CN108486272B - 基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物培育技术领域，特别是一种基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。本发明是一种可靠，快速的鉴定方法，可以在苗期进行。也可以在人工气候箱中按照白粉病的发病条件，提供准确的发病所需要的温度、湿度、光照等环境条件。通过生物技术方法，快速获得在白粉病接种后，材料中CmROR2基因的表达量。通过表达量分析，来确定种质资源的抗白粉病能力。从而达到快速筛选种质资源的目的。

Description

基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物培育技术领域，特别是一种基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。
背景技术
瓜类白粉病在全世界广泛发生。近年来，保护地甜瓜面积逐年扩大，为白粉病病原菌的活体越冬提供了极大的便利，致使白粉病现已成为我国甜瓜栽培过程中的主要病害。白粉病给世界各国的甜瓜生产造成过巨大损失，据报道，美国曾经由于白粉病造成甜瓜产量的重大损失，严重时达到50%，我国甜瓜主产区新疆在50 年代、90 年代中期曾两次大面积发生白粉病，2007 年甘肃、山东，浙江等省甜瓜白粉病也非常严重，给生产造成严重损失。
甜瓜白粉病菌的生理小种众多，分化快，目前已经报道的单丝壳属白粉菌生理小种就有11个。生理小种快速分化，使得抗性材料很难保证对白粉病的持久抗性。所以甜瓜抗白粉病育种相对比较困难。生理小种演替的原因目前尚不清楚，有研究认为这种现象的产生可能是由于抗性适应导致的, 同时认为解决办法就是不断的推出新的抗生理小种的品种。随着分子生物学的发展，人们对抗病分子机理了解越来越透彻，但是与R基因控制植物抗性相比，人们对非寄主抗性分子基础的认识仍然相当滞后。从分子生物学角度开展甜瓜白粉病广谱抗性的研究工作，鉴定分离白粉病相关的基因，解析基因之间的互作关系，对于创新优良抗病种质，开展甜瓜白粉病防控工作具有一定的现实意义。
发明内容
本发明解决现有技术不足提供一种筛选周期短、防控效果好、不污染环境的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，包括如下步骤：
A、取白粉病菌源孢子接种在待接种甜瓜叶片上，白粉病菌源在目标甜瓜叶片轻轻摩擦进行接种；
B、目标甜瓜叶片感染后培养三天待白粉病菌源入侵细胞后进行分子生物学鉴定，提取甜瓜感染叶片和未感染白粉病菌的RNA样品；
C、取步骤B中RNA样品1.0-10.0μL，RNA样品加入反转录混合液中，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer4.0μL和RNase Free dH2O 4.0μL组成，7℃反应15 min，85℃反应5sec进行酶失活，降温至4℃，制得反转录产物cDNA 模板；
D、利用特定引物进行PCR扩增，特定引物P1为 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2为ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制备扩增混合液，扩增混合液由5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL组成，再加入 RNase FreedH2O至总体积10μL，扩增混合液放置于4℃环境下；
F、冰上融化abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10.0μL、步骤D中的扩增混合液1.6 μL、步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL和灭菌蒸馏水dH2O7.4 μL，并以每分钟2000转进行离心后使用；加入 96 孔板后， 95℃变性10 min，进行循环变性94℃处理15 sec重复40-45 遍；60℃退火处理1min，使用定量 PCR 仪进行分析测定CmROR2基因的表达量；
G、使用 2-ΔΔCt 法对表达量进行分析，接种病菌前至接种3天后，CmROR2基因的表达量增长200%以上，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。
所述步骤A的甜瓜叶片的培育步骤如下：甜瓜种子在55℃温水中浸泡20分钟，在常温25℃中浸泡8小时，放置于28℃气候箱中催芽，两天后，将露白的种子播种在消毒基质中，消毒基质配方按质量分数配制肥田土50%、腐熟牲畜粪便40%和炉灰10%，3-5天出苗后转入苗期管理，苗期环境温度为白天25℃，夜间20℃，环境湿度60%。
所述步骤A苗期管理期间光照时间16小时，黑暗时间8小时。通过配比和光照管理培育性状稳定、无杂菌污染的甜瓜叶片用于实验。
所述步骤C反转录使用试剂盒RR047A处理，得到反转录产物。
所述步骤F中abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 使用时上下颠倒摇晃混合，避免反应液起泡。
所述步骤G中CmROR2基因的表达量增长300%，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。基因的表达量增长越高其种质抗白粉病的性能越好。
所述步骤F中使用ABI STEP ONE PLUS定量 PCR 仪。更加准确得到分析结果。
本发明的有益效果为：
在甜瓜中已经发现许多抗白粉病基因，但是大部分都是针对某一种白粉病生理小种的抗病基因。目前在甜瓜中被发现鉴定的具有广谱抗白粉病的基因数量较少，有关与甜瓜CmROR2基因的白粉病相关研究尚未见报道。在甜瓜种质资源研究中，对白粉病的抗性是甜瓜非常重要的一个目标性状，抗性的高低直接决定了甜瓜品质和产量。本发明设计了检测引物，利用CmROR2的相对表达量和白粉病发病率之间的相关性，通过检测甜瓜CmROR2和标准对照植株的表达量，快速对种质的抗白粉病能力进行筛选鉴定，该方法在国内外未见报道。
本法明是一种可靠，快速的鉴定方法，可以在苗期进行。也可以在人工气候箱中按照白粉病的发病条件，提供准确的发病所需要的温度、湿度、光照等环境条件。通过生物技术方法，快速获得在白粉病接种后，材料中CmROR2基因的表达量。通过表达量分析，来确定种质资源的抗白粉病能力。达到快速筛选种质资源的目的。
附图说明
图1为抗病品种和感病品种接种白粉病后CmROR2基因的表达差异；
图2为抗病野生甜瓜接种白粉病后CmROR2表达量变化趋势；
图3为利用CmROR2基因表达量进行抗白粉病种质资源筛选。
具体实施方式
基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，包括如下步骤：
A、取白粉病菌源孢子接种在待接种甜瓜叶片上，白粉病菌源在目标甜瓜叶片轻轻摩擦进行接种；
B、目标甜瓜叶片感染后培养三天待白粉病菌源入侵细胞后进行分子生物学鉴定，提取甜瓜感染叶片和未感染白粉病菌的RNA样品；
C、取步骤B中RNA样品1.0-10.0μL，RNA样品加入反转录混合液中，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer4.0μL和RNase Free dH2O 4.0μL组成，7℃反应15 min，85℃反应5sec进行酶失活，降温至4℃，制得反转录产物cDNA 模板；
D、利用特定引物进行PCR扩增，特定引物P1为 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2为ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制备扩增混合液，扩增混合液由5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL组成，再加入 RNase FreedH2O至总体积10μL，扩增混合液放置于4℃环境下；
F、冰上融化abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10.0μL、步骤D中的扩增混合液1.6μL、步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL和灭菌蒸馏水dH2O7.4 μL，并以每分钟2000转进行离心后使用；加入 96 孔板后， 95℃变性10 min，进行循环变性94℃处理15 sec重复40-45遍；60℃退火处理1min，使用定量 PCR 仪进行分析测定CmROR2基因的表达量；
G、使用 2-ΔΔCt 法对表达量进行分析，接种病菌前至接种3天后，CmROR2基因的表达量增长200%以上，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。
所述步骤A的甜瓜叶片的培育步骤如下：甜瓜种子在55℃温水中浸泡20分钟，在常温25℃中浸泡8小时，放置于28℃气候箱中催芽，两天后，将露白的种子播种在消毒基质中，消毒基质配方按质量分数配制肥田土50%、腐熟牲畜粪便40%和炉灰10%，3-5天出苗后转入苗期管理，苗期环境温度为白天25℃，夜间20℃，环境湿度60%。
所述步骤A苗期管理期间光照时间16小时，黑暗时间8小时。通过配比和光照管理培育性状稳定、无杂菌污染的甜瓜叶片用于实验。所述步骤C反转录使用试剂盒RR047A处理，得到反转录产物。所述步骤F中abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 使用时上下颠倒摇晃混合，避免反应液起泡。
所述步骤G中CmROR2基因的表达量增长300%，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。基因的表达量增长越高其种质抗白粉病的性能越好。所述步骤F中使用ABI STEPONE PLUS定量 PCR 仪。更加准确得到分析结果。
对比例1
选用甜瓜品种“甘甜S13”（为甘肃省农业科学院蔬菜研究所最新选育的薄皮甜瓜品种，为抗白粉病品种），用感病的地方品种“盛开花”最为对照。待甜瓜苗长到三叶一心后，用白粉病孢子进行接种处理，48小时后取液氮冷冻，保存在-80℃冰箱，取部分用叶片，用研钵研碎。用经典的Trizol法提取RNA，反转录后，利用本专利方法进行进行定量PCR。
结果如下附图1所示，接种后24h，抗病材料甘甜S13中，CmROR2基因的表达量是感病品种盛开花的4.1倍。表明，CmROR2和白粉病的抗感有关。抗病品种中CmROR2的表达量显著高于感病品种。
对比例2
随着白粉病孢子的入侵，CmROR2的表达量从低到高，然后在从高低的变化趋势。将抗病的野生甜瓜资源Y15接种白粉病孢子，利用Acting基因（Actin Forward primer：CTACGAACTTCCTGATGGACAAG；Reverse primer：CCAATGAGAGATGGCTGGAATAG）做对照检测表达量后发现，如如图2所示CmROR2的表达量变化和发病趋势基本一致。
