyme that has the property of preferentially degrading double-stranded polynucleotides that have been formed without disrupting the double-stranded polynucleotides Solution (for example, containing a quenching agent such as a chelating agent, eg, water or a buffer as described above),
  • a buffer for an enzyme group that can be converted into a single-stranded polynucleotide eg, a buffer for glycine containing a magnesium salt and a surfactant
  • a buffer for an enzyme having a property capable of preferentially degrading a polynucleotide for example, a buffer such as glycine containing a magnesium salt and a thiol compound
  • Hybridization buffer eg, Good buffer containing sodium salt
  • Polynucleotide extraction reagent eg, grinding buffer, phenol, chloroform, SDS, Mercaptoethanol, etc.
  • DPCR reagents eg, polymerization enzymes, polymerization enzyme buffers, one or more primers, nucleotide mixtures, etc.
  • Reagents for electrophoresis eg, agarose or polyacrylamide gel, loading buffer, reagent for staining with odorants, etc.
  • Polynucleotide isolation (separation) or purification reagent e.g. purification column
  • Reagent for alcohol precipitation for example, ethanol solution, isopronol V solution, polymer carrier, sodium acetate solution, etc.
  • instructions for use in the acquisition, amplification, and identification methods of the present invention as described above may be included.
  • the “instructions” means the instruction manual, package insert, pamphlet (leaflet), etc. of the kit in which the characteristic “principle” operation procedure etc. in the method of the present invention is substantially described by sentences or diagrams. Means.
  • the method of the present invention has the following effects.
  • Tester polynucleotide and driver polynucleotide can be prepared from a cDNA library.
  • the circular plasmid could not be removed in the subtraction cDNA production process, so both the tester polynucleotide and the driver polynucleotide could only be prepared from cDNA.
  • problems such as limitations.
  • Hybridization (subtractive 'hybridization) only once.
  • the tester polynucleotide since the tester polynucleotide is double-stranded, double-stranded hybridization between the reassembled tester polynucleotides occurs. If expressed, the tester non-specific polynucleotide (housekeeping gene) remains, which may adversely affect subsequent PCR amplification. Therefore, in the conventional method, it was necessary to repeat the hybridization two to three times or more. In contrast, in the present invention, the tester polynucleotide is a single strand. Therefore, a double-stranded hybrid between tester polynucleotides is not formed, and it is sufficient to perform the hybridization once.
  • a tester non-specific polynucleotide can be decomposed and removed from polynucleotides present in the tester by one enzymatic treatment.
  • the single-stranded polynucleotide obtained as a result of subtractive hybridization is physically bound or adsorbed. In fact, they could not be separated exactly, causing a decrease in sub-tratat efficiency.
  • the double-stranded polynucleotide hybridized by the enzyme treatment is removed, so the double-stranded polynucleotide can be removed with high efficiency by a single enzymatic treatment, and the single-stranded tester can be efficiently produced. Specific polynucleotides can be obtained.
  • the tester-specific polynucleotide can be easily concentrated.
  • tester-specific polynucleotides Only present in single-stranded tester-specific polynucleotides, not in driver-derived polynucleotides! ⁇ Based on the sequence! Since nucleotides are not amplified and only tester-specific polynucleotides are substantially amplified, tester-specific polynucleotides can be enriched and efficient subtratat 'polynucleotides can be made.
  • the driver polynucleotide can be easily removed.
  • the driver polynucleotide coexisting with the tester-specific polynucleotide can be easily removed.
  • the single-stranded driver polynucleotide can be easily removed by enzymatic treatment.
  • the density of tester monospecific polynucleotides can be further increased, so that the effects of driver polynucleotide contamination (remaining), which has been a problem with conventional methods, are further reduced, and highly efficient subtraction.
  • ⁇ Polynucleotide can be produced.
  • Hep G2 cells were cultured in 4 225 mL culture flasks (Nalge Nunc) to 5 ⁇ 10 6 cells / cm 2 and washed with phosphate buffer (PH7.5). 15 mL of ISOGEN (manufactured by Futtsubon Gene) was added to 1 culture flask, the cells were detached, and each was transferred to a centrifuge tube (Nalge Nunc, Oak Riddge Centrifoge Tube, 50 mL). 3 mL of black mouth form was added to each, stirred, and then centrifuged at 12000 rpm, 4 ° C.
  • ISOGEN manufactured by Futtsubon Gene
  • RNA concentration was measured at 260 nm. After concentration measurement, 250 ⁇ L (500 ⁇ g) of RNA solution prepared to 2 g / ⁇ L with sterilized water was obtained.
  • Poly (A) + RNA was extracted using Oligotex-dT 30 Super (manufactured by Takara Biotech) using 500 g of Hep G2 cell total RNA obtained in (1) above, according to the package insert.
  • RNA concentration was measured at 260 nm with a spectrophotometer (Beckman, DU640). After concentration measurement, 28 L (7 g) of Poly (A) + RNA solution prepared to 0.25 ⁇ / ⁇ L with sterile water was obtained.
  • RNA obtained in (2) above was taken and prepared according to the package insert using TimeSaver cDNA Synthesis Kit (manufactured by Amersham).
  • the vector used was PNEB193 (New England Biolabs), and DH5a was used for transformation.
  • the plasmid library was cultivated in 100 ml of Luria-Bertani's broth (containing ampicillin sodium 100 g / ml) and then recovered.
  • RNA 5 i ug (20 i u) obtained in (2) above first heated to 65 ° C for 10 minutes in First-Strand Reaction Mixes (manufactured by mersham) and then rapidly cooled in ice.
  • Oligo— dT (24) — Pac I sit e Primer (5'-TTTTTTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • the first-strand reaction was stopped by heating at 65 ° C. for 10 minutes, and Primer and low-molecular DNA were removed with SizeSep 400 Spun Columns (manufactured by Amersham) to obtain double-stranded cDNA.
  • PNEB193 DNA (manufactured by New England Biolabs) cleaved with the obtained cDNA 3 L (approximately 100 ng in terms of Poly (A) + RNA), EcoR I (manufactured by Tubongene) and Pacl (manufactured by New England Biolabs) )
  • the transformed cDNA library is cultured in 100 ml of Luria-Bertani's broth (containing 100 g / ml of ampicillin sodium) at 37 ° C for 16 hours, and the Hep G2 cell plasmid cDNA library inserted in one direction is recovered. did.
  • a portion of the obtained cDNA library was prepared with 10 ng ZU with sterilized water and used as a PCR amplification reaction template in the preparation of the tester cDNA described in (4) below.
  • the insert cDNA was PCR amplified using TOPOTAQ DNA Polmerase (Fidelity Systems).
  • the following reagents were mixed, and the mixture L was dispensed into five 0.2 mL PCR tubes.
  • Phosphorylated primer (5'-P-CCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3) (Sigma Dienosis) Dissolved in sterilized water to 10 M.
  • Non-phosphorylated primer (5'-CACACAGGAAACAGCTATGACC-3) (manufactured by Sigma Dienosis) dissolved in sterilized water to a concentration of 10M.
  • TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems, 3units / L) 1 L Dilution buffer (Fidelity Systems) 3 ⁇ L was mixed and mixed to make 4 ⁇ L.
  • the insert cDNA was amplified by PCR using a normal human liver tissue-derived cDNA library (BioChain, cDNA Library: Human Adult Normal Tissue: Liver) as a saddle.
  • Each reagent was mixed, and the mixture L was dispensed into five 0.2 mL PCR tubes.
  • Stop Solution (5 mM EDTA aqueous solution) was added thereto and incubated at 68 ° C. for 5 minutes to stop the reaction of the double-stranded specific DNA nuclease.
  • reaction solution To the obtained reaction solution, add 80 L of sterilized water and an equal volume (100 ⁇ L) of phenol: black mouth form: iso-amyl alcohol mixture (25: 24: 1) mixture (Nitsubon Gene Co., Ltd.) And mixed.
  • the following reagents were mixed, and the mixture L was dispensed into five 0.2 mL PCR tubes.
  • Phosphorylated primer (5'-P-CCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3,) (manufactured by Sigma Dienosis) dissolved in sterilized water to 10M.
  • Non-phosphorylated primer (5'-CACACAGGAAACAGCTATGACC-3) (manufactured by Sigma Dienosis) dissolved in sterilized water to a concentration of 10M.
  • TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems, 3units / L) 1 L Dilution buffer (Fidelity Systems) 3 ⁇ L was mixed and mixed to make 4 ⁇ L.
  • PCR amplification product (tester cDNA amplification product) prepared in (8) above was added to 44 ⁇ L of 10 X Exonucl ease I Buffer (New England Biolabs, 67 mM magnesium chloride and lOOmM 2-mercaptoethanol-containing 670 mM glycine-KOH Buffer, pH 9.5) 5 ⁇ L and Exonuclease I (New England Biolabs, 20 units / ⁇ ⁇ > 1 ⁇ L) were added, mixed, and incubated at 37 C for 30 minutes. Exonuclease I was inactivated by incubation at ° C for 15 minutes.
  • 10 X Exonucl ease I Buffer New England Biolabs, 67 mM magnesium chloride and lOOmM 2-mercaptoethanol-containing 670 mM glycine-KOH Buffer, pH 9.5
  • Exonuclease I New England Biolabs, 20 units / ⁇ ⁇ > 1 ⁇ L
  • Tester cDNA obtained in (4) above Hep G2 cDNA
  • driver cDNA obtained in (5) above normal liver cDNA
  • tester specific cDNA obtained in (9) above subtracted cDNA
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) amplified chain length: 859bp
  • AFP alpha-fetoprotein
  • the following reagents were mixed, and the mixture L was dispensed into 0.2 mL PCR tubes.
  • ⁇ cDAN-containing solution 1 ⁇ L (containing 10 ng / ⁇ L cDNA)
  • the single-stranded tester cDNA prepared in (4) above is diluted with sterile water so that the DNA concentration is 10 ng / ⁇ L.
  • the double-stranded driver cDNA prepared in (5) above is diluted with sterile water so that the DNA concentration is 10 ng / ⁇ L, or
  • the subtraction cDNA obtained in (9) above is diluted with sterile water so that the DNA concentration is 10 ng / ⁇ L.
  • GAPDH amplification primer 1 (5'-GAGTACGTCGTGGAGTCCACTG-3,) or AFP amplification primer 1 (5'-GTACGGACATTCAGACTGCTG-3,) dissolved in sterilized water to a concentration of 10 ⁇ .
  • GAPDH amplification primer 2 (5'-CCTCACAGTTGCCATGTAGAC-3 ') or AFP amplification primer 2 (5'-CATCCAGGAGAGCCAAGCATTG-3,) dissolved in sterilized water to 10 ⁇ 10.
  • TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems, 3units / L) 1 L Dilution buffer (Fidelity Systems) 3 ⁇ L was mixed and mixed to make 4 ⁇ L.
  • lane 1 is the result of PCR amplification of the GAPDH gene using the tester cDNA prepared in (4) (the HepG2 cell cDNA derived from human liver cancer) as a saddle
  • lane 2 is prepared in (4).
  • Lane 3 shows the driver cDNA prepared in (5) as a saddle.
  • Figure 4 shows the results of PCR amplification of the GAPDH gene
  • lane 4 shows the results of PCR amplification of the AFP gene using the driver cDNA (cDNA derived from human normal liver tissue) prepared in (5) as a saddle
  • lane 5 shows (9).
  • Figure 6 shows the results of PCR amplification of the GAPDH gene using the tester-specific cDNA (subtracted cDNA) obtained in step 1 as a cage.
  • Lane 6 shows the tester-specific cDNA (subtracted cDNA) obtained in step (9).
  • the results of PCR amplification of the AFP gene as the type are shown in lane 7
  • Molecular weight markers: 10 The result using Obp DNA Step Ladder (100-l.
  • GAPDH which is a high-expressing housekeeping gene
  • AFP a Hep G2-specific expression gene
  • tester-specific cDNA (subtracted cDNA) can be easily and efficiently obtained in a short time.

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Description

明 細 書
サブトラクシヨン ·ポリヌクレオチドの取得方法
技術分野
[0001] 本発明は、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存在量より も多いポリヌクレオチドを取得'増幅する方法に関する。
背景技術
[0002] 機能、性質の異なる細胞又は組織間においては、発現量の異なる遺伝子が存在し ており、その細胞又は組織の機能解析にぉ 、て重要な役割を果たして 、る可能性が ある。このような遺伝子を取得することは、その機能や発現機構の解明等に有用であ る。
[0003] 一方、機能、性質の異なる細胞又は組織間において、発現量の異なる遺伝子をクロ 一-ングする方法として、 cDNAサブトラクシヨン法がある。
この cDNAサブトラクシヨン法は、以下の手順で行われる。
例えば癌細胞組織の特異的な機能、性質を解析する場合、
(1)先ず、癌細胞組織力ゝら調製した一本鎖 RNA又は cDNA (テスター)と正常細胞組織 力も調製された過剰量の一本鎖 RNA又は cDNA、若しくは二本鎖 cDNA (ドライバー)と をノヽイブリダィゼーシヨンさせる。この時、テスターとドライバーともに発現している遺 伝子（ノ、ウスキーピング遺伝子など）は二本鎖 cDNA又は RNA-DNAノ、イブリツドを形 成するが、テスターに特異的に発現して 、る遺伝子由来の RNA又は cDNAはハイプリ ッドを形成せず、一本鎖 RNA又は cDNAの状態である。
(2)次 、で、ハイブリッドを形成しな力つたテスターに特異的に発現して 、る遺伝子由 来の一本鎖 RNA又は cDNAを、例えばハイドロキシアパタイト 'クロマトグラフィー法 (H endrick, S.M.,Cohen, D.I., Nielsen, E.L. and Davis, M.M. (1984) Nature. 308, 149— 153)、アビジン ·ピオチン結合法 (Duguin, J.R. and Dinauer, M.C. (1990) Nucleic Acid Research. 18, 2789-2792、特表平 9— 507021号公報)、ラテックス、ビーズ、カラム 等を用いたオリゴ (dT) 固相法 (Hara, E" Kato T.
