CN115786491A - Lcn2、fcn1作为标志物在糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学诊断技术领域,具体公开了LCN2、FCN1作为标志物在糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估中的应用。本发明首次发现脂质运载蛋白‑2(LCN2)和纤维胶凝蛋白1(FCN1)的表达水平与糖尿病合并结核病的严重程度成正比,可以间接反映人群是否患有糖尿病合并结核病及病情发展,以便及时诊断和治疗。根据上述两种标志物可以制备一种新的糖尿病合并结核病检测试剂盒,并应用于公共医疗中。使用上述两种标志物能够有效提高糖尿病合并结核病的诊断效率,且灵敏度高,特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域,特别是涉及LCN2、FCN1作为标志物在糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估中的应用。
背景技术
结核病是危害人类健康的主要传染性疾病,据世界卫生组织2021年全球结核病报告,2020年全球约有1000万例结核病患者,20亿人为潜伏性结核感染者。大约16%的结核病患者并发糖尿病,糖尿病合并结核病的双重负担已经成为全球重大公共卫生挑战。
糖尿病患者患结核病的风险是普通人的3倍,结核病治疗失败增加2倍。与单纯结核病患者相比,糖尿病合并结核病患者的治疗转归更差。因此,世界卫生组织已将糖尿病确定为结核病的一个被忽视的、重要的、再出现的危险因素。总体来说,糖尿病能够影响结核病的临床表现和治疗反应,结核病则会造成糖尿病患者血糖控制恶化。两者之间复杂的相互影响对全球终结结核病造成了严峻挑战。
糖尿病合并结核病患者容易延误病情,加重治疗负担。因此,早发现、早治疗是防治糖尿病合并结核病的关键。然而,目前糖尿病合并结核病缺乏高效准确的诊断方法。糖尿合并结核病的现有诊断方式主要是分开进行血糖和结核分枝杆菌诊断,这种诊断方法耗时较长,费用较高,不能满足患者快速诊断和经济需要。
因此,开发可用于高灵敏度和高特异性的早期诊断糖尿病合并结核病的生物标志物和检测方法,研制灵敏、高效的糖尿病合并结核病诊断试剂,对糖尿病合并结核病防治意义重大。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供LCN2、FCN1作为标志物在糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估中的应用,为糖尿病合并结核病的诊断、预后及疗效评估提供一种新的技术手段。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供脂质运载蛋白-2(LCN2)和/或纤维胶凝蛋白1(FCN1)作为生物标志物在制备或筛选用于诊断糖尿病合并结核病和/或用于对糖尿病合并结核病预后及治疗效果进行评估的检测试剂盒中的应用。
进一步,所述糖尿病包括Ⅱ型糖尿病,所述结核病包括肺结核。
进一步,所述检测试剂盒用于定量检测样本中脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
进一步,所述脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平与糖尿病合并结核病的严重程度正相关。
进一步,当脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平下降到正常人群的表达水平,则提示糖尿病合并结核病的治疗效果较好或基本治愈。
进一步,若脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平A1显著高于对照参比值A0,则检测对象发生糖尿病合并结核病的几率大于正常人群,所述对照参比值A0为非糖尿病合并结核病的健康人群或仅患有糖尿病或结核病的患者中的糖尿病合并结核病标志物脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
进一步,若脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平A1水平下降到对照参比值A0,则提示检测对象糖尿病合并结核病的治疗效果较好或基本治愈。
进一步,所述样本选自选自血液样本、血清样本、组织样本、体液样本中的至少一种。
进一步,所述样本来源于哺乳动物;优选地,所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物;更优选地,所述非人哺乳动物优选为除人以外的灵长类动物,如猴、猿。
进一步,所述检测试剂盒用于检测脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的基因、mRNA、cDNA、蛋白或其组合。
进一步,所述检测试剂盒包括:
(a)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体、特异性结合分子;
和/或(b)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片,所述芯片包括核酸芯片和蛋白质芯片。
进一步,所述核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针,所述特异性寡核苷酸探针包括与脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1多核苷酸特异性结合的探针,所述多核苷酸为mRNA或cDNA。
进一步,所述蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体,所述特异性抗体包括与脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体。
