KR20040080097A

KR20040080097A - 아그로박테리움을 통한 꿩의비름 형질전환 방법

Info

Publication number: KR20040080097A
Application number: KR1020030014943A
Authority: KR
Inventors: 최용의; 윤의수; 정재훈
Original assignee: 최용의; 윤의수; 정재훈
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2003-03-10
Publication date: 2004-09-18

Abstract

본 발명은 꿩의비름 (Sedum erythrostichumMiq)의 조직절편체를 이용하여 완전한 식물체로 재분화 (regeneration)하는 방법과 아그로박테리움을 이용한 식물형질전환 기술을 이용하여 유용형질이 도입된 꿩의비름 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구성은 꿩의비름의 잎과 줄기 절편체를 특정한 배지조건에서 배양하여 효율적인 기관 분화를 유도하는 방법 및 이러한 재분화 체계를 이용하여 유용형질이 도입된 형질전환 식물체를 생산하는 것이다. 효과적인 식물형질전환을 위해서는 먼저 식물 절편체에서의 효율적인 재분화 체계가 확립되어야 하며 아그로박테리움과 공조배양 이후 형질전환세포의 선발이 중요하다. 따라서 본 발명에 의하면 꿩의비름 잎과 줄기를 이용하여 효울적으로 재분화시킬 수 있으며, 형질전환체를 선발, 형질전환체의 확인 및 토양순화를 거쳐 꿩의비름 형질전환 식물체를 얻을 수 있게 된다. 또한, 본 발명은 꿩의비름 최초의 형질전환 방법이다.

Description

아그로박테리움을 통한 꿩의비름 형질전환 방법 {The method for genetic transformation of Sedum erythrostichum via Agrobacterium-mediated transformation}

본 발명은 아그로박테리움을 매개로 한 식물형질전환 기술을 이용하여 꿩의비름을환하는 방법에 대한 것으로서 특히, 제초제 저항성을 가진 phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) 유전자를 도입하여 제초제 저항성 식물체를 개발하는 방법 및 제초제 저항성 식물체의 생산에 관한 것이다.

꿩의비름 (Sedum erythrostichum)은 흔히 돌나무과에 속하는 여러해살이풀로써 전세계적으로 약 350여종 이상이 존재하며, 피부의 상처치유 (Sendl et al, Phytochemistry 34; 1357-1362, 1993) 및 피부 미백효과가 탁월한 것으로 보고되고 있다 (Gill et al, Farm Pol. 40; 211-214, 1984). 또한, 꿩의비름의 잎은 다육조직으로 왁스층으로 된 큐티클 층이 발달되어 외부 환경 즉 추위와 더위 및 영양분이 없는 척박한 토양에서도 잘 견디며 특히, 건조한 환경에서 매우 강한 것으로 알려지고 있는데, 이는 지피식물로써 요구되는 매우 우수한 형질로써, 이러한 특성으로 인해 영양분이 고갈된 바위나 척박한 토양에 식재하여 바위정원 (rock garden)을 꾸미는 중요한 수종으로 이용되고 있으며, 유럽에서는 지붕에 식재되고 있다. 특히, 최근에는 산업화가 진행됨에 따라 대기오염 등의 공해를 피할 수 있는 도시 환경녹화에 대한 관심이 고조되고 있는데, 도시내의 공간 부족 및 자투리 공간의 활용 방안으로 빌딩 내·외 및 옥상녹화가 대안으로 제시되고 있다. 이에 따라 외부 환경에 잘 견디며, 특히 건조에 강한 특성을 가지는 꿩의비름 수종이 빌딩옥상녹화의 대표적 수종으로 부각되고 있으며, 다양한 형질을 가지는 새로운 품종개발이 요구되고 있다.

식물체에 외래 유용유전자를 도입하여 새로운 품종을 개발하는 방법은 최근 유전공학의 발달에 따라 매우 활발하게 이루어지고 있다. 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 식물형질전환 기술은 식물 병원성균인 아그로박테리움과 식물조직 절편을 공동배양하여 아그로박테리움 내에 있는 일부 유전자(T-DNA)가 식물 세포내로 전이되어 식물의 염색체내에 삽입되는 현상을 이용하는 방법으로 도입하고자하는 유용유전자와 형질전환된 세포를 선발할 수 있는 항생제 저항성 유전자를 T-DNA 사이에 삽입한 유전자 운반체를 제작하여 사용하고 있다. 본 발명에 사용된 유전자 운반체에는 제초제 Basta에 저항성을 가지는 유전자와 항생제 선발 유전자로 항생제 kanamycin에 저항성을 가지는 NPT II 유전자로 구성된 유전자 운반체를 사용하였다 (Strauch et al, Physiol Plant 63; 65-74, 1988).

