CN113075399B - 抗单链dna抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗单链DNA抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用。通过人自免抗原芯片筛选先天性巨结肠患儿的血浆，得到先天性巨结肠患儿血浆高表达的抗单链DNA(ssDNA)抗体。并在独立的样品中用酶联免疫(ELISA)的方法验证了抗单链DNA(ssDNA)抗体的有效性。该抗单链DNA(ssDNA)抗体能有效诊断先天性巨结肠患儿，AUC为0.9167；最佳界限对应灵敏性为74.63％，特异性为96.88％。抗单链DNA(ssDNA)抗体可以作为先天性巨结肠血浆诊断标记物，用于疾病的筛查和诊断，填补了先天性巨结肠血浆诊断的空白。

Description

抗单链DNA抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗单链DNA抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用。

背景技术

先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是一种儿童肠神经发育异常的出生缺陷疾病，病理机制为肠神经嵴细胞迁移和分化成肠神经元发生障碍，导致肠神经缺乏而发生持续性痉挛，是小儿常见的先天性肠道疾病之一。先天性巨结肠的早期表现为呕吐、腹胀、腹泻等，临床上会造成新生儿死亡或手术后反复肠炎、难治性便秘等并发症，严重影响患儿的生长发育和生活质量。

先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。该疾病确诊需要术后病变组织的病理切片。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。目前，钡灌肠为最重要的诊断方法，原理为先天性巨结肠患儿的肠道存在无神经节段的狭窄、近端的扩张，钡灌肠后可见扩张和狭窄段而诊断为巨结肠。但该方法只能诊断出有典型肠道形态改变的患儿，灵敏度需要提高，诊断的准确度80％左右。直肠活检是直接取直肠组织，检测是否有神经节细胞的缺失，准确率高，但取样部位对结果有影响。该方法为介入有创型，且价格非常高，一般情况下该方法应用于钡灌肠不明显，或不适用的患儿，比如当患儿有坏死性小肠结肠炎(NEC)这种可能的时候，钡灌肠会导致肠穿孔，这种时候不适合用钡灌肠去诊断，才考虑用直肠活检。直肠测压是通过检测肛门内括约肌的松弛缺乏判定肠神经的支配异常，仅为辅助诊断方法，假阳性和假阴性都较多，不能用于单独检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种先天性巨结肠诊断标记物抗单链DNA(ssDNA)抗体及其应用，为先天性巨结肠的诊断提供了一种新的、准确、灵敏的检测途径。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂、试剂盒或试纸条中的应用，所述检测剂包括抗单链DNA抗体的定量检测剂。

可选的，如上所述的应用，所述抗单链DNA抗体为抗单链DNA IgG抗体。

可选的，如上所述的应用，所述检测剂还包括抗NMDAR抗体的定量检测剂。

可选的，如上所述的应用，所述抗NMDAR抗体为抗NMDAR IgG抗体。

可选的，如上所述的应用，所述检测剂用于执行如下任一方法：

放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。

可选的，如上所述的应用，所述检测剂为抗原，所述抗原包括ssDNA以及任选的NMDAR蛋白。

可选的，如上所述的应用，所述抗原缀合于固相支持物上。

可选的，如上所述的应用，所述固相支持物选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔和微球。

可选的，如上所述的应用，所述检测剂还包括抗人Ig抗体。

可选的，如上所述的应用，所述抗人Ig抗体为抗人IgG抗体。

可选的，如上所述的应用，所述抗人Ig抗体缀合有信号物质。

可选的，如上所述的应用，所述检测剂所检测的待检样本为血液、血浆、血清、组织、细胞、组织或细胞裂解物样品中至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现ssDNA在儿童先天性疾病诊断中具有操作简单、无介入、通量高、成本低的优势，克服了现有技术中无血浆诊断的缺点。且本方法诊断的灵敏度和特异性较好，AUC为0.9167；最佳界限对应灵敏性为74.63％，特异性为96.88％，为临床上诊断先天性巨结肠疾病提供了有效的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中人自免抗原芯片筛选先天性巨结肠患儿血浆中的诊断标记物；