进一步,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步,所述检测试剂盒中的检测试剂偶联有或带有可检测标记。
进一步,所述可检测标记选自同位素、荧光团、化学发光基团、酶中的至少一种。
进一步,所述诊断包括早期诊断和辅助性诊断。
进一步,所述检测试剂盒包括:用于扩增脂质运载蛋白-2的引物对、用于扩增纤维胶凝蛋白1的引物对,或其组合。
进一步,所述用于扩增脂质运载蛋白-2的引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,所述用于扩增纤维胶凝蛋白1的引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
进一步,所述检测试剂盒测定样品中脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平的方法选自实时荧光定量PCR、免疫印迹试验、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验中的任意一种。
本发明第二方面提供一种检测试剂盒,所述检测试剂盒通过检测脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平,用于诊断糖尿病合并结核病,和/或,用于对糖尿病合并结核病预后及治疗效果进行评估。
进一步,所述糖尿病包括Ⅱ型糖尿病,所述结核病包括肺结核。
进一步,所述检测试剂盒用于定量检测样本中脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
进一步,所述脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平与糖尿病合并结核病的严重程度正相关。
进一步,当脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平下降到正常人群的表达水平,则提示糖尿病合并结核病的治疗效果较好或基本治愈。
进一步,若脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平A1显著高于对照参比值A0,则检测对象发生糖尿病合并结核病的几率大于正常人群,所述对照参比值A0为非糖尿病合并结核病的健康人群或仅患有糖尿病或结核病的患者中的糖尿病合并结核病标志物脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
进一步,若脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平A1水平下降到对照参比值A0,则提示检测对象糖尿病合并结核病的治疗效果较好或基本治愈。
进一步,所述样本选自选自血液样本、血清样本、组织样本、体液样本中的至少一种。
进一步,所述样本来源于哺乳动物;优选地,所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物;更优选地,所述非人哺乳动物优选为除人以外的灵长类动物,如猴、猿。
进一步,所述检测试剂盒用于检测脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的基因、mRNA、cDNA、蛋白或其组合。
进一步,所述检测试剂盒包括:
(a)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体、特异性结合分子;
和/或(b)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片,所述芯片包括核酸芯片和蛋白质芯片。
进一步,所述核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针,所述特异性寡核苷酸探针包括与脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1多核苷酸特异性结合的探针,所述多核苷酸为mRNA或cDNA。
进一步,所述蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体,所述特异性抗体包括与脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体。
进一步,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步,所述检测试剂盒中的检测试剂偶联有或带有可检测标记。
进一步,所述可检测标记选自同位素、荧光团、化学发光基团、酶中的至少一种。
进一步,所述诊断包括早期诊断和辅助性诊断。
进一步,所述检测试剂盒包括:用于扩增脂质运载蛋白-2的引物对、用于扩增纤维胶凝蛋白1的引物对,或其组合。
进一步,所述用于扩增脂质运载蛋白-2的引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,所述用于扩增纤维胶凝蛋白1的引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
进一步,所述检测试剂盒测定样品中脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平的方法选自实时荧光定量PCR、免疫印迹试验、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验中的任意一种。
如上所述,本发明的LCN2、FCN1作为标志物在糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估中的应用,具有以下有益效果:
