CN109652443A - 一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，该干扰载体以pre‑amiR‑OsAGO17159质粒和pHB质粒为原料，经过酶切和酶接处理并转化大肠杆菌感受态后得到。本发明中干扰载体的构建是先根据osa‑miR159a设计引物并以水稻为模板进行扩增；再筛选出特异靶向水稻OsAGO17基因的人工小分子RNA；然后合成相应引物并进行PCR扩增，用筛选出的amiRNA替换pre‑miR159a中成熟miR159a/miR159a*的序列，并转化大肠杆菌感受态，得重组质粒；最后对重组质粒和pHB质粒进行酶切和酶接处理，并转化大肠杆菌感受态，得人工microRNA干扰载体。

Description

一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用。
背景技术
Zeng(2002)和Guo(2005)等研究发现改变microRNA序列的几个核苷酸不会影响microRNA的产生和成熟。这一发现就使得在机体内产生人工合成的microRNA(artificialmicroRNA，amiRNA)这一理论成为现实。目前，amiRNA介导的基因沉默这一策略已被广泛的应用于动植物中。2002年，Zeng等首次成功的将amiRNA技术应用于人类细胞中；随后Parizotto等又将这一技术运用于拟南芥，并证实了amiRNA可以有效的抑制报告基因的表达。随后的研究表明，amiRNA不仅可以沉默报告基因还可以靶向内源基因，目前这一策略已在多种物种中得到验证。另外，无论是表达组成性的还是组织特异性的启动子都可以有效的表达amiRNA，且amiRNA和内源microRNA一样，都能高效的发挥作用。
与常规的RNAi相比，amiRNA策略具有许多优点。RNAi策略中的茎环结构会产生多种不同siRNA，而microRNA的前体一般只产生一种有效的microRNA，这就使得amiRNA策略能够较为精确的预测潜在的脱靶现象；由于amiRNA的长度只有21nt，不易与内源基因发生同源重组，在生物安全方面优于RNAi；据报道，siRNA介导的基因沉默在低温条件下会被打破，Niu等研究发现amiRNA策略即使在低温条件下也能高效的介导基因沉默，这也使得amiRNA介导的基因沉默在稳定性和可靠性方面都得到人们的认可。
发明内容
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，干扰载体包括pre-amiR-OsAGO17159序列，所述pre-amiR-OsAGO17159序列如SEQ ID No:7所示。
本发明中在构建人工microRNA干扰载体时所用到的表达载体为pHB质粒。
本发明中干扰载体的构建方法包括以下步骤：
(1)根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，再以水稻DNA为模板进行PCR扩增，得pre-miR159a片段；所述pre-miR159a-F和pre-miR159a-R引物的序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述pre-miR159a片段的序列如SEQ IDNo:3所示；
(2)设计特异靶向水稻OsAGO17基因的amiRNA，并从中筛选出替代pre-miR159a中miR159a序列后仍能保持pre-miR159a原二级结构的amiRNA，所筛选出的amiRNA为amiR-OsAGO17，其序列如SEQ ID No:4所示；再根据amiR-OsAGO17的序列设计用于检测人工microRNA表达的带生物素标记的探针amiR-OsAGO17*，其序列如SEQ ID No:8所示；
(3)根据pre-miR159a序列和amiR-OsAGO17序列，设计合成带酶切位点的引物pre-amiR-OsAGO17159-F和pre-amiR-OsAGO17159-R，它们的序列分别如SEQ ID No:5和SEQ IDNo:6所示；
(4)利用步骤(3)中的引物，以pre-miR159a质粒为模板进行PCR扩增，再将pre-miR159a中成熟miR159a/miR159a*的序列替换成amiR-OsAGO17/amiR-OsAGO17*的序列，并转化大肠杆菌感受态，得pre-amiR-OsAGO17159的重组质粒，所述pre-amiR-OsAGO17159重组质粒的序列如SEQ ID No:7所示；
(5)对pre-amiR-OsAGO17159质粒和pHB质粒进行酶切和酶接处理，并转化大肠杆菌感受态，得针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体。
本发明的有益效果是：
(1)人工microRNA干扰载体转入水稻体内后能稳定产生成熟的人工microRNA，amiR-OsAGO17。
(2)amiR-OsAGO17能介导精确剪切OsAGO17基因的mRNA，有效导致OsAGO17的基因下调。
附图说明