图2为本发明一个实施例中酶联免疫(ELISA)检测抗单链DNA(ssDNA)抗体在先天性巨结肠患儿及其它对照组中的水平；

图3为本发明一个实施例中ROC曲线分析抗单链DNA(ssDNA)抗体在先天性巨结肠中的诊断价值；

图4为本发明一个实施例中人神经免疫芯片筛选先天性巨结肠患儿血浆中的诊断标记物；

图5为本发明一个实施例中先天性巨结肠病变组织中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体检测；

图6为本发明一个实施例中酶联免疫(ELISA)检测抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体在先天性巨结肠患儿及其它对照组中的水平；

图7为本发明一个实施例中ROC曲线分析抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体在先天性巨结肠中的诊断价值；

图8为本发明一个实施例中用逻辑回归联合NMDAR和ssDNA自身抗体，检测检测先天性巨结肠，ROC曲线分析。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂、试剂盒或试纸条中的应用；所述检测剂包括抗单链DNA抗体的定量检测剂。

本发明证明了抗单链DNA(ssDNA)抗体可以用于先天性巨结肠的诊断标志物，填补了先天性巨结肠血浆诊断领域的空白。该技术在儿童先天性疾病诊断中具有操作简单、无介入、通量高、成本低的优势，克服了现有技术中无血浆诊断的缺点。且本方法诊断的灵敏度和特异性较好，AUC为0.9167；最佳界限对应灵敏性为74.63％，特异性为96.88％，为临床上诊断先天性巨结肠疾病提供了有效的方法。

本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。

在一些实施方式中，所述抗单链DNA抗体为抗单链DNA IgG抗体。

在一些实施方式中，所述检测剂还包括抗NMDAR抗体的定量检测剂。

本发明公开的两种自身抗体的组合作为先天性巨结肠的联合诊断标记物及其应用的技术方案，进一步提高了血浆诊断先天性巨结肠方法的灵敏性和特异性，AUC为0.9351；最佳界限对应灵敏性为82.05％，特异性为93.75％，诊断效果显著优于单个指标检测的效果，为临床上诊断先天性巨结肠疾病提供了更为可靠的方法。

在一些实施方式中，所述抗NMDAR抗体为抗NMDAR IgG抗体。

在本发明涉及的判定方法中，对于针对单链DNA的自身抗体以及任选的抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体的表达分析法不作特别限定。例如，不限于测定血液样品中这些自身抗体的绝对量或浓度，也可以测定相对的量或浓度。更具体地说，例如可以测定上述自身抗体等在血液样品中的量、浓度或活性。这些方法在本领域是公知的，作为示例，在一些实施方式中，所述检测剂用于执行如下任一方法：

放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。

作为上述检出方法，所述生物质谱法可以举出例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MASS)、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MASS)等飞行时间质谱(TOF-MASS)。由TOF-MASS图，通过分子量峰、其它的片段峰、它们的强度等，可以掌握自身抗体的浓度或量。此外，与ELISA的情况同样地，也可以使用具有标记基团且可以与各自身抗体结合的二次抗体来检出与蛋白质芯片选择性地结合的自身抗体。

在这些方法中，作为用于进行上述表达分析的方法，优选免疫测定法。免疫测定法的灵敏度和精度高，即使血中的自身抗体浓度稍微变化也可以检出。通过酶联免疫吸附法(ELISA)进行本发明涉及的自身抗体的表达分析时，可以合适地使用本发明涉及的先天性巨结肠的诊断用试剂盒。

在一些实施方式中，所述检测剂为抗原，所述抗原包括ssDNA以及任选的NMDAR蛋白。

包含被自身抗体识别的表位的自身抗原片段的长度可至少为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750或1000个核苷酸。该片段也可为5、10、15、20、25、50、75、100、150、200或250和比ssDNA全长少一个核苷酸之间。