本发明基于血清学研究发现了两种糖尿病合并结核病的血清标志基因,根据其转录和蛋白水平,可用于诊断糖尿病合并结核病和/或对糖尿病合并结核病的预后及治疗效果进行评估;本发明发现的两种基因分别是脂质运载蛋白-2(LCN2)和纤维胶凝蛋白1(FCN1),它们的水平与糖尿病合并结核病的严重程度成正比,可以间接反映人群是否患有糖尿病合并结核病及病情发展,以便及时诊断和治疗。同时,本发明通过转录组学和蛋白质组学验证了上述两种标志基因的转录水平和蛋白翻译在糖尿病合并结核病患者中显著增高,且随着病情的加重,水平会更高;反之降低。基于此,本发明提出了将上述两种基因作为这两种基因作为糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估的生物标志物,并根据这两种基因制备一种新的糖尿病合并结核病检测试剂盒,可广泛用于公共医疗中,能够有效提高糖尿病合并结核病的诊断效率,且灵敏度高,特异性强。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中两种标志物LCN2和FCN1在南非糖尿病合并结核病患者和不同对照组中的的转录水平。
图2显示为本发明实施例1中南非患者数据中LCN2和FCN1的ROC曲线图。
图3显示为本发明实施例2中两种标志物LCN2和FCN1在罗马尼亚糖尿病合并结核病患者和不同对照组中的的转录水平。
图4显示为本发明实施例2中罗马尼亚患者数据中LCN2和FCN1的ROC曲线图。
图5显示为本发明实施例3中印度尼西亚糖尿病合并结核病患者在治疗中LCN2和FCN1的转录水平。
图6显示为本发明实施例3中印度尼西亚糖尿病合并结核病患者治疗前和治疗后LCN2和FCN1的ROC曲线图。
图7显示为本发明实施例4中中国糖尿病合并结核病患者在治疗中LCN2和FCN1的转录水平。
图8显示为本发明实施例4中中国糖尿病合并结核病患者治疗前和治疗后LCN2和FCN1的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本申请发明人经过广泛而深入地研究,首次发现两种存在于血液中的糖尿病合并结核病标志物:脂质运载蛋白-2(LCN2)、纤维胶凝蛋白1(FCN1)。LCN2和FCN1在糖尿病合并结核病患者的血液中特异性高表达,因此可用作糖尿病合并结核病诊断(尤其是早期诊断和辅助诊断)的特异性标志物。同时,本申请实施例的实验结果显示,与健康人群、仅患结核病或糖尿病的患者相比,糖尿病合并结核病标志物LCN2和FCN1在糖尿病合并结核病患者中的表达量显著升高,可以作为糖尿病合并结核病诊断、预后及疗效评估的生物标志物。在此基础上完成了本发明。
术语
本文中使用的术语“样本”或“样品”是指与检测者特异地相关联的材料,从其中可以确定、计算或推断出与检测者有关的特定信息。样本可以全部或部分又来自检测者的生物材料构成。
术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生,并且包括由RNA或基因或基因部分嗦编码的的蛋白质的产生,还包括与表达相关的检测物质的出现,如cDNA、结合配体(如抗体)与基因或其他寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包含在“表达”范围内。
属于“参比值”或“对照参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优化的实施方案中,参比值是根据比较糖尿病合并结核病标志物LCN2和FCN1的表达,并与已知临床结果研究进行的统计学分析来确定的。当然,这一比值可根据具体情况来确定。
糖尿病合并结核病标志物LCN2和FCN1
如本文所用,术语“本发明的糖尿病合并结核病标志物”是指选自下列的一种或多种生物标志物:LCN2和FCN1。所述术语包括全场的糖尿病合并结核病标志物LCN2和FCN1及其片段,以及完成的氨基酸序列、其分泌蛋白、突变体,以及其功能上活性的片段。
LCN2(NCBI基因ID:3934),Lipocalin 2,脂质运载蛋白-2,该基因编码一种属于脂质运载蛋白家族的蛋白质。这个家族的成员运输小的疏水分子,如脂类、类固醇激素和类视黄醇。该基因编码的蛋白质是一种中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白,通过螯合含铁铁载体限制细菌生长,在先天免疫中发挥作用。该蛋白被认为参与多种细胞过程,包括维持皮肤稳态,抑制侵袭和转移。缺乏这种基因的小鼠比野生型小鼠更容易受到细菌感染。与LCN2相关的途径包括免疫系统中的细胞因子信号通路和防御素信号通路。
FCN1(NCBI基因ID:2219),Ficolin 1,纤维胶凝蛋白1,该蛋白家族的特征是存在一个前导肽,一个短N-末端片段、一个胶原样区域和一个C-末端纤维蛋白原样结构域。FCN1编码的Ficolin 1主要在外周血白细胞中表达,并被假设为具有弹性结合活性的血浆蛋白。与FCN1相关的途径包括先天免疫系统和补体级联。
在本发明中,术语“糖尿病合并结核病标志物基因”和“糖尿病合并结核病标志物的多核苷酸”以及“糖尿病合并结核病标志物蛋白”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可进行互换。
需要理解的是,当编码相同的氨基酸时,密码子中核苷酸的取代是可接受的;由核苷酸算取代而产生保守的氨基酸取代时,也是可接受的。本发明的蛋白还包括其保守性变异体,如保守性的多肽。
在得到了糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1氨基酸或核苷酸片段的情况下,可根据其序设计特异性探针。核昔酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1核昔酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段、衍生物)的DNA序列。