30 ， Nakada, S" Sekiya, L and Oda, K
. (1991) Nucleic Acid Research. 19, 7097-7104、特開 2001— 269172号公報)、ァ ビジン ·ピオチン ·磁気ビーズ法（特開 2001— 269172号公報、特開 2002— 25323 7号公報）等の方法により、ハイブリッド形成した二本鎖 cDNA又は RNA-DNAノヽイブリ ッドと分離し、テスター特異的に発現している遺伝子を濃縮する。
[0004] しかしながら、上記の方法は何れも物理的結合又は吸着を利用して、テスターに特 異的に発現している遺伝子由来の一本鎖 RNA又は cDNAとハイブリッド形成した二本 鎖 cDNA又は RNA-DNAハイブリッドとを分離するため、これらを厳密に分離すること はできず、ハイブリッド形成した二本鎖 cDNA又は RNA- DNAハイブリッドが混在してし まうという問題があった。その結果、上記の方法では、テスターおよびドライバー両方 に発現して 、る遺伝子 (例えばノヽウスキーピング遺伝子など）の混入が多ぐ高効率 にテスター特異的に発現して 、る遺伝子を濃縮 (取得)することはできな力つた。また 、上記方法は、操作が煩雑で作業工程が多ぐ時間と熟練を要するという問題もあつ た。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存在量より も多いポリヌクレオチドを、容易に且つ短時間に、高効率に取得'増幅する方法、当 該方法により得られた (増幅された)ポリヌクレオチド、テスターにおける遺伝子変異を 同定する方法、並びにこれらに用いられるキットを提供する。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、以下の構成よりなる。
1.以下の工程を含む、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での 存在量よりも多いポリヌクレオチドを取得する方法；
(1)(0テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となり得るドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとをノヽイブリダィ ゼーシヨンを行うか、或いは GOテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、ドライバー 由来の二本鎖ポリヌクレオチドとを混合して、熱変性後、ノ、イブリダィゼーシヨンを行う かして、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となり得るドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌ クレオチドを形成する工程、及び
(2)ハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により除去する工程。
2.以下の工程を含む、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での 存在量よりも多いポリヌクレオチドを増幅する方法；
(1) (0テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとを混合してハイプリ ダイゼーシヨンを行うか、或いは GOテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、ドライバ 一由来の二本鎖ポリヌクレオチドとを混合して、熱変性後、ノ、イブリダィゼーシヨンを 行うかして、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一本鎖ポリ ヌクレオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌ クレオチドを形成する工程、
(2)ハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により除去する工程、及 び
(3)ハイブリッド形成しな力つたテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドを増幅するェ 程。
3.上記 1の方法により得られた (テスターに特異的に存在する）ポリヌクレオチド又は 上記 2の方法により増幅された (テスターに特異的に存在する）ポリヌクレオチドを同 定することを特徴とするテスターにおける遺伝子変異を同定する方法。
4.上記 1の方法により得られた又は上記 2の方法により増幅された (テスターに特異 的に存在する）ポリヌクレオチド。
5.二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ及びテスター由来のポリヌクレオチドを一本鎖に するための酵素を含んでなる (テスターに特異的に存在する）ポリヌクレオチドを取得 又は増幅するためのキット。
即ち、本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、サブトラタティ ブハイブリダィゼーシヨンにより形成された、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと 当該テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖 ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチドを、酵素処理により除去することにより、テ スターでの存在量が別のドライバーでの存在量よりも多 、ポリヌクレオチドを、容易に 且つ短時間に、高効率に取得 ·増幅し得ることを見出し、本発明を完成させるに至つ た。
発明の効果
[0008] 本発明の方法により、テスターでの存在量がドライバーでの存在量よりも多いポリヌ クレオチドを、容易に且つ短時間に、高効率に取得 ·増幅することが可能であり、その 結果、テスターにおける遺伝子変異を高精度に同定することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明の取得方法又は増幅方法を示すチャート図である。
[0010] [図 2]本発明の一本鎖テスター cDNAの調製工程を模式的に示した図である。
[0011] [図 3]本発明の二本鎖ドライバー cDNAの調製工程を模式的に示した図である。
[0012] [図 4]本発明のテスター cDNAとドライバー cDNAとのハイブリダィゼーシヨン工程〔ェ 程（ 1)〕を模式的に示した図である。
[0013] [図 5]本発明のハイブリッド形成した二本鎖 cDNAの除去工程〔工程（2)〕を模式的に 示した図である。
[0014] [図 6]本発明のハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的 cDNAの増幅工程〔 工程（3)〕を模式的に示した図である。
[0015] [図 7]本発明のハイブリッド形成しなカゝつた一本鎖ドライバー cDNAの除去工程〔工程 (
4)〕を模式的に示した図である。
[0016] [図 8]実施例で得られた、ヒト肝臓癌由来の HepG2細胞の cDNA (テスター cDNA)、ヒト 正常肝臓組織由来の cDNA (ドライバー cDNA)及びサブトラクシヨン cDNA (テスター 特異的 cDNA)をそれぞれ铸型として、 glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase (
GAPDH)遺伝子と alpha-fetoprotein (AFP)遺伝子とを PCR増幅して得られた PCR産 物を電気泳動した結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 1.試料
本発明において、「ある試料 (テスター）」及び「別の試料 (ドライバー）」とは、両者が それぞれ異なることを意味し、例えば (1)試料の種類は異なるが、試料の由来〔生体（ 個体'集団）、場所等〕は同一である場合、（2)試料の種類は同一であるが、試料の由 来が異なる場合、（3)試料の種類及び試料の由来が異なる場合、（4)試料の種類及び 試料の由来が同一である場合である。
より具体的には、例えば (1)同一個体 (生体）における異なる種類の細胞、組織、器官 、体液等、（2)異なる個体 (生体'商品）間 (特定個体と標準 (正常)個体間)又は特定 の個体 (生体'商品）と集団間 (特定個体と標準 (正常)集団間）における同じ種類の 細胞、組織、器官、体液等、（3)異なる個体間 (罹患個体と標準 (正常)個体間)又は 特定個体と集団間 (罹患個体と標準 (正常)集団間）における異なる種類の細胞、組 織、器官、体液 (異常細胞と正常細胞、異常組織と正常組織、異常器官と正常器官、 異常体液と正常体液等)等、（4)環境、状態等が異なる場合 (薬剤投与前後、ストレス 付加前後、病態の異なるステージ等)の同一個体 (生体）における同一種類の細胞、 組織、器官、体液等
[0018] 本発明が適用される試料の種類としては、この分野で用いられているものであれば良 ぐ特に限定されない。このような試料としては、例えば細胞、組織、器官、体液 (血液 、血清、血漿、髄液、滑液、膝液、リンパ液等)、排泄物 (尿、唾液、糞便等)、喀たん 、膿、皮膚由来物等の生体由来試料;微生物 (菌類、細菌類、ウィルス等）；例えば環 境試料 (食品、飲料、水道水、海水、湖沼水、河川水、工場廃液、半導体用洗浄水、 医療器具等を洗浄した後の洗浄液等）；これらから得られる抽出液;及びこれらを水 や通常この分野で用いられている緩衝液等（トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩 衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）に適宜溶解させて再構成 して得られた処理物等が挙げられる。
[0019] 本発明において、「ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存 在量よりも多い」とは、（1)テスターには存在するがドライバーには存在しない場合や、 (2)テスターとドライバーの両方に存在はして 、るものの、テスターでの存在量がドライ バーでの存在量に比較して多い場合等を意味する。尚、「テスターに特異的に存在 する」や「テスター特異的」も同じ意味である。
[0020] 本発明の方法により、取得 '増幅される「ポリヌクレオチド」（即ち、「ある試料 (テスター )での存在量が別の試料 (ドライバー）での存在量よりも多 、ポリヌクレオチド」 )には、 例えば mRNA等の RNA;当該 mRNAに由来する cDNA、ゲノム DNA等の DNA等が含ま れる。なかでも、本発明の方法は、 mRNAに由来する cDNA、ゲノム DNA等の DNAを 取得'増幅するのに有効であり、特にテスターでの存在量がドライバーでの存在量よ りも多い mRNA由来の cDNAを取得 ·増幅するのに極めて有効である。
[0021] 2.本発明の方法
本発明は、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存在量よりも 多いポリヌクレオチド (以下、テスター特異的ポリヌクレオチドと略記する。）を取得又 は増幅する方法に関する。
本発明の当該ヌクレオチドの取得方法は、（1)テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチ ドを用いてドライバー由来の一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダィゼーシ ヨンを行って、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一本鎖ポ リヌクレオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリ ヌクレオチドを形成させること、及び (2)酵素処理により、ハイブリッド形成した二本鎖 ポリヌクレオチドを除去することを特徴とする。
更に、当該二本鎖ポリヌクレオチドの除去後、ハイブリッド形成しな力つたテスター由 来の一本鎖ポリヌクレオチドを増幅させることにより、テスターでの存在量がドライバー での存在量よりも多いポリヌクレオチドを大量に得ることができる。
即ち、本発明の当該ヌクレオチドの増幅方法は、（1)テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドを用いてドライバー由来の一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダィ ゼーシヨンを行って、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一 本鎖ポリヌクレオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二 本鎖ポリヌクレオチドを形成させること、（2)酵素処理により、ハイブリッド形成した二 本鎖ポリヌクレオチドを除去すること、及び（3)ハイブリッド形成しな力つたテスター由 来の一本鎖ポリヌクレオチドを増幅することを特徴とする。
[0022] 2- 1.本発明のテスター特異的ポリヌクレオチドの取得方法
(1)テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチド
本発明におけるテスター由来のポリヌクレオチド (以下、テスターポリヌクレオチドと略 記する。）は一本鎖ポリヌクレオチドである。当該一本鎖ポリヌクレオチドは、 DNA及び RNAのどちらでも良いが、好ましくは DNAである。なかでも、ゲノム DNA及びテスター に存在する mRNAに由来する cDNA (換言すれば、テスターから抽出した mRNAを铸 型として合成された cDNA)が好ましぐ特に cDNAが好ましい。
本発明の一本鎖テスターポリヌクレオチドは、前述した如き試料から適宜調製でき る。一本鎖ポリヌクレオチドの調製は、通常この分野で用いられている自体公知の方 法を適宜選択して用いることができ、市販のキットを用いて行うこともできる。
このような方法としては、通常この分野で用いられている方法であれば特に限定さ れず、前述した如き試料力 直接一本鎖ポリヌクレオチドを調製する方法〔例えば、 V ieira J, Messing J. Methods in Enzymology. 1987;153:3-11 ; Krieg PA, Melton DA. Methods in Enzymology. 1987;155:397-415 ; Davanloo P, Rosenberg AH, Dunn JJ, S tudier FW. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Apr;81(7):2035- 9等〕、前述した如き試 料から一且ニ本鎖ポリヌクレオチドを調製した後、当該二本鎖ポリヌクレオチドを一本 鎖ポリヌクレオチドにする方法〔例えば、 Higuchi RG, Ochman H. Nucleic Acid Resea rch. 1989 Jul 25;17(14):5865 ; Guo LH, Wu R. Methods in Enzymology. 1983;100:60 -96等〕、 PCRプライマーの片側だけピオチン標識したプライマーを使用して PCR増幅 し、それをマグネチック 'ストレプトアビジン'ビーズと混合して一本鎖 DNAを回収する 方法等が何れも使用できる。また、市販のキットを用いて行うこともできる。ここで、二 本鎖ポリヌクレオチドの調製も、通常この分野で用いられている自体公知の方法を適 宜選択して用いることができ〔例えば、 Kazuo Maruyama and Sumio Sugano Gene, 13 8 ( 1994 ) 171-174 ; Diatchenko,L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6025-6030 ( 1996 )； Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N , Hase T. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63 ; Shimada M, Hino F, Sagawa H, Mukai H, Asada K, Kato I. Rinsho Byori. 2002 May;50(5):528- 32等〕、市販のキ ットを用いて行うこともできる。
尚、上記において、調製される一本鎖ポリヌクレオチド及び二本鎖ポリヌクレオチド は、テスター中に存在するポリヌクレオチドそのものでも、また、当該ポリヌクレオチド を铸型として、例えばポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)等の自体公知の増幅方法により増 幅された当該ポリヌクレオチドに相補又は Z及び相同なポリヌクレオチドであってもよ い。 [0024] 本発明においては、上記した如き一本鎖テスターヌクレオチドを得る方法のなかでも 、二本鎖ポリヌクレオチドを調製した後、酵素処理等により一本鎖ポリヌクレオチドに する方法〔例えば、 Higuchi RG, Ochman H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25;17( 14):5865 ; Guo LH, Wu R. Methods in Enzymology. 1983;100:60- 96等〕が好ましぐ 特に、テスター中に存在するポリヌクレオチドを铸型として、例えば PCR等の自体公 知の増幅方法により、当該ポリヌクレオチドに相補又は Z及び相同なポリヌクレオチド を増幅した後、酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドにする方法〔例えば、 Higuchi R G, Ochman H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25;17(14):5865等〕が好ましい。 従って、本発明の一本鎖テスターヌクレオチドを得る方法は、（1 ' )テスター由来の二 本鎖ポリヌクレオチドを調製した後、当該二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により一 本鎖ポリヌクレオチドにする工程、を含んでなる方法が好ましぐ特に（1")テスター由 来の二本鎖ポリヌクレオチドを増幅した後、当該二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理 により一本鎖ポリヌクレオチドにする工程、を含んでなる方法が好ま 、。
尚、上記において、酵素処理の際に用いられる酵素としては、通常この分野で用い られるものであれば良く特に限定されないが、例えばラムダ 'ェキソヌクレアーゼ等の 二本鎖ポリヌクレオチドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖ポリヌクレオチドとする性 質を有する酵素、例えば 2種以上の酵素を組み合わせることにより二本鎖ポリヌクレ ォチドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる酵素群（ 例えば 5'突出末端を生じ得る制限酵素、 3'突出末端を生じ得る制限酵素及び Exomi clease III等の 5 '突出末端を認識する 3 '→5 ' Exonuclease活性を有する酵素の組み合 わせ等)等が挙げられる。尚、これら酵素の由来は特に限定されず、また、 自体公知 の方法で得られたもの及び市販されているものの何れも使用できる。
[0025] また、上記した如き方法において使用される試薬類や反応条件等も自体公知の方 法に準じて行えばよい。
分解酵素の使用量は、二本鎖ポリヌクレオチドの片側の鎖を充分に分解して一本鎖 ポリヌクレオチドとし得る量であれば良く特に限定されない。具体的には、使用する分 解酵素の種類によって異なるため一概には言えないが、例えば酵素としてラムダ 'ェ キソヌクレアーゼを用いる場合には、通常 DNA2 μ gに対して 0.1units〜100units、好 ましくは 0.5units〜50units、より好ましくは 1 units〜 1 Ounitsである。
当該酵素処理の条件 (温度、時間、 pH等）、即ち、二本鎖ポリヌクレオチドとラムダ -ェ キソヌクレア一ゼとを反応 (接触）させる際の条件は、通常 25°C〜60°C、好ましくは 30 °C〜50°C、より好ましくは 35°C〜40°C、通常 pH7〜ll、好ましくは pH8〜10.5、より好 ましくは 9〜10で、通常 0.1分〜 60分、好ましくは 0.5分〜 45分、より好ましくは 1分〜 30 分処理される。
また、上記した如き pH範囲を維持するために、通常この分野で用いられる緩衝剤が 使用できる。このような緩衝液としては、上記した如き pH範囲で緩衝能を有するもの であれば良く特に限定されないが、例えばトリス—塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッ ド緩衝液 (例えば HEPES、 PIPES等）が挙げられる。使用濃度も通常この分野で用い られる濃度範囲、例えば通常 lmM〜500mM、好ましくは 5mM〜250mM、より好ましく は 10mM〜100mMから適宜選択される。
[0026] 尚、上記した如き酵素処理を行った後、当該酵素の反応を停止するには、例えば ED TA等のキレート剤等の反応停止剤を用いる方法又は Z及び加熱処理を行う方法に より行えばよい。
反応停止剤を用いる方法としては、例えば水や上記した如き緩衝剤等に当該反応停 止剤を含有させ、この反応停止剤含有溶液と、酵素処理を行って得られた反応液と 混合させれる等により、当該反応停止剤を、酵素処理を行って得られた反応液中に 存在させればよい。
また、加熱処理により反応を停止する方法としては、酵素処理を行って得られた反 応液を、通常 60°C〜95°C、好ましくは 70°C〜90°C、より好ましくは 80°C〜85°Cで処理 すればよい。
反応停止剤による反応時間及び加熱処理時間は、通常 5分〜 60分、好ましくは 10分 〜30分、より好ましくは 15分〜 20分である。
上記の反応停止方法のうち、反応停止剤を用いる方法と加熱処理による方法の両 者を併用するのが好ましい。
[0027] 尚、二本鎖ポリヌクレオチドとラムダ 'ェキソヌクレア一ゼとを反応させる際には、通 常この分野で用いられる活性化剤（例えば塩ィ匕マグネシウム、硫酸マグネシウム等の マグネシウム塩に由来するマグネシウムイオン等の金属イオン等）、界面活性剤（例 えば Triton-XlOO (ポリオキシエチレン (10)ォクチルフエ-ルエーテル）等）、安定化剤 (ジチオスレィトール、メルカプトエタノール等のチオールィ匕合物等）、防腐剤等を存 在させておいても良い。特に、マグネシウム塩及び界面活性を存在させるのが好まし い。尚、これらの使用量は通常この分野で使用される範囲から適宜選択し得、具体 的には、マグネシウム塩の使用量としては、通常 0.1mM〜100mM、好ましくは 0.5mM 〜50mM、より好ましくは lmM〜10mMであり、界面活性剤の使用量としては、通常 0.0 01〜l% (w/v)、好ましくは 0.005〜0.5% (w/v)、より好ましくは 0.01〜0.1% (w/v)である。 更に、本発明で使用される一本鎖テスターポリヌクレオチドとしては、その 5'末端又 は Z及び 3'末端に、既知配列力もなるアダプターが結合している (付加されている)も のが好ましぐ特に当該アダプタ一は 5'末端及び 3'末端の両末端に結合 (付加）させ るのが好ましい。アダプターはいかなる配列を含んでいても良いが、その塩基数はそ れ自体が単独でプライマーとして機能し得る程度が好ましい。従って、アダプターの 塩基数は、通常 15bp〜60bp、好ましくは 20bp〜35bp、より好ましくは 25bp〜30bpであ る。
尚、 5'末端及び 3'末端の両末端にアダプターを結合 (付加）させる場合は、両末端の アダプターが相補的であると、一本鎖テスターポリヌクレオチド内でのアダプターハイ ブリツドを形成するおそれがあるので、相補的ではな 、アダプターを両末端に結合さ せるのが好ましい。また、当該アダプタ一は、ドライバー由来のポリヌクレオチド中に 存在しな!、配列力 なるものが好まし!/、。
このように一本鎖テスターポリヌクレオチドに上記した如きアダプターを結合 (付加）さ せておくことにより、本発明のテスター特異的ポリヌクレオチドの取得方法で所得され たポリヌクレオチドを、ドライバー由来の（一本鎖)ポリヌクレオチドから容易に単離 ·精 製することができる。
