CN118109472A - 一种可翻译蛋白的环形rna表达载体及构建方法和表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可翻译蛋白的环形RNA表达载体及构建方法和表达方法。本发明提供了一种环形RNA过表达骨架，包括以下依次连接的结构：上游同源臂序列、上游促环化序列、第一酶切位点、间隔序列、IRES序列、第二酶切位点、下游促环化序列和下游同源臂序列。本发明所述环形RNA过表达骨架可以使表达的环形RNA具备蛋白翻译能力，将需要环化的基因线性序列通过酶切位点重组至装载有表达骨架的真核表达载体中，然后将重组质粒转染至细胞即可使表达的目标环形RNA分子翻译蛋白。本发明构建的环形RNA过表达骨架及表达载体提供了一种表达具有蛋白翻译功能环形RNA的工具。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可翻译蛋白的环形RNA表达载体及构建方法和表达方法。
背景技术
环形RNA(Circular RNA，circRNA)是一类共价闭合的单链环状RNA分子，由前信使RNA(pre-mRNA)经反向剪接形成。目前已证明circRNA具有作为微小RNA(miRNA)海绵调节多种肿瘤组织的发生和转移、转录调节和作为肿瘤的生物标志物等功能。
circRNA不具有5'帽与3'polyA尾结构，所以其通常被认为不具有编码功能。但随着circRNA相关研究的深入，越来越多的证据表明某些circRNA具有蛋白或小肽编码功能，并通过其翻译的功能性产物参与生命活动调节。circRNA的结构特异性导致其不易被核酸外切酶降解，因此其相较于线性RNA更稳定，翻译蛋白的能力更加持久，是替代线性RNA翻译的一种重要手段。circRNA的翻译只能通过非帽依赖式的途径，因此IRES序列及其他辅助序列的优化有利于提高circRNA的翻译水平。而自然条件下具有翻译潜能的circRNA序列中的IRES或m6A序列启动翻译的活性一般较弱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可翻译蛋白的环形RNA表达载体及构建方法和表达方法，在保证circRNA高效环化效率的前提下，进一步提高circRNA的蛋白翻译效率，可应用于后续的疫苗研发与基因治疗。
本发明提供了环形RNA过表达骨架，包括以下依次连接的结构：上游同源臂序列、上游促环化序列、第一酶切位点、间隔序列、IRES序列、第二酶切位点、下游促环化序列和下游同源臂序列；
所述上游促环化序列和下游促环化序列分别选自SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示序列中的一种；
所述间隔序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述第一酶切位点和第二酶切位点分别选自BamH I和Xho I中的一种。
优选的，所述IRES序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述环形RNA过表达骨架的核苷酸序列包括SEQ ID No.5所示的序列。
本发明还提供了一种包含上述环形RNA过表达骨架的重组载体。
优选的，所述重组载体的基础载体包括真核表达载体。
本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：将上述环形RNA过表达骨架以同源重组的方式，连接到基础载体上，得所述重组载体。
优选的，在所述环形RNA过表达骨架的两端分别含有一段同源臂序列，可利用扩增引物进行扩增含有同源臂的环形RNA过表达骨架直接用于同源重组。
优选的，所述基础载体包括pcDNA3.1(+)。
本发明还提供了上述环形RNA过表达骨架或上述重组载体在表达目的基因或环形RNA中的应用。
本发明还提供了利用上述重组载体表达目的基因的方法，包括以下步骤：将目的基因的核苷酸序列分为up和down两段，将片段down重组到第一酶切位点处，然后将片段up重组到第二酶切位点处，得到表达目的基因的重组载体；
利用所述表达目的基因的重组载体转化真核细胞，表达所述目的基因。
有益效果：本发明提供了一种环形RNA过表达骨架，包括以下依次连接的结构：上游同源臂序列、上游促环化序列、第一酶切位点、间隔序列、IRES序列、第二酶切位点、下游促环化序列和下游同源臂序列。本发明所述环形RNA过表达骨架可以使表达的环形RNA具备蛋白翻译能力，将需要环化的基因线性序列通过酶切位点重组至装载有表达骨架的真核表达载体中，然后将重组质粒转染至细胞即可使表达的目标环形RNA分子翻译蛋白。本发明构建的环形RNA过表达骨架及表达载体提供了一种表达具有蛋白翻译功能环形RNA的工具。
附图说明
图1为所述环形RNA过表达骨架的结构示意图；
图2为pc-Scirc-protein的质粒图谱；
图3为环形RNA表达载体插入GFP基因的组成展示图；
图4为环形RNA表达载体插入GFP基因的荧光定量检测结果图；