通过常规的DNA重组技术,可利用本发明的多核昔酸序列来表达或生产重组的糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1。
特异性抗体
在本发明中,术语“本发明抗体”和“抗糖尿病合并结核病标志物的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体,以及能与修饰或未经修饰形式的人糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1的基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的糖人尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1基因产物或具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似,表达糖人尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白或具有抗原性片段的细胞可用免疫动物来生产抗体。
抗人糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测标本(尤其是组织样本或血液样本)中的糖人尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白。由于糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白存在于血液样本中的单个核细胞中,因此其表达量可成为检测对象。
检测方法
基于糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1在血液中的单个核细胞中高表达,本发明还提供了相应的诊断糖尿病合并结核病的方法。本发明涉及定量检测人糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1的蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白水平或mRNA水平,可以用于诊断(包括早期诊断和辅助诊断)是否存在糖尿病合并结核病。
一种优选的方法是对mRNA或cDNA,进行PCR定量检测。
一种优选的方法是对mRNA或cDNA,进行测序定量检测。
一种优选的方法是对糖尿病合并结核病标志物的蛋白进行定量检测。
优选地,一种检测样本中是否存在糖尿病合并结核病蛋白的方法是利用特异性抗体进行检测,它包括:将样本与糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白特异性抗体接触,观察是否形成抗体复合物,形成抗体复合物代表样本中存在糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白。
糖尿病合并结核病标志物蛋白或其多核昔酸可用于糖尿病合并结核病的诊断。本发明的多核昔酸的部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上,用于分析单个核细胞中基因的差异表达分析和基因诊断。抗糖尿病合并结核病的抗体可以固定在蛋白质芯片上,用于检测样本中的糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1蛋白,基于本发明的研究,LCN2和/或FCN1基因的表达量(mRNA水平或蛋白水平)均在糖尿病合并结核病人中存在显著上升。因此,LCN2和/或FCN1可以单独地或组合地用作检测或诊断(尤其是辅助性诊断和/或早期诊断)糖尿病合并结核病的标志物。在检测时,如果标志物基因(即LCN2和/或FCN1)的表达量与正常人群中的相应表达量的比值显著变化,则均可视为患糖尿病合并结核病的风险上升。尤其是综合检测2个标志物的表达量时,可以获得更准确的检测结果。
根据本发明的实验结果,一种优选的诊断糖尿病合并结核病患者的方法是基于转录水平几何平均值。优选地,该方法包括以下判断标准:如果检测对象的PBMCs中LCN2和/或FCN1基因的转录水平几何平均值升高,该检测对象可初步预判为糖尿病合并结核病患者。此外,鉴于糖尿病合并结核病患者在治疗过程中和治疗完成时各标志物基因(LCN2和/或FCN1)的转录水平存在明显的下降趋势,因此,可通过检测所述标志物基因的表达水平来反映或评价糖尿病合并结核病的治疗效果。其中,当各标志物基因(或其组合)的表达水平下降到正常人群的水平,则提示糖尿病合并结核病治疗效果较好或基本治愈。
检测试剂盒
基于糖尿病合并结核病标志物与糖尿病合并结核病的相关性,因此糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1可以作为糖尿病合并结核病的一种诊断标志物。
本发明还提供了一种诊断糖尿病合并结核病的试剂盒,所述试剂盒含有一检测试剂,所述检测试剂用于检测糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1基因、mRNA,cDNA、蛋白、或其组合。
优选地,所述试剂盒含有本发明的抗糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1的抗体或免疫偶联物,或其活性片段;或者含有特异性扩增糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片。
在另一优选例中,所述的试剂盒还包括标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断糖尿病合并结核病和/或评价糖尿病合并结核病的治疗效果。
本发明的主要优点包括:
(a)LCN2和FCN1是本申请发明人首次发现的糖尿病合并结核病的生物标志物,可应用于包括糖尿病合并结核病的诊断,为更精确和更早期诊断提供参考依据。
