CN115947826A - 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 - Google Patents
一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115947826A CN115947826A CN202211145739.2A CN202211145739A CN115947826A CN 115947826 A CN115947826 A CN 115947826A CN 202211145739 A CN202211145739 A CN 202211145739A CN 115947826 A CN115947826 A CN 115947826A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactalbumin
- alpha
- expression
- fusion
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 title claims abstract description 59
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 claims description 3
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000611330 Chryseobacterium Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000946384 Homo sapiens Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 238000013332 literature search Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000003988 neural development Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程和食品领域,具体涉及提高α‑乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法。通过α‑乳白蛋白与所述融合肽融合表达,可以显著提高α‑乳白蛋白的表达量。产生α‑乳白蛋白融合蛋白分泌量比单独表达α‑乳白蛋白提高了1.5‑3倍,摇瓶产量达到70 mg/L,在5L发酵罐中的产量达到600mg/L以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和食品领域,具体涉及提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法。
背景技术
α-乳清蛋白年进口量逐年攀升,亟需推动我国乳清蛋白类蛋白产品的生产研发。α-乳白蛋白是乳清蛋白中含量最高的蛋白质组分,也是牛乳清中第二大丰富的蛋白质。α-乳白蛋白具备多种重要的生理功能,首先,作为小分子蛋白质,更易肠道吸收利用,有助于提高蛋白质的生物利用度,降低蛋白质总量,从而有效减轻肾脏负担;其次,α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸,色氨酸被认为是调节婴儿睡眠、情绪和食欲的重要氨基酸,有助于婴儿睡眠,促进大脑发育;另外,乳白蛋白的水解肽段能够增强孩子的自身抵抗力,抗炎抗氧化,减少过敏反应发生;α-乳白蛋白也是人体必需氨基酸的最佳来源,能促进神经发育,调节肠道的菌群平衡。基于其突出的生理和营养功能,α-乳白蛋白成为国内外婴幼儿配方奶粉的重要原料,伊利乳业将α-乳白蛋白配方作为其婴幼儿配方奶的专利组分。目前国内市场中乳白蛋白均为乳提取产品,且乳铁蛋白产品完全依赖进口。实现α-乳白蛋白的自主研发和微生物制造具有重要的战略意义。
α-乳白蛋白的专利较少,相关专利表明目前已实现在大肠杆菌、酵母、藻类等体系中生产,例如US9732351B2、WOUS90007438等。最近,CN113481115A专利中公布了一种利用毕赤酵母表达人源α-乳白蛋白的方法,产量为5mg/L。现有技术中涉及的微生物生产α-乳白蛋白的产量均较低,无法实现产业化应用。
另外,目前有一些专利文献中报道了利用融合肽来增强蛋白表达产量,例如:CN108794635A、CN114127124A、CN114249839A等。但尚没有用于提高α-乳白蛋白表达量的融合肽被报道。
发明内容
本发明筛选了一系列可与α-乳白蛋白融合表达,并提高其分泌产量的融合肽,所述融合肽与α-乳白蛋白串联构成。
所述的融合肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1-10的任意一个,连接在α-乳白蛋白的N端或者C端进行融合表达,可由全基因合成获得。
因此,本发明提供一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1-10所示的任意一个。尤其提供所述融合肽在提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽在增加重组细胞例如酵母菌表达α-乳白蛋白的产量中的用途。
进而本发明提供一种α-乳白蛋白的融合蛋白,其是将如所述的融合肽连接在α-乳白蛋白的N端或者C端肽,优选地两者之间还增加有酶切位点。
本发明还提供一种编码所述融合肽的核酸。
本发明还提供含有所述的核酸的载体。优选地,其是表达载体,其中所述的核酸与启动子可操作的连接,优选地,出发载体为质粒pKLAC1。
本发明提供含有所述的核酸或所述的表载体重组细胞。优选地,所述重组细胞是酵母菌。更优选地,所述重组细胞是乳酸克鲁维酵母。
本发明还提供一种生产α-乳白蛋白的方法,包括培养所述的重组细胞,收集α-乳白蛋白的步骤。
优选地,所述培养用的培养基组成包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-3g/L的半乳糖,更优选地,所述培养用的培养基YPG培养基:酵母提取物1%,蛋白胨2%,半乳糖2%;发酵后收集发酵液上清,再进一步进行纯化;另外优选地,培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。通过α-乳白蛋白与融合肽融合表达,可以显著提高α-乳白蛋白的表达量。这些融合肽也可以用于α-乳白蛋白在其他酵母中的表达。产生α-乳白蛋白融合肽分泌量比单独表达α-乳白蛋白提高了1.5-3倍,摇瓶产量达到70mg/L,在5L发酵罐中的产量达到600mg/L以上。