包含被自身抗体识别的表位的自身抗原片段的长度可至少为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750或1000个氨基酸。该片段也可为5、10、15、20、25、50、75、100、150、200或250和比自身抗原全长少一个氨基酸之间。通常，提前表征这些表位使得已知给定自身抗原的自身抗体识别该表位。表位作图的方法为本领域熟知。“表位”为抗原例如本文公开的自身抗原上被自身抗体识别的位点。显然，所述检测剂还可以为NMDAR蛋白的片段肽、变性物、修饰物中的至少一种肽。NMDAR蛋白的变性物指的是通过实施加热、冷冻、紫外线等物理性处理或应用表面活性剂、变性剂等化学性处理而得到的、可以与上述自身抗体特异性地结合的变性物。例如，可以举出通过SDS、DTT处理而得到的变性物。修饰物指的是对1个以上氨基酸进行修饰而得到的、可以与上述自身抗体特异性地结合的修饰物。例如，可以举出用戊二醛处理而得到的修饰物。上述肽可以具有1个或几个氨基酸残基的突变、置换、缺失和/或添加，只要可以与上述自身抗体特异性地结合。

在一些实施方式中，所述抗原缀合于固相支持物上。

在一些实施方式中，所述固相支持物选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔和微球。

术语“固相支持物”表示载体材料以非液体坚固性为主，从而允许核酸在载体材料上的精确和可追踪的定位。固相支持物可以选用聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质。优选的固相载体为酶标板。其含有的孔位可以为16、32、48、64、96或更多。

在本发明中，术语“微球”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。

微球的表面上具有对于待测定的感兴趣物质(靶标或分析物)的特异性结合特性。

微球优选为磁珠，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。

所述微球的表面修饰有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团包括-OH、-COOH、-NH₂、-CHO、以及-SO₃H中的一种或多种。在一些实施方式中，包被的抗原和抗体通过物理吸附或直接化学缀合(例如通过桥接物进行桥接)与所述微球缀合或结合。具体的，用于构成桥接物的合适技术包括，例如，共价附接、吸附、非共价相互作用或其组合。在一些实施方案中，可以通过戊二醛固定、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学法或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)NHS化学法来实现直接桥接。用于间接桥接的合适方式包括，例如，通过肽、蛋白、抗体、接头或其组合的桥接。在一些实施方案中，至固体支持物的间接桥接是经由链霉抗生物素蛋白和生物素。

在一些实施方式中，所述检测剂还包括抗人Ig抗体。

在一些实施方式中，所述抗人Ig抗体为抗人IgG抗体。

抗人Ig抗体是指针对人Ig蛋白的抗体，抗人IgG抗体是指针对人IgG蛋白的抗体。

在一些实施方式中，所述抗人Ig抗体缀合有信号物质。

在另外一些实施方式中，抗人Ig抗体并未标记信号物质，且所述检测剂还包括标记有信号物质的抗人Ig抗体的第二抗体。用缓冲液等将与单链DNA以及任选的NMDAR蛋白等非特异性地结合的物质等洗涤除去后，使上述二次抗体进行作用。二次抗体和与上述肽等结合的上述自身抗体等结合。上述二次抗体用对应于信号物质的方法检出。

在本发明中，用作定量检测剂的抗体可以是IgA、IgD、IgG、IgE或IgM同种型或单结构域形式，诸如来自骆驼科动物的单结构域抗体。在一些实施方案中，用作定量检测剂的抗体是IgG抗体。

所述缓冲液包含例如下列成分中的一种或多种：磷酸盐缓冲液、NaCl、EDTA、普朗尼克F-127、叠氮化钠、山梨糖醇、巯基修饰的牛血清或其任何组合、变体或等同物。

在本发明中，信号物质能够提供被检测的信号的物质，在一些实施方式中，所述信号物质独立的选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。下面非限定部分列出这些标记：

·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物和染料。

·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。

·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。

·电子致密物质，如放射性分子(如³²P，³⁵S或¹²⁵I)。

在一些实施方式中，所述信号物质为吖啶酯(AE)。

进一步的，吖啶类化学发光物质包括吖啶酯和吖啶磺酰胺。

进一步的，吖啶类化学发光物质包括吖啶酯AE-NHS、吖啶酯DMAE-NHS、吖啶酯Me-DMAE-NHS、吖啶酯NSP-DMAE-NHS、吖啶盐NSP-SA、吖啶盐NSP-SA-NHS、吖啶酰肼NSP-SA-ADH等。