图5为环形RNA表达载体插入GFP基因的荧光观察结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种环形RNA过表达骨架，包括以下依次连接的结构：上游同源臂序列、上游促环化序列、第一酶切位点、间隔序列、IRES序列、第二酶切位点、下游促环化序列和下游同源臂序列；
所述上游促环化序列和下游促环化序列分别选自SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示序列中的一种；本发明实施例中以SEQ ID No.1(TGAAAACACGGGTTATTCCCCTCCTGGCAGGTATATAGGAGCCCTATCAA AGTCGAGCTAACGGAATGGGGTTTTCTTTCCCTCCTCTTCAG)为上游促环化序列，SEQ ID No.2(GTAAGACTTGCTTTTGTCAGTGGGGTGGCTCCCAGGATGCAGGGTCCCATAGGAGGGGAATAACCCGTGTTTTCA)为下游促环化序列。
所述间隔序列如SEQ ID No.3所示：GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCC CTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA。
本发明所述环形RNA过表达骨架的结构如图1所示，能够使产生的环形RNA具有蛋白翻译功能。本发明所述第一酶切位点和第二酶切位点优选分别选自BamH I和Xho I中的一种，实施例中以BamH I为第一酶切位点，以Xho I为第二酶切位点为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述IRES序列优选如SEQ ID No.4所示：TTAAAACAGCGGATGGGTACCCCACCATCCGACCCACTGGGTGTAGTACTCTGGTACTTCGTACCTTTGTACGCCTGTTCTTCCCATTGTACCCTTCCTGAACTTCCAACCCAAGTAACGTTAGAAGCTCAACATTTAGTACAACAGGAAGCACCACATCCAGTGGTGTTTAGTACAAGCACTTCTGTTTCCCCGGAGCGAGGTATAGGCTGTACCCACTGCCAAAAACCTTTAACCGTTATCCGCCAACCAACTACGTAAAAGCTAGTAGTATTATGTTTTTAACTAGGCGTTCGATCAGGTGGATTTCCCCTCCACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGCCAACCCAGCTTATGCTGGGACGCCTTTTTATAGACATGGTGTGAAGACTCGCATGTGCTTGGTTGTGATTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAACCTTAACCCTGGAGCCTTGTGTCACAAACCAGTGATGATAAGGTCGTAATGAGCAATTCCGGGACGGGACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTATTTTTCTTATTATTGTCTTATGGTCACAGCATATATATAACATATACTGTGATC。
本发明实施例中，所述环形RNA过表达骨架的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.5所示：TAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCTGAAAACACGGGTTATTCCCCTCCTGGCAGGTATATAGGAGCCCTATCAAAGTCGAGCTAACGGAATGGGGTTTTCTTTCCCTCCTCTTCAGGGATCCGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGATTAAAACAGCGGATGGGTACCCCACCATCCGACCCACTGGGTGTAGTACTCTGGTACTTCGTACCTTTGTACGCCTGTTCTTCCCATTGTACCCTTCCTGAACTTCCAACCCAAGTAACGTTAGAAGCTCAACATTTAGTACAACAGGAAGCACCACATCCAGTGGTGTTTAGTACAAGCACTTCTGTTTCCCCGGAGCGAGGTATAGGCTGTACCCACTGCCAAAAACCTTTAACCGTTATCCGCCAACCAACTACGTAAAAGCTAGTAGTATTATGTTTTTAACTAGGCGTTCGATCAGGTGGATTTCCCCTCCACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGCCAACCCAGCTTATGCTGGGACGCCTTTTTATAGACATGGTGTGAAGACTCGCATGTGCTTGGTTGTGATTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAACCTTAACCCTGGAGCCTTGTGTCACAAACCAGTGATGATAAGGTCGTAATGAGCAATTCCGGGACGGGACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTATTTTTCTTATTATTGTCTTATGGTCACAGCATATATATAACATATACTGTGATCCTCGAGGTAAGACTTGCTTTTGTCAGTGGGGTGGCTCCCAGGATGCAGGGTCCCATAGGAGGGGAATAACCCGTGTTTTCATCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCT。在本发明所述SEQ ID No.5所示的序列中，第1-25bp为上游同源臂序列，用于和骨架质粒同源重组，第26-117bp为上游促环化序列，第118-123bp为酶切位点BamH I，第124-224bp为间隔序列，第225-850bp为IRES序列，第851-856bp为酶切位点Xho I，第857-931bp为下游促环化序列，第932-956bp为下游同源臂序列。调整后的新序列长度为956bp。
本发明还提供了一种包含上述环形RNA过表达骨架的重组载体。
本发明所述重组载体的基础载体优选包括真核表达载体，实施例中以pcDNA3.1(+)为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明得全部保护范围。
本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：以上述环形RNA过表达骨架及两端的同源臂序列长度956bp的片段(SEQ ID No.5)为模板，PCR扩增后，回收目的核酸片段，通过同源重组的方式连接到基础载体上，得所述重组载体。
本发明所述扩增引物设计区域为同源臂(下划线)部分，引物核苷酸序列如下：
Frame-F(SEQ ID No.6)：5’TAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTC 3’，Frame-R(SEQ IDNo.7)：5’AGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGA 3’。
本发明优选以合成的SEQ ID No.5为模板，扩增出两端含有同源臂的序列，所述扩增的体系以50μL计，优选包括：2×Max buffer 25μL，dNTP 1μL，上下游引物各2μL(10mM)，合成的骨架序列DNA模板1μL(约100ng)，Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，和余量的灭菌水。本发明所述扩增的反应条件，优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃继续延伸5min，然后4℃保存。
本发明优选将PCR产物割胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化；用第一酶切位点和第二酶切位点的内切酶对真核表达载体进行双酶切后继续用清洁回收试剂盒回收纯化，然后将回收的PCR产物重组至经上述双酶切的真核表达载体中，得到含有环形RNA过表达骨架的重组载体。
本发明还提供了上述环形RNA过表达骨架或上述重组载体在表达目的基因或环形RNA中的应用。
本发明在保证circRNA高效环化效率的前提下，对其蛋白翻译所需的间隔序列与IRES序列进行了优化，以进一步提高circRNA的蛋白翻译效率，以期应用于后续的疫苗研发与基因治疗。
本发明还提供了利用上述重组载体表达目的基因的方法，包括以下步骤：将目的基因的核苷酸序列分为up和down两段，将片段down重组到第一酶切位点处，将片段up重组到第二酶切位点处，得到表达目的基因的重组载体；
利用所述表达目的基因的重组载体转化真核细胞，表达所述目的基因。
本发明优选将目的基因的核苷酸序列分为up和down两段，然后用BamH I酶在环形RNA表达骨架的BamH I位置切开载体，将片段down重组到所述环形RNA表达骨架中；在此基础上继续用Xho I酶在环形RNA表达骨架的Xho I位置切开载体，将片段up重组到上一步环形RNA表达骨架中。本发明对所述目的基因的核苷酸序列进行分段，如本发明实施例中，将720bp的GFP基因分为285bp和435bp的两段。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种可翻译蛋白的环形RNA表达载体及构建方法和表达方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
环形RNA过表达骨架设计
本发明设计环形RNA表达骨架包括上游同源臂序列、上游促环化序列、酶切位点BamH I、间隔序列、IRES序列、酶切位点Xho I、下游促环化序列和下游同源臂序列。该骨架的碱基序列如SEQ ID No.5所示。第1-25bp为上游同源臂序列，用于和骨架质粒同源重组，第26-117bp为上游促环化序列，第118-123bp为酶切位点BamH I，第124-224bp为间隔序列，第225-850bp为IRES序列，第851-856bp为酶切位点Xho I，第857-931bp为下游促环化序列，第932-956bp为下游同源臂序列，骨架组成示意图如图1所示。