本发明的优势在于利用融合肽与α-乳白蛋白融合表达,大幅提高了α-乳白蛋白产量。并且融合肽构建于N端或C端均有提高效果。融合肽串联α-乳白蛋白的表达方式也可以应用于其他表达系统中,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为α-乳白蛋白与融合肽融合表达产量对比。
图2为GG799/pKLAC1-LP3-btla表达融合蛋白Western结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进一步进行阐述,但并不构成对本发明的限制。
实施例一:融合表达质粒的构建
本发明通过文献检索筛选找到10个融合肽,其中一些是已被报道应用于其他酵母中融合蛋白表达的(例如LP1,LP6);有些是蛋白自身可以在乳酸克鲁维酵母中高效的分泌表达(例如LP2,LP3,LP4,LP5,LP7,LP8,LP9,LP10),但其并没有用于α-乳白蛋白的融合表达,本发明通过研究希望利用这些蛋白来实现与α-乳白蛋白的融合表达。
LP1氨基酸序列:
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAQQTVWGQCGGQGWSGPTSCVAGSACSTLNPYYAQCIPGATTMSTTTKPTSVSASTTRASATSSATPPTSS;
LP2氨基酸序列:
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAVNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK;
LP3氨基酸序列:
MASLVAGALCILGLTPAAFARAPVAARATGSLDSFLATETPIALQGVLNNIGPNGADVAGASAGIVVASPSRSDPNYFYSWTRDAALTAKYLVDAFIAGNKDLEQTIQQYISAQAKVQTISNPSGDLSTGGLGEPKFNVNETAFTGPWGRPQRDGPALRATALIAYANYLIDNGEASTADEIIWPIVQNDLSYITQYWNSSTFDLWEEVEGSSFFTTAVQHRALVEGNALATRLNHTCSNCVSQAPQVLCFLQSYWTGSYVLANFGGSGRSGKDVNSILGSIHTFDPAGGCDDSTFQPCSARALANHKVVTDSFRSIYAINSGIAEGSAVAVGRYPEDVYQGGNPWYLATAAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITDVSLPFFQDIYPSAAVGTYNSGSTTFNDIISAVQTYGDGYLSIVEKYTPSDGSLTEQFSRTDGTPLSASALTWSYASLLTASARRQSVVPASWGESSASSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSSTTTSSAPCTTPTSVAVTFDEIVSTSYGETIYLAGSIPELGNWSTASAIPLRADAYTNSNPLWYVTVNLPPGTSFEYKFFKNQTDGTIVWEDDPNRSYTVPAYCGQTTAILDDSWQ;
LP4氨基酸序列:
KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTRITK;
LP5氨基酸序列:
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL;
LP6氨基酸序列:
MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLVKRAVCYDTDQVPLNIFFGPPDKKKRDY;
LP7氨基酸序列:
MNIFYIFLFLLSFVQGKRIHMAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSGAGAGAGAGA;
LP8氨基酸序列:
MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKRDGDSKAITNTTFSLNRPSVHFTPSHGWMNDPNGLWYDAKEEDWHLYYQYNPAATIWGTPLYWGHAVSKDLTSWTDYGASLGPGSDDAGAFSGSMVIDYNNTSGFFNSSVDPRQRAVAVWTLSKGPSQAQHISYSLDGGYTFQHYSDNAVLDINSSNFRDPKVFWHEGENGEDGRWIMAVAESQVFSVLFYSSPNLKNWTLESNFTHHGWTGTQYECPGLVKVPYDSVADSSSNSSDSKPDSAWVLFVSINPGGPLGGSVTQYFVGDFNGTHFTPIDDQTRFLDMGKDYYALQTFFNTPNEKDVYGIAWASNWQYAQQAPTDPWRSSMSLVRQFTLKDFSTNPNSADVVLNSQPVLNYDALRKNGTTYSITNYTVTSENGKKIKLDNPSGSLEFHLEYVFNGSPDIKSNVFADLSLYFKGNNDDNEYLRLGYETNGGAFFLDRGHTKIPFVKENLFFNHQLAVTNPVSNYTTNVFDVYGVIDKNIIELYFDNGNVVSTNTFFFSTNNVIGEIDIKSPYDKAYTINSFNVTQFNV;
LP9氨基酸序列:
MRCLVVLLAVFALSQGAEITRIPLYKGKSLRKALKEHGLLEDFLQKQQYGISSKYSGFGEVASVPLTNYLDSQYFGKIYLGTPPQEFTVLFDTGSSDFWVPSIYCKSNACKNHQRFDPRKSSTFQNLGKPLSIHYGTGSMQGILGYDTVTVSNIVDIQQTVGLSTQEPGDVFTYAEFDGILGMAYPSLASEYSIPVFDNMMNRHLVAQDLFSVYMDRNGQESMLTLGAINPSYYTGSLHWVPVTVQQYWQFTVDSVTISGVVVACEGGCQAILDTGTSKLVGPSSDILNIQQAIGATQNQYGEFDIDCDNLSYMPTVVFEINGKMYPLTPSAYTSQDQGFCTSGFQSENHSQKWILGDVFIREYYSVFDRANNLVGLAKAI;
LP10氨基酸序列:
MKFLVLAVLLTVGAAQEGISSRALWQFRSMIKCAIPGSHPLMDFNNYGCYCGLGGSGTPVDELDRCCETHDNCYRDAKNLDSCKFLVDNPYTESYSYSCSNTEITCNSKNNACEAFICNCDRNAAICFSKAPYNKEHKNLDTKKYC。
首先构建α-乳白蛋白表达载体:以商品化质粒pKLAC1(柯雷生物,货号:kl-zl-0249)为模板,以表1中引物VF/VR扩增获得载体;以来源牛Bos taurus的α-乳白蛋白(GeneID:113893771)基因为模板(但不限于牛来源),引物IF/IR扩增获得目标片段,两部分通过Gibson组装的方式连接起来,构建获得表达载体pKLAC1-btla。
融合肽LP1-LP10基因序列由华大基因全合成获得,利用表1所列的相应的引物序列(LP-IF/LP-IR)分别扩增对应的融合肽基因片段。将融合肽LP1-LP11除LP4构建于α-乳白蛋白的C端,均分别构建于α-乳白蛋白的N端。其中LP4和LP11都对应来自大肠杆菌的(E.coli)麦芽糖结合蛋白序列,不同之处在于LP4是将融合肽序列构建于α-乳白蛋白的C端,而LP11是构建于N端。以前步获得载体pKLAC1-btla为模板,以表1所列引物序列(LP-VF/LP-VR)为引物,扩增获得载体片段。将融合肽片段与对应的载体片段以Gibson组装的方式连接起来,化学法转化大肠杆菌DH5a感受态,涂布氨苄抗性平板。长出的单菌落利用引物(checkF:GAGAGAAGATGTTCTTCCCT;checkR:AACAGCTTGGGTATCATA)进行菌落PCR和测序验证。
表1所使用的引物
实施例二、融合表达的酵母菌株的构建
提取实施例一中测序验证正确的质粒,命名为pKLAC1-LP1-btla至pKLAC1-LP11-btla,使用限制性内切酶SacII进行质粒线性化后,利用酵母转化试剂盒(酷来博货号:SK2400-200T)转入乳酸克鲁维酵母GG799菌种中,涂布于含有乙酰胺的YCB平板上,30℃培养5天获得转化子,阳性菌落即为含有LP1-btla至LP11-btla融合肽基因的重组菌命名为GG799/pKLAC1-LP1-btla至GG799/pKLAC1-LP11-btla。另外,转化pKLAC1-btla于GG799菌株作为融合表达对照,命名为GG799/pKLAC1-btla。
YCB固体平板(100mL):3mL 1M Tris-HCl pH7.5;1.17g YCB;2g琼脂粉加水99mL,121℃20min灭菌后,加入1mL过滤除菌0.5M乙酰胺。
实施例三、融合表达的酵母菌株的表达和表征
将单菌落接入1mLYPG(YPG培养基:酵母提取物1%,蛋白胨2%,半乳糖2%)培养基中进行培养,30℃220rpm 24小时后,以1%接种量转接种子液于250mL三角瓶中,内含10mLYPG培养基,30℃220rpm摇瓶培养72小时后,收集发酵液上清,以不含LP融合肽的GG799/pKLAC1-btla发酵液上清作为对照;以α-乳白蛋白标品(货号:S12080)作为定量标准。通过western来确证产物,其中一抗为APPLYGEN/普利莱(生产)的鼠抗α-乳白蛋白单克隆抗体(9E9)(货号:C1385-50);二抗为Easybio/柏奥易杰(生产)的Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP Conjugated羊抗鼠(货号:BE0102-100)。同时通过上海天能全自动化学发光图像分析系统内置软件,计算α-乳白蛋白产量。结果见图1和图2,结果可知所有的融合肽,α-乳白蛋白产量都明显高于对照,其中LP3效果最好达到70mg/L,LP11、LP10、LP6、LP1、LP7次之,分别达到65mg/L、62mg/L、62mg/L、57mg/L、55mg/L,这些都基本是对照的α-乳白蛋白产量近3倍或3倍以上。另外,对比LP4和LP11可以发现,相同融合肽,放置于目标蛋白N端或C端均可帮助其表达。
Claims (10)
1.一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽在增加重组细胞例如酵母菌表达α-乳白蛋白的产量中的用途,其特征在于,氨基酸序列为SEQ ID NO.1-10所示的任意一个。
2.一种α-乳白蛋白的融合蛋白,其特征在于,将如权利要求1所述的融合肽连接在α-乳白蛋白的N端或者C端肽,优选地两者之间还增加有酶切位点。
3.一种编码如权利要求2所述融合蛋白的核酸。
4.含有如权利要求3所述的核酸的载体。
5.如权利要求4所述的载体,其特征在于,是表达载体,其中如权利要求3所述的核酸与启动子可操作的连接,优选地,出发载体为质粒pKLAC1。
6.含有如权利要求3所述的核酸或如权利要求4或5所述的表载体重组细胞。
7.如权利要求6所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞是酵母菌。
8.如权利要求7所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞是乳酸克鲁维酵母。
9.一种生产α-乳白蛋白的方法,其特征在于,包括培养如权利要求7或8所述的重组细胞,收集α-乳白蛋白的步骤,优选地,在融合肽与α-乳白蛋白之间有酶切位点时还包括切除融合肽的步骤。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述培养用的培养基组成包括10-30g/ L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-3g/L的半乳糖,更优选地,所述培养用的培养基YPG培养基:酵母提取物1%,蛋白胨2%,半乳糖2%;发酵后收集发酵液上清,再进一步进行纯化;另外优选地,培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211145739.2A CN115947826A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211145739.2A CN115947826A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115947826A true CN115947826A (zh) | 2023-04-11 |
Family
ID=87286380