只要包含自身抗体的任何生物样品都可以作为待检测样本，包括，但不限于，血清、血浆、全血、唾液、尿液、精液、汗液、泪液和身体组织。在一些较为优选的实施方式中，所述检测剂所检测的待检样本为血液、血浆、血清、组织、细胞、组织或细胞裂解物样品中至少一种。

本文使用的“组织或细胞裂解物”也可与“裂解物”、“裂解的样品”、“组织或细胞提取物”等用语通用，表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。

作为本发明的诊断用试剂盒，其优选含有正常对照样品、先天性巨结肠对照样品。若试剂盒附带这些样品，则对这些样品进行同样的实验，将其测定值和受检样品的结果进行比较，由此可以更客观地判定受检者的先天性巨结肠的有无。

样品中含有的自身抗体的浓度或量是通过显色强度等间接得到的。可以通过校准曲线等将得到的测定值换算为相对或绝对浓度、量、活性等。

本发明还涉及一种诊断先天性巨结肠的方法，包括对待检样本中的抗单链DNA抗体以及任选的抗NMDAR抗体进行定量检测，其中升高的抗单链DNA抗体水平是先天性巨结肠的指征。

当在本发明实施方案应用的自身抗体的语境下使用的术语“指征”包括本发明实施方案测定其存在或缺失的自身抗体通常存在于患有先天性巨结肠的受试者中。“通常存在”意指该自身抗体经常与先天性巨结肠相关。“经常相关”包括大于50％的可能性，优选大于60％，更优选大于70％，甚至更优选大于80％并特别优选大于90％或95％。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

在本发明方法中，接着由所得到的表达分析结果判定先天性巨结肠发病的有无。即，若先天性巨结肠发病、或其症状越重，则血液中的本发明涉及的自身抗体的浓度或量越高。由此，基于本发明涉及的自身抗体的表达分析结果，若其表达量多则可以判断为阳性，若其表达量少则可以判断为阴性。

实际上，根据先天性巨结肠的定义、严重程度、本发明涉及的自身抗体的表达分析方法，可以改变阳性与阴性的边界，即截断值(cutoff value)。因此，在没有一般基准的阶段，本发明方法的实施者有必要在通过预实验等事先确定表达分析方法和截断值后进行测定。

在一些实施方式中，受试者为18以下的患者，例如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁。或在是婴儿，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月龄的婴儿。

以下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

本发明所采用的样品均来来源于广州市妇女儿童医疗中心，所有实验用组织和血液样本的采集均获得广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会授权和病人同意。

本发明试验结果均采用统计学分析，t检验用来评估两组间的差异，p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用R和Graphpad8.0软件进行。

本发明所述“先天性巨结肠疾病”又称希尔施普龙病，是由于结肠缺乏神经节细胞导致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，近端结肠肥厚、扩张，是小儿常见的先天性肠道疾病之一，其中对于先天性巨结肠疾病而言，按照严重程度递增，临床上可分为短段型，普通型，长段型，全结肠型。短段型病变位于直肠近、中段，距肛管不超过6.5cm；常见型病变位于直肠近端或直肠乙状结肠远端，距肛管约9cm；长段型病变延至乙状结肠或降结肠；全结肠型病变波及全部结肠及回肠末端，距回盲瓣30cm以内。

本发明所述自身抗体是错误地以机体特定组织或器官为靶目标并损伤组织或器官的抗体。

本发明所述ssDNA是指细胞核中的单链DNA；抗单链DNA(ssDNA)抗体是指针对自身细胞核中的单链DNA产生的抗体，优选为IgG抗体。

本发明所述N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是离子型谷氨酸受体的一个亚型，对神经系统发育发挥重要生理作用；抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体是指针对自身的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)蛋白产生的抗体，优选为IgG抗体。