实施例2
环状RNA表达骨架序列的获得
化学合成实施例1所述环形RNA过表达骨架的完整的骨架序列。然后以合成的骨架序列DNA为模板，设计骨架序列的上下游扩增引物，PCR扩增后，使用同源重组方法将全长序列连接到质粒载体。
1、设计PCR扩增引物
Frame-F(SEQ ID No.6)和Frame-R(SEQ ID No.7)，扩增片段大小为956bp。
2、PCR扩增环形RNA表达骨架
用高保真酶Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vazyme)和上述引物配制50μLPCR反应体系，2×Maxbuffer25μL，dNTP 1μL，上下游引物各2μL(10mM)，合成的骨架序列DNA模板1μL(约100ng)，/>Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，灭菌水将体积补至50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃继续延伸5min，然后4℃保存。
将PCR产物割胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化；用BamH I与Xho I对真核表达载体pcDNA3.1(+)双酶切后继续用清洁回收试剂盒回收纯化，然后将回收的骨架DNA重组至BamH I/Xho I双酶切的pcDNA3.1(+)载体中得到含有环形RNA过表达框架的新质粒pc-Scirc-protein。其模式图谱参见图2。
实施例3
pc-Scirc-GFP过表达环形RNA
根据GFP基因(SEQ ID No.16：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAG)设计PCR扩增引物，将GFP基因序列分为up(G)和down(FP)两段，其核苷酸序列长度分别为285bp和435bp；然后通过BamH I和Xho I酶切位点将GFP-down和GFP-up序列依次重组到本发明实施例2构建的环形RNA过表达骨架pc-Scirc-protein中构建pc-Scirc-GFP过表达质粒，其骨架组成示意图如图3所示。最后将此载体转染到HEK 293细胞中检测表达效率。
通过SYBR染料法荧光定量PCR检测构建的环形RNA过表达骨架高效过表达目标环形RNA。其具体步骤如下：
1、环形RNA GFP PCR扩增引物设计
使用Primer Premier 5.0设计引物，并分别在正向引物和反向引物5’端添加15bp长度的同源臂序列用于和pcDNA3.1(+)质粒同源重组。引物序列如下：
circGFP-up-F(SEQ ID No.8)：5’ACATATACTGTGATCATGGTGAGCA AGGGCGAGGAG 3’，
circGFP-up-R(SEQ ID No.9)：5’AAAAGCAAGTCTTACCTGGACGTA GCCTTCGGGCAT 3’；
circGFP-down-F(SEQ ID No.10)：5’TTCCCTCCTCTTCAGGAGCGCA CCATCTTCTTCAAG3’，
circGFP-down-R(SEQ ID No.11)5’CACCGAGGCTCCAGCCTACTTGTA CAGCTCGTCCATGC3’。
2、PCR扩增环形RNA GFP序列
用高保真酶Max Super-Fidelity DNAPolymerase和上述引物配制50μLPCR反应体系，2×Max buffer25μL，dNTP 1μL，上下游引物各2μL(10mM)，DNA模板1μL(约100ng)，/>Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，灭菌水将体积补至50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃继续延伸5min，然后4℃保存。PCR产物通过割胶回收后通过酶切位点BamH I和Xho I重组至pc-Scirc-protein载体中，新质粒命名为pc-Scirc-GFP。
3、pc-Scirc-GFP过表达环形RNA的荧光定量PCR检测
将pc-Scirc-protein与pc-Scirc-GFP分别用Biobest转染试剂转染到HEK 293细胞中，质粒转染浓度为1μg/mL，转染24h后用荧光定量PCR检测环形RNA表达情况。
使用Primer Premier 5.0设计用于扩增包含环形RNA GFP接头序列在内的“背对背”引物，引物序列如下：
q-circGFP-F(SEQ ID No.12)：5’CGACCACATGAAGCAGCACGACT 3’，q-circGFP-R(SEQ ID No.13)：5’TCAGCTCGATGCGGTTCACCA3’。
选择GAPDH基因为内参基因，作为荧光定量结果的矫正对照，引物序列如下：