제초제 저항성 식물체를 만드는데 가장 유력한 방법으로는 제초제를 분해하거나 무독화시키는 효소를 생합성하는 유전자를 작물에 도입하는 것이다. 따라서 많은 제초제에 이러한 전략을 이용하려는 연구가 진행되고 있으며, 이러한 효소들은 주로 미생물에서 발견되고 있다. Bar 유전자 (Thompson et al., EMBO J 6; 2519-2523, 1987)와 PAT 유전자 (Strauch et al., Physiol Plant 63; 65-74, 1988)는 각각Streptomyces hygroscopicus와 S.viridochromogenes에서 클로닝된 것으로 Thompson 등(1987)은Streptomyces hygroscopicus가 자체 독성물질인 tripeptide bialaphos를 2차 대사산물로 생성하는데, 이 물질에 내성을 가지며 생존하는 이유는 acetyl CoA를 이용하여 bialaphos의 자유 아미노기를 acetyl화하여 제초활성이 없는 산물로 만드는 phosphinothricin acetyl transferase (PAT)의 작용임을 발견하였다. 따라서 이러한PAT 유전자를 클로닝하여 제초제에 저항성을 가지는 형질전환 식물체 개발에 많은 연구가 진행되어 왔으며, 사용된 유전자는 주로bargene이라고 명명된Streptomyces hygroscopicus에서 클로닝된 유전자를 사용하였다 (Rathore et al., Plant Mol. Biol. 21; 871-884, 1993; Thompson et al., EMBO J 6; 2519-2523, 1987; De Block et al., Plant Physiol 91; 694-701, 1989).Bar유전자는 CaMV 35S promotor와 함께 재조합 되었으며 이 식물형질전환용 운반체는 담배에 도입하여 제초제 저항성 형질전환체를 얻었다 (De Block et al., EMBO J 6; 2513-2518, 1987).

꿩의비름의 조직배양에 대한 보고는S. sieboldii품종의 shoot-tip을 이용한 재분화 (Uhring, HortScience 18; 616, 1983) 와S. telephium품종에서 잎절편을 배양하여 캘러스 유도 후 신초를 유기하였던 결과 (Brandao and Salema, Pflanzenphysiol, 85; 1-8, 1977) 등이 보고되었다. 그러나 본 발명에서 사용된S. erythrostichum을 이용한 재분화에 대한 연구는 아직까지 보고되고 있지 않았으며, 또한 현재까지 꿩의 비름을 이용한 형질전환 연구는 전세계적으로도 보고되고 있지 않은 실정이다.

본 발명의 목적은 아그로박테리움을 이용한 꿩의비름 식물의 형질전환방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 꿩의비름 식물체의 일부조직에서 완전한 식물체로 재분화 시키는 적절한 배지와 식물생장조절물질 등의 조건을 제시하고, 아그로박테리움과 공동배양하여 형질전환 식물체를 생산하는 방법을 제공한다. 실 예로써 형질전환체의 손쉬운 확인을 위한 거스 유전자와 제초제에 저항성인 PAT 유전자를 이용하여 제초제 저항성 꿩의비름 식물체를 생산하였으며, 형질전환된 식물체는 제초제에 저항성을 가졌다.

본 발명은 꿩의비름 잎절편체를 이용한 식물체 재분화체계를 확립하는 방법에 관계된다.

본 발명은 외래유용유전자를 이용한 꿩의비름 형질전환체계를 확립하는 방법에 관계된다.

본 발명은 꿩의비름 식물체에 제초제 저항성 유전자가 도입함으로써 새로운 신품종의 육성에 관계된다.

본 발명은 외래유용유전자가 삽입된 형질전환 식물체가 토양에 이식되어 순화되는 방법에도 관계된다.

도 1은 제초제 저항성 및 거스유전자를 함유하는 식물발현백터 (pRD 320)의 모식도

도 2는 꿩의비름 잎절편체에서 유도되는 부정아 사진

도 3는 형질전환된 꿩의비름 식물체에서의 GUS 유전자의 안정된 발현을 확인하는 사진

도 4는 꿩의비름 식물체에서 유전자의 도입을 확인하는 PCR 분석사진.

도 5은 형질전환 꿩의비름 식물체의 게놈내에 유전자가 안정되게 삽입되었음을 확인하는 게놈 서던 분석 (genomic southern analysis)한 사진.

도 6은 형질전환 꿩의비름 식물체에서 도입된 유전자의 안정된 발현을 확인하는 노던 블롯한 사진.