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211145739.2A Pending CN115947826A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115947826A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101550426A (zh) * | 2009-02-03 | 2009-10-07 | 陈群泉 | 乳酸克鲁维斯酵母菌表达外源白蛋白的方法 |
CN113481115A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-10-08 | 江南大学 | 表达人α-乳白蛋白的重组毕赤酵母菌及其构建方法与应用 |
CN114957448A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用 |
-
2022
- 2022-09-20 CN CN202211145739.2A patent/CN115947826A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101550426A (zh) * | 2009-02-03 | 2009-10-07 | 陈群泉 | 乳酸克鲁维斯酵母菌表达外源白蛋白的方法 |
CN113481115A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-10-08 | 江南大学 | 表达人α-乳白蛋白的重组毕赤酵母菌及其构建方法与应用 |
CN114957448A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
AKIRA SAITO等: "Secretion of glycosylated alpha-lactalbumin in yeast Pichia pastoris", J BIOCHEM ., vol. 132, no. 1, 31 July 2002 (2002-07-31), pages 77 - 82 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hafeez et al. | Strategies of producing bioactive peptides from milk proteins to functionalize fermented milk products | |
CN108085308B (zh) | 一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用 | |
WO2015158213A1 (zh) | 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法和应用 | |
CN102154393A (zh) | 一种γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株 | |
Dong et al. | Expression and purification of intact and functional soybean (Glycine max) seed ferritin complex in Escherichia coli | |
KR102152138B1 (ko) | 활성이 개선된 자일라나제 변이체 및 이의 생산방법 | |
JPWO2012124567A1 (ja) | Vps遺伝子が破壊されている酵母を用いる異種タンパク質の製造方法 | |
CN113136349B (zh) | 一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建 | |
US20040029252A1 (en) | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone | |
CN115947826A (zh) | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法 | |
CN115807023B (zh) | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合 | |
JPS5869897A (ja) | Dna遺伝子 | |
CN112500495A (zh) | 一种elp-ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用 | |
CN111088241A (zh) | 基因工程改造的高活力人溶菌酶 | |
CN101538571A (zh) | 一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法 | |
CN110343688A (zh) | 碱性蛋白酶pa3及其编码基因和应用 | |
AU2019218315A1 (en) | Codon optimized precursor gene and signal peptide gene of human insulin analogue | |
JP2002520045A (ja) | 酵母からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法及びそれに有用な微生物菌株 | |
CN113493785A (zh) | 一种适用于谷氨酸棒杆菌的高强度启动子及应用 | |
CN116970503B (zh) | 一种强化囊泡转运的产乳铁蛋白毕赤酵母及促进胞外分泌的方法 | |
CN117343199A (zh) | 一种促进骨桥蛋白在乳酸克鲁维酵母中表达的融合蛋白及其制备方法 | |
KR100761790B1 (ko) | GsMTx4 유전자를 포함하는 효모 발현용 재조합플라스미드 및 이를 이용한 칠레산 타란툴라 거미독펩타이드 GsMTx4의 생산 방법 | |
KR101840535B1 (ko) | 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 | |
WO2024022474A1 (zh) | 一种嵌合型转录激活因子及其应用 | |
CN117777276B (zh) | 一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |