CN103937812B - 水稻斑点叶性状控制基因spl29在衰老和抗病上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻斑点叶性状控制基因<i>SPL29</i>在衰老和抗病上的用途。本发明通过对水稻斑点叶突变体（<i>spl29</i>）的研究克隆了控制其性状的基因。突变基因<i>spl29</i>的编码核苷酸序列如Seq？ID？No.1所示，其所对应的野生型控制基因<i>SPL29</i>的编码核苷酸序列如Seq？ID？No.2所示。水稻斑点叶突变体表现出斑点叶、加速的叶片衰老以及增强的植株抗病能力，表明<i>SPL29</i>基因在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。本发明的性状控制基因为阐明衰老的机制和创造高抗病性作物方面提供了新的理论依据，特别是可利用基因工程方法调控植株的生命和抗病性，在衰老与抗病的理论和应用研究上具有重要的潜在利用价值。

Description

水稻斑点叶性状控制基因SPL29在衰老和抗病上的用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻斑点叶性状控制基因SPL29（SPOTTEDLEAF29）在衰老和抗病上的用途。

背景技术

斑点叶突变体，也常被称作类病斑突变体，其表现为错误地调节细胞死亡。通过克隆斑点叶突变体的基因，使得调节细胞死亡程序的基因被大量发现，这对解析衰老信号途径、防御反应途径以及它们的交叉调控网络具有重要的意义（LorrainS,VailleauF,BalagueC,RobyD.2003.Lesionmimicmutants:keysfordecipheringcelldeathanddefensepathwaysinplants.TrendsPlantSci8,263-271.）。如要依靠不同的胁迫处理研究植株反应，来达到这些研究目的，通常是不太可能的。

叶片衰老是一个复杂的生物学过程，通常发生在叶片发育的最后阶段，通常受年龄发育以及大量内源、外源因素的影响和调控（BalazadehS,KwasniewskiM,CaldanaC,MehrniaM,ZanorMI,XueGP,Mueller-RoeberB.2011.ORS1,anH₂O₂-responsiveNACtranscriptionfactor,controlssenescenceinArabidopsisthaliana.MolPlant4,346-360;LimPO,NamHG.2005.ThemolecularandgeneticcontrolofleafsenescenceandlongevityinArabidopsis.CurrTopDevBiol67,49-83.）。虽然叶片衰老相关的问题被大量研究，但是目前人们对于叶片衰老的科学认识仍然不是十分清晰。因此对叶片衰老关键基因的克隆和研究显得十分重要，这使得清晰地阐明叶片衰老在分子水平上的遗传机制成为了可能。例如，从快速衰老突变体rls1中克隆到了RLS1基因，该基因在水稻叶衰老过程中参与自噬调节的叶绿体降解途径（JiaoBB,WangJJ,ZhuXD,ZengLJ,LiQ,HeZH.2012.AnovelproteinRLS1withNB-ARMdomainsisinvolvedinchloroplastdegradationduringleafsenescenceinrice.MolPlant5,205-217.）。另外，叶片衰老关键基因的克隆，对利用基因工程的手段调控作物叶片的衰老进程、改善作物的光合功能和挖掘作物的产量潜力，提供了潜在的可行性。

斑点叶突变体在没有病原菌入侵的情况下也呈现类似病斑的表型。通过检测这类突变体的抗病性，通常会发现它们对于病原菌的抗性也大大增强（JungYH,LeeJH,AgrawalGK,RakwalR,KimJA,ShimJK,LeeSK,JeonJS,KohHJ,LeeYH,IwahashiH,JwaNS.2005.Therice(Oryzasativa)blastlesionmimicmutant,blm,mayconferresistancetoblastpathogensbytriggeringmultipledefense-associatedsignalingpathways.PlantPhysiolBiochem43,397-406;WuC,BordeosA,MadambaMR,BaraoidanM,RamosM,WangGL,