도 7은 형질전환 꿩의비름 식물체의 제초제 저항성을 검정하기 위해 200 ppm의 제초제 바스타 (BASTA)를 처리한 후 4주가 지난 형질전환체와 형질전환 되지 않은 꿩의비름 식물체의 사진이다.

이하 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1] 식물체 절편으로부터 식물체 재분화

꿩의비름 식물체의 잎을 재료로 사용하였다. 공시 식물체의 잎은 유리온실에서 생육하고 있는 식물체의 상단 1-3번째 잎을 취했으며, 70% 에탄올로 1분간, 1% 차아염소산 나트륨 용액으로 15분 동안 표면살균하였다. 이 후 멸균수로 3회 정도 세척하였으며, 살균된 잎은 5X5 mm 크기로 예리한 면도날로 절단하여 식물체 재분화 및 형질전환 실험에 사용하였다.

식물체 재분화 실험을 위해 절편체는 15개씩 한 페트리디쉬에 치상하여 3개의 페트리디쉬를 1반복으로 하여 3반복 실시하였으며, 절편체를 치상한 후 4주에 각 절편체에 형성된 부정아를 조사하였다. 또한 배양실 조건은 30 μmol·m-2·sec-1, 백색 형광등으로 16시간 명처리, 8시간 암처리 하였으며 온도는 24℃로 유지하였다.

잎 절편체들은 옥신으로 NAA 0-0.5 mg/L, 사이토카인류로 BA와 Kinetin을 0-2.0 mg/L으로 조합 첨가된 MS 고체배지 (Murashige and Shoog; Plant Physiol. 15; 473-497, 1962) 에서 배양하였다. 약 배양 2주 후부터 잎절편체의 절단면에서 부정아들이 형성되기 시작하였으며, BA처리가 kinetin을 처리한 실험구보다 부정아형성에 보다 효과적이었는데, NAA 0.5 mg/L와 BA 2.0 mg/L를 혼용처리하였을 때가 총 치상한 절편체 중 56%의 절편체에서 부정아를 형성하였으며 절편체당 7.1 ± 1.7 의 신초가 생성되어 가장 효과적인 재분화 체계인 것으로 결정되었다 (표 1, 도 1).

꿩의비름 잎절편체를 이용한 식물재분화에 미치는 식물생장조절물질의 영향

식물생장조절물질 (mg/L)	부정아를 형성한 잎절편수 (%)	절편체당 형성된 평균 부정아수
NAA	부정아를 형성한 잎절편수 (%)	절편체당 형성된 평균 부정아수	BA	Kinetin
00.50.50.5	002.00	0002.0	0056±3.335±2.1	007.1±1.74.3±1.2

[실시예 2] 효과적인 형질전환 및 선발

본 연구에서 사용된 꿩의비름 형질전환용 재조합 유전자는 식물발현용 벡터 pRD 320을 이용하였으며, 유전자가 도입된 세포의 확인을 위한 거스유전자 (β-glucuronidase)와 항생제 선발유전자인 NPT II (neomycin phosphotransferase II)유전자 및 제초제 저항성 유전자인 PAT (phosphinothricin acetyl transferase) gene으로 재조합되어있다. 식물발현용 백터내에 구성된 거스유전자와 항생제 kamycine에 저항성인 NPT II 유전자는 서로 융합되어있으며, 제초제 Basta에 저항성을 가지는 PAT 유전자도 함께 존재한다. 이들 유전자는 모두 35S/35S/AMV 프로모터와 nopaline synthase gene 터미네이터로 구성되어있다. 식물발현용 벡터 pRD 320은A. tumefaciensGV 3101에 도입되어 있다 (도 2).

아그로박테리움 균주는 YEP배지 (5 g/l yeast extract, 5 g/l bacto-peptone, and 5 g/l sucrose; pH 7.2)에 접종하여 1-2일 동안 120 rpm으로 배양한 후 사용하였으며, 배양된 아그로박테리움은 3,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 제거한 후 새로운 무라시쿠 스쿠트 액체배지를 이용하여 재현탁하여 꿩의비름 식물체의 잎절편체에 접종하였다. 아그로박테리아에 접종된 잎절편체는 멸균된 필터페이퍼에서 박테리아 잔액을 제거하고 재분화 배지로 옮겨 암상태에서 3일간 공동배양하였다.

형질전환 효율을 높이고 형질전환된 조직의 효과적인 선발을 위해서는 형질전환 과정 중 일어날 수 있는 식물조직의 괴사를 최소한으로 하는 것이 바람직하다. 형질전환 과정 중 식물 절편체는 조직의 절단과 외부 박테이아의 감염에 의한 이중의 스트레스를 받게 되는데, 형질전환 세포를 선발하기 위한 항생제 처리는 이러한 스트레스를 받는 절편체에 스트레스를 가중시킨다. 따라서 정상적으로 형질전환된 세포조차도 정상적으로 항생제에 내성을 보이지 못해 괴사하게 될 가능성이 있다. 따라서 이러한 가능성을 최소화하며 효율적인 형질전환을 위해 균액에 접종된 절편체를 3일간의 공동배양 후 바로 선발배지에 옮기지 않고 균만을 제거하는 균제거용 배지에 치상한다. 즉 300 mg/Lcefotaxime이 첨가된 재분화 배지에서 절편체를 치상하여 약 7일간 배양하며 균만을 제거한다. 이 후 이들 절편체는 형질전환체의 선발을 위한 선발배지로 옮긴다. 선발배지 조건은 동일한 재분화 배지에 25 mg/L kanamycin 과 300 mg/L cefotaxime을 첨가한 배지를 이용하였다. 형질전환된 신초의 선발은 3주에 한번씩 신선한 동일 선발배지로 계대배양하면서 선발하였으며, 3차례의 계대배양 후에 항생제 kanamycine에 저항성을 가지는 신초를 얻을 수 있었다. 발생된 신초는 절편체 조직에서 분리하여 호르몬 무첨가 배지로 옮겨졌으며, 이후 3차례 동일 배지에서 계대되었다. 이와 같은 방법으로 650개의 잎 절편체 중에서 항생제 Kanamycin에 저항성을 나타낸 신초를 생성한 절편체 24개체 (3.75%)를 얻을 수 있었다 (표 2).

꿩의비름 형질전환 과정 중 각 단계에 따라 확인된 형질전환 효율

형질전환체 선발 단계	절편체나 식물체의 수	빈도 (%)
아그로박테리움과 접종된 절편체항생제 kanamycin에 저항성을 가지는 신초GUS 양성 반응을 보이는 식물체제초제에 저항성을 가지는 식물체유전자의 도입이 확인된 형질전환체	64024161616	3.752.52.52.5

[실시예 4] 거스반응을 이용한 형질전환체 분석

선발배지에서 임으로 선택된 24개체를 이용하여 유전자의 도입 및 발현을 눈으로 쉽게 확인 할 수 있는 거스반응을 실시하였다. 거스반응은 Jefferson 등 (1987)의 방법에 따라 실시하였는데, 임으로 선발된 식물체 잎조직을 2mM 5-bromo-4- chloro-3-indolyl-glucuronide을 포함하는 50mM의 sodium phosphate buffer에 침지한 후 24시간동안 37℃에서 배양하였으며, 이후 99% 에탄올에서 식물색소 등을 제거하였다. 반응 결과 16개체에서 GUS 양성반응을 보였는데, 정상식물체의 잎조직에서는 아무런 변화가 없었으나 형질전환 식물체의 잎에서는 강한 청색의 반응이 일어나 유전자가 성공적으로 도입되어 발현됨을 증명하였다 (표 2, 도 3).

[실시예 5] PCR을 이용한 형질전환체 분석

형질전환체에 도입된 유전자의 확인은 먼저 PCR을 이용하여 실시하였으며, 거스반응이 양성으로 확인된 식물체들을 이용하여 게놈 DNA을 분리하고 각각PAT,NPT II, GUS유전자의 도입을 확인 할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후 PCR 산물을 전기영동하여 유전자의 삽입을 확인하였다 (도 4). 유전자의 확인을 위해 사용된 프라이머는 각각 PAT; 5'-AGG ACA GAG CCA CAA ACA CC-3'과 5'-ATG CTT GTA TCC AGC TGC G-3', NPT; 5'-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3'과 5'-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3', GUS; 5'-CTG TAG AAA CCC CAA CCC GTG-3'과 5'-CAT TAC GCT GCG ATG GAT CCC-3' 이었으며, PCR 산물은 각각 350bp, 700bp, 510bp이다. PCR 반응은 Applied Biosystems PCR 기기를 사용하였으며, 반응조건은 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 15분간 신장반응하였다.

[실시예 6] 서던 블롯을 이용한 형질전환체 분석

PCR 반응에 의해 유전자의 도입이 확인된 식물체에서는 제초제 저항성 유전자 (PAT)를 특이 탐침(probe)으로 한 게놈 서던 블롯을 실시하여 꿩의비름 식물체의 게놈에 목적유전자가 안전하게 도입된 것을 확인하였다 (도 5). 거스양성반응을 보인 식물체들에서 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 EcoR I 으로 절단하였으며, 0.8% 아가로스겔 상에서 크기별로 분리한 후 Hybond-N+ 나일론 멤브레인으로 옮겨, Roche사의 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II에서 제시된 방법으로 특이탐침을 제조하고 하이브리다이제이션 및 검출과정 등을 수행하였다.

