JP2002520045A - 酵母からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法及びそれに有用な微生物菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する酵母からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法に関する。本発明は更にラクトフェリンポリペプチドに抵抗性を有するピキア・パストリスKCTC0500BPを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野及び背景技術 ラクトフェリン（lactoferrin ）は、糖タンパク質であって、殺菌性、成長促
進、鉄分運搬活性、免疫調節及び膜の受容体に対する特異的反応性など、生理・
生物学的な特徴を有する。

【０００２】 ヒトラクトフェリンの構造は、681 個のアミノ酸残基から構成される。2 個の
ローブ（lobe）中、1 個のローブのドメイン間に鉄分と結合する鉄分結合部位が
存在する。そして、ラクトフェリンに由来するペプチドまたはポリペプチドは、
抗菌性及び安定性面でラクトフェリン自体よりも一層優れた性能を有していると
報告されている（米国特許5,304,633 ；5,571,697 ）。よって、ラクトフェリン
ポリペプチドは静菌効果、細胞増殖促進効果又は炎症阻害効果などの特性を有す
るため、幼児用の調剤などの添加剤として、または、動物飼料若しくは医薬剤と
しての応用が期待されている。

【０００３】 ラクトフェリンポリペプチドは、主に牛乳の乳清から分離されていた。最近、
ポリペプチドを遺伝工学的な方法により大量生産しようとする研究が行われてい
る。Ward氏及びPiddington氏は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae
）でグルコアミラーゼプロモータを利用して、組換ラクトフェリンを2g／l の量
で発現させた（Ward、P.P.等、Bio ／Technology、13:498-503(1995)) 。Qianwa
は、サッカロマイセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）のケラチン（
chelatin）プロモータを利用して、酵母インベルターゼとヒトラクトフェリンと
の融合タンパク質形態に発現させる方法により、1.5 〜2.0mg ／l の組換ヒトラ
クトフェリンを得たと報告している（Qianwa Liang等J.Agric. Food Chem. 41:1
800-1807(1939)）。サッカロマイセス・セレビシェにより合成された組換ラクト
フェリンは糖単位が付加され、その収率は一定ではなかったと考察されている。
遺伝工学的技法を利用してラクトフェリンまたはその抗菌ペプチド誘導体を生産
する場合、発現されたラクトフェリンまたは抗菌ペプチドは宿主微生物の成長を
阻害するか、若しくは、宿主微生物を死滅させることがある。そこで、抗菌ペプ
チドを融合タンパク質形態に発現させる方法が報告されている。米国特許5,571,
697 には、ラクトフェリンに由来する抗菌ポリペプチドをアスペルギルで融合ペ
プチドとして発現させたと記載されてある。

【０００４】 発明の概要 本発明はラクトフェリンポリペプチドを微生物から大量生産する方法を提供す
る。 本発明はラクトフェリンポリペプチドを微生物から単独で大量生産する方法を
提供する。 本発明はラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する新規の微生物株を
提供する。 本発明はラクトフェリンポリペプチドを生産する微生物株を提供する。

【０００５】 発明の詳細な説明 本発明者等は、大韓民国チュンチョン道地域で採取した醤油、味噌及びワイン
などの試料からラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する株を探索し、
その中から優れたラクトフェリンポリペプチド耐性株を選定して、株を同定した
。

【０００６】 本明細書において、特別な限定がない限り、ラクトフェリンポリペプチドは、
ラクトフェリン、該ラクトフェリンに由来する抗菌ペプチドまたは抗菌ポリペプ
チドの全てを意味する。なお、ラクトフェリンの起源は特に限定されず、例えば
、ヒト、ウシまたはブタなど、多様な哺乳類動物から由来される。

【０００７】 本発明の微生物はラクトフェリンポリペプチドに対して極めて耐性であるため
、該ラクトフェリンポリペプチドは本発明の微生物により融合タンパク質として
又はペプチド自体として製造されうる。

【０００８】 更に、本発明の微生物はラクトフェリンポリペプチドの大量生産だけでなく、
宿主細胞の増殖遅度の低下又はそれを殺生することに基づき大量生産が困難とさ
れたその他の抗菌ペプチドの大量生産にも利用できる。

【０００９】 本発明は更に微生物からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法に関
連し、この方法は： 酵母細胞で活性なプロモータ配列と、該プロモータに連結されてラクトフェリ
ンポリペプチドをコードする配列とからなるプラスミドベクターを製造する段階
、 該ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する酵母細胞を前記ベクター
で形質転換させる段階、そして 該形質転換された酵母細胞を培養する段階、 から成る。