q-GAPDH-F(SEQ ID No.14)5’TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC 3’，
q-GAPDH-R(SEQ ID No.15)5’GGAAGAT GGTGATGGGATTTC 3’。
具体检测方法如下。
(1)提取细胞总RNA。将转染pc-Scirc-protein与pc-Scirc-GFP质粒的HEK 293细胞严格按照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂操作说明提取细胞总RNA。
(2)RNA反转录为cDNA。使用HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)对总RNA进行反转录，反应体系和反应条件为：RNA950 ng，4×gDNA wiperMix 4μL，ddH2O补至16μL，混匀后42℃水浴2min，继续往体系中加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4μL，混匀后50℃15min，85℃5s进行逆转录反应，得到的cDNA保存于-40℃冰箱用于后续的qPCR检测。
(3)荧光定量检测环形RNA GFP。使用AceQ qPCR SYBR GreenMasterMix试剂盒(Vazyme)对上一步得到的cDNA中环形RNA GFP的表达水平进行检测，检测体系如下：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，10μM上、下游引物各0.4μL、cDNA4μL、ddH2O 5.2μL。qPCR程序为95℃预变性1个循环5min；95℃10秒、60℃30秒、95℃15秒，40个循环；60℃30秒、95℃15秒，1个循环。
荧光定量结果如图4所示，转染pc-Scirc-GFP质粒的HEK 293细胞中环形RNA的表达量是转染骨架质粒pc-Scirc-protein HEK 293细胞的5000多倍。
4、pc-Scirc-GFP过表达环形RNA的荧光观察
将pc-Scirc-protein与pc-Scirc-GFP分别用Biobest转染试剂转染到HEK 293细胞中，质粒转染浓度为2μg/mL，转染72h后用荧光显微镜观察环形RNA GFP的蛋白翻译情况。转染pc-Scirc-protein质粒的HEK 293细胞中未观察到荧光信号，但转染pc-Scirc-GFP质粒的HEK 293细胞中可观察到明显的绿色荧光信号。说明本发明构建的环形RNA表达骨架可用于表达具有蛋白翻译能力的环形RNA。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.环形RNA过表达骨架，其特征在于，包括以下依次连接的结构：上游同源臂序列、上游促环化序列、第一酶切位点、间隔序列、IRES序列、第二酶切位点、下游促环化序列和下游同源臂序列；
所述上游促环化序列和下游促环化序列分别选自SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示序列中的一种；
所述间隔序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述环形RNA过表达骨架，其特征在于，所述第一酶切位点和第二酶切位点分别选自BamH I和Xho I中的一种。
3.根据权利要求1所述环形RNA过表达骨架，其特征在于，所述IRES序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述环形RNA过表达骨架，其特征在于，所述环形RNA过表达骨架的核苷酸序列包括SEQ ID No.5所示的序列。
5.一种包含权利要求1～4任一项所述环形RNA过表达骨架的重组载体。
6.根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括真核表达载体。
7.权利要求5或6所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1～4任一项所述环形RNA过表达骨架以同源重组的方式，连接到基础载体上，得所述重组载体。
8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述基础载体包括pcDNA3.1(+)。
9.权利要求1～4任一项所述环形RNA过表达骨架或权利要求5或6所述重组载体在表达目的基因或环形RNA中的应用。
10.利用权利要求5或6所述重组载体表达目的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：将目的基因的核苷酸序列分为up和down两段，将片段down重组到第一酶切位点处，然后将片段up重组到第二酶切位点处，得到表达目的基因的重组载体；
利用所述表达目的基因的重组载体转化真核细胞，表达所述目的基因。
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