图1为质粒的PCR扩增结果以及干扰载体的酶切鉴定结果；
图2为OsAGO17基因amiRNA干扰载体的构建意图；
图3为转基因水稻的PCR鉴定结果；
图4为液相杂交检测转基因水稻植株中amiRNA的表达结果；
图5为qRT-PCR定量检测转基因水稻植株中OsAGO17基因mRNA的表达量结果；
图6为Western blot检测转基因水稻植株中OsAGO17蛋白的表达量结果；
图7为利用5’RLM-RACE鉴定amiR-OsAGO17靶基因的剪切位点结果；
图8为转基因水稻与野生型水稻在种子成熟期的比较；
图9为转基因水稻与野生型水稻稻穗的比较(白色箭头表示空壳种子)，Bar＝5cm；
图10为转基因水稻与野生型水稻总谷子的比较；
图11为转基因水稻与野生型水稻结实率的统计结果；
图12为转基因水稻与野生型水稻花药的I2/KI染色结果；
图13为转基因水稻与野生型水稻花粉粒的I2/KI和亚历山大染色，Bar＝200μm；
图14为转基因水稻与野生型水稻花粉粒的I2/KI和亚历山大染色统计结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一：以水稻osa-miR159a前体为骨架的人工miRNA干扰载体的构建根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，所设计的引物序列分别为：
pre-miR159a-F：5’-GTTGTGGACGTTGAGCTCCTTTC-3’(SEQ ID No:1)；
pre-miR159a-R：5’-ACAAAAGATGCAGAGCTCCCTTC-3’(SEQ ID No:2)。
然后以水稻DNA为模板，利用特异性引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，进行PCR扩增，扩增结果如图1A所示，获得一条272bp左右的特异条带，符合预测片段大小，该片段即为pre-miR159a片段。经测序验证结果表明该序列与osa-miR159a完全匹配，测序结果如下，其中下划线为miR159a/miR159a*序列：GTTGTGGACGTTGAGCTCCTTTCGGTCCAAAAAGGGGTGTTGCTGTGGGTCGATTGAGCTGCTGGGTCATGGATCCCGTTAGCCTACTCCATGTTCATCATTCAGCTCGAGATCTGAAAGAAACTACTCCAATTTATACTAATAGTATGTGTGTAGATAGGAAAATGATGGAGTACTCGTTGTTGGGATAGGCTTATGGCTTGCATGCCCCAGGAGCTGCATCAACCCTACATGGACCCTCTTTGGATTGAAGGGAGCTCTGCATCTTTTGT(SEQ ID No:3)。
随后将获得的pre-miR159a片段进行回收，并与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态，最终得到含有miR159a前体pre-miR159a的重组质粒。
利用在线amiRNA设计网站WMD3和RNAfold软件设计特异靶向OsAGO17基因的amiRNA，并筛选出替代miR159a/miR159a*后尽量还能保持pre-miR159a原二级结构的amiRNA，所筛选出的amiRNA与OsAGO17的mRNA从21nt到41nt的21个核苷酸序列完全互补配对，即amiR-OsAGO17，其序列为：5’-TGGTGACGATCGTAGAGCCAG-3’(SEQ ID No4)。
根据选定的amiR-OsAGO17序列和pre-miR159a序列，设计合成带酶切位点(引物中下划线所示)的引物pre-amiR-OsAGO17159-F和pre-amiR-OsAGO17159-R，序列分别为：
pre-amiR-OsAGO17159-F：
5'-GCTCTAGAGTTGTGGACGCTGGCTCTACGATCGTCACCAAAGGGGTGTT GCTGTGG-3'(SEQID No:5)；
pre-amiR-OsAGO17159-R：
5'-CCGAGCTCACAAAAGATGCTGGCTCTACGATCGTCACCAGAGGGTCCAT GTAGG-3'(SEQ IDNo:6)。
以pre-miR159a质粒为模板进行PCR扩增，将pre-miR159a中成熟miR159a的序列替换成amiR-OsAGO17的序列。PCR扩增结果如图1B所示，获得一条与pre-miR159a片段大小相近的特异条带。经胶回收后，连接克隆载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性单克隆进行菌液PCR和测序验证，获得含pre-amiR-OsAGO17159的重组质粒。测序结果如下(下划线所示为amiR-OsAGO17/amiR-OsAGO17*序列；斜体加粗表示酶切位点XbaI和SacI)：