【００１０】 本発明に係る酵母細胞は、サッカロマイセス、アスペルギルス、ピキア及びカ
ンジダ属の細胞から選ばれうるが、ピキア属細胞が好ましい。

【００１１】 本発明の製造方法において、前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配
列は、他のペプチドに融合された融合ペプチドまたはラクトフェリンポリペプチ
ドに幾つかのアミノ酸が付加された配列をコードする配列、または、ラクトフェ
リンポリペプチドのみをコードする配列であってよい。ラクトフェリンポリペプ
チドと同一のポリペプチドをコーディングするなら、改変配列も利用できうる。

【００１２】 また、本発明は、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子を包含するプラスミドベ
クターを包含するピキア・パストリス細胞に関するものである。

【００１３】 本明細書の実施例で使用された全ての制限酵素及びその他の酵素はBoehringer
Mannhein Biochemical 社製を利用し、オリゴヌクレオチドプライマはInvitr
ogen社製から入手し、アミノ酸、酵母窒素ベース（YNB ）、酵母抽出物、ペプト
ン及びグルコース等の培地構成成分はDifco 社製を利用し、ヒトラクトフェリン
及びその他のタンパク質電気泳動等に使用される試薬はSigma 社製を利用した。

【００１４】 また、形質転換には、E.コリTop10F' 及び本発明に係る菌株ピキア・パストリ
スSJW-28が使用された。

【００１５】 なお、本明細書に記載された培地の組成は次のようである。 ・YM培地：酵母抽出物0.3%、麦芽抽出物0.3%、ペプトン0.5%、デキストロース
1%、寒天2%。 ・YM-L培地：YL培地1ml 当たりにラクトフェリン−ペプシンの加水分解物1mg
を添加した培地。 ・YPD 液体培地：酵母抽出物1%、ペプトン2%、デキストロース2%。

【００１６】 以下、本発明の実施の形態に対し、図面を用いて説明する。

【００１７】 実施例１ ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する宿主微生物の選
別 先ず、ワイン及び醤油などの試料をYM-L培地に塗り付けてラクトフェリンポリ
ペプチドに対して抵抗性を有する微生物を1 次選別した。

【００１８】 次いで、ラクトフェリンポリペプチドに対する2 次抗菌力を検証するために、
H.Wakabayashi 氏(Hiroyuki Wakabayashi 等、J.Food protection. 55(4):238-2
40.6(1992)) の方法を施した。即ち、前記1 次選別された株を入れた培地上に、
ラクトフェリン加水分解物を浸した紙ディスクを載置して培養した後、透明ゾー
ンの形成可否を観察した。このとき、前記ラクトフェリン加水分解物は、ラクト
フェリン1mg ／pH2 のグエン酸緩衝液1ml をペプシン（10unit／ml）により37℃
の温度下で4 時間の間処理して得た。このようにしてラクトフェリンポリペプチ
ドに対する抵抗力の優れた菌株を選別し（図1 ）、SJW-28と命名した。次いで、
PI-CHE kit 及びN.J.W. Kreger-Van Rij. 1987. The yeasts; a taxonomic stu
dy third revised and enlarged edition, Elsevier に基づくその他の微生物同
定方法を利用して同定を行った。この株（SJW-28）は、1998年7 月8 日付で、大
韓民国大田広域市ユソン区オウン洞52番地所在の生命工学研究所付設遺伝子銀行
（KCTC）に寄託し、寄託番号KCTC 0500BPを付与された。

【００１９】 表１ ─────────────────────────────────── 性質 SJW-28 ─────────────────────────────────── D-アラビノース − D-リボース − D-キシロース − D-ガラクトース − L-ラムノース ＋ マルトース − スクロース − ラクトース − メリビオース − セロビオース − トレハロース ＋ ラフィノース − メリトース − メチル-D- グルコシド − D-グルコサミン − イヌリン − メタノール ＋ エタノール ＋ エリトリトール − イノシトール − D-マンニトール ＋ D-グルコン酸塩 − グリセリン ＋ 琥珀酸塩 ＋ グエン酸塩 −または遅く生育 ───────────────────────────────────

【００２０】 表２ ─────────────────────────────────── 性質 SWJ-28 ─────────────────────────────────── 最適生育pH pH6 最適生育温度 29℃ 窒酸塩利用性 − 脂肪分解性 ＋ ゼラチン液化 ＋ カロチノイド生産 − 有機酸の顕著な生産 ＋ 澱粉性物質の生産 − ビタミン要求性 ＋ 麦芽汁液体培地またはYM液体培地 29℃で1 日培養すると、培地が乳白色 に変化する。37℃では、非常に弱い成 長を見せる。 麦芽汁寒天培地またはYM寒天培地 29℃で1 日培養すると、乳白色のコロ ニーが形成され、表面には僅かな潤い と共に微細な突出が見える。 胞子形成 有性胞子形成。子嚢間の接合はなく、 母細胞での生成が良かった。細胞間に 接合がある。1 個又は4 個の帽子状の 胞子が各子嚢から生成され、成長して 分離される。 ───────────────────────────────────