本发明所述“ROC曲线”是1-特异性(假阳性率)和敏感性(真阳性率)变化的曲线，反应了二分类器的诊断能力。一个好的分类器真阳性率与假阳性率的变化比值是大于1的，远离45度直线。

本发明所述“AUC”是指ROC曲线下面积，介于0.1和1之间，用于评价分类器的好坏，越接近1分类器越好。

本发明通过人自免抗原芯片筛选先天性巨结肠患儿的血浆，用其它肠病和健康组患儿血浆做对照，得到先天性巨结肠患儿血浆高表达的抗单链DNA(ssDNA)的自身抗体。并在独立的样品中用酶联免疫(ELISA)的方法对其进行了进一步效果验证。

实施例1.血浆和组织样本采集和分组

血浆样品分为先天性巨结肠患儿组(37例)，其它肠病对照组(18例)，健康儿童组(30例)，年龄介乎3个月到3岁，性别男性3/4为男性，疾病和对照组年龄和性别匹配。所有样品来源于广州市妇女儿童医疗中心，健康儿童组为健康儿童体检后剩余血样。采血方式为抗凝采血，离心分离血浆，冻存样品。结肠组织样品为先天性巨结肠患儿组(36例)，为手术切除的病变组织。其它肠病对照组(包括肛门狭窄和肠狭窄造瘘的结肠组织共11例)。

实施例2.人自免抗原芯片筛选和差异表达的自身抗体分析

先天性巨结肠(HSCR)患儿的血浆5例，健康组(HC)及其它肠病(DC)组患儿血浆各5例，用于人自免抗原芯片的筛选，该芯片由广州易锦生物技术有限公司提供，包含了超过100种自身免疫抗体的lgG检测，原始数据，减去阴性对照以后，用RLM方法进行归一化处理，得到结果用M统计做的组间差异分析，图1显示了差异的自身抗体的聚类分析图，从中可以看到抗单链DNA(ssDNA)在先天性巨结肠患儿血浆中显著高于对照组(p＝0.019)。

实施例3.抗单链DNA(ssDNA)抗体的酶联免疫(ELISA)检测

为了验证抗单链DNA(ssDNA)抗体对先天性巨结肠的诊断效果，我们收集来源于巨结肠病人(37例)、其它肠疾病对照(包括肛门狭窄和肠狭窄造瘘儿童的血浆样品共18例)、健康儿童对照(30例)的血浆，用酶联免疫(ELISA)检测血浆中抗单链DNA(ssDNA)抗体的水平，检测试剂盒为人抗单链DNA(ssDNA)抗体(ssDNA-Ab)酶联免疫(ELISA)试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)。结果如图2显示巨结肠病人的血浆中抗单链DNA(ssDNA)抗体显著高于肠疾病对照组(p<0.01)和健康儿童对照组(p<0.01)，也高于肠疾病与健康儿童合并的对照组(p<0.01)。

实施例4.ROC曲线分析

图3显示ROC曲线用于评价抗单链DNA(ssDNA)抗体对先天性巨结肠的诊断效果。AUC为0.9167；最佳界限对应灵敏性为74.63％，特异性为96.88％。由此可见，抗单链DNA(ssDNA)抗体可以有效诊断先天性巨结肠。

实施例5.人自免抗原芯片筛选和差异表达的自身抗体分析

先天性巨结肠(HSCR)患儿的血浆5例，健康组(HC)及其它肠病(DC)组患儿血浆各5例，用于人神经免疫芯片的筛选，该芯片由广州易锦生物技术有限公司提供，包含了超过100种神经自身免疫抗体的lgG检测，原始数据，减去阴性对照以后，用RLM方法进行归一化处理，得到结果用M统计做的组间差异分析，图4显示了差异的自身抗体的聚类分析图，从中可以看到N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)在先天性巨结肠患儿血浆中显著高于对照组(p<0.05)。