(b)糖尿病合并结核病标志物LCN2和FCN1存在于血液中的单个核细胞,因此可以方便地采样并进行检测。
(c)糖尿病合并结核病标志物LCN2和/或FCN1可作为有效评价糖尿病合并结核病治疗效果的生物标志物,还可以作为有效评估糖尿病合并结核病预后效果的生物标志物。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
通用方法
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是将荧光定量技术应用于多聚酶链式反应的实验方法。一种称为SYBR Green I的荧光染料在这个实验中会被使用。在PCR反应体系中,SYBRGreen I特异性地参入DNA双链后会发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因为这种方法使得荧光信号的增加与PCR产物的增加保持同步,也就是说,荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比。所以,检测PCR过程的荧光信号强度便可得知靶序列初始浓度,从而可以达到定量的目的。
实施例1
LCN2和FCN1是糖尿病合并结核病的血清标志物
1.1研究对象
在本实施例中,研究对象为糖尿病合并结核病患者组、仅患糖尿病或结核病组,和健康对照组。
糖尿病合并结核病患者组包括15个经临床诊断为南非糖尿病合并结核病患者,HIV呈阴性,无怀孕或正在服用皮质类固醇,无其他严重疾病。年龄分为27-57岁,平均年龄46岁。7男8女。
糖尿病患者组,33个临床糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5%或空腹血糖≥7mmol/L患者,无其他严重疾病。年龄分为29-64岁,平均年龄49岁。15男18女。
结核病患者组,11个结核分枝杆菌检测阳性和影像学检测患者,无其他严重疾病。年龄分为31-56岁,平均年龄48岁。2男9女。
健康对照组,24个无严重疾病。年龄分为30-70岁,平均年龄42岁。12男12女。
1.2 LCN2和FCN1在静脉血中表达量的检测
对于各研究对象,在诊断时采集静脉血,导入PAXgene血液RNA管(PreAnalytiX),并用于RNA-seq分析,采用polyA尾文库制备方法和单读测序。将测序FASTQ文件与人类基因组进行比对,并按照固定方法进行转录定量、差异基因表达、生物学特性和机器学习。
1.3结果
RNA-seq分析结果显示,LCN2和FCN1基因的表达量在糖尿病合并结核病组显著升高,糖尿病合并结核病组中LCN2和FCN1基因的相对表达量显著高于健康对照组、仅患糖尿病或结核病组(图1A和1B)。
结果表明:与健康对照组和仅患糖尿病或结核病组相比,2个基因的表达量均存在显著差别。LCN2和FCN1基因用于诊断糖尿病合并结核病具有较高的准确性。根据糖尿病合并结核病组、仅患糖尿病或结核病组,和健康对照组血液中LCN2和FCN1基因的相对表达量的几何平均值,使用R语言进行受试者工作特征曲线分析。
受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡,ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标,ROC曲线下面积越大,试验的诊断价值越大。
灵敏度(真阳性率):实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率,灵敏度越大越好,理想灵敏度为100%。
特异性(真阴性率):实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率,特异性越大越好,理想特异度为100%。
ROC曲线如图2A和2B所示。ROC曲线下面积分别为0.803和0.819,这说明根据LCN2和FCN1基因的表达量诊断糖尿病合并结核病患者具有较高的准确性。
实施例2
LCN2和FCN1是糖尿病合并结核病的血清标志物
1.1研究对象
在本实施例中,研究对象为糖尿病合并结核病患者组、仅换糖尿病或结核病组,和健康对照组。
糖尿病合并结核病患者组包括15个经临床诊断为罗马尼亚糖尿病合并结核病患者,HIV呈阴性,无怀孕或正在服用皮质类固醇,无其他严重疾病。年龄分为22-64岁,平均年龄47岁。13男2女。
糖尿病患者组,19个临床糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5%或空腹血糖≥7mmol/L患者,无其他严重疾病。年龄分为38-65岁,平均年龄55岁。14男5女。
结核病患者组,10个结核分枝杆菌检测阳性和影像学检测患者,无其他严重疾病。年龄分为30-64岁,平均年龄43岁。6男4女。
健康对照组,12个无严重疾病。年龄分为38-61岁,平均年龄46岁。10男2女。
1.2 LCN2和FCN1在静脉血中表达量的检测
对于各研究对象,在诊断时采集静脉血,导入PAXgene血液RNA管(PreAnalytiX),并用于RNA-seq分析,采用polyA尾文库制备方法和单读测序。将测序FASTQ文件与人类基因组进行比对,并按照固定方法进行转录定量、差异基因表达、生物学特性和机器学习。
1.3结果
RNA-seq分析结果显示,LCN2和FCN1基因的表达量在糖尿病合并结核病组显著升高,糖尿病合并结核病组中LCN2和FCN1基因的相对表达量显著高于健康对照组、仅患糖尿病或结核病组(图3A和3B)。
结果表明:与健康对照组和仅患糖尿病或结核病组相比,2个基因的表达量均存在显著差别。LCN2和FCN1基因用于诊断糖尿病合并结核病具有较高的准确性。
根据糖尿病合并结核病组、仅患糖尿病或结核病组,和健康对照组血液中LCN2和FCN1基因的相对表达量的几何平均值,使用R语言进行受试者工作特征曲线分析。