【００２１】 実施例２ ヒトラクトフェリンポリペプチドのサブクローニング 図2 に示された方法により、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子を包含する発
現ベクターを製造した。即ち、下記のプライマA （forward ；35mer ）及びB （
backward；30mer ）を利用して、ヒトラクトフェリン遺伝子が入っているpRL100
（North Dakota State University, Dep. of Biochemistry, Molecular Biology
Laboratory ）でポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を行ってラクトフェリンポリペ
プチド遺伝子を得た。ここで、前記プライマA 及びB は、ヒトラクトフェリン塩
基配列中、システインのジスルフィド結合を包含する次のような配列を増幅する
ようにデザインした。

【化１】

【００２２】 pRL100に由来するラクトフェリンポリペプチド遺伝子配列及びアミノ酸序列は
次のようである。

【化２】

【００２３】 最終的に増幅されたラクトフェリンポリペプチド遺伝子配列及びアミノ酸序列
は次のようである。

【化３】

【００２４】 以上のように増幅されたラクトフェリンポリペプチド遺伝子及びpPIC9 （Invi
trogen社製）をSnaBＩ及びEcoRＩでそれぞれ処理した後、それらを連結して発現
ベクターpPIC9 −LFP を得た。次いで、pPIC9 −LFP をE.コリ（E.coli）Top10F
' に形質転換させた。アンピシリンが入っている培地に塗り付けて成長するコロ
ニーを形質転換体として選別した。

【００２５】 実施例３ SJW-28によるヒトラクトフェリンポリペプチドの生産 Chang 氏（Chang, D氏、Guide to electroporation and electrofusion, Acad
emic Press. p501 (1992) ）の方法により、エレクトロンポレーションしてSJW-
28にpPIC9 −LFP を形質転換させた。即ち、SJW-28をYPD 液体培地でOD₆₀₀1.3〜
1.5 まで培養した後、培養液500ml を遠心分離してペレットを集めて100ml のYP
D に再懸濁させた後、pH8.0 のHEPES （N-（ヒドロキシエチル）ピペラジン-N'
（2-エタン- スルホン酸））及びジチオスレイトールをそれぞれ20mM、25mMにな
るように処理して30℃で15分間反応させ、更に、1Mのソルビトール0.5ml に溶解
させた後、40μl を取ってSaI Ｉで切ったpPIC9 −LFP100mgと一緒に、予め冷却
させたギャップキュベット（gap cuvette ）に入れて氷の中で5 分間反応させた
後、1500V 、25mAでエレクトロポレーションさせた。エレクトロポレーションを
行った後、直ちに冷たい1Mのソルビトール750 μl を入れて、YM培地に100 μl
ずつ塗り付けた。次いで、YM培地で成長する形質転換体のゲノムDNA を精製し、
前記プライマA 及びB を使用してPCR 反応させて、ラクトフェリンポリペプチド
遺伝子が挿入された菌を最終選別した。

【００２６】 ここで、前記形質転換体が生産するラクトフェリンポリペプチド遺伝子序列及
びアミノ酸序列は次のようである。

【化４】

【００２７】 前記最終選別された形質転換体をYPD 培地でOD₆₀₀1.3〜1.5 まで培養した後、
LB寒天培地にE.コリJB 109 を均等に塗り付けた培地上に、前記形質転換体培養
液を浸した紙ディスクを載置させて培養した後、透明ゾーンの形成可否を観察し
、その結果、抗菌活性があることを確認した（図3 ；M ：pPIC9 に形質転換され
たSJW-28、1 ：形質転換体、2 ：形質転換体）。

【００２８】 実施例４ SJW-28による韓牛ラクトフェリンポリペプチドの生産 既知のラクトフェリンのアミノ酸序列に基づいて、次のようなプライマを作成
した。

【化５】

【００２９】 韓牛ラクトフェリンのcDNAを鋳型として用いるPCR 反応を行って、韓牛ラクト
フェリンポリペプチド部分が包含された220bp 程度のDNA 断片を得た。韓牛ラク
トフェリンポリペプチド遺伝子及びpPIC9 （Invitrogen社製）をそれぞれXho Ｉ
で処理した後、それらを連結して発現ベクターpKLFC を得た。該pKLFC をE.コリ
Top10F' に形質転換させ、アンピシリンが入っている培地に塗り付けて成長する
コロニーを形質転換体として選別した。制限酵素処理及びPCR 反応により、前記
韓牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA が正方向に入ったプラスミドを選別及び
分離して、配列を確認した結果、報告された牛ラクトフェリン遺伝子中の一部の
序列とほぼ類似することが分かった。ここで、本発明で得た韓牛ラクトフェリン
ポリペプチドのDNA 序列と既知の牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA 序列とを
比較すると次のようである。塩基の異なる部分に下線を付した。