用XbaI和SacI双酶切pre-amiR-OsAGO17159质粒和pHB质粒，分别回收小片段和大片段，再用T4连接酶将大、小片段连接，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性单克隆进行菌液PCR和酶切鉴定后(图1C)，得到pHB-2×35S::pre-amiR-OsAGO17159表达载体，即为OsAGO17基因amiRNA干扰载体，干扰载体的具体构建过程如图2所示。将鉴定正确的重组质粒进行扩增，提取质粒后，转化农杆菌EHA105。用菌液PCR进行农杆菌转化子鉴定，结果表明重组质粒已经成功转入农杆菌中(图1D)，可用于下一步的水稻转化。
实施例二：转基因水稻植株的获得与PCR鉴定
用上述两个成功转有重组质粒的农杆菌分别转化水稻品种中花11号(ZH11)，最终得到T0代的pHB-2×35S::pre-amiR-OsAGO17159转基因水稻植株(A17)。
移栽存活后，提取转基因水稻A17和野生型水稻ZH11的基因组DNA，以此为模板，用抗性基因Hyg特异引物进行PCR鉴定，结果如图3所示，图中P为质粒-阳性对照组，M为DL5000marker，WT为野生型水稻ZH11，1～10为转基因水稻。图3表明pHB-2×35S::pre-amiR-OsAGO17159表达载体已成功整合到水稻的基因组DNA中。
收取PCR鉴定为阳性的转基因水稻植株种子，用50mg/L的潮霉素连续进行2次纯合子筛选，最终鉴定获得了T3代转基因水稻纯合子植株，作为以后实验材料。
实施例三：液相杂交检测转基因水稻中amiRNA的表达
根据amiR-OsAGO17序列设计合成带生物素标记的探针amiR-OsAGO17*，利用液相杂交技术检测转基因水稻A17中amiRNA的表达情况，所用探针序列为：5’(Biotin)-ACCTGGCTCTACGATCGTCACCA-3’(SEQ IDNo:8)。具体方法如下：
(1)用Trizol试剂盒提取水稻三核花粉总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，取5μg总RNA在200μl无Rnase的EP管中，加入1pmol探针amiR-OsAGO17159*和2.5μl 10×杂交缓冲液，用DEPC处理水补足25μl。
(2)混匀后，95℃变性5min，然后42℃杂交1h；之后加入2μl Exonuclease1，37℃孵育30min，以消化未杂上的单链。
(3)将杂交产物用15％非变性PAGE胶进行电泳分离，90～110V，1～2h。
(4)根据胶的大小，裁剪6张同等大小的滤纸片和1张正电荷尼龙膜，并将它们浸润在核酸转膜缓冲液中；从下到上以3层滤纸、胶、尼龙膜、3层滤纸的顺序摆放后按照转膜仪操作说明进行转膜1h。
(5)转膜完成后，取出，将对着胶的一面朝上放在浸有核酸转膜缓冲液滤纸上，在紫外交联仪下交联9min。
(6)将膜取出，对着胶的一面朝上，放入干净培养皿中，加入适量封闭液，37℃封闭1h，之后去封闭液，用核酸洗膜缓冲液润洗10min。
(7)去核酸洗膜缓冲液，加入一定比例稀释(1:5000)的抗体，20～37℃孵育1h，之后去抗体，用核酸洗膜缓冲液润洗3次，每次10min。
(8)将膜放入检测缓冲液中3min，然后将膜置于保鲜膜上，核酸面朝上，加配制好的CDP Star到膜上，使整个膜浸润后，盖上保鲜膜，用ChemiDoc成像检测。
随机选取3株T3代转基因水稻A17和1株野生型水稻ZH11提取其总RNA，将其与探针amiR-OsAGO17*和杂交缓冲液混合先进行液相杂交，之后用非变性PAGE胶进行电泳分离，再转膜进行固相检测杂交信号，结果如图4所示，检测的3株转基因水稻A17均有杂交信号，而野生型水稻ZH11没有杂交信号，这表明A17中都能产生一定量的amiR-OsAGO17，野生型水稻ZH11不能产生，从而说明构建的pre-amiR-OsAGO17159能够被识别并产生成熟的amiRNA。
实施例四：转基因水稻中OsAGO17基因的表达分析
为了鉴定OsAGO17基因在转基因水稻植株中的表达情况，提取T3代转基因水稻A17和野生型水稻ZH11的三核花粉，利用qRT-PCR和Western blot技术对其在转录水平和翻译水平进行检测。首先，在转录水平，qRT-PCR检测结果显示OsAGO17基因表达量在转基因水稻A17中明显下降，且不到野生型水稻ZH11的50％，结果如图5所示。
Western blot检测，同时以α-Tubulin为内参，检测结果如图6所示，OsAGO17蛋白含量在两个转基因水稻A17样品中均显著下降，最低只有野生型水稻ZH11的0.36倍。
综上结果表明成功通过将pHB-2×35S::pre-amiR-OsAGO17159转入水稻后表达产生了一定量的成熟amiR-OsAGO17，降低了OsAGO17基因的mRNA和蛋白表达量。
实施例五：转基因水稻中amiR-OsAGO17靶基因剪切位点的验证