また、上記した如きアダプタ一は、後述する本発明のポリヌクレオチドの増幅方法に ぉ 、て、本発明のテスター特異的ポリヌクレオチドの取得方法で所得されたポリヌクレ ォチド (ハイブリッド形成しな力つたテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチド)を増幅す る際に有用である。即ち、当該アダプターを後述する工程（3)で行う PCR等の増幅反 応用のプライマーが結合する既知の配列とすることにより、当該アダプターに結合す るプライマーを用いて容易にテスター特異的ポリヌクレオチドを増幅することができる 一本鎖テスターポリヌクレオチドにアダプターを結合 (付加）させる方法としては、通 常この分野で用いられている自体公知の方法を適宜選択して用いることができ、巿 販のキットを用いて行うこともできる。
このような方法としては、通常この分野で用いられている方法であれば特に限定さ れず (1)上記した如き方法により調製された一本鎖ポリヌクレオチドにアダプターを結 合 (1\Γ加)させる方法〔例 ば、 uligo— capping:a simple method to replace the cap str ucture of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides , Kazuo Maruyama and Sumio Sugano, Gene, 138 (1994) 171- 174に記載のオリゴ-キヤッビング法； Diatchenko,L.， e t al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6025-6030 (1996)に記載の SMART法； High- effic iency full-length cDNA cloning by biotinylated CAP trapper, Carninci P, Kvam C, K itamura A, Ohsumi T, Okazaki Y, Itoh M, Kamiya M, Shibata K, Sasaki N, Izawa M, Muramatsu M, Hayasnizaki Y, Schneider C, Genomics. 1996 Nov 1;37(3):327- 3bに 記載の Gene Trapper法等〕、（2)上記した如き方法において、調製された二本鎖ポリヌ クレオチドにアダプターを結合 (付加）させた後、これを一本鎖ポリヌクレオチドにする 方法〔例 は、 Determination of 5 ends of specinc mRNAs by DNA iigase- dependen t amplification, Bertling WM, Beier F, Reichenberger E., PCR Methods Appl. 1993 Oct;3(2):95-9に記載の RACE法等〕、（3)上記方法において、テスター中に存在する ポリヌクレオチドを铸型として、例えばアダプター配列に基づ 、て設計されたプライマ 一を用いた PCR法、 LAMP法、 ICAN法等の自体公知の増幅方法により、アダプター（ プライマー）が結合 (付加）された当該ポリヌクレオチドに相補又は Z及び相同なポリ ヌクレオチドを増幅する方法等が挙げられる。
尚、上記方法 (3)において、増幅されるポリヌクレオチドが二本鎖の場合は、当該二本 鎖ポリヌクレオチドを上記した如き方法により一本鎖ポリヌクレオチドにする必要があ る。この場合、使用する 2種類のプライマーのうち片側のみの 5'末端をリン酸ィ匕してお けば、増幅された二本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖 DNAの 5'末端リン酸化 DNA鎖を除 去するラムダ 'ェキソヌクレアーゼ等で処理することにより、 5'末端リン酸ィ匕プライマー 側の cDNA鎖を除去することができ、容易にアダプターが結合した (付加された）一本 鎖テスターポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明にお 、ては、上記した如き一本鎖テスターポリヌクレオチドにアダプターを結 合 (付加）させる方法のなかでも、テスター中に存在するポリヌクレオチドを铸型として 、例えばアダプター配列に基づいて設計されたプライマーを用いた PCR法、 LAMP法 、 ICAN法等の自体公知の増幅方法により、アダプター（プライマー）が結合 (付加）さ れた当該ポリヌクレオチドに相補又は Z及び相同なポリヌクレオチドを増幅する方法 が好ましい。
従って、本発明において、アダプターが結合した (付加された)一本鎖テスターヌクレ ォチドを得る方法は、（ 1 ' ")テスター由来の二本鎖ポリヌクレオチドをアダプター配列 に基づ!/、て設計されたプライマーを用いて増幅した後、当該二本鎖ポリヌクレオチド を酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドにする工程、を含んでなる方法が好ましい。 例えば以下の方法により、アダプターが結合した (付加された)一本鎖テスターポリ ヌクレ才チドを得ることができる。
(1)自体公知の方法〔Gublerらの方法（Gulber, U. and Hoffman, B. J. (1983) Gene. 25 , 263-269)等〕によってテスターカゝら抽出した mRNAを铸型として作成された cDNAラ イブラリー或いは市販の cDNAライブラリーを用い、 cDNA挿入断片両端のベクター由 来の既知配列で設計された 5'末端がリン酸化されたプライマーとリン酸化されていな V、プライマーの 2種のプライマーを作製し、これを用いてベクターに挿入されて!、る c DNAを铸型として、 PCR法、 LAMP法、 ICAN法等によりテスター遺伝子由来の二本鎖 cDNAを増幅する。次いで、増幅されたプライマー（アダプター）付力卩ニ本鎖 cDNAを、 例えばラムダ'ェキソヌクレアーゼ等の二本鎖 DNAの 5'末端リン酸化 DNA鎖を除去す る酵素により処理し、 5'末端リン酸ィ匕プライマー側の cDNA鎖を除去して、アダプター が結合した（付カ卩された）一本鎖テスター cDNAを得る〔Higuchi RG, Ochman H. Nucl eic Acid Research. 1989 Jul 25;17(14):5865等〕。
(2)既知配列 (アダプター)で設計された 5'末端がリン酸化されたプライマーとリン酸化 されて ヽな 、プライマーの 2種のプライマーを作製し、これを用いてオリゴ 'キヤッピン グ法に従って 5'末端及び 3'末端にアダプター配列が付加された cDNAを作製する。 次 、で、 5'末端及び 3'末端のアダプター配列でプライマーを作製して二本鎖 cDNAを PCR法、 LAMP法、 ICAN法等により増幅し、次いで、増幅されたアダプター付力卩ニ本 鎖 cDNAを、例えばラムダ 'ェキソヌクレアーゼ等の二本鎖 DNAの 5'末端リン酸化 DNA 鎖を除去する酵素により処理し、 5'末端リン酸ィ匕プライマー側の cDNA鎖を除去して、 アダプターが結合した（付カ卩された）一本鎖テスター cDNAを得る〔Higuchi RG, Ochm an H. Nucleic Acid Research. 1989 Jul 25;17(14):5865等〕。
(3)適当なプラスミドに目的とするポリヌクレオチドを挿入し、プラスミドのマルチクロー ユングサイトを利用して挿入されたポリヌクレオチド断片の片方を 5'突出末端 (例えば EcoR I等）とし、もう片方を 3'突出末端 (例えば Pst I等)とした後、 Exonuclease III等の 5' 突出末端を認識する 3'→5'EXOnuCleaSe活性を有する酵素で消化して一本鎖 cDNAを 得る〔Guo LH, Wu R. Methods in Enzymology. 1983;100:60- 96等〕。
尚、上記方法のうち、（1)及び (2)が好ましい。
得られた一本鎖テスターポリヌクレオチドは、例えばフエノール Zクロ口ホルム混合液 、フエノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコール混合液又は/及びクロ口ホルム/ イソアミルアルコール混合液による抽出、アルコール沈澱、カラム精製、フィルター濾 過等の自体公知の精製方法により精製するのが好ま 、。
(2)ドライバー由来のポリヌクレオチド
本発明におけるドライバー由来のポリヌクレオチド (以下、ドライバーポリヌクレオチド と略記する。 )は一本鎖ポリヌクレオチドであっても二本鎖ポリヌクレオチドであっても どちらでも良いが、好ましくは二本鎖ポリヌクレオチドである。尚、ドライバーポリヌクレ ォチドがー本鎖である場合は、当然のことながら、当該一本鎖ドライバーポリヌクレオ チドは、一本鎖テスターポリヌクレオチドと相補鎖となり得るものである。即ち、テスタ 一ポリヌクレオチドがセンス鎖である場合、ドライバーポリヌクレオチドはアンチセンス 鎖であり、テスターポリヌクレオチドがアンチセンス鎖である場合、ドライバーポリヌクレ ォチドはセンス鎖である。
また、当該ドライバーポリヌクレオチドは、 DNA及び RNAのどちらでも良いが、好ましく は DNAである。なかでも、ゲノム DNA及びテスターに存在する mRNAに由来する cDN A (換言すれば、テスターから抽出した mRNAを铸型として合成された cDNA)が好まし ぐ特に cDNAが好ましい。
[0032] 本発明のドライバーポリヌクレオチドも、上記した如き、テスターポリヌクレオチドを調 製するために用いられる二本鎖ポリヌクレオチドを調製する方法、一本鎖ポリヌクレオ チドを調製する方法等の通常この分野で用いられている自体公知の方法や、市販の キットを用いて得ることができる。
なかでも、ドライバ一中に存在するポリヌクレオチドを铸型として、例えば PCR法、 LA MP法、 ICAN法等の自体公知の増幅方法により、当該ポリヌクレオチドに相補又は Z 及び相同なポリヌクレオチドを増幅する方法が好ま 、。
[0033] また、本発明で使用されるドライバーポリヌクレオチドには、一本鎖テスターポリヌク レオチドと同様、その 5'末端又は Z及び 3'末端に、既知配列力もなるアダプターを結 合 (付加）させておいてもよいが、この場合、当該アダプタ一は、少なくとも一本鎖テス ターポリヌクレオチドが有する、後述する工程（3)で行う PCR用のプライマーが結合す る既知の配列とは異なるものである。換言すれば、後述する工程（3)で行う PCR用の プライマーが結合しな 、既知配列からなるアダプターであれば、当該ドライバーポリ ヌクレオチドに結合 (付加）させておいてもよいが、当該ドライバーポリヌクレオチドに は一本鎖テスターヌクレオチドに結合 (付加）させたアダプターを含む既知配列を含 まな 、か、或いはそれ自体が単独でプライマーとして機能し得る塩基数力もなる当該 アダプターの一部の配列を含まな ヽ〔即ち、アダプターを結合 (付加）させな 、〕のが 好ましい。また、相補的ではないアダプターを両末端に結合させるのが好ましい。
[0034] 例えば以下の方法により、ドライバーポリヌクレオチドを得ることができる。
(1)自体公知の方法〔Gublerらの方法（Gulber, U. and Hoffman, B. J. (1983) Gene. 25 , 263-269)等〕によってドライバ一力ゝら抽出した mRNAを铸型として作成された cDNA ライブラリー或いは市販の cDNAライブラリーを用い、 cDNA挿入断片両端のベクター 由来の既知配列で設計された 2種のプライマーを作製し、これを用いてベクターに挿 入されている cDNAを铸型として、 PCR法、 LAMP法、 ICAN法等によりドライバー遺伝 子由来の二本鎖 cDNAを増幅して、アダプターが結合した (付加された）二本鎖ドライ バー cDNAを得る。 (2)上記 (1)によって増幅されたアダプターが結合した (付加された）二本鎖 cDNAの、 挿入断片 cDNAの両末端力も増幅したプライマー (アダプター)までを、挿入断片両 側のマルチクローユングサイトの制限酵素部位を利用して適当な制限酵素で切断し 、挿入断片のみ力もなる二本鎖ドライバー cDNA〔アダプターが結合 (付加）して ヽな い二本鎖ドライバー cDNA〕を得る。尚、この方法は、テスター由来 cDNAライブラリー とドライバー由来 cDNAライブラリ一とで cDNAライブラリーを構成するベクターが同系 列（例えば、両方ともに pUC系プラスミドである場合等)である場合等、テスターポリヌ クレオチドとドライバーポリヌクレオチドで同じプライマーを使用する場合（同じァダプ ターが結合している場合）に有用である。
尚、上記の方法を用いる場合、以下の点で注意が必要である。
即ち、テスター由来 cDNAライブラリーとドライバー由来 cDNAライブラリ一とで cDNAラ イブラリーを構成するベクターが同系列（例えば、両方ともに pUC系プラスミドである 場合等)である場合等、テスターポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチドで同じプ ライマーを使用する場合（同じアダプターが結合している場合）には、挿入されている cDNA断片の末端カゝらプライマーまでの長さ、言い換えれば、プライマーの末端から 挿入断片が結合しているプライマーを含めた鎖長が lOObp以上であると、切断された 挿入断片 cDNAの両末端カゝら増幅したプライマー (アダプター)までの断片を後述す る精製方法で除去することが困難となる。その場合、当該切断された断片がテスター に存在する相補部分とハイブリダィズして二本鎖ノヽイブリツドを形成し、後述する本発 明の工程 (2)にお 、てテスターのアダプター領域 (PCR用プライマーがァニールする 領域）が除去されてしまい、工程（3)での目的の一本鎖テスター特異的ポリヌクレオ チドの増幅に支障をきたす。従って、このような場合には、挿入断片 cDNAの両末端 力も増幅したプライマー（アダプター）までの鎖長が lOObp以下となるように、挿入断片 cDNAの両末端力も増幅したプライマー (アダプター)までの切断を複数の制限酵素 を用いて行うか、切断された挿入断片 cDNAの両末端カゝら増幅したプライマー（ァダ プター）までの断片を更に他の制限酵素を用いて切断することが好ましい。
(3)既知配列 (アダプター)で設計された、 5'末端がリン酸化された一本鎖テスター c DNAと相補鎖となる側のプライマーとリン酸ィ匕されて 、な 、一本鎖テスター cDNAと相 同鎖となる側のプライマーの 2種のプライマーを作製し〔調製される一本鎖テスター c DNAと相補鎖となるようにリン酸ィ匕プライマーと非リン酸ィ匕プライマーを設計する。言 い換えれば、 5'末端がリン酸ィ匕された一本鎖テスター cDNAと、これに相補的となる 5' 末端がリン酸化されて 、な 、一本鎖 cDNAが生じるように 2つのプライマー（リン酸ィ匕 プライマーと非リン酸ィ匕プライマー）を設計する〕、これを用いてオリゴ 'キヤッビング法 [Maruyama, k. and Sugano, S. (1994) Gene. 138, 171- 174等〕に従って 5'末端及び 3' 末端に特定のプライマー（アダプター配列）が付加された cDNAを作製する。次いで、 5'末端及び 3'末端のアダプター配列でプライマーを作製して二本鎖 cDNAを PCR法、 LAMP法、 ICAN法等により増幅し、次いで、増幅されたアダプター付力卩ニ本鎖 cDNA を、例えばラムダ 'ェキソヌクレアーゼ等の二本鎖 DNAの 5'末端リン酸化 DNA鎖を除 去する酵素により処理し、 5'末端リン酸ィ匕プライマー側の cDNA鎖を除去して、一本鎖 テスター cDNAと相補鎖となる cDNA〔即ち、アダプターが結合した (付加された)一本 鎖ドライバー cDNA〕を得る。
(4)適当なプラスミドに目的とするポリヌクレオチドを挿入し、プラスミドのマルチクロー ユングサイトを利用して挿入されたポリヌクレオチド断片の片方を 5'突出末端 (例えば EcoR I等）とし、もう片方を 3'突出末端 (例えば Pst I等)とした後、 Exonuclease III等の 5' 突出末端を認識する 3'→5'EXOnuCleaSe活性を有する酵素で消化して一本鎖 cDNAを 得る〔Guo LH, Wu R. Methods in Enzymology. 1983;100:60- 96等〕。
上記方法のうち (2)が好ましい。
尚、得られた一本鎖又は二本鎖ドライバーポリヌクレオチドは、例えばフエノール Zク ロロホルム混合液、フエノール Zクロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液又は Z及 びクロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液による抽出、アルコール沈澱、カラム精 製、フィルター濾過等の自体公知の精製方法により精製するのが好ま 、。
(3)テスター由来のポリヌクレオチドとドライバー由来のポリヌクレオチドとのハイブリダ ィゼーシヨン〔工程（1)〕
上記の如くして調製された、（0—本鎖テスターポリヌクレオチドと当該一本鎖テスター ポリヌクレオチドと相補鎖となり得る一本鎖ドライバーポリヌクレオチドとの間、或いは (i i)一本鎖テスターポリヌクレオチドと二本鎖ドライバーポリヌクレオチドとの間で、ハイ ブリダィゼーシヨン (所謂、サブトラクティブ'ハイブリダィゼーシヨン）を行う。
このハイブリダィゼーシヨンにより、ドライバーポリヌクレオチド中に相補的なものが存 在する一本鎖テスターポリヌクレオチド〔即ち、テスターとドライバーの両方に存在す るテスターポリヌクレオチド (テスター非特異的ポリヌクレオチド）〕は、テスターポリヌク レオチドとこれに相補的なドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド (ハイ ブリツド)を形成する。一方、ドライバーポリヌクレオチド中に相補的なものが存在しな い（或いは存在量が少ない）一本鎖テスターポリヌクレオチド (即ち、テスター特異的 ポリヌクレオチド）は、ハイブリッドを形成せずに一本鎖のままで存在する。
[0037] 当該ノ、イブリダィゼーシヨンは、通常この分野で用いられて 、る自体公知のハイブリ ダイゼーシヨン方法や、市販のキットを用いて行うことができる。
[0038] 例えば、上記の如くして調製した一本鎖テスターポリヌクレオチドと、当該テスターポリ ヌクレオチドに対して過剰量の一本鎖又は二本鎖ドライバーポリヌクレオチドを、適当 量のナトリウム塩を含む緩衝液中で、要すれば熱変性後、適当な温度で適当な時間 ハイブリダィゼーシヨンを行 、、テスターポリヌクレオチドとこれに相補的なドライバー ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド (ノ、イブリツド)を形成させる。
上記において、使用されるドライバーポリヌクレオチドの量は、テスターポリヌクレオチ ドの量よりも多ければ良ぐ標的とするポリヌクレオチド (遺伝子)や使用目的等により 異なるため一概には言えないが、使用されるドライバーポリヌクレオチドが一本鎖の 場合のポリヌクレオチドの量 (核酸量）は、テスターポリヌクレオチドの量 (核酸量)の 通常 10〜5000倍、好ましくは 50〜1000倍、より好ましくは 100〜500倍である。また、使 用されるドライバーポリヌクレオチドが二本鎖の場合のポリヌクレオチドの量 (核酸量） は、テスターポリヌクレオチドの量（核酸量）の通常 20〜10000倍、好ましくは 100〜200 0倍、より好ましくは 200〜1000倍である。
使用されるナトリウム塩としては、通常この分野で用いられる、例えば塩ィ匕ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等が用いられ、また、その使用濃度も通常この分野で用いられる濃 度範囲、例えば通常 20mM〜2M、好ましくは 50mM〜1.5M、より好ましくは 100mM〜l Mから適宜選択される。
また、使用される緩衝液も、通常この分野で用いられるものは全て使用可能であり、 例えば通常 pH5〜9、好ましくは pH6〜8、より好ましくは pH6.5〜7.5の範囲で緩衝能 を有する、例えばトリス—塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液 (例えば HEPES 、 PIPES等）が挙げられる。使用濃度も通常この分野で用いられる濃度範囲、例えば 通常 lmM〜lM、好ましくは 5mM〜500mM、より好ましくは 10mM〜100mMから適宜選 択される。
上記において、熱変性は、通常 90°C〜105°C、好ましくは 93°C〜103°C、より好ましく は 95°C〜100°Cで、通常 0.1分〜 15分、好ましくは 0.5分〜 10分、より好ましくは 1分〜 5 分行われる。尚、上記方法では、テスターポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチ ドの共存下同時に熱変性をしているが、これらをそれぞれ別々に熱変性しても良い。 この場合には、ナトリウム塩は特に必要ない。また、この場合には、熱変性した後、氷 冷し、テスターポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチドとを接触させてハイブリダ ィゼーシヨンを行うのが好まし 、。
ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、通常この分野で行われて 、る方法に準じて 行えば良く特に限定されないが、例えば上記した如きナトリウム塩の存在下、下限が 通常 30°C以上、好ましくは 37°C以上、より好ましくは 50°C以上、更に好ましくは 55°C 以上、特に好ましくは 60°C以上、最も好ましくは 65°C以上であって、上限が通常 80°C 以下、好ましくは 75°C以下、より好ましくは 70°C以下で、通常 1分〜 30時間、好ましく は 30分〜 20時間、より好ましくは 1時間〜 16時間行えばよい。
尚、上記方法において、ハイブリダ一ゼーシヨン後に、更に上記した如き濃度範囲か ら選択されるドライバーポリヌクレオチドを追加してハイブリダィゼーシヨンを繰り返し てもよく、これにより、よりストリンジェントな条件でハイブリダィゼーシヨンを行うことがで きる。
また、上記においては、通常この分野で使用される、例えば有機溶媒等の試薬類を 用!/、ることができる。
(4)ハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチドの除去〔工程 (2)〕
上記した如き本発明の工程（1)によりハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレオチ ド (即ち、テスター非特異的ポリヌクレオチドとこれに相補的なドライバーポリヌクレオ チドとの二本鎖ポリヌクレオチド)を酵素処理により除去する。 これにより、テスターポリヌクレオチドのうち、テスターに特異的ではなくドライバーにも 存在するテスター非特異的ポリヌクレオチドを除去することができる。尚、二本鎖ドラ ィバーポリヌクレオチドを用いた場合は、上記工程（1)において再会合したドライバー ポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド (ハイブリッド） も同時に除去される。
本発明の上記工程（2)の酵素処理において用いられる酵素は、一本鎖ポリヌクレ ォチドを分解せずハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレオチドを優先的に分解し 得る性質を有するものであり、使用されるテスターポリヌクレオチド及びドライバーポリ ヌクレオチドの種類により異なる。例えばテスターポリヌクレオチド及びドライバーポリ ヌクレオチドが共に DNA(cDNA)である場合は、二本鎖 DNAを優先的に分解し得る 性質を有する DNA分解酵素が使用され、テスターポリヌクレオチドとドライバーポリヌ クレオチドのどちらか一方が DNA(cDNA)であって他方が RNAである場合は、 DNA— RNAハイブリッドを優先的に分解し得る性質を有する分解酵素が使用される。また、 テスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチドが共に RNAである場合は、二 本鎖 RNAを優先的に分解し得る性質を有する RNA分解酵素が使用される。このよう な分解酵素を用いて酵素処理することにより、上記した如き本発明の工程（1)により ノ、イブリツド形成された二本鎖ポリヌクレオチド (及び再会合したドライバーポリヌクレ ォチドとドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド)を分解することができ 、結果としてハイブリット形成した二本鎖ポリヌクレオチド (即ち、テスターに特異的で はなくドライバーにも存在するテスター非特異的ポリヌクレオチド)を除去することがで きる。