对比例3
利用CmROR2进行大规模甜瓜抗性，以相对表达量上调200%作为选择阈值，如图3所示随机甜瓜品种中挑选68份种质资源，本次实验筛选出8份抗白粉病的种质资源，编号46、47、48、50、51、52、54、56的种质用于抗白粉病的品种选育工作，这些抗性资源和田间表现基本一致，大大提高了选择效率。
序列表
<110> 甘肃省农业科学院蔬菜研究所
<120> 基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用
<141> 2018-04-04
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatcgggat atgcacaagt c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atactcggtg agctattgat g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacgaactt cctgatggac aag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaatgagag atggctggaa tag 23

Claims (7)

1.基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
A、取白粉病菌源孢子接种在待接种甜瓜叶片上，白粉病菌源在目标甜瓜叶片轻轻摩擦进行接种；
B、目标甜瓜叶片感染后培养三天待白粉病菌源入侵细胞后进行分子生物学鉴定，提取甜瓜感染叶片和未感染白粉病菌的RNA样品；
C、取步骤B中RNA样品1.0-10.0μL，RNA样品加入反转录混合液中，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer4.0μL和RNase Free dH2O 4.0μL组成，7℃反应15 min，85℃反应5sec进行酶失活，降温至4℃，制得反转录产物cDNA 模板；
D、利用特定引物进行PCR扩增，特定引物P1为 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2为ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制备扩增混合液，扩增混合液由5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL组成，再加入 RNase FreedH2O至总体积10μL，扩增混合液放置于4℃环境下；
F、冰上融化abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10.0μL、步骤D中的扩增混合液 1.6μL、步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL和灭菌蒸馏水dH2O7.4 μL，并以每分钟2000转进行离心后使用；加入 96 孔板后，95℃变性10 min，进行循环变性94℃处理15 sec，60℃退火处理1min，重复40-45 遍；使用定量 PCR 仪进行分析测定CmROR2基因的表达量；
G、使用 2-ΔΔCt 法对表达量进行分析，接种病菌前至接种3天后，CmROR2基因的表达量增长200%以上，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。
2.根据权利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于所述步骤A的甜瓜叶片的培育步骤如下：甜瓜种子在55℃温水中浸泡20分钟，在常温25℃中浸泡8小时，放置于28℃气候箱中催芽，两天后，将露白的种子播种在消毒基质中，消毒基质配方按质量分数配制肥田土50%、腐熟牲畜粪便40%和炉灰10%，3-5天出苗后转入苗期管理，苗期环境温度为白天25℃，夜间20℃，环境湿度60%。
3.根据权利要求2所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于所述步骤A苗期管理期间光照时间16小时，黑暗时间8小时。
4.根据权利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于所述步骤C反转录使用试剂盒RR047A处理，得到反转录产物。
5.根据权利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于所述步骤F中abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 使用时上下颠倒摇晃混合，避免反应液起泡。
6.根据权利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法的应用，其特征在于所述步骤G中CmROR2基因的表达量增长300%，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。
7.根据权利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于所述步骤F中使用ABI STEP ONE PLUS定量 PCR 仪。
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