为了进一步证明转基因水稻A17中OsAGO17基因的表达量下降是由amiR-OsAGO17介导剪切OsAGO17基因mRNA的结果，根据OsAGO17的mRNA序列，在amiR-OsAGO17靶序列下游分别设计两个特异引物5'RACE-ago17-Outer(5’-TCAAATGGCAATGGACCAGATGTG-3’)和5'RACE-ago17-Inner(5’-GCACGATTGATTCCAACCTCAGGAGTGACACATACAT-3’)，然后，按照RLM-RACE Kit方法，提取转基因水稻和野生型水稻三核花粉的总RNA，进行5’RLM-RACE。具体方法如下：
(1)将提取的三核花粉总RNA用CIP进行5’端去磷酸化处理，反应体系如下：
混匀，短暂离心后，37℃反应1h；
(2)终止CIP反应，用苯酚和氯仿进行萃取，加入：
震荡后，室温最大速度离心5min，取上清放于新管；然后加入150μl氯仿，震荡离心5min，取上清放于新管；
(3)异丙醇沉淀RNA，加入150μl预冷的异丙醇，放冰上10min；4℃离心20min，加入500μl 70％乙醇；离心去上清，室温干燥；加入10μl Nuclease-free Water溶解。
(4)将上一步的RNA用TAP处理，反应体系如下：
轻轻混匀，37℃处理1h；
(5)5’RACE Adapter连接，反应体系如下：
将混合物轻轻混匀，在37℃处理1h，将混合物储存于-20℃或用于反转录。
(6)反转录，反应体系如下：
将混合物轻轻摇匀，在42℃反应1h，产物储存于-20℃或用于PCR；
(7)将获得的cDNA进行巢式PCR：
首先，Outer 5’RLM-RACE PCR，反应体系如下：
PCR程序：
其次，进行Inner 5’RLM-RACE PCR，反应体系如下：
PCR程序同上；
(8)将上一步获得的PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到预期大小特异条带后，胶回收片段，连接克隆载体，转化大肠杆菌后，选取阳性克隆送出测序。
实验结果表明5’RACE-PCR在转基因水稻A17中能扩增出了一条约217bp的条带，而在野生型水稻ZH11中没有，如图7所示，图中下方箭头指示的是amiR-OsAGO17对OsAGO17基因mRNA的剪切位点。经胶回收这条特异条带，连接克隆载体，转化大肠杆菌后挑选6个阳性克隆进行测序。测序结果表明6个克隆的剪切位点均发生在amiR-OsAGO17的第10位和第11位之间(图7)。因此，这表明amiR-OsAGO17能对OsAGO17基因进行精确剪切，从而证明了转基因水稻A17中OsAGO17的下调是由amiR-OsAGO17介导剪切产生的。
实施例六：转基因水稻植株的表型分析
针对鉴定好的T3代转基因水稻A17，进行表型观察，结果发现转基因水稻A17与野生型水稻ZH11相比，在水稻营养生长时期和株型上没有明显差异，但在种子成熟时期，转基因水稻A17的稻穗大多数笔直，少数轻微弯曲，如图8所示。收割稻穗后，发现转基因水稻植株A17中的稻穗中有大量的空瘪种子，如图9所示。将每株水稻稻穗上的饱满种子和空瘪种子分别摘下，发现它们的种子总数差异不大，但是转基因水稻A17中空瘪种子数量远远大于野生型水稻ZH11，说明转基因水稻A17的结实率显著小于和野生型水稻ZH11，如图10所示。通过统计分析发现转基因水稻A17的结实率不到40％，而野生型水稻ZH11均能达到90％以上，如图11所示。取成熟花粉时期的颖花进行观察，发现其颖花结构未见异常，但是转基因水稻A17的花药大小要比野生型水稻ZH11的略小，颜色也不如野生型水稻ZH11黄。然后通过对该时期的花药进行I2/KI染色，结果发现转基因水稻A17花药中有将近一半的花粉不能被染色，但野生型水稻ZH11花药中绝大多数可以被染色，如图12所示，这可能是因为转基因水稻A17花药有近一半的花粉是败育的。为进一步确定花粉的育性情况，用I2/KI和亚历山大染液对花粉进行染色分析，结果发现转基因水稻A17花粉中有近一半不能被I2/KI染色，然而野生型水稻ZH11基本上都能染上，这与花药的染色结果相一致；同样，用亚历山大染色发现转基因水稻A17花粉只有不到一半可以被紫红色，其他为蓝色，而野生型水稻ZH11中的花粉基本上都能染成紫红色，如图13所示。通过统计学分析发现转基因水稻A17中只有56.21％可以被I2/KI染色，39.61％可以被亚历山大染色，而而野生型水稻ZH11能达90％以上，如图14所示，这表明转基因水稻植株A17的花粉有近一半是无活性的败育花粉，表现为半不育，而野生型水稻ZH11的花粉基本正常。
以上结果表明OsAGO17基因的下调显著影响了水稻花粉的育性，导致了花粉败育，结实率也显著降低，表现为水稻半不育性，而OsAGO17基因的上调则没有影响。
虽然结合实施例及附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgtggacg ttgagctcct ttc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaaagatg cagagctccc ttc 23
<210> 3
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgtggacg ttgagctcct ttcggtccaa aaaggggtgt tgctgtgggt cgattgagct 60