また、テスターポリヌクレオチド力 ¾NA(cDNA)でドライバーポリヌクレオチドが RNAで ある場合には、 DNA—RNAハイブリッド中の DNAを優先的に分解し得る性質を有する DNA分解酵素も使用でき、テスターポリヌクレオチドが RNAでドライバーポリヌクレオ チドが DNA(cDNA)である場合は、 DNA—RNAハイブリッド中の RNAを優先的に分解 し得る性質を有する RNA分解酵素（例えば RNase H等)も使用できる。これらの分解 酵素を用いて酵素処理行った場合には、上記した如き本発明の工程（1)によりハイ ブリツド形成された二本鎖ポリヌクレオチド (及び再会合したドライバーポリヌクレオチ ドとドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド）自体 (全体)を分解すること はできないが、ハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレオチド中のテスターポリヌクレ ォチドを分解することができるので、結果としてテスターに特異的ではなくドライバー にも存在するテスター非特異的ポリヌクレオチドを除去することができる。
上記した如き分解酵素のうち、二本鎖 DNAを優先的に分解し得る性質を有する DNA 分解酵素が好ましぐこのような分解酵素としては、例えば二本鎖特異的 DNAヌクレ ァーゼ（Duplex- specific nuclease : DSN)等が挙げられる。当該酵素の由来について は特に限定されないが、例えば海洋性甲殻類 (ェビ、力-等)、ゥ二等の海洋性無脊 椎動物が挙げられる。なかでも海洋性甲殻類、特にカムチャツカ力- (Paralithodes c amtschaticus)由来の二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼが好まし!/、。
尚、二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼは、自体公知の方法〔例えば Shagin DA, Rebri kov DV, Kozhemyako VB, Altshuler IM, Sncneglov AS, Zhulidov PA, Bogdanova EA , Staroverov DB, Rasskazov VA, Lukyanov S.： Genome Research. 2002 Dec 2(12): 1935-42]に準じて製造することができ、また、市販品（例えば Evrogen社)を使用する ことちでさる。
分解酵素の使用量は、ノ、イブリツド形成された二本鎖ポリヌクレオチドを充分に分解 し得る量であれば良く特に限定されない。具体的には、使用する分解酵素の種類に よって異なるため一概には言えないが、例えば分解酵素として二本鎖特異的 DNAヌ クレアーゼを用いる場合には、通常全ポリヌクレオチド l ;z gに対して O.Olu/ l〜10u / j l、好ましくは O. lu/ μ l〜5u/ μ 1、より好ましくは 0.5u/ μ l〜lu/ μ 1である。
当該酵素処理の条件 (温度、時間、 ρΗ等）、即ち、ハイブリッド形成された二本鎖ポリ ヌクレオチドと分解酵素とを接触させる際の条件は、使用する分解酵素の種類によつ て異なるため一概には言えないが、通常使用する分解酵素が有する至適温度及び 至適 ρΗ付近で、形成されたハイブリッド（又はハイブリッド中のテスターポリヌクレオチ ド）を充分分解し得る時間処理すればょ ヽ。
より具体的には、例えば分解酵素として二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いる場 合には、下限が通常 20°C以上、好ましくは 30°C以上、より好ましくは 50°C以上、更に 好ましくは 55°C以上、特に好ましくは 60°C以上、最も好ましくは 65°C以上であって、上 限が通常 80°C以下、好ましくは 75°C以下、より好ましくは 70°C以下で、通常 pH6〜9、 好ましくは 6.5〜8.5、より好ましくは？〜 8で、通常 0.5分〜 60分、好ましくは 1分〜 45分 、より好ましくは 5分〜 30分処理される。
また、上記した如き pH範囲を維持するために、通常この分野で用いられる緩衝剤が 使用できる。このような緩衝液としては、上記した如き pH範囲で緩衝能を有するもの であれば良く特に限定されないが、例えばトリス—塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッ ド緩衝液 (例えば HEPES、 PIPES等）が挙げられる。使用濃度も通常この分野で用い られる濃度範囲、例えば通常 lmM〜500mM、好ましくは 5mM〜100mM、より好ましく は 10mM〜50mMから適宜選択される。
[0042] 尚、上記した如き酵素処理を行った後、当該酵素の反応を停止するには、例えば ED TA等のキレート剤等の反応停止剤を、酵素処理を行って得られた反応液中に存在 させればよい。
このような反応停止剤を当該反応液中に存在させるには、例えば水や上記した如き 緩衝剤等に当該反応停止剤を含有させ、この反応停止剤含有溶液を酵素処理を行 つて得られた反応液と混合させればょ 、。
反応停止のための時間は、通常 0.1分〜 30分、好ましくは 0.5分〜 20分、より好ましく は 1分〜 10分である。
また、反応を停止する際の温度は特に限定されないが、 50°C〜90°C、好ましくは 60 °C〜80°C、より好ましくは 65°C〜75°Cで行うのが好ましい。
[0043] 当該酵素処理は、上記した如き本発明の工程（1)によりハイブリッド形成された二本 鎖ポリヌクレオチドと上記した如き分解酵素とを接触させることにより実施される。 このような方法としては、最終的にハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレオチドと 分解酵素とを接触し得るものであれば良く特に限定されないが、一般的には、上記し た如き本発明の工程（1)を実施して得られたハイブリダィゼーシヨン溶液に当該分解 酵素を含有する溶液を添加混合することにより行われる。
上記において、分解酵素を含有させる溶液としては、当該分解酵素の分解作用を阻 害しな 、ものであればよぐ水や上記した如き緩衝剤等の通常この分野で用いられる 溶液が挙げられ、その使用濃度等も上記した如き濃度範囲から適宜選択すればよ 、 ここで、当該溶液中には、分解酵素以外に、ナトリウム塩、通常この分野で用いられ る活性化剤（マグネシウムイオン等の金属イオン等）、安定化剤（グリセロール、ジチ オスレィトール、メルカプトエタノール等のチオールィ匕合物等）、防腐剤等を含有させ ておいても良い。尚、これらナトリウム塩、活性化剤、安定化剤、防腐剤等は、分解酵 素を含有する溶液とは別の上記した如き溶液に含有させておいても良ぐこの場合は
、分解酵素を含む溶液とナトリウム塩、活性化剤、安定化剤又は防腐剤を含有する 1 種以上の溶液とをノヽイブリダィゼーシヨン溶液に別々に添加することになる。なかでも 、ナトリウム塩を含有させておくのが好ましい。
使用されるナトリウム塩としては、通常この分野で用いられる、例えば塩ィ匕ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等が用いられ、また、その使用濃度も通常この分野で用いられる濃 度範囲、例えば通常 20mM〜2M、好ましくは 50mM〜1.5M、より好ましくは 100mM〜l Mから適宜選択される。
例えば分解酵素として二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いる場合、当該酵素処理 〔本発明の工程（2)〕は以下の如くして実施される。
本発明の工程（1)を実施して得られたハイブリダィゼーシヨン溶液に、二本鎖特異 的 DNAヌクレアーゼ含有溶液と活性化剤及び安定化剤を含有する溶液とを添加混 合し、上記した如き条件で処理し (反応させ)て、当該ハイブリダィゼーシヨン溶液中 に存在するノ、イブリツド形成した二本鎖ポリヌクレオチド (テスターポリヌクレオチドとこ れに相補的なドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド、又はこれと再会 合したドライバーポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオ チド)を分解除去する。
尚、上記において、活性化剤としてはマグネシウムイオンが好ましい。その由来として は、例えば塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等のマグネシウムの塩が挙げられ、 なかでも塩化マグネシウムが好ましい。また、マグネシウムの塩の使用量としては、二 本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを充分活性ィ匕し得る量であればよぐ通常 0.1mM〜100 mM、好ましくは 0.5mM〜50mM、より好ましくは lmM〜10mMである。
また、安定化剤としては例えばジチオスレィトール、メルカプトエタノール等のチォー ル化合物が好ましぐなかでもジチオスレィトールが好ましい。また、その使用量とし ては、二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを安定化し得る量であればよぐ通常 O.OlmM 〜10mM、好ましくは 0.1mM〜5mM、より好ましくは 0.5 mM〜lmMである。
尚、本発明の工程（1)と（2)は、なるべく高い温度で実施するのが好ましい。例えば 本発明の工程（1)と（2)は、下限が好ましくは 50°C以上、更に好ましくは 55°C以上、 特に好ましくは 60°C以上、最も好ましくは 65°C以上であって、上限が通常 80°C以下、 好ましくは 75°C以下、より好ましくは 70°C以下でそれぞれ実施される。また、工程（1) に引き続いて工程 (2)を実施する際には、上記した如き温度範囲力も一旦下げること 無ぐ上記した如き温度範囲を維持したまま、当該温度範囲から温度を一旦下げるこ となく実施されるのが好ましい。
上記したように本発明の方法〔本発明の工程（1)及び工程（2)〕によって、テスター中 に存在するポリヌクレオチドのうち、テスター非特異的ポリヌクレオチドを分解除去し、 テスター特異的ポリヌクレオチドを取得することができる。
尚、本発明の工程（2)を実施して得られた反応液中には、ハイブリッド形成しなかつ た一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド以外に、ハイブリッドを形成しな力つた一本 鎖ドライバーポリヌクレオチドが共存して 、るが、共存するハイブリッドを形成しなかつ た一本鎖ドライバーポリヌクレオチドは、自体公知の単離 (分離)処理又は精製処理 により除去することができ、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドのみを単離するこ とがでさる。
このような方法としては、例えば一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを、テスター c DNAを増幅したプライマー等のテスター特異的ポリヌクレオチドのみに存在するァダ プター配列を基に設計したプライマーを使用してタレノウ'フラグメント（Klenow Fragm ent)で二本鎖にし、その後両端のアダプター配列中の制限酵素で切断して、適当な ベクターに組み込み、テスター特異的ポリヌクレオチド (cDNA)のみを形質転換する 方法、テスター cDNAを増幅したプライマー等のテスター特異的ポリヌクレオチドのみ に存在するアダプター配列を基に設計したプライマーをピオチン標識して、テスター 特異的ポリヌクレオチド（cDNA)とアニーリング後、ストレプトアビジン'ビーズ等の固 相と結合させてテスター特異的ポリヌクレオチドを単離する方法等が挙げられる。 尚、ノ、イブリツドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドとは、テスターポリ ヌクレオチドに相補的な一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを用いた場合は、ドライバ 一に特異的な一本鎖ポリヌクレオチド及びテスター非特異的ポリヌクレオチドとハイブ リツドを形成しな力つたテスターとドライバーの両方に存在する一本鎖ドライバーポリ ヌクレオチドであり、二本鎖ドライバーポリヌクレオチドを用いた場合は、再会合せず に一本鎖として存在するドライバーに特異的な一本鎖ポリヌクレオチド (テスターポリ ヌクレオチドに対する相補鎖及び相同鎖の 2種)及び再会合せずに一本鎖として存 在するテスターとドライバーの両方に存在する一本鎖ドライバーポリヌクレオチド (テス ターポリヌクレオチドに対する相補鎖及び相同鎖の 2種)である。
[0046] 2- 2.本発明のテスター特異的ポリヌクレオチドの増幅方法
力べして得られたテスター特異的ポリヌクレオチドを増幅することにより、テスター特異 的ポリヌクレオチドを濃縮することができる。
[0047] (1)ハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの増幅〔工程 ( 3)〕
本発明の取得方法によって取得された一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを大 量に得ることができる。
即ち、本発明の工程（2)を実施した後に残存する一本鎖テスター特異的ポリヌクレオ チドのみを実質的に増幅させる。
これにより、本発明の工程（2)を実施した後に一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド を単離 (分離)処理又は精製処理しな力つた場合でも、一本鎖テスター特異的ポリヌ クレオチドと共存するハイブリッドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチド は実質的に増幅されないので、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドのみが濃縮さ れる。
本発明において、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを増幅するとは、（1)一本鎖 テスター特異的ポリヌクレオチドの相補鎖のみを増幅する場合又は (2)—本鎖テスタ 一特異的ポリヌクレオチドとこれの相補鎖の二本鎖を増幅する場合を意味する。
[0048] 当該増幅は、本発明の取得方法によって取得された一本鎖テスター特異的ポリヌク レオチド〔(1)一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの相補鎖のみ又は (2)—本鎖テス ター特異的ポリヌクレオチドとこれの相補鎖の二本鎖等〕を増幅することができるもの であれば良ぐ通常この分野で用いられている自体公知のポリヌクレオチド増幅方法 に従って実施できる。このような自体公知のポリヌクレオチド増幅方法としては、例え は PCR〔01igo- capping:a simple metnod to replace the cap structure of eukaryotic m RNAs with oligoribonucleotides , Kazuo Maruyama and Sumio Sugano, Gene, 138 (19 94) 171- 174に記載のオリゴ-キヤッビング法； Diatchenko,L.， et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6025-6030 (1996)に記載の SMART法； High- efficiency folHength cDNA cloning by biotinylated CAP trapper, Carninci P, Kvam C, Kitamura A, Ohsumi T, Okazaki Y, Itoh M, Kamiya M, Shibata K, Sasaki N, Izawa M, Muramatsu M, Hayash izaki Y, Schneider C, Genomics. 199b Nov 1;37(3):327- 36に ti載の Gene Trapper 法； Determination of 5' ends of specific mRNAs by DNA ligase- dependent amplificati on, Bertling丽, Beier F, Reichenberger E.， PCR Methods Appl. 1993 Oct;3(2):95 -9に記載の RACE法〕、 LAMP法〔Loop- mediated isothermal amplification of DNA, N otomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63〕、 ICAN法 [Development of the detectio n system for Mycobacterium tuberculosis DNA by using the isothermal DNA amplific ation method ICAN, Shimada M, Hino F, Sagawa H, Mukai H, Asada K, Kato I. Rins ho Byori. 2002 May;50(5):528-32〕等が挙げられ、なかでも PCRが好ましい。
尚、各種増幅条件 (温度、時間、 pH、サイクル数等）は上記した如き自体公知の方法 に準じて行えばよぐまた、使用される酵素類や試薬類等もこれら自体公知の方法で 用いられて 、るものが使用できる。
また、当該増幅は、市販のキットを用いて行うこともできる。
当該増幅に使用されるプライマーは、本発明の取得方法によって取得された一本鎖 テスター特異的ポリヌクレオチド〔(1)一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの相補鎖 のみ又は (2)—本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドとこれの相補鎖の二本鎖等〕を増 幅することができるものであれば良く特に限定されない。
即ち、当該プライマーは、例えば、目的とする増幅方法及びその条件等に応じて、 また、解離温度 (Tm値)などを考慮して、適宜設計'作製すればよい。好ましくはブラ イマ一配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられて 、る、 15塩 基〜 60塩基、好ましくは 20塩基〜 35塩基、より好ましくは 25塩基〜 30塩基の長さを有 しているものがよい。
例えば本発明の工程 (2)を実施した後に、上記した如き単離 (分離)処理又は精製 処理により、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドが単離されている場合には、これ 以外のテスター非特異的ポリヌクレオチドやハイブリッドを形成しな力つたドライバー ポリヌクレオチドは共存していないので、どのようなプライマーも使用できる。
このようなプライマーとしては、例えば前述した如きアダプターが結合した (付加され た)テスターポリヌクレオチドを用いた場合は、当該アダプター配列に基づ 、て設計' 作製されたプライマー等が挙げられ、例えば cDNAライブラリ一力ゝらテスター cDNAを 調製した場合は cDNA挿入断片両端のベクター由来の配列に基づ ヽて設計 ·作製さ れた 1種又は 2種以上プライマー（即ち、前述した如きドライバー由来のポリヌクレオ チド中に存在しな 、配列力もなるアダプター配列又はその相補配列の一部若しくは 全部を含有するオリゴヌクレオチド)等が挙げられる。
また、例えば本発明の工程 (2)を実施した後に、単離 (分離)処理又は精製処理を行 わず、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドが単離されていない場合には、テスタ 一非特異的ポリヌクレオチドは共存して ヽな 、ものの、ハイブリッドを形成しな力つた 一本鎖ドライバーポリヌクレオチドが共存している。し力しながら、一本鎖テスター特 異的ポリヌクレオチドにのみ存在し、ドライバー由来のポリヌクレオチド中に存在しな V、配列に基づ 、て設計 ·作製されたプライマーを用 、ることにより、一本鎖テスター特 異的ポリヌクレオチドのみを増幅することができる。
このようなプライマーとしては、例えば前述した如きドライバー由来のポリヌクレオチド 中に存在しな 、配列力 なるアダプターに基づ 、て設計'作製された 1種又は 2種以 上プライマー（即ち、前述した如きドライバー由来のポリヌクレオチド中に存在しな!ヽ 配列からなるアダプター配列又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリ ゴヌクレオチド)等が挙げられる。
また、 PCR等に使用する場合の 2種以上のプライマーとしては、相補的ではないァ ダブター配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有す るオリゴヌクレオチド、即ち、それぞれ異なる 2種以上のプライマーが好ましい。
[0051] 当該プライマーは、標識物質で標識化されていてもよぐプライマーを標識物質で 標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体 (32p, 33P, 35s等)や酵素
(アルカリホスファターゼ，西洋ヮサビペルォキシダーゼ等）、蛍光物質〔Cyanine Dye 系の Cy3, Cy5 (アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルォレセイン等〕、発光物 質 (Acridinium Esterを含む化学発光試薬等）、ピオチンなど公知の標識物質であれ ば何れも用いることができる。また、プライマーを標識物質で標識する方法も、例えば プライマーを合成する際に、放射性同位体や蛍光物質で標識されたヌクレオチドを 取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、 放射性同位体で標識する方法 (ランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼによる 5'—末端標識法、ターミナルデォキシヌクレオチドト ランスフェラーゼを用いた 3'—末端標識法、 RNAラベリング法)、酵素分子を標識する プライマーに直接共有結合させる直接標識法等、リンカ一アームを有するヌクレオチ ドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換して、ヌクレオチドを蛍光物質で標識 する方法、ヌクレオチドを発光標識又はピオチン標識する方法等、通常この分野で 行われて 、る自体公知の標識方法に従って行えばょ 、。
[0052] 本発明の工程（3)によって、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを増幅 (濃縮)す ることができるが、本発明の工程（2)を実施した後に一本鎖テスター特異的ポリヌクレ ォチドを単離 (分離)処理又は精製処理しない場合、即ち、本発明の工程 (2)を実施 して得られた、ハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドとハ イブリツドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドとが共存している反応液 中の、ハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを増幅する 場合においては、本発明の工程（3)を実施して得られた反応液中には、増幅された 、ノ、イブリツド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド以外に、ハイプリ ッドを形成しなかった一本鎖ドライバーポリヌクレオチドが共存して 、る。しかしながら 、この場合には、後述する本発明の工程 (4)における一本鎖ポリヌクレオチドを除去 する工程により、増幅された一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを単離することが できる。 特に、後述する本発明の工程 (4)における一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程 1S 酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程である場合には、酵素処 理により一本鎖ポリヌクレオチドを特異的に分解除去して、増幅されたテスター特異 的ポリヌクレオチドを容易に単離することができるため、本発明の工程（3)で増幅され たテスター特異的ポリヌクレオチドは二本鎖であるのが好ましい。
[0053] 増幅された二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを得る方法としては、例えば上記 した如き自体公知の増幅方法のうち、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドとこれ の相補鎖の二本鎖を増幅する方法が挙げられる。