ROC曲线如图4A和4B所示。ROC曲线下面积分别为0.645和0.794,这说明根据LCN2和FCN1基因的表达量诊断糖尿病合并结核病患者具有较高的准确性。
实施例3
LCN2和FCN1转录水平在糖尿病合并结核病患者治疗过程中的变化
在本实施例中,研究对象为糖尿病合并结核病患者组全血样本在治疗过程中的LCN2和FCN1蛋白水平变化情况。
小提琴图展示2个基因在糖尿病合并结核病治疗过程中的变化情况,并秩和检验(Wilcoxon rank sum test)计算两时间点的差异。
在本实施例中,测定了29例印度尼西亚糖尿病合并结核病病人在治疗前,治疗中和康复后基因的表达情况。
如图5A和5B中所示,结果表明,对于糖尿病合并结核病患者的LCN2和FCN1基因的转录水平:随着治疗的进行,LCN2和FCN1蛋白水平在糖尿病合并结核病患者中持续下降,且具有显著差异性。
根据糖尿病合并结核病治疗期和治疗后LCN2和FCN1基因的相对表达量的几何平均值,使用R语言进行受试者工作特征曲线分析。
ROC曲线如图6A和6B所示。ROC曲线下面积分别为0.597和0.693,这说明根据LCN2和FCN1基因的表达量诊断糖尿病合并结核病患者具有较高的准确性。
实施例4
LCN2和FCN1蛋白水平在糖尿病合并结核病患者治疗过程中的变化
在本实施例中,研究对象为糖尿病合并结核病患者组全血样本在治疗过程中的LCN2和FCN1蛋白水平变化情况。
小提琴图展示2个基因在糖尿病合并结核病治疗过程中的变化情况,并秩和检验(Wilcoxon rank sum test)计算两时间点的差异。
在本实施例中,测定了4例中国糖尿病合并结核病病人在治疗前,治疗中和康复后基因的表达情况。
如图7A和7B中所示,结果表明,对于糖尿病合并结核病患者的LCN2和FCN1的蛋白水平:随着治疗的进行,LCN2和FCN1蛋白水平在糖尿病合并结核病患者中持续下降,且具有显著差异性。
根据糖尿病合并结核病治疗期和治疗后LCN2和FCN1基因的相对表达量的几何平均值,使用R语言进行受试者工作特征曲线分析。
ROC曲线如图8A和8B所示。ROC曲线下面积均为1.000,这说明根据LCN2和FCN1基因的表达量诊断糖尿病合并结核病患者具有较高的准确性。
实施例5
检测糖尿病合并结核病的试剂盒
制备一款用于检测糖尿病合并结核病的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)容器,以及位于容器内的特异性针对糖尿病合并结核病标志物的引物,其中包括:
用于扩增LCN2的引物对:SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;
用于扩增FCN1的引物对:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
表1
(b)以及标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测糖尿病合并结核病。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1作为生物标志物在制备或筛选用于诊断糖尿病合并结核病和/或用于对糖尿病合并结核病预后及治疗效果进行评估的检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述检测试剂盒用于定量检测样本中脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平与糖尿病合并结核病的严重程度正相关。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述样本选自选自血液样本、血清样本、组织样本、体液样本中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述检测试剂盒包括:
(a)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体、特异性结合分子;
(b)和/或(b)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片,所述芯片包括核酸芯片和蛋白质芯片。
6.一种检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒通过检测脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平,用于诊断糖尿病合并结核病,和/或,用于对糖尿病合并结核病预后及治疗效果进行评估。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒用于定量检测样本中脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的表达水平。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于:所述脂质运载蛋白-2和纤维胶凝蛋白1的表达水平与糖尿病合并结核病的严重程度正相关。
9.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于:所述样本选自选自血液样本、血清样本、组织样本、体液样本中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒包括:
(a)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的特异性抗体、特异性结合分子;
(b)和/或(b)脂质运载蛋白-2和/或纤维胶凝蛋白1的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片,所述芯片包括核酸芯片和蛋白质芯片。
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