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aaactactcc aatttatact aatagtatgt gtgtagatag gaaaatgatg gagtactcgt 180
tgttgggata ggcttatggc ttgcatgccc caggagctgc atcaacccta catggaccct 240
ctttggattg aagggagctc tgcatctttt gt 272
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<400> 5
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<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgagctcac aaaagatgct ggctctacga tcgtcaccag agggtccatg tagg 54
<210> 7
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctctagagt tgtggacgct ggctctacga tcgtcaccaa aggggtgttg ctgtgggtcg 60
attgagctgc tgggtcatgg atcccgttag cctactccat gttcatcatt cagctcgaga 120
tctgaaagaa actactccaa tttatactaa tagtatgtgt gtagatagga aaatgatgga 180
gtactcgttg ttgggatagg cttatggctt gcatgcccca ggagctgcat caaccctaca 240
tggaccctct ggtgacgatc gtagagccag catcttttgt gagctcgg 288
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctggctct acgatcgtca cca 23

Claims (4)

1.一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，其特征在于：所述干扰载体包括pre-amiR-OsAGO17159序列，所述pre-amiR-OsAGO17159序列如SEQ ID No:7所示。
2.如权利要求1所述的人工microRNA干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，再以水稻DNA为模板进行PCR扩增，得pre-miR159a片段；所述pre-miR159a-F和pre-miR159a-R引物的序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述pre-miR159a片段的序列如SEQ ID No:3所示；
(2)针对水稻OsAGO17基因筛选特异性的amiRNA，并从中筛选出替代pre-miR159a中miR159a序列后仍能保持pre-miR159a原二级结构的amiRNA，所筛选出的amiRNA为amiR-OsAGO17，其序列如SEQ ID No:4所示；再根据amiR-OsAGO17的序列设计用于检测人工microRNA表达的带生物素标记的探针amiR-OsAGO17*，其序列如SEQ ID No:8所示；
(3)根据pre-miR159a序列和amiR-OsAGO17序列，设计合成带酶切位点的引物pre-amiR-OsAGO17159-F和pre-amiR-OsAGO17159-R，它们的序列分别如SEQ ID No:5和SEQ IDNo:6所示；
(4)利用步骤(3)中的引物，以pre-miR159a质粒为模板进行PCR扩增，再将pre-miR159a中成熟miR159a/miR159a*的序列替换成amiR-OsAGO17/amiR-OsAGO17*的序列，并转化大肠杆菌感受态，得pre-amiR-OsAGO17159的重组质粒，所述pre-amiR-OsAGO17159重组质粒的序列如SEQ ID No:7所示；
(5)利用双酶切方法将pre-amiR-OsAGO17159重组质粒剪切，并用连接酶连接到表达载体上，再转化大肠杆菌感受态，构建得到针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体。和pHB质粒进行酶切和酶接处理，并转化大肠杆菌感受态，得针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所用表达载体为pHB质粒。
4.权利要求1所述的人工microRNA干扰载体在水稻OsAGO17基因沉默方面的应用。
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