【化６】

【００３０】 前記実施例3 に記載された方法により、韓牛ラクトフェリンポリペプチドのDN
A が正方向に入ったプラスミドをピキア・パストリスSJW-28にエレクトロポレー
ションにより形質転換させた。前記正方向プライマ及び逆方向プライマを使用し
てPCR 反応を行って、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子の挿入された株を最終
選別した。前記最終選別された形質転換体をYPD 培地でOD₆₀₀1.3〜1.5 まで培養
した後、LB寒天培地上の試験菌に接種して均等に塗り付けた培地上に、前記形質
転換体培養液を浸した紙ディスクを載置させて培養した後、透明ゾーンの形成可
否を観察し、その結果、抗菌活性があることを確認した。その結果を図4 （A ）
〜（F ）に表す。ここで、図4 （A ）はストレプトコッカス・ムタンス（Strept
ococcus mutans）KCTC 3065 、図4 （B ）はシュードモナス・アエルギノザ（Ps
eudomonas aerogenosa）KCTC 2004 、図4 （C ）はエンテロバクター・アエロゲ
ノス（Enterobacter aerogenos）KCTC 2190 、図4 （D ）はエッシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）JM109 KCTC 2427 、図4 （E ）はサルモネラ（Salmonel
la）、図4 （F ）はエッシェリヒア・コリo157:H7 、に対する抗菌活性をそれぞ
れ示したものである。 なお、図4 （A ）〜（F ）において、C はSJW-28、3 及び6 は形質転換体をそ
れぞれ示したものである。

【００３１】 本発明に係る方法を適用すると、ラクトフェリンポリペプチド及びその他の抗
菌性ペプチドを微生物から大量生産し得るという効果がある。

【００３２】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に係る微生物のラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写
真である。

【図２】 本発明で使用された発現ベクターの製造方法を示した概略図である。

【図３】 本発明に係るヒトラクトフェリンポリペプチドを発現させた形質転換体のラク
トフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写真である。

【図４】 （A ）〜（F ）、本発明に係る韓牛ラクトフェリンポリペプチドを発現させた
形質転換体のラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ウー，ムーン スク 大韓民国，テジョン 305−335，ユソン− ク，グーン−ドン，425−７，302 (72)発明者 キム，サン キュ 大韓民国，テジョン 302−181，セオ− ク，ナエ−ドン，15−46 (72)発明者 リー，ジョン ヒュン 大韓民国，テジョン 301−070，ジューン −ク，ジューンチョン−ドン，クムホ ア パートメント ２−1201 (72)発明者 リー，キウム スーン 大韓民国，チューンチャンブック−ド，ジ ェチョン−シ，キョ−ドン 146−２，７ ／２ (72)発明者 キム，ヨン ホー 大韓民国，テジョン 305−390，ユソン− ク，ジュンミン−ドン，チョング−ナラエ アパートメント 108−202 (72)発明者 ホン，スン スー 大韓民国，テジョン 305−390，ユソン− ク，ジュンミン−ドン，462−２，チョン グ−ナラエ アパートメント 109−404 (72)発明者 リー，ヒュン−スー 大韓民国，ソウル 137−040，スチョ− ク，バンポ−ドン，550−18，ジェウーハ ウス 101 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA10 BA80 CA04 CA07 CA20 DA12 EA04 GA11 GA14 GA27 4B064 AG01 CA06 CA19 CC01 CC24 DA01 DA10 DA11 4B065 AA72X AA90Y AA93Y AB01 AC12 AC14 BA02 BA03 BA23 BA25 BB01 BD50 CA24 CA41 CA43 CA44 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 EA01 EA05 EA20 FA74

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KCTC 0500BP。
2. 【請求項２】 酵母細胞で活性なプロモータ配列と、該プロモータに連結さ
   れ、ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列とからなるプラスミドベクタ
   ーを製造する段階、 ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する酵母細胞を前記ベクターで
   形質転換させる段階、そして 該形質転換された酵母細胞を培養する段階、 を含んで成る、微生物からラクトフェリンポリペプチドを生産する方法。
3. 【請求項３】 前記酵母細胞がピキア属細胞である、請求項2 記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ピキア属細胞がKCTC 0500BPである、請求項3 記載の方
   法。
5. 【請求項５】 前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列が、ラク
   トフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドの融合ペプチド形態をコードする
   配列である、請求項2 記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列がラクト
   フェリンポリペプチドを単独でコードする配列である、請求項2 記載の方法。