また、上記した如き自体公知の増幅方法のうち、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオ チドの相補鎖のみを増幅する場合には、増幅された一本鎖特異的ポリヌクレオチドの 相補鎖を用いて、例えば以下の方法によって二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド を得ることができる。
(a)増幅された一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの相補鎖を铸型として、これに 相補的なプライマーを用いて再度 PCRを行って増幅された一本鎖テスター特異的ポ リヌクレオチドの相補鎖に対する相補鎖を増幅させて、一本鎖テスター特異的ポリヌ クレオチドとこれの相補鎖の二本鎖を得る方法、（b)増幅された一本鎖テスター特異 的ポリヌクレオチドの相補鎖を铸型として、これに相補的なプライマーとタレノウフラグ メント等の重合酵素を用いて増幅された一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの相 補鎖に対する相補鎖をプライマー伸長させて、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチ ドとこれの相補鎖の二本鎖を得る方法等。
これらの方法のなかでも、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドとこれの相補鎖の 二本鎖を増幅する方法が好ま U、。
尚、上記において、得られた二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドの二本鎖ハイブ リットを形成させるには特別な処理は必要ではなぐ例えば得られた一本鎖テスター 特異的ポリヌクレオチドとこれの相補鎖を含有する溶液を、通常 30°C〜80°C、好まし くは 37°C〜75°C、より好ましくは 50°C〜70°Cとすることによりこれらのハイブリットが形 成される。
[0054] 上記したことから、本発明にお 、ては、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドとこれ の相補鎖の二本鎖を増幅するのが好ま 、。
従って、本発明のテスター特異的ポリヌクレオチドの増幅方法は、（3 ' )ハイブリッド形 成しな力つたテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドとこれの相補鎖とを増幅してテス ター由来の二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程、を含んでなる方法が好ましい。
例えば以下の方法により、ハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌ クレオチドを増幅することができる。
即ち、（a)本発明の工程 (2)を実施して得られた反応液、要すれば更に単離処理又 は精製処理により単離された一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを含有する溶液 に、上記した如きそれぞれ異なる 2種のプライマーとデォキシリボヌクレオチド三リン 酸（dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTP)を適当量加え、得られた溶液を適当な温度で適 当な時間加熱して熱変性する。（b)加熱後当該溶液を冷却して一本鎖テスター特異 的ポリヌクレオチド (又は一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドと、増幅されたこれに 相補的なポリヌクレオチド）にプライマーをァニールさせる。（c)次いで、適当な重合酵 素を適当な温度で適当な時間作用させてプライマーを伸長させることによって、一本 鎖テスター特異的ポリヌクレオチドに対する相補鎖 (又は一本鎖テスター特異的ポリ ヌクレオチドに対する相補鎖と、増幅された、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド に相補的なポリヌクレオチドに対する相補鎖）を合成 (増幅)する。以上の (a)〜(c)のェ 程を適当回数（例えば通常 5回〜 60回、好ましくは 10回〜 50回、より好ましくは 15回〜 40回)繰り返すことによってハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的ポリヌク レオチドとこれの相補鎖とを増幅する。
上記方法において、使用される試薬類の量、重合酵素の種類や量、反応条件等は 上記した如き自体公知の方法に準じて適宜選択されればょ ヽ。
例えば、上記工程 (a)の熱変性は、通常 90°C〜105°C、好ましくは 93°C〜103°C、より 好ましくは 95°C〜100°Cで、通常 0.01分〜 10分、好ましくは 0.05分〜 5分、より好ましく は 0.1分〜 2分行われる。また、工程 (b)のアニーリングは、通常 30°C〜75°C、好ましく は 40°C〜72°C、より好ましくは 50°C〜68°Cで、通常 0.01分〜 10分、好ましくは 0.05分 〜5分、より好ましくは 0.1分〜 2分行われる。上記工程 (c)において使用される重合酵 素としては、特に限定されず、この分野で使用される酵素が使用可能であるが、例え ば DNAポリメラーゼ I、タレノウフラグメント、 T4 DNAポリメラーゼ等の DNAポリメラーゼ 、例えば TaqDNAポリメラーゼ、 Tth DNAポリメラーゼ、 Pfo DNAポリメラーゼ等の而 熱性酵素、逆転写酵素等が挙げられる。また、重合酵素を作用させる際の条件 (温 度、時間等）は、使用する重合酵素の種類等により異なるため一概には言えないが、 例えば DNAポリメラーゼ I等の非耐熱性酵素の場合は、通常 20°C〜50°C、好ましくは 25°C〜45°C、より好ましくは 30°C〜37°Cで、通常 1分〜 24時間、好ましくは 5分〜 12時 間、より好ましくは 30分〜 4時間であり、例えば TaqDNAポリメラーゼ等の耐熱酵素の 場合は、通常 30°C〜85°C、好ましくは 40°C〜80°C、より好ましくは 50°C〜75°Cで、通 常 0.01分〜 20分、好ましくは 0.05分〜 15分、より好ましくは 0.1分〜 10分である。
尚、上記方法においては、（a)〜(c)の各工程後に、デォキシリボヌクレオチド三リン 酸、プライマー、試薬類、重合酵素等を新たに添加してもよい。
なかでも、 TaqDNAポリメラーゼ、 Tth DNAポリメラーゼ、 Pfo DNAポリメラーゼ等の 耐熱性酵素を用いれば、（a)〜(c)の各工程後に、デォキシリボヌクレオチド三リン酸、 プライマー、試薬類、重合酵素等を新たに添加する必要がなぐ最初に全ての試薬 類や重合酵素を共存させておくことができるので、特に好まし 、。
得られた二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドは、例えばフエノール Zクロ口ホルム 混合液、フエノール,クロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液又は,及びクロロホ ルム Zイソアミルアルコール混合液による抽出、アルコール沈澱、カラム精製、フィル ター濾過等の自体公知の精製方法により精製するのが好ま 、。
(2)ハイブリット形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドの除去〔工程 (4)〕 上記したように、本発明の工程（3)によって増幅 (濃縮)されたテスター特異的ポリヌ クレオチド (一本鎖又は二本鎖） 1S 一本鎖ドライバーポリヌクレオチドと共存している 場合、即ち、本発明の工程（2)を実施した後に一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチ ドを単離 (分離)処理又は精製処理しな！ヽ場合は、本発明の工程 (3)を実施して得ら れた反応液中には、増幅されたテスター特異的ポリヌクレオチド〔工程 (2)でハイプリ ッドを形成しな力つた、一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド〕以外に、ハイブリッド を形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドが共存して 、る。この場合には、 当該一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを除去することにより、増幅されたテスター特 異的ポリヌクレオチド（一本鎖又は二本鎖）を単離することができる。
一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを除去する方法としては、前述した如き自体公知の 単離 (分離)方法又は精製方法が挙げられる。
[0057] また、増幅されたテスター特異的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである場 合には、一本鎖ポリヌクレオチドを分解するが二本鎖ポリヌクレオチドを分解しな ヽ性 質を有する酵素を用いた酵素処理により、二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドと 共存する一本鎖ポリヌクレオチド (一本鎖ドライバーポリヌクレオチド)を特異的に分解 除去して、二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを単離することもできる〔Convenien t single-step, one tube purification of Pし R products for direct sequencing. E Werle, C Schneider, M Renner, M Veolker, and W Fiehn, Nucleic Acids Res. 1994 Octobe r 11; 22(20): 43544355等〕。
[0058] 上記の方法のなかでも、酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドを除去 (分解)する方 法が好ましい。
従って、本発明において、一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを除去する方法は、（4') ハイブリット形成しな力つたドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により 除去する工程、を含んでなる方法が好ましい。
[0059] 当該酵素処理において用いられる酵素は、ハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレ ォチドを分解せず一本鎖ポリヌクレオチドを優先的に分解し得る性質を有するもので あり、使用されるテスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチドの種類により 異なる。
例えばテスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチドが共に DNA (cDNA) である場合は、例えば一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ（ェキソヌクレアーゼ I、ェキソ ヌクレアーゼ IX等)等の二本鎖 DNAを分解せず一本鎖 DNAを優先的に分解し得る性 質を有する DNA分解酵素が使用され、テスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌ クレオチドが共に RNAである場合は、例えば一本鎖特異的 RNAエンドヌクレアーゼ（リ ボヌクレアーゼ）（RNaseAゝ RNase IV、 RNaseTl、 RNaseT2、 RNase II、 RNase III、 Rnas e I等)等の二本鎖 RNAを分解せず一本鎖 RNAを優先的に分解し得る性質を有する R NA分解酵素が使用される。 このような分解酵素を用いて酵素処理することにより、上記した如き本発明の工程（3 )にお 、て得られた二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド） と共存する一本鎖ドライバーポリヌクレオチド (一本鎖ドライバー特異的ポリヌクレオチ ド及び一本鎖ドライバー非特異的ポリヌクレオチド)を分解することができ、二本鎖ポリ ヌクレオチド（二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチド)を単離することができる。
上記した如き分解酵素のうち、二本鎖 DNAを分解せず一本鎖 DNAを優先的に分解 し得る性質を有する DNA分解酵素が好ましぐェキソヌクレアーゼ Iがより好まし 、。 上記した如き分解酵素の由来については特に限定さず、通常この分野で用いられる ものであれば使用可能である。尚、当該分解酵素は、自体公知の方法〔例えば Lehm an,IR., Nussbaum, A丄.， J.Bio.Chem., 239, 2628-2636, 1964]に準じて製造すること ができ、また、市販品（例えば New England Biolabs社)を使用することもできる。 分解酵素の使用量は、一本鎖ポリヌクレオチドを充分に分解し得る量であれば良く特 に限定されない。具体的には、使用する分解酵素の種類によって異なるため一概に は言えないが、例えば分解酵素として一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いる場合 には、通常テスターポリヌクレオチド 1 μ gに対して O.lu/ μ l〜100u/ μ 1、好ましくは 0 • 5u/ μ l〜50u/ μ 1、より好ましくは lu/ μ l〜10u/ μ 1である。
当該酵素処理の条件 (温度、時間、 ρΗ等)、即ち、一本鎖ポリヌクレオチドと分解酵素 とを接触させる際の条件は、使用する分解酵素の種類によって異なるため一概には 言えないが、通常使用する分解酵素が有する至適温度及び至適 ρΗ付近で、一本鎖 ポリヌクレオチドを充分分解し得る時間処理すればよい。
より具体的には、例えば分解酵素として一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いる場 合には、通常 20°C〜60°C、好ましくは 25°C〜50°C、より好ましくは 30°C〜40°C、通常 p H7〜ll、好ましくは pH8〜10.5、より好ましくは 9〜10で、通常 0.1分〜 60分、好ましく は 0.5分〜 45分、より好ましくは 1分〜 30分処理される。
また、上記した如き pH範囲を維持するために、通常この分野で用いられる緩衝剤が 使用できる。このような緩衝液としては、上記した如き pH範囲で緩衝能を有するもの であれば良く特に限定されないが、例えばトリス—塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッ ド緩衝液 (例えば HEPES、 PIPES等）が挙げられる。使用濃度も通常この分野で用い られる濃度範囲、例えば通常 lmM〜500mM、好ましくは 5mM〜250mM、より好ましく は 10mM〜100mMから適宜選択される。
[0061] 尚、上記した如き酵素処理を行った後、当該酵素の反応を停止するには、例えば ED TA等のキレート剤等の反応停止剤を用いる方法又は Z及び加熱処理を行う方法に より行えばよい。
反応停止剤を用いる方法としては、例えば水や上記した如き緩衝剤等に当該反応停 止剤を含有させ、この反応停止剤含有溶液と、酵素処理を行って得られた反応液と 混合させれる等により、当該反応停止剤を、酵素処理を行って得られた反応液中に 存在させればよい。
また、加熱処理により反応を停止する方法としては、酵素処理を行って得られた反 応液を、通常 60°C〜90°C、好ましくは 65°C〜85°C、より好ましくは 70°C〜80°Cで処理 すればよい。
尚、反応停止剤による反応時間及び加熱処理時間は、通常 1分〜 60分、好ましくは 5 分〜 30分、より好ましくは 10分〜 20分である。
上記の反応停止方法のうち、反応停止剤を用いる方法と加熱処理による方法の両 者を併用するのが好ましい。
[0062] 当該酵素処理は、上記した如き本発明の工程（3)によって増幅 (濃縮)されたテスタ 一特異的ポリヌクレオチド及びそれと共存する一本鎖ドライバーポリヌクレオチドと上 記した如き分解酵素とを接触させることにより実施される。
このような方法としては、最終的に増幅 (濃縮)されたテスター特異的ポリヌクレオチ ド、共存する一本鎖ドライバーポリヌクレオチド及び分解酵素とを接触し得るものであ れば良く特に限定されないが、一般的には、上記した如き本発明の工程 (3)を実施 して得られた反応液に当該分解酵素を含有する溶液を添加混合することにより行わ れる。
上記において、分解酵素を含有させる溶液としては、当該分解酵素の分解作用を阻 害しな 、ものであればよぐ水や上記した如き緩衝剤等の通常この分野で用いられる 溶液が挙げられ、その使用濃度等も上記した如き濃度範囲から適宜選択すればよ 、 ここで、当該溶液中には、分解酵素以外に、通常この分野で用いられる活性化剤（ マグネシウムイオン等の金属イオン等）、安定化剤（ジチオスレィトール、メルカプトェ タノール等のチオールィ匕合物等）、防腐剤等を含有させておいても良い。尚、これら 活性化剤、安定化剤、防腐剤等は、分解酵素を含有する溶液とは別の上記した如き 溶液に含有させておいても良ぐこの場合は、分解酵素を含む溶液と活性化剤、安 定化剤又は防腐剤を含有する 1種以上の溶液とを反応液に別々に添加することにな る。
[0063] 例えば分解酵素として一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いる場合、当該酵素処理 〔本発明の工程 (4)〕は以下の如くして実施される。
本発明の工程 (4)を実施して得られた反応液に、一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ 含有溶液と活性化剤及び安定化剤を含有する溶液とを添加混合し、上記した如き条 件で処理し (反応させ)て、当該反応液中に存在するハイブリッド形成しなかった一本 鎖ドライバーポリヌクレオチド (一本鎖ドライバー特異的ポリヌクレオチド及び一本鎖ド ライバー非特異的ポリヌクレオチド)を分解除去する。
尚、上記において、活性化剤としてはマグネシウムイオンが好ましい。その由来として は、例えば塩ィ匕マグネシウム、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩が挙げられ、な かでも塩化マグネシウムが好ましい。また、マグネシウム塩の使用量としては、一本鎖 特異的 DNAヌクレアーゼを充分活性化し得る量であればよぐ通常 0.1mM〜100mM 、好ましくは 0.5mM〜50mM、より好ましくは lmM〜10mMである。
また、安定化剤としては例えばジチオスレィトール、メルカプトエタノール等のチォー ル化合物が好ましぐなかでもジチオスレィトールが好ましい。また、その使用量とし ては、一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを安定化し得る量であればよぐ通常 O.OlmM 〜100mM、好ましくは 0.05mM〜50mM、より好ましくは 0.1mM〜10mMである。
[0064] 上記したように本発明の工程 (4)によって、本発明の増幅方法〔本発明の工程（1)〜
(3)〕で増幅されたテスター特異的ポリヌクレオチドを容易に単離することができる。 尚、工程（3)の増幅を行わずに、工程（2)で得られた一本鎖テスター特異的ポリヌク レオチドを、当該一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを铸型として、これに相補的 なプライマーとタレノウフラグメント等の重合酵素を用いて一本鎖テスター特異的ポリ ヌクレオチドに対する相補鎖をプライマー伸長させて、一本鎖テスター特異的ポリヌク レオチドとこれの相補鎖の二本鎖を得る方法等により二本鎖とした後に、本発明のェ 程 (4)を行ってもよぐこの場合には、テスター特異的ポリヌクレオチドは増幅 (濃縮） されな ヽものの、工程 (2)で得られた一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドと共存す るハイブリッドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを分解除去すること ができ、容易にテスター特異的ポリヌクレオチドのみを単離することができる。
[0065] 2- 3.本発明の具体的方法
本発明の取得方法又は増幅方法は、一本鎖テスターポリヌクレオチドと一本鎖又は 二本鎖ドライバーポリヌクレオチドとを用いて、図 1に示されたチャートに従って実施 することができる。
即ち、先ず、 目的とするある試料から、 自体公知の方法、好ましくはテスター由来の 二本鎖ポリヌクレオチドを調製した後に酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドにする 方法〔本発明の工程（1 ' )〕、より好ましくはテスター由来の二本鎖ポリヌクレオチドを 増幅した後に当該二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドに する方法〔本発明の工程（1")〕により、一本鎖テスターポリヌクレオチド、好ましくはァ ダブターが付加された一本鎖テスターポリヌクレオチドを調製する。一方、別の試料 力 、自体公知の方法により、二本鎖ドライバーポリヌクレオチド又は一本鎖テスター ポリヌクレオチドに対して相補的な一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを調製する。次 V、で、例えば以下の手順で本発明の取得方法又は増幅方法を実施する。
[0066] (手順 1)
(0—本鎖テスターポリヌクレオチドと当該一本鎖テスターポリヌクレオチドと相補鎖と なり得る一本鎖ドライバーポリヌクレオチドとの間、或いは GO—本鎖テスターポリヌクレ ォチドと二本鎖ドライバーポリヌクレオチドとの間で、ハイブリダィゼーシヨンを行!、、 テスター非特異的ポリヌクレオチドとこれに相補的なドライバーポリヌクレオチド（ドライ バー非特異的ポリヌクレオチド）との二本鎖ポリヌクレオチド、又は当該ハイブリッドと 再会合したドライバーポリヌクレオチドとドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌク レオチドをハイブリッド形成させる〔工程（1)〕。次いで、ハイブリッド形成された二本鎖 ポリヌクレオチドを酵素処理により分解除去して、テスター非特異的ポリヌクレオチド 又はこれと再会合したドライバ一二本鎖ポリヌクレオチドを除去する〔工程 (2)〕。更に 要すれば、共存するノ、イブリツドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチド を、自体公知の単離 (分離)方法又は精製方法等により除去する〔単離工程〕。以上 の手順により一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを取得又は単離することができる 。 （本発明の取得方法 1)
[0067] (手順 2)
上記工程（1)及び (2)、要すれば単離工程を実施した後、取得又は単離された一 本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを増幅させる〔工程（3)〕。これにより、テスター 特異的ポリヌクレオチドのみを実質的に増幅させて、テスター特異的ポリヌクレオチド のみを大量に得ることができる。 （本発明の増幅方法 1)
[0068] (手順 3)
上記工程（1)及び（2)を実施した後、取得された一本鎖テスター特異的ポリヌクレ ォチドを増幅させる〔工程（3)〕。次いで、増幅されたテスター特異的ポリヌクレオチド と共存して 、る、ハイブリッドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを除 去する〔工程 (4)〕。これにより、増幅されたテスター特異的ポリヌクレオチドを単離す ることができる。（本発明の増幅方法 2)
[0069] (手順 4)
以下の手順により、より簡便にテスター特異的ポリヌクレオチドを増幅 (濃縮)及び単 離することができる。（本発明の増幅方法 3)
即ち、上記工程（1)及び（2)を実施した後、取得された一本鎖ポリヌクレオチドとこ れの相補鎖とを増幅させて二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを得る〔工程 (3 ' )〕 。次いで、増幅された二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドと共存している、ハイブ リツドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを酵素処理により分解除去 し、二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを単離する〔工程 (4' )〕。
[0070] (手順 5)
上記工程（1)及び（2)を実施した後、取得された一本鎖テスター特異的ポリヌクレ ォチドを铸型として、これに対する相補鎖を合成して二本鎖テスター特異的ポリヌクレ ォチドを得る〔二本鎖工程〕。次いで、工程 (4' )により、二本鎖テスター特異的ポリヌ クレオチドと共存して 、る、ノ、イブリツドを形成しな力つた一本鎖ドライバーポリヌクレ ォチドを酵素処理により分解除去する。この場合には、工程（2)で取得されたテスタ 一特異的ポリヌクレオチドを容易に単離することができる。 （本発明の取得方法 2) [0071] (手順 6)
上記工程（1)、 （2)、及び単離工程を実施した後、上記二本鎖工程により、一本鎖 テスター特異的ポリヌクレオチドを铸型として、これに対する相補鎖を合成して二本鎖 テスター特異的ポリヌクレオチドを得る。（本発明の増幅方法 4)
[0072] 本発明の取得方法としては、上記手順 1が好ましい。また、本発明の増幅方法として は、上記手順 2及び 3が好ましぐ手順 3が特に好ましい。
[0073] 以下に、テスターポリヌクレオチドとしてアダプターが付加された一本鎖 cDNAを用い 、ドライバーポリヌクレオチドとして二本鎖 cDNAを用いる場合を例に取り、本発明の方 法を具体的に説明する。
[0074] 〔一本鎖テスター cDNAの調製〕
自体公知の方法によって目的とする試料カゝら抽出された mRNAを铸型として作成され た cDNAライブラリー或いは市販の cDNAライブラリーにおける、 cDNA挿入断片両端 のベクター由来の既知配列で設計された 5'末端がリン酸ィ匕されたプライマーとこれと は異なる配列のリン酸ィ匕されて 、な 、プライマーの 2種のプライマーを作製する。当 該 cDNAライブラリーを铸型とし、作製した 2種のプライマーを用いて PCR等によりテス ター遺伝子由来の 5'末端及び 3'末端にアダプター配列が付加された二本鎖 cDNAを 増幅する。或いは、 自体公知の方法により目的とする試料カゝら mRNAを抽出する。既 知配列で設計された 5'末端力 Sリン酸化されたプライマーとこれとは異なる配列のリン 酸化されて 、な 、プライマーの 2種のプライマーを作製する。抽出した mRNAを铸型 とし、作製した 2種のプライマーを用いてオリゴ 'キヤッビング法に従って 5'末端及び 3' 末端にアダプター配列が付加された cDNAを作製する。次いで、 5'末端及び 3'末端 のアダプター配列でプライマーを作製して二本鎖 cDNAを PCR等により増幅する。 要すれば、増幅されたアダプター付力卩ニ本鎖 cDNAを、フエノール Zクロ口ホルム Z イソアミルアルコール混合液等による抽出処理、アルコール沈澱処理等に付す。 増幅されたアダプター付力卩ニ本鎖 cDNAを、例えばラムダ 'ェキソヌクレアーゼ等の二 本鎖 DNAの 5'末端リン酸化 DNA鎖を除去する酵素により処理し、その後、例えば ED TA等のキレート剤等の反応停止剤での処理又は Z及び加熱処理を行うことによって 当該酵素の反応を停止させて、 5'末端リン酸ィ匕プライマー側の cDNA鎖を除去して、 アダプターが結合した (付加された)一本鎖テスター cDNAを得る。
尚、要すれば、得られた一本鎖テスター cDNAを、カラム精製等により精製する。 上記した方法の概略を図 2に示す。
[0075] 〔二本鎖ドライバー cDNAの調製〕
自体公知の方法によって目的とする試料とは別の試料カゝら抽出された mRNAを铸型 として作成された cDNAライブラリー或いは市販の cDNAライブラリーにおける、 cDNA 挿入断片両端のベクター由来の既知配列で設計された、それぞれ配列が異なる 2種 のプライマーを作製する。当該 cDNAライブラリーを铸型とし、作製した 2種のプライマ 一を用いて PCR等によりドライバー遺伝子由来の 5'末端及び 3'末端にアダプター配 列が付加された二本鎖 cDNAを増幅する。要すれば、増幅されたアダプター付カロ二 本鎖 cDNAを、フエノール Zクロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液等による抽出 処理、アルコール沈澱処理等に付す。
増幅されたアダプター付力卩ニ本鎖 cDNAの、挿入断片 cDNAの両末端から増幅した プライマー（アダプター）までを、挿入断片両側のマルチクローユングサイトを利用し て切断し、挿入断片のみ力もなる二本鎖ドライバー cDNA〔アダプターが結合 (付加） して!/、な!/、二本鎖ドライバー cDNA〕を得る。
尚、要すれば、得られた二本鎖ドライバー cDNAを、カラム精製等により精製する。 上記した方法の概略を図 3に示す。
[0076] 〔テスター cDNAとドライバー cDNAとのハイブリダィゼーシヨン：工程（1)〕
調製した一本鎖テスター cDNAと、当該一本鎖テスター cDNAに対して過剰量の二本 鎖ドライバー cDNAを、適当量のナトリウム塩を含む緩衝液に添加混合した後、適当 な温度で適当な時間加熱して熱変性を行う。次いで、適当な温度で適当な時間ハイ ブリダィゼーシヨンを行 、、テスター cDNAとこれに相補的なドライバー cDNAとの二本 鎖 cDNAをノヽイブリツド形成させ、一本鎖テスター特異的 cDNA、一本鎖テスター非特 異的 cDNAとこれと相補的な一本鎖ドライバー cDNAとの二本鎖ハイブリッド、再会合 した二本鎖ドライバー特異的 cDNA、再会合した二本鎖ドライバー非特異的 cDNA、 再会合しなかった一本鎖ドライバー特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖の 2種） 及び再会合しな力つた一本鎖ドライバー非特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖 の 2種)を含有するハイブリダィゼーシヨン溶液を得る。
上記した方法の概略を図 4に示す。
[0077] 〔ハイブリッド形成した二本鎖 cDNAの除去：工程 (2)〕
得られたノヽイブリダィゼーシヨン溶液に、例えば二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ等 の二本鎖 DNAを優先的に分解し得る性質を有する DNA分解酵素を含有する溶液と 活性化剤及び安定化剤を含有する溶液とを添加混合し、通常 20°C〜80°C、好ましく は 30°C〜75°C、より好ましくは 50°C〜70°C、通常 pH6〜9、好ましくは 6.5〜8.5、より好 ましくは？〜 8で、通常 0.5分〜 60分、好ましくは 1分〜 45分、より好ましくは 5分〜 30分 処理し (反応させ) 当該ハイブリダィゼーシヨン溶液中に含有するハイブリッド形成し た二本鎖 cDNA (—本鎖テスター非特異的 cDNAとこれと相補的な一本鎖ドライバー c DNAとの二本鎖ハイブリッド、再会合した二本鎖ドライバー特異的 cDNA及び再会合 した二本鎖ドライバー非特異的 cDNA)を分解し、その後、例えば EDTA等のキレート 剤等の反応停止剤での処理又は反応停止剤での処理及び加熱処理を行うことによ つて当該 DNA分解酵素の反応を停止させて、一本鎖テスター特異的 cDNA、再会合 しなかった一本鎖ドライバー特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖の 2種)及び再 会合しなかった一本鎖ドライバー非特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖の 2種） を含有する反応液を得る。
尚、要すれば、これら cDNAを、フエノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコール混 合液等による抽出処理、アルコール沈澱処理等に付す。
上記した方法の概略を図 5に示す。
[0078] 〔ハイブリッド形成しな力つた一本鎖テスター特異的 cDNAの増幅：工程 (3)〕
得られた反応液に、上記した一本鎖テスター cDNAの調製において用いたのと同じ 配列の 2種のプライマー（但し、何れも 5'末端はリン酸ィ匕されていない）、デォキシリボ ヌクレオチド三リン酸（dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTP)、例えば TaqDNAポリメラーゼ 等の重合酵素及び PCR用の緩衝液を適当量加える。（a)得られた溶液を適当な温度 で適当な時間加熱して熱変性処理を行う。次いで、（b)当該溶液を冷却して一本鎖テ スター特異的 cDNA(2サイクル目以降は、一本鎖テスター特異的 cDNAと増幅された これの相補鎖）にプライマーをァニールさせる。その後、（c)当該溶液を適当な温度で 適当な時間処理し、当該重合酵素の作用によりプライマーを伸長させて一本鎖テス ター特異的 cDNAに対する相補鎖（2サイクル目以降は、一本鎖テスター特異的 cDN Aに対する相補鎖と、増幅された、一本鎖テスター特異的 cDNAの相補鎖に対する相 補鎖)を合成 (増幅)する。以上の (a)〜(c)の工程を適当回数繰り返すことによってハ イブリツド形成しな力つた一本鎖テスター特異的 cDNAとこれの相補鎖とを増幅し、増 幅された二本鎖テスター特異的 cDNA、一本鎖ドライバー特異的 cDNA (センス鎖とァ ンチセンス鎖の 2種)及び一本鎖ドライバー非特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス 鎖の 2種)を含有する反応液を得る。
尚、要すれば、これら cDNAを、フエノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコール混 合液等による抽出処理、アルコール沈澱処理等に付す。
上記した方法の概略を図 6に示す。
〔ハイブリット形成しな力つた一本鎖ドライバー cDNAの除去：工程 (4)〕
得られた反応液に、一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ等の二本鎖 DNAを分解せず 一本鎖 DNAを優先的に分解し得る性質を有する DNA分解酵素を含有する溶液と活 性化剤及び安定化剤を含有する溶液とを添加混合し、通常 20°C〜60°C、好ましくは 25°C〜50°C、より好ましくは 30°C〜40°C、通常 pH7〜ll、好ましくは pH8〜10.5、より 好ましくは 9〜10で、通常 0.1分〜 60分、好ましくは 0.5分〜 45分、より好ましくは 1分〜 30分処理し (反応させ）当該反応液中に含有する一本鎖ドライバー cDNA〔一本鎖ドラ ィバー特異的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖の 2種)及び一本鎖ドライバー非特異 的 cDNA (センス鎖とアンチセンス鎖の 2種)〕を分解する。その後、例えば EDTA等の キレート剤等の反応停止剤での処理又は Z及び加熱処理を行うことによって当該 DN A分解酵素の反応を停止させる。
尚、要すれば、得られた二本鎖テスター特異的 cDNAを、カラム精製等により精製す る。
上記した方法の概略を図 7に示す。 [0080] 2-4.本発明の遺伝子変異同定方法
本発明の方法により取得、増幅又は単離されたテスター特異的ポリヌクレオチドは、 例えば以下の如き、テスターにおける遺伝子変異の同定等の各種同定及びスクリー ニング等に使用される。
[0081] (1)当該テスター特異的ポリヌクレオチドの塩基配列を自体公知の塩基配列決定法 により決定することにより、変異遺伝子の塩基配列の同定や新規な遺伝子の配列の 同定を行うことができる。
(2)変異遺伝子が病原性であるのか否かの同定
例えばノーザンブロット法、 RT-PCR法、リアルタイム PCR法等を用いることにより、テ スター (異常 (罹病)試料に由来するもの）とドライバー (正常 (健常者)試料に由来す るもの）における特定の変異遺伝子 (mRNA)の発現量を確認し、比較することにより、 当該特定の変異遺伝子 (mRNA)が病原性であるか否かを同定することができる。
(3)変異遺伝子のゲノム DNA上の位置の同定
ヒト、マウス、ラット等ゲノムの全 DNA配列が解読されているものでは、データベース等 を用いて当該全 DNA配列と変異遺伝子の塩基配列とを比較することによってゲノム D NA上の変異遺伝子の位置が同定できる。また、全 DNA配列が解読されていない場 合は、例えば FISH法等の自体公知の方法によりゲノム DNA上の変異遺伝子の位置 が同定できる。
(4)疾病の診断同定'予測 ·予防
例えばノーザンブロット法、 RT-PCR法、リアルタイム PCR法等を用いることにより、テ スター (異常 (罹病)試料に由来するもの）とドライバー (正常 (健常者)試料に由来す るもの）における特定の変異遺伝子 (mRNA)の発現量を確認し、比較することにより、 当該特定の変異遺伝子 (mRNA)が病原性であるか否かを同定することができる。
(5)疾病治療の効果の同定や治療時期の同定
例えばノーザンブロット法、 RT-PCR法、リアルタイム PCR法等を用いることにより、テ スター (異常 (罹病)試料に由来するもの）とドライバー (正常 (健常者)試料に由来す るもの）における特定の変異遺伝子 (mRNA)の発現量を確認し、比較することにより、 当該特定の変異遺伝子 (mRNA)が病原性であるか否かを同定することができる。 (6)当該テスター特異的ポリヌクレオチドをプローブとして用いて cDNAライブラリーや ESTライブラリ一等についてスクリーニングを行えば、ある機能又は形質発現に関与 する変異遺伝子をスクリーニングすることができる。このような方法としては、例えば標 識物質により標識されたテスター特異的ポリヌクレオチド又はその相補鎖の一部若し くは全部を含有するオリゴヌクレオチドをプローブとし、 DNAチップ上に固定ィ匕された 上記のライブラリーとハイブリダィゼーシヨンを行う方法等、自体公知のスクリーニング 方法〔Beck MT, Holle L, Chen WY. Biotechniques. 2001 Oct;31(4):782-4, 786〕等 が挙げられる。
(7)当該テスター特異的ポリヌクレオチド (特にゲノム DNA又は cDNA)をクローニング し、サブトラクティブゲノム DNA又は cDNAライブラリーとする。正常 (健常者)試料から 抽出したゲノム DNA又は cDNAと異常（罹病）試料力 抽出したゲノム DNA又は mRNA 群をプローブとしてハイブリダィゼーシヨンを行 、、異常（罹病）試料のゲノム DNA又 は mRNA群のみに反応したゲノム DNA又は cDNAが未知病原体由来である可能性が ある。即ち、これにより、未知病原体を検出できる可能性がある。
(8)当該テスター特異的ポリヌクレオチド (特に、 cDNA)を、例えばプラスミドベクター 等の適当なベクターに挿入し、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換することによ り、テスターに特異的な遺伝子をクローニングすることができる。
(9)当該テスター特異的ポリヌクレオチド (特に、 cDNA)或いはクローユングされた DN Aの塩基配列を決定し、その塩基配列に基づ 、て設計されたプライマーを用いて 3' 及び 5'RACE法を行うことにより変異遺伝子の全長 cDNAを得ることができる。
(10)当該プライマーを用いた TAIL-PCRを行うか、当該テスター特異的ポリヌクレオ チドをプローブとして用 ヽてゲノミックライブラリ一につ 、てスクリ一二ングを行えば、あ る機能又は形質発現において特異的に働くプロモーター（変異遺伝子のプロモータ 一）をスクリーニングすることもできる。
( 11 )ハイスループットな特異的発現遺伝子の同定
本発明の方法で得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (特に、 cDNA)を用いてマ イクロアレイ (チップ)を作製し、これを用いることによって、例えば上記の（1)〜（7)の 同定'解析を迅速且つ簡便に行うことができる。 従って、本発明の方法には、本発明の方法により取得、増幅又は単離されたテスタ 一特異的ポリヌクレオチドを用いた、上記した如き各種同定法やスクリーニング法が 包含される。尚、当該同定法やスクリーニング法は、本発明の方法により取得、増幅 又は単離されたテスター特異的ポリヌクレオチドを用いる以外は、 自体公知の方法に 従って実施すれば良ぐそこで使用される試薬類等も自体公知の方法で用いられる ものが使用できる。
従って、本発明の遺伝子変異同定方法には、例えば以下の（1)〜（9)のから選ばれ る少なくとも 1つの工程を含むものが好ましい。
(1)得られたテスター特異的ポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、
(2)ノーザンブロット法、 RT- PCR法、リアルタイム PCR法等により、テスターとドライバ 一における得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (特定の変異遺伝子; mRNA)の 発現量を確認し、それらを比較する工程、
(3)全 DNA配列と得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (変異遺伝子）の塩基配 列とを比較し、ゲノム DNA上の得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (変異遺伝子 )の位置を同定する工程、又は FISH法等の自体公知の方法によりゲノム DNA上の得 られたテスター特異的ポリヌクレオチド (変異遺伝子）の位置を同定する工程、
(4)得られたテスター特異的ポリヌクレオチドをプローブとして用いて cDNAライブラリ 一や ESTライブラリ一等にっ ヽてスタリ一ユングを行う工程、
(5)得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (特にゲノム DNA又は cDNA)をクロー- ングし、サブトラクティブゲノム DNA又は cDNAライブラリ一とし、正常 (健常者)試料か ら抽出したゲノム DNA又は cDNAと異常（罹病）試料カゝら抽出したゲノム DNA又は mRN A群をプローブとしてハイブリダィゼーシヨンを行う工程、
(6)得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (特に、 cDNA)を、例えばプラスミドべク ター等の適当なベクターに挿入し、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換すること により、テスターに特異的な遺伝子をクローユングする工程、
(7)得られたテスター特異的ポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて 、変異遺伝子の全長 cDNAを得る工程、
(8)得られたテスター特異的ポリヌクレオチドをプライマーとして用いた TAIL-PCRを 行うか、当該テスター特異的ポリヌクレオチドをプローブとして用いてゲノミックライブ ラリーについてスクリーニングを行い、ある機能又は形質発現において特異的に働く プロモーター（変異遺伝子のプロモーター）をスクリーニングする工程、
(9)得られたテスター特異的ポリヌクレオチド (特に、 cDNA)を用いてマイクロアレイ（ チップ）を作製し、これを用いて、上記の（1)〜（7)を行う工程。
また、本発明の方法により取得、増幅又は単離されたテスター特異的ポリヌクレオチ ド又はその相補鎖の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドからなるプロ一 ブゃプライマー及び本発明の方法により得ることができる cDNAライブラリーをも包含 する。
3.本発明のキット
本発明のキットは、上記した如き本発明の取得方法、増幅方法又は同定方法を実 施するために使用されるものである。
このようなキットとしては、 a)少なくとも先述した如き本発明の工程（2)においてハイブ リツド形成された二本鎖ポリヌクレオチド (即ち、テスター非特異的ポリヌクレオチドとこ れに相補的なドライバーポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレオチド)を除去するため に用いられる、一本鎖ポリヌクレオチドを分解せずハイブリッド形成された二本鎖ポリ ヌクレオチドを優先的に分解し得る性質を有する酵素、好ましくは二本鎖 DNAを優先 的に分解し得る性質を有する DNA分解酵素、より好ましくは二本鎖特異的 DNAヌクレ ァーゼを含んでなるものであり、 b)好ましくは、更に、先述した如き本発明の工程（1 ' ) において調製されたテスター由来の二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチド にするために用いられる、二本鎖ポリヌクレオチドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖 ポリヌクレオチドとする性質を有する酵素或いは 2種以上の酵素を組み合わせること により二本鎖ポリヌクレオチドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖ポリヌクレオチドとす ることができる酵素群、好ましくは二本鎖ポリヌクレオチドの片側の核酸鎖を除去して 一本鎖ポリヌクレオチドとする性質を有する酵素、より好ましくはラムダ 'ェキソヌクレア ーゼを含んでなるものであり、 c)より好ましくは、先述した如き本発明の工程 (4)にお V、て二本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドと共存する一本鎖ポリヌクレオチド (一本 鎖ドライバーポリヌクレオチド)を特異的に分解にするために用いられる、二本鎖ポリ ヌクレオチドを分解せず一本鎖ポリヌクレオチドを優先的に分解し得る性質を有する 酵素、好ましくは二本鎖 DNAを分解せず一本鎖 DNAを優先的に分解し得る性質を 有する DNA分解酵素、より好ましくは一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ、更に好ましく はェキソヌクレアーゼ Iを含んでなるものである。
これら構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
更に、上記以外の試薬類を加えて、本発明のキットとすることもできる。このような試薬 類としては、例えば以下の如き a)〜i)から選ばれる少なくとも 1種が挙げられる力 これ らに限定されない。
a)—本鎖ポリヌクレオチドを分解せずノヽイブリツド形成された二本鎖ポリヌクレオチドを 優先的に分解し得る性質を有する酵素用の緩衝液 (例えばナトリウム塩、要すればマ グネシゥム塩及びチオールィ匕合物を含有する HEPES等のグッド緩衝液）、 a')—本鎖ポリヌクレオチドを分解せずノヽイブリツド形成された二本鎖ポリヌクレオチド を優先的に分解し得る性質を有する酵素の反応を停止するための溶液 (例えばキレ ート剤等の反応停止剤を含有する、例えば水や上記した如き緩衝剤）、
b)二本鎖ポリヌクレオチドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖ポリヌクレオチドとする性 質を有する酵素或いは 2種以上の酵素を組み合わせることにより二本鎖ポリヌクレオ チドの片側の核酸鎖を除去して一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる酵素群用 の緩衝液 (例えばマグネシウム塩及び界面活性剤を含有するグリシン等の緩衝液）、 c)二本鎖ポリヌクレオチドを分解せず一本鎖ポリヌクレオチドを優先的に分解し得る 性質を有する酵素用の緩衝液 (例えばマグネシウム塩及びチオールィ匕合物を含有 するグリシン等の緩衝液）、
d)ハイブリダィゼーシヨン用緩衝液 (例えばナトリウム塩を含有するグッド緩衝液等）、 e)ポリヌクレオチド抽出用試薬 (例えば粉砕用緩衝液、フエノール、クロ口ホルム、 SD S、 —メルカプトエタノール等）、
DPCR用試薬 (例えば重合酵素、重合酵素用緩衝液、 1種又は 2種以上のプライマー 、ヌクレオチド混合物等）、
g)電気泳動用試薬 (ァガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローデイング緩衝液、臭 化工チジゥム染色用試薬等)、 h) PCR反応後の余剰プライマーの除去、ミス 'アニーリングにより増幅されてしまった 鎖長の短!、DNAの除去、ヌクレアーゼにより完全に消化されなかった短!、DNAの除 去等のために用いられるポリヌクレオチド単離 (分離)又は精製用試薬 (例えば精製 用カラム等)、
i)アルコール沈澱用試薬 (例えばエタノール溶液、イソプロノ V—ル溶液、高分子キヤ リア一、酢酸ナトリウム溶液等)。
[0085] また、前述した如き本発明の取得、増幅、同定方法での使用のための説明書等を含 ませておいても良い。当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴 '原理'操作手 順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書 、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット)等を意味する。
[0086] 本発明の方法は、以下のような効果を奏する。
(1)テスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチドを cDNAライブラリーから 作製できる。
従来の方法では、サブトラクシヨン cDNAの作製工程で環状プラスミドを除去すること ができな力 たため、テスターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチド共に cD NAからしか作製できず、 cDNA作製の手間や作製できる cDNA量に限界がある等の 問題があった。一方、本発明方法では、工程（2)において一本鎖ポリヌクレオチドを 分解せずハイブリッド形成された二本鎖ポリヌクレオチドを優先的に分解し得る性質 を有する酵素を用いた酵素処理により二本鎖ポリヌクレオチドを除去できるので、テス ターポリヌクレオチド及びドライバーポリヌクレオチド共に cDNAライブラリー（プラスミド ベクター）から作製できる。
(2)ハイブリダィゼーシヨン (サブトラクティブ'ハイブリダィゼーシヨン）は一回でょ 、。 従来の方法においては、テスターポリヌクレオチドは二本鎖であったため、再会合し たテスターポリヌクレオチド間の二本鎖ハイブリッド形成がされてしまうので、ドライバ 一ポリヌクレオチドを過剰量使用しても、高発現して!/、るテスター非特異的ポリヌクレ ォチド (ハウスキーピング遺伝子）が残ってしまい、後の PCR増幅に悪影響を及ぼす 場合がある。そのため、従来法では、ハイブリダィゼーシヨンを 2〜3回以上繰り返す 必要があった。これに対して、本発明では、テスターポリヌクレオチドは一本鎖である ので、テスターポリヌクレオチド間の二本鎖ハイブリッドは形成されず、ハイブリダィゼ ーシヨンは一回行えば充分である。
(3)—回の酵素処理でテスター中に存在するポリヌクレオチドのうち、テスター非特異 的ポリヌクレオチドを分解除去することができる。
従来の物理的結合又は吸着によるサブトラクシヨン法においては、サブトラクティブ' ハイブリダィゼーシヨンの結果得られた一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成した 二本鎖ポリヌクレオチドとを、物理的結合又は吸着により分離していたため、実際に はこれらを厳密に分離することができず、サブトラタト効率低下の要因となっていた。 しかしながら、本発明では酵素処理によりハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチ ドを除去するため、一回の酵素処理で二本鎖ポリヌクレオチドを高効率に除去するこ とができ、効率良く一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドを得ることができる。
(4)テスター特異的ポリヌクレオチドを容易に濃縮できる。
一本鎖テスター特異的ポリヌクレオチドにのみ存在し、ドライバー由来のポリヌクレオ チド中に存在しな!ヽ配列に基づ!/ヽて設計 ·作製されたプライマーを用いた PCR等を 行えば、ドライバーポリヌクレオチドは増幅されず、テスター特異的ポリヌクレオチドの みが実質的に増幅されるので、テスター特異的ポリヌクレオチドを濃縮することができ 、効率的なサブトラタト'ポリヌクレオチドを作製することができる。
(5)ドライバーポリヌクレオチドを容易に除去できる。
本発明の工程 (4)により、テスター特異的ポリヌクレオチドに共存しているドライバー ポリヌクレオチドを容易に除去することができる。特に、二本鎖テスター特異的ポリヌク レオチドと一本鎖ドライバーポリヌクレオチドが共存して 、る場合には、酵素処理によ り容易に一本鎖ドライバーポリヌクレオチドを除去することができる。その結果、テスタ 一特異的ポリヌクレオチドの密度をさらに高めることができるので、従来法で問題とな つていたドライバーポリヌクレオチドの混入 (残存）による影響がさらに低減され、高効 率なサブトラクシヨン ·ポリヌクレオチドが作製できる。
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら により何等限定されるものではな 、。
実施例 [0088] (1)ヒト肝臓癌由来の Hep G2細胞からの全 RNAの抽出
ISOGEN (二ツボンジーン社製）を用い、その添付文書に従い Hep G2細胞（ヒューマン サイエンス研究資源バンク製)力も全 RNAを抽出した。
Hep G2細胞を 225mL培養フラスコ（Nalge Nunc社製） 4本に 5 X 106細胞/ cm2まで培養 し、リン酸緩衝液 (PH7.5)で洗浄した。 ISOGEN (二ツボンジーン社製)を 1培養フラス コに対して 15mL入れて、細胞を剥がし、それぞれ、遠心チューブ (Nalge Nunc社製、 Oak Riddge Centrifoge Tube,50mL)に移した。それぞれにクロ口ホルムを 3mL入れ、 攪拌後、高速遠心機（日立社製、 SCR20B)で 12000rpm、 4°C、 15分間遠心分離して、 それぞれ、上清を 10mL回収した。上清を新しい遠心チューブに移し、 10mLのイソプ ロバノール (和光純薬工業社製)を加えて攪拌し、高速遠心機 (日立社製、 SCR20B) で 12000rpm、 4°C、 15分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿を 70%エタノール (和 光純薬工業社 (株)製)で洗浄し、乾燥後、滅菌水に溶解して、分光光度計 (Beckma n社製、 DU640)にて UV 260nmで RNA濃度を測定した。濃度測定後、滅菌水で 2 g/ μ Lに調製した RNA溶液を 250 μ L (500 μ g)得た。
[0089] (2) Hep G2細胞由来の全 RNAからの Poly(A)+ RNAの抽出
上記（1)で得られた Hep G2細胞全 RNA 500 gを使用して Oligotex- dT 30 Super (タ カラバイオテク社製)を用い、その添付文書に従い、 Poly(A)+ RNAを抽出した。
Hep G2細胞全 RNA 250 μ L (500 μ g)に、 2 X Elution Buffer (2mM EDTA及び 0.2% S DS含有 20mM Tris- HCl緩衝液、 pH7.5)を 250 Lカ卩えて、混合した。その後、 Oligote x-dT 30 Superを加えて、混合し、 65°C、 5分間加熱後、氷中に急冷した。 5M塩ィ匕ナ トリウムを 100 Lカ卩えて、 37°Cで、 10分間インキュベートし、高速微量遠心機（日立社 製、 CF16RX)で 14500rpm、室温で、 5分間遠心分離した。上清を除去し、滅菌水を 4 00 Lカ卩えて、混合し、 65°Cで、 5分間加熱後、高速微量遠心機（日立社製、 CF16R X)で、 14500rpm、室温で、 5分間遠心分離した。上清を回収し、 5M塩ィ匕ナトリウムを 20 L及びエタノールを lmLカ卩えて、混合し、高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX) で、 14500rpm、 4°Cで、 10分間遠心分離した。上清を除去し 70%エタノールで洗浄し 、乾燥後、滅菌水に溶解して、分光光度計 (Beckman社製、 DU640)にて UV 260nm で RNA濃度を測定した。 濃度測定後、滅菌水で 0.25 μ / μ Lに調製した Poly(A)+ RNA溶液を 28 L (7 g)得 た。
(3) Hep G2細胞の cDNAライブラリーの作製
上記（2)で得られた Hep G2細胞由来の Poly(A)+ RNA 5 μ gをとり、 TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Amersham社製）を使用して、その添付文書に従い作製した。ベクター は PNEB193 (New England Biolabs社製）を使用し、形質転換は DH5 aを使用した。ま た、プラスミドライブラリ一は、 100 mlの Luria- Bertani's broth (アンピシリンナトリウム 1 00 g / mlを含む)で培養し後、回収した。
First-Strand Reaction Mixes (mersham社製）に、 65°C、 10分間加熱後氷中で急冷し た、上記（2)で得られた Hep G2 Poly(A)+ RNA 5 iu g (20 iu L) , Oligo— dT(24)— Pac I sit e Primer (5'-TTTTTTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3\シグマジ エノシス社製、 0.5 mg/ml) 1 L及び DTT Solution (Amersham社製） 1 Lを混合し、 37°Cで、 1時間インキュベートして、第一鎖反応 (逆転写反応）を行った。 Second-Stra nd Reaction Mixes (Amersham社製）に、第一鎖反応液を混合し、 12°Cで、 30分インキ ュベート後、 22°C、 1時間インキュベートして第-鎖反応を行った。
次いで、 65°C、 10分加熱して、第-鎖反応を停止させ、 SizeSep 400 Spun Columns ( Amersham社製）にて Primer及び低分子 DNAを除去し、二本鎖 cDNAを得た。
作製した二本鎖 cDNA 100 μ Lに、 EcoR I/Not I adaptor (Amersham社製） 5 L、 PE G Buffer (Amersham社製） 30 μ Lゝ ATP Solution (Amersham社製、 15mM) 1 μ L及び T 4 DNA Ligase (5units ) (Amersham社製） 1 μ Lを加え、 16°Cで、 1時間インキュベート した後、 65°Cで、 10分加熱して T4 DNA Ligaseを失活させた。得られた反応液 (ァダ プターを結合させた cDNAを含有する溶液） 137 μ Lに、フエノール：クロ口ホルム：イソ ァミルアルコール（25 : 24 : 1)混合液（二ツボンジーン社製）を 140 μ L加えて、攪拌し、 高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で、 14500rpm、室温で、 3分間遠心分離した 。上清を回収し、エタ沈メイト（二ツボンジーン社製） 1 L、 5M NaCl (和光純薬工業社 製) Ί μ L及びエタノール (和光純薬工業社製) 350 μ Lを加えて、混合して、高速微量 遠心機（日立社製、 CF16RX)で、 14500rpm、 4°Cで、 10分間遠心分離した。上清を除 去し、 70%エタノール (和光純薬工業社製)で洗浄して、乾燥後、滅菌水 85 Lに溶 解した。滅菌水に溶解した cDNAに、 10 X NEB bufferl (New England Biolabs社製） 1 0 Lゝ BSA溶液（New England Biolabs社製） 1 μ L及び Pac I (New England Biolabs 社製、 lOunits/ L /z Lを加えて、混合し、 37°Cで、 2時時間インキュベートした後、 6 5°C、 20分間加熱し、 Pac Iを失活させた。
得られた反応液（Pac Iで切断した cDNA含有溶液）を、 SizeSep 400 Spun Columns (A mersham社製）により処理し、未結合のアダプター及び低分子 DNAを除去し、全量 15 0 Lになるように滅菌水で調製した。これにより、 5'末端が EcoR I、 3'末端が Pac Iの 切断末端となった cDNAが得られた。
得られた cDNA 3 L (Poly(A)+ RNAに換算して約 100ng)、 EcoR I (-ツボンジーン社 製）及び Pac l (New England Biolabs社製）で切断した pNEB193 DNA (New England Biolabs社製） 100ng (2 μ L)、及び DNA Ligation Kit Ver.2.1 (タカラバイオテク社製） I 液（Reaction Buffer) 5 Lを混合し、 16°Cで、 1時間インキュベートした後、全量（10 L)を DH5 a (100 ^ L)に 42°Cで、 30秒の熱ショックによって形質転換した。形質転換 した cDNAライブラリーを 100 mlの Luria- Bertani's broth (アンピシリンナトリウム 100 g/mlを含む）で 37°C、 16時間培養し、一方向に挿入された Hep G2細胞プラスミド cD NAライブラリーを回収した。
得られた cDNAライブラリーの一部を滅菌水で 10ngZ Uこ調製して、下記 (4)のテス ター cDNAの調製における PCR増幅反応の铸型とした。
[0091] (4)テスター cDNAの調製
上記（3)で調製したヒト肝臓癌由来の H印 G2細胞の cDNAライブラリーを铸型として、 挿入断片 cDNAを TOPOTAQ DNA Polmerase (Fidelity Systems社製）を使用して PC R増幅した。
下記の試薬を混合し、その混合液 Lを 0.2mL PCRチューブ 5本に分注した。
[0092] 'ヒト肝臓癌由来の HepG2細胞の cDNAライブラリー溶液： 1 L (10ng)
•6mM MgCl含有 2 X Amplification Buffer (Fidelity Systems社製） : 50 μ L
2
•dNTPs溶液（各 dNTP lOmM含有、 Amersham社製） : 5 μ L
•M13/pUC Forwad Primer溶液： 5 L
リン酸化プライマー（5'- P- CCAGTCACGACGTTGTAAAACG- 3，）（シグマジエノシス 社製)を 10 Mとなるように滅菌水に溶解したもの。
•M13/pUC Reverse Primer溶液： 5 L
非リン酸化プライマー（5'- CACACAGGAAACAGCTATGACC- 3，）（シグマジエノシス 社製)を 10 Mとなるように滅菌水に溶解したもの。
•TOPOTAQ DNA Polymer as e溶液： 4 L
TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems社製、 3units/ L) 1 Lに 1 X Dilutio n buffer (Fidelity Systems社製） 3 μ Lをカロえて混合して 4 μ Lとしたもの。
'滅菌水：30 ;z L
次いで、これを 95°C 2分、 95°C 20秒→ 60°C 20秒→ 72°C 2分 30サイクル、 72°C 5 分でサーマルサイクラ一（MJ Research社製、 PTC- 225)にて PCR反応に付した。 得られた PCR増幅産物 (100 μ L)を、 0.6mLマイクロチューブに移して、これに、等量 (1 00 μ L)のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール (25 : 24： 1)混合液（-ッポンジ ーン社製)を加え、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温で、 3分間遠心分離後、水 相（上清）を 0.6mLマイクロチューブに移した。これに、エタ沈メイト（二ツボンジーン社 製） 1 レ 5M NaCl (和光純薬工業社製) 5 μ L及びエタノール (和光純薬工業社製) 2 50 しを加え、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温、 5分間遠心分離後、上清 を除去し、得られた沈殿物を 70%エタノール (和光純薬工業社製)で洗浄後、乾燥さ せ、 44 Lの滅菌水に溶解した。
次いで、溶解液に、 10 X Lambda Exonuclease Buffer (EPICENTRE社製、 25mM塩化 マグネシウム及び 0.1 %Triton-X100含有 670mMグリシン- KOH緩衝液、 ρΗ9.4) 5 μ L 及び Lambda Exonuclease (EPICENTRE社製、 lOunits/ μ ΐ μ Lを加えて、混合し、 37°C、 30分インキュベートした。次いで、更に 80°C、 15分インキュベートして Lambda E xonucleaseを失活させ 7こ。
これに、 50 L滅菌水を加えて混合し、全量を 100 μ Lにして、 CHROMA SPIN+TE- 4 00 Columns (Clontech社製）を用いて、低速遠心機（TOMY社製、 LX- 120)で 700 X g、室温で、 5分間遠心分離して、低分子 DNA及び PCRプライマーを除去した。その一 部を分光光度計 (Beckman社製、 DU640)を用いて、 UV 260nmで濃度を測定し、以 下の式を用いて DNA濃度が lng/ μ Lとなるように滅菌水で希釈した。
DNA濃度 ( g/ zz L) = OD X 37 /z gZmL X (希釈倍率) / 1000
260
(5)ドライバー cDNAの調製
ヒト正常肝臓組織由来の cDNAライブラリー（BioChain社製、 cDNA Library: Human Adult Normal Tissue: Liver)を铸型として、挿入断片 cDNAを PCR増幅した。
ヒト正常肝臓組織由来の cDNAライブラリー溶液（BioChain社製、 cDNA Library: Hu man Adult Normal Tissue: Liver) 1 μ L (10ng)を使用した以外は、上記（4)と同じ試 薬を用いた。
各試薬を混合し、その混合液 Lを 0.2mL PCRチューブ 5本に分注した。
次いで、これを 95°C 2分、 95°C 20秒→ 60°C 20秒→ 72°C 2分 30サイクル、 72°C 5 分でサーマルサイクラ一（MJ Research社製、 PTC- 225)にて PCR反応に付した。 得られた PCR増幅産物 (100 μ L)を、 0.6mLマイクロチューブに移して、これに、等量 (1 00 μ L)のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール (25 : 24： 1)混合液（-ッポンジ ーン社製)を加え、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温で、 3分間遠心分離後、水 相（上清）を 0.6mLマイクロチューブに移した。これに、エタ沈メイト（二ツボンジーン社 製） 1 レ 5M NaCl (和光純薬工業社製) 5 μ L及びエタノール (和光純薬工業社製) 2 50 しを加えて、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温、 5分間遠心分離後、上清 を除去し、得られた沈殿物を 70%エタノール (和光純薬工業社製)で洗浄後、乾燥さ せ、 10 Lの滅菌水に溶解した。
得られた PCR増幅産物 5 μ gを滅菌水で全量 43 μ Lに調製し、 10 X H Buffer (二ツボン ジーン社製） 5 レ EcoR I (二ツボンジーン社製、 lOunits/ μ L) l μ L及び Xho I (-ッ ポンジーン社製、 lOunits/ μ ΐ μ Lを加えて、混合し、 37°Cで、 2時間インキュベート して、挿入断片両側のマルチクローユング 'サイトの制限酵素を使用して PCR Primer までを切断した。その後、 65°Cで、 20分間加熱して、制限酵素を失活させた。
次いで、これに 50 μ L滅菌水をカ卩えて混合し、全量を 100 μ Lにして、 CHROMA SPI N+TE-400 Columns (Clontech社製）を用いて、低速遠心機（TOMY社製、 LX- 120) で 700 X g、室温で、 5分間遠心分離して、低分子 DNA及び PCRプライマーを除去した 。その一部を分光光度計 (Beckman社製、 DU640)を用いて、 UV 260nmで濃度を測 定し、以下の式を用いて DNA濃度が lOOng/ Lとなるように滅菌水で希釈した。
DNA濃度 ( g/ zz L) = OD X gZmL X (希釈倍率) / 1000
260
[0095] (6)ハイブリダィゼーシヨン
上記（4)で調製したテスター cDNA 1 μ L(lng)及び上記（5)ドライバー cDNA 2 μ L(20 Ong)含有溶液 3 μ Lに、 1 μ Lの 4 X Hybridization Buffer (2M NaCl含有 200mM HEPE S緩衝液、 pH7.3)をカ卩えて、混合し、これをサーマルサイクラ一（MJ Research社製、 P TC-225)にて 98°Cで 2分間熱変性した後、 68°Cで 15時間、ハイブリダィゼーシヨンし た。
[0096] (7)二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ処理によるハイブリッド形成した二本鎖 cDNAの 除去
68°Cに保温したハイブリダィゼーシヨン溶液に、 68°Cに温めた 5 μ Lの 2 X DSN maste r Buffer (Evrogen社製、 lOmM塩化マグネシウム及び 2mM DTT lOOmM含有トリス塩 酸緩衝液 pH8.0、）を加え、混合した後、 68°Cで 10分間インキュベートした。これに、 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ（Duplex- specific nuclease； Evrogen社製、 1 kunitz- u nits/ μ ϋ) \ β Lを加えて、 68°Cで 30分、インキュベートした。
次いで、これに、 Stop Solution (5mM EDTA水溶液） 10 μ Lを加えて、 68°Cで 5分間ィ ンキュペートして二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼの反応を停止させた。
得られた反応液に、 80 Lの滅菌水及び等量 (100 μ L)のフエノール：クロ口ホルム：ィ ソァミルアルコール混合液 (25： 24： 1)混合液 (二ツボンジーン社製）を加えて、混合し た。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温で、 3分間遠心分離後、水 相（上清）を 0.6mLマイクロチューブに移した。これに、エタ沈メイト（二ツボンジーン社 製） 1 レ 5M NaCl (和光純薬工業社製) 5 μ L及びエタノール (和光純薬工業社製) 2 50 Lを加えて、混合した。高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室 温で、 5分間遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿物を 70%エタノール (和光純 薬工業社製)で洗浄後、乾燥させ、 31 μ Lの滅菌水に溶解した。
[0097] (8)ハイブリッド形成しなかったテスター cDNAの PCR増幅
下記の試薬を混合し、その混合液 Lを 0.2mL PCRチューブ 5本に分注した。
[0098] ·上記（7)で調製した一本鎖テスター cDNA含有反応液： 31 L
•6mM MgCl含有 2 X Amplification Buffer (Fidelity Systems社製） : 50 μ L
2
•dNTPs溶液（各 dNTP 10mM含有、 Amersham社製） : 5 μ L
•M13/pUC Forwad Primer溶液： 5 L
リン酸化プライマー（5'- P- CCAGTCACGACGTTGTAAAACG- 3，）（シグマジエノシス 社製)を 10 Mとなるように滅菌水に溶解したもの。
•M13/pUC Reverse Primer溶液： 5 L
非リン酸化プライマー（5'- CACACAGGAAACAGCTATGACC- 3，）（シグマジエノシス 社製)を 10 Mとなるように滅菌水に溶解したもの。
•TOPOTAQ DNA Polymer as e溶液： 4 L
TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems社製、 3units/ L) 1 Lに 1 X Dilutio n buffer (Fidelity Systems社製） 3 μ Lをカロえて混合して 4 μ Lとしたもの。
[0099] 次いで、これを 95°C 2分、 95°C 20秒→ 60°C 20秒→ 72°C 2分 35サイクル、 72°C 5 分でサーマルサイクラ一（MJ Research社製、 PTC- 225)にて PCR反応に付した。 得られた PCR増幅産物 (100 μ L)を、 0.6mLマイクロチューブに移して、これに、等量 (1 00 μ L)のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール (25 : 24： 1)混合液（-ッポンジ ーン社製)を加え、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温で、 3分間遠心分離後、水 相（上清）を 0.6mLマイクロチューブに移した。これに、エタ沈メイト（二ツボンジーン社 製） 1 レ 5M NaCl (和光純薬工業社製) 5 μ L及びエタノール (和光純薬工業社製) 2 50 しを加えて、混合した。
高速微量遠心機（日立社製、 CF16RX)で 14500rpm、室温、 5分間遠心分離後、上清 を除去し、得られた沈殿物を 70%エタノール (和光純薬工業社製)で洗浄後、乾燥さ せ、 44 Lの滅菌水に溶解した。
[0100] (9) Exonuclease I処理によるハイブリッド形成しなかった一本鎖ドライバー cDNAの除 去
上記（8)で調製した PCR増幅産物（テスター cDNA増幅産物） 44 μ Lに、 10 X Exonucl ease I Buffer (New England Biolabs社製、 67mM塩化マグネシウム及び lOOmM 2-メ ルカプトエタノール含有 670mMグリシン- KOH緩衝液、 pH9.5) 5 μ L及び Exonuclease I (New England Biolabs社製、 20units/ μν> 1 μ Lを加えて、混合し、 37。C、 30分、イン キュペートした。次いで、更に 80°C、 15分インキュベートして Exonuclease Iを失活させ た。
これに、 50 L滅菌水を加えて混合し、全量を 100 μ Lにして、 CHROMA SPIN+TE- 4 00 Columns (Clontech社製）を用いて、低速遠心機（TOMY社製、 LX- 120)で 700 X g、室温で、 5分間遠心分離して、低分子 DNA及び PCRプライマーを除去した。その一 部を分光光度計 (Beckman社製、 DU640)を用いて、 UV 260nmで濃度を測定し、以 下の式を用いて DNA濃度が 10ng/ μ Lとなるように滅菌水で希釈した。
DNA濃度 ( g/ zz L) = OD X gZmL X (希釈倍率) / 1000
260
[0101] ( 10)サブトラクシヨン cDNAの評価検討
上記（4)で得られたテスター cDNA (Hep G2 cDNA)、上記（5)で得られたドライバー c DNA (正常肝臓 cDNA)又は上記（9)で得られたテスター特異的 cDNA (サブトラクシ ヨン cDNA) 10ngを铸型として、高発現ハウスキーピング遺伝子である glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) (増幅鎖長： 859bp)と Hep G2特異的発現遺伝 子である alpha-fetoprotein (AFP) (増幅鎖長： 931bp)をそれぞれ PCR増幅した。
下記の試薬を混合し、その混合液 Lを 0.2mL PCRチューブ分注した。
[0102] · cDAN含有溶液： 1 μ L(10ng/ μ L cDNA含有）
上記 (4)で調製した一本鎖テスター cDNAを DNA濃度が 10ng/ μ Lとなるように滅菌水 で希釈したもの、
上記（5)で調製した二本鎖ドライバー cDNAを DNA濃度が 10ng/ μ Lとなるように滅菌 水で希釈したもの、又は
上記（9)で得られたサブトラクシヨン cDNAを DNA濃度が 10ng/ μ Lとなるように滅菌水 で希釈したもの。
•6mM MgCl含有 2 X Amplification Buffer (Fidelity Systems社製） : 50 μ L •dNTPs溶液（各 dNTP lOmM含有、 Amersham社製） : 5 μ L
•Primerl溶液： 1 L
GAPDH増幅用プライマー 1 (5'- GAGTACGTCGTGGAGTCCACTG- 3，）又は AFP増 幅用プライマー 1 (5'- GTACGGACATTCAGACTGCTG- 3，）を 10 μ Μとなるように滅 菌水に溶解したもの。
•Primer2溶液： 1 L
GAPDH増幅用プライマー 2 (5'- CCTCACAGTTGCCATGTAGAC- 3')又は AFP増幅 用プライマー 2 (5'- CATCCAGGAGAGCCAAGCATTG- 3，）を 10 μ Μとなるように滅菌 水に溶解したもの。
•TOPOTAQ DNA Polymerase溶液： 1 μ L
TOPOTAQ DNA Polymerase (Fidelity Systems社製、 3units/ L) 1 Lに 1 X Dilutio n buffer (Fidelity Systems社製） 3 μ Lをカロえて混合して 4 μ Lとしたもの。
•滅菌水 5 A (し
次いで、これを 95°C 2分、 95°C 20秒→ 60°C 20秒→ 72°C 20秒 22サイクル、 72°C 2分でサーマルサイクラ一（MJ Research社製、 PTC- 225)にて PCR反応に付した。 得られた PCR増幅産物 (20 μ L)10 μ Lを、 1 X TAE Bufferを使用して 1.5 %ァガロース ゲル (二ツボンジーン社製)で電気泳動後、ェチジゥムブロマイド染色により各遺伝子 の増幅量を比較した。
その結果を図 8に示す。尚、図中、レーン 1は (4)で調製したテスター cDNA (ヒト肝 臓癌由来の HepG2細胞の cDNA)を铸型として GAPDH遺伝子を PCR増幅した結果を 、レーン 2は（4)で調製したテスター cDNA (ヒト肝臓癌由来の HepG2細胞の cDNA)を 铸型として AFP遺伝子を PCR増幅した結果を、レーン 3は（5)で調製したドライバー cD NA (ヒト正常肝臓組織由来の cDNA)を铸型として GAPDH遺伝子を PCR増幅した結 果を、レーン 4は（5)で調製したドライバー cDNA (ヒト正常肝臓組織由来の cDNA)を 铸型として AFP遺伝子を PCR増幅した結果を、レーン 5は（9)で得られたテスター特 異的 cDNA (サブトラクシヨン cDNA)を铸型として GAPDH遺伝子を PCR増幅した結果 を、レーン 6は (9)で得られたテスター特異的 cDNA (サブトラクシヨン cDNA)を铸型と して AFP遺伝子を PCR増幅した結果をそれぞれ示し、レーン 7は分子量マーカー： 10 Obp DNA Step Ladder (100- l.5kbp) (和光純薬工業 (株）製）を用いた結果を示す。ま た、「 1500bp」は 1500bpの DNAの泳動位置を、「 1000bp」は lOOObpの DNAの泳動 位置を、「 500bp」は 500bpの DNAの泳動位置を、それぞれ示す。
図 8から明らかなように、高発現ハウスキーピング遺伝子である GAPDHは Hep G2 cD NA及び正常肝臓組織 cDNAの両者とも PCR増幅が確認できた力 サブトラクシヨン c DNAでは確認できないことが判る。一方、 Hep G2特異的発現遺伝子である AFPは正 常肝臓組織 cDNAにおいて、 PCR増幅が確認できないが、サブトラクシヨン cDNAに おいては Hep G2 cDNAと同程度の PCR増幅を示した。
以上のことから、本発明によればテスター特異的 cDNA (サブトラクシヨン cDNA)を容 易に且つ短時間に、高効率に取得し得ることが判る。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程を含む、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存 在量よりも多いポリヌクレオチドを取得する方法；
(ι)(0テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となり得るドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとをノヽイブリダィ ゼーシヨンを行うか、或いは GOテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、ドライバー 由来の二本鎖ポリヌクレオチドとを混合して、熱変性後、ノ、イブリダィゼーシヨンを行う かして、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二本鎖ポリヌクレ ォチドを形成する工程、及び
(2)ハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により除去する工程。
[2] 酵素が、二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼである請求項 1に記載の方法。
[3] 工程（2)力 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いて、二本鎖ポリヌクレオチドを分 解することにより、ハイブリット形成した二本鎖ポリヌクレオチドを除去するものである 請求項 1に記載の方法。
[4] 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼが、海洋性無脊椎動物由来の二本鎖特異的 DNAヌ クレアーゼである請求項 2又は 3に記載の方法。
[5] テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチド力 （1，）テスター由来の二本鎖ポリヌクレオ チドを調製した後、当該二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により一本鎖ポリヌクレオ チドにする工程、により得られたものである請求項 1に記載の方法。
[6] テスター由来のポリヌクレオチド及びドライバー由来のポリヌクレオチド力 DNAである 請求項 1に記載の方法。
[7] テスター由来のポリヌクレオチドに対して過剰量のドライバー由来のポリヌクレオチド を使用する請求項 1に記載の方法。
[8] 以下の工程を含む、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存 在量よりも多いポリヌクレオチドを増幅する方法；
(1)(0テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、当該テスター由来の一本鎖ポリヌク レオチドと相補鎖となり得るドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとを混合してハイ ブリダィゼーシヨンを行うか、或いは (ii)テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと、ドラ ィバー由来の二本鎖ポリヌクレオチドとを混合して、熱変性後、ハイブリダィゼーショ ンを行うかして、テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと当該テスター由来の一本鎖 ポリヌクレオチドと相補鎖となるドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオチドとの二本鎖ポ リヌクレオチドを形成する工程、
(2)ハイブリッド形成した二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により除去する工程、及 び
(3)ハイブリッド形成しな力つたテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドを増幅するェ 程。
[9] 酵素が、二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼである請求項 8に記載の方法。
[10] 工程（2)力 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを用いて、二本鎖ポリヌクレオチドを分 解することにより、ハイブリット形成した二本鎖ポリヌクレオチドを除去するものである 請求項 8に記載の方法。
[11] 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼが、海洋性無脊椎動物由来の二本鎖特異的 DNAヌ クレアーゼである請求項 9又は 10に記載の方法。
[12] テスター由来の一本鎖ポリヌクレオチド力 （1，）テスター由来の二本鎖ポリヌクレオ チドを調製した後、当該二本鎖ポリヌクレオチドを酵素処理により一本鎖ポリヌクレオ チドにする工程、により得られたものである請求項 8に記載の方法。
[13] テスター由来のポリヌクレオチド及びドライバー由来のポリヌクレオチド力 DNAである 請求項 8に記載の方法。
[14] テスター由来のポリヌクレオチドに対して過剰量のドライバー由来のポリヌクレオチド を使用する請求項 8に記載の方法。
[15] 工程（3)が PCRにより行われるものである請求項 8に記載の方法。
[16] テスター由来のポリヌクレオチド力 その 5'末端及び 3'末端に、工程（3)で行う PCR用 のプライマーが結合する既知の配列が結合されているものである請求項 15に記載の 方法。
[17] ドライバー由来のポリヌクレオチド力 工程（3)で行う PCR用のプライマーが結合する 配列を有さないものである請求項 16に記載の方法。
[18] 工程（3)が（3 ' )ハイブリッド形成しなかったテスター由来の一本鎖ポリヌクレオチドと これの相補鎖とを増幅してテスター由来の二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程である、 請求項請求項 8に記載の方法。
[19] 更に、（4)工程（2)でノヽイブリット形成しな力つたドライバー由来の一本鎖ポリヌクレオ チドを除去する工程、を行う請求項 18に記載の方法。
[20] 工程 (4)が、（4' )酵素処理により一本鎖ポリヌクレオチドを除去するものである、請求 項 19に記載の方法。
[21] 酵素が、一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼである請求項 20に記載の方法。
[22] 請求項 1〜7に記載の方法により得られた、ある試料 (テスター）での存在量が別の試 料 (ドライバー）での存在量よりも多いポリヌクレオチド又は請求項 8〜21に記載の方 法により増幅されたある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー）での存 在量よりも多いポリヌクレオチドを同定することを特徴とするテスターにおける遺伝子 変異を同定する方法。
[23] 請求項 1〜7に記載の方法により得られた、ある試料 (テスター）での存在量が別の試 料 (ドライバー）での存在量よりも多 、ポリヌクレオチド。
[24] 請求項 8〜21に記載の方法により増幅された、ある試料 (テスター）での存在量が別 の試料 (ドライバー）での存在量よりも多 、ポリヌクレオチド。
[25] 二本鎖特異的 DNAヌクレアーゼ及びテスター由来のポリヌクレオチドを一本鎖にする ための酵素を含んでなる、ある試料 (テスター）での存在量が別の試料 (ドライバー） での存在量よりも多いポリヌクレオチドを取得又は増幅するためのキット。
[26] テスター由来のポリヌクレオチドを一本鎖にするための酵素がラムダ ·ェキソヌクレア ーゼである請求項 25に記載のキット。
[27] 更に、一本鎖特異的 DNAヌクレアーゼを含んでなる請求項 25に記載のキット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009000044A (ja) * 2007-06-21 2009-01-08 Hitachi High-Technologies Corp 核酸増幅法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8623603B2 (en) 2010-03-08 2014-01-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Full cold-PCR enrichment with reference blocking sequence
EP2691541B1 (en) 2011-03-31 2017-10-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for enriching in single-stranded mutant sequences from mixture of wild-type and mutant sequences
US11725230B2 (en) 2015-06-24 2023-08-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Selective degradation of wild-type DNA and enrichment of mutant alleles using nuclease
EP3347465B1 (en) * 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US10584363B2 (en) * 2016-06-03 2020-03-10 Takara Bio Usa, Inc. Methods of producing and using single-stranded deoxyribonucleic acids and compositions for use in practicing the same
CA3046953A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048378A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 Euregen Llc Methods and compositions for selectively cleaving dna containing duplex acids in a complex nucleic acid mixture
WO2003102243A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Methods for improving rna transcription reactions
JP2005218385A (ja) * 2004-02-06 2005-08-18 Dnaform:Kk １本鎖ｄｎａを調製するための方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100355111B1 (ko) 1993-10-27 2003-03-03 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 발췌제거cDNA라이브러리제조법및제조된라이브러리의용도
US5525471A (en) * 1994-10-12 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enzymatic degrading subtraction hybridization
US5958738A (en) * 1997-03-24 1999-09-28 Roche Diagnostics Corporation Procedure for subtractive hybridization and difference analysis
JP3459977B2 (ja) 2000-03-24 2003-10-27 独立行政法人農業技術研究機構 新規なｃＤＮＡサブトラクション法
US6455255B1 (en) * 2000-08-02 2002-09-24 Abbott Laboratories Method of performing subtractive hybridization using RDA
JP4915492B2 (ja) 2000-08-25 2012-04-11 独立行政法人理化学研究所 ノーマライズ／サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの作成方法
EP1197552B1 (en) 2000-08-25 2006-11-08 Riken Method of preparing normalized and/or subtracted cDNA

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048378A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 Euregen Llc Methods and compositions for selectively cleaving dna containing duplex acids in a complex nucleic acid mixture
WO2003102243A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Methods for improving rna transcription reactions
JP2005218385A (ja) * 2004-02-06 2005-08-18 Dnaform:Kk １本鎖ｄｎａを調製するための方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COCHE T. ET AL.: "Reducing bias in cDNA sequence representation by molecular selection", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 22, no. 21, 1994, pages 4545 - 4546, XP003004511 *
HAYASHIDA Y., TECHNICAL REPORT: "Shinki no Hoho ni yoru Kokoritsu cDNA Subtraction", WAKO JUNYAKU JIHO, vol. 73, no. 3, 15 July 2005 (2005-07-15), pages 5 - 7, XP003004507 *
HAYASHIDA Y.: "Nihonsa Tokuiteki DNA Bunkai Koso o Mochiita cDNA Substraction-ho ni yoru Tokuiteki Hatsugen Idenshi no Kaiseki", 28TH ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SCIENTY OF JAPAN, 25 November 2005 (2005-11-25), pages 758, 3P-1162, XP003004508 *
HIGUCHI R.G. ET AL.: "Production of single-stranded DNA templates by exonuclease digestion following the polymerase chain reaction", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 17, no. 14, 1989, pages 5865, XP000226748 *
MOLL P.R. ET AL.: "Identification of vitamin D target genes in human keratinocytes by subtractive screening", J. STEROID BIOCHEM. MOL. BIOL., vol. 89-90, no. 1-5, 2004, pages 261 - 267, XP003004510 *
See also references of EP1854882A4 *
ZHULLDOV P.A. ET AL.: "Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 32, no. 3, 2004, pages E37, XP003004509 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009000044A (ja) * 2007-06-21 2009-01-08 Hitachi High-Technologies Corp 核酸増幅法

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