[실시예 7] 노던 블롯을 이용한 형질전환체 분석

유전자의 도입이 확인된 식물체에서 안정적인 유전자의 발현을 확인하기 위해 전체 RNA를 추출하여 노던 블롯 분석을 실시하였다. PAT 유전자를 특이 탐침으로 하여 노던 블롯을 실시한 결과 비형질전환체에서는 유전자의 발현을 확인 할 수 없었으나 선발된 형질전환체에는 PAT 유전자의 안정적인 발현을 확인 할 수 있었다 (도 6).

[실시예 8] 형질전환체의 토양순화

유전자의 도입이 확인된 형질전환식물체들은 측아를 손상시키지 않고 취해 무라시쿠 스쿠트 배지에 치상하여 기내에서 증식한 후 정상적으로 뿌리와 잎이 전개된 식물체로 크기가 약 10 cm 정도 되게 생장시켰다. 이후 토양순화를 위해 식물체는 깨끗한 모래가담긴 용기로 이식하였으며, 수분의 급속한 손실을 막기 위해 비닐랩으로 용기를 감싸주었다. 약 1달 후에 비닐랩을 제거하였으며, 2달 후에는 건실한 식물체로 성장시켰다.

[실시예 9] 제초제 처리

제초제 저항성 유전자가 도입된 꿩의비름 형질전환체의 제초제 Basta 저항성 여부를 확인하고자 선발된 식물체를 토양에 순화시킨 후 200 mg/L Basta를 식물체가 흠뻑 젖도록 분무하여 일주일간 5회 분무하여 4주간 관찰한 결과 형질전환 되지 않은 식물체는 모두 고사하는 반면에 형질전환 식물체는 모두 제초제에 영향받지 않으며 강력한 저항성을 나타내며 정상적인 생육을 보였다 (도 7).

본 발명의 효과는 유용유전자를 아그로박테리움을 이용하여 꿩의비름 식물체에 도입시키는 유용한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 꿩의비름 잎절편체를 이용한 효과적인 재분화 체계를 제공하고 있으며, 아그로박테리움을 이용한 꿩의비름 형질전환시 효과적으로 형질전환체를 선발할 수 있는 조건과 형질전환 효율을 높일 수 있는 유효한 방법을 제공한다. 또한, 형질전환체계가 보고되고 있지 않은 꿩의비름 식물체에서 최초로 보고되는 형질전환 기술개발이라는 효과가 있다.

Claims

꿩의비름 잎과 줄기 절편체를 옥신 NAA 와 사이토카인류 BA와 Kinetin가 조합 첨가된 MS 고체배지에서 배양하여 부정아를 유도하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 잎과 줄기 절편체는 돌나물과 세듐 (Sedum)속에 속하는 것을 특징으로 하는 형질 전환 꿩의비름 식물체의 제조방법
꿩의비름 식물체의 형질전환에 있어서, 식물체의 잎과 줄기 절편체를 아그로박테리움과 공동배양하여 외래 유전자를 도입하는 방법
가나마이신을 이용 형질전환된 신초를 유도하고 이를 선발하며, 계대배양으로 형질전환체를 얻는 방법.
상기 제 4항의 형질전환 방법에 의해 꿩의비름 형질전환 시 아그로박테리움 투미파시엔스를 이용하여 꿩의비름 잎과 줄기 절편체를 이용하여 형질전환 하는 것을 특징으로 하며, MS배지에 3% 설탕과 생장조절제인 NAA 와 BA 및 Kinetin를 혼합처리하는 단계, 아그로박테리움과 공동배양하는 단계, 항생제를 이용 아그로박테리움만을 제거하는 단계, 가나마이신을 이용 형질전환된 부정아를 선발하기 위한 선발단계, 선발된 부정아를 완전한 식물체로 재분화 하는 단계를 일련의 과정으로 하는 형질전환 꿩의비름 제조 방법.
상기 제 5항에 의해 제조된 꿩의비름 유식물체를 깨끗한 모래에 이식하여 약 2개월간 생육시켜 건실한 식물체로 생장시켜 형질전환 식물체를 제조하는 방법.
제 5항의 식물형질전환 방법에 따라 제조된 형질전환 꿩의비름 1종 (제초제 저항성 꿩의비름)