实施例6.先天性巨结肠病变组织中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体检测

N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)为神经组织特异性表达蛋白，该蛋白的自身抗体在脑炎中有报道，但在外周的肠神经系统疾病中没有报道过。为了验证抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体确实来源于巨结肠病人病变段的肠神经组织，收集巨结肠病人病变段的肠道组织(36例)，以及其它肠道疾病结肠组织(包括肛门狭窄和肠狭窄造瘘的结肠组织共11例)，用酶联免疫(ELISA)检测组织中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体的水平，检测试剂盒为人N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抗体酶联免疫(ELISA)试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)。图5所示结果发现，先天性巨结肠病变组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的自身抗体水平显著高于其它肠病的结肠组织，此结果证明先天性巨结肠组织中确实有较高的抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体。

实施例7.抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体的酶联免疫(ELISA)检测

为了验证抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体对先天性巨结肠的诊断效果，我们收集来源于先天性巨结肠病人(37例)、其它肠疾病对照(包括肛门狭窄和肠狭窄造瘘儿童的血浆样品共18例)、健康儿童对照(30例)的血浆，用酶联免疫(ELISA)检测血浆中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体的水平，检测试剂盒为人N-甲基D-天冬氨酸型受体抗体(NMDAR-Ab)酶联免疫(ELISA)试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)。结果如图6显示，先天性巨结肠病人的血浆中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体显著高于肠疾病对照组(p<0.05)和健康儿童对照组(p<0.01)，也高于肠疾病与健康儿童合并的对照组(p<0.01)。

实施例8.ROC曲线分析(NMDAR)

图7显示ROC曲线用于评价抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体对先天性巨结肠的诊断效果。AUC值为0.9046，最佳界限对应灵敏性为93.75％，特异性为81.58％。用于疾病筛选时，灵敏性为100％时，特异性为78.95。由此可见，抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)自身抗体可以有效诊断先天性巨结肠，对先天性巨结肠的筛选，表现出很好的效果。

实施例9.联合ROC曲线分析(NMDAR与ssDNA)

图8显示用逻辑回归的方法评价联合NMDAR和ssDNA指标诊断先天性巨结肠的效果，结果显示NMDAR和ssDNA联合诊断的效果好于两个单独指标。AUC为0.9351；最佳界限对应灵敏性为82.05％，特异性为93.75％。由此可见，NMDAR和ssDNA自身抗体联合可以更好的诊断先天性巨结肠。

综上所述，本发明通过人自免抗原芯片筛选得到先天性巨结肠患儿血浆高表达的抗单链DNA(ssDNA)的自身抗体。并在独立的样品中用酶联免疫(ELISA)的方法验证了抗单链DNA(ssDNA)的自身抗体在巨结肠组(HSCR)显著高于其它疾病和健康对照组，能有效诊断先天性巨结肠患儿，AUC为0.9167；最佳界限对应灵敏性为74.63％，特异性为96.88％。抗单链DNA(ssDNA)抗体可以作为先天性巨结肠血浆诊断标记物，用于疾病的筛查和诊断，填补了先天性巨结肠血液诊断的空白。此外，NMDAR和ssDNA联合诊断的效果好于两个单独指标。AUC为0.9351；最佳界限对应灵敏性为82.05％，特异性为93.75％。NMDAR和ssDNA自身抗体联合可以更好的诊断先天性巨结肠。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂、试剂盒或试纸条中的应用；

所述检测剂包括抗单链DNA抗体的定量检测剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗单链DNA抗体为抗单链DNA IgG抗体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂还包括抗NMDAR抗体的定量检测剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗NMDAR抗体为抗NMDAR IgG抗体。

5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行如下任一方法：

放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述检测剂为抗原，所述抗原包括ssDNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗原包括NMDAR蛋白。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗原缀合于固相支持物上。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相支持物选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔和微球。

10.根据权利要求7~9任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂还包括抗人Ig抗体。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抗人Ig抗体为抗人IgG抗体。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抗人Ig抗体缀合有信号物质。

13.根据权利要求1~4、7~9、11、12任一项所述的应用，所述检测剂所检测的待检样本为血液、血浆、血清、组织、细胞、组织或细胞裂解物样品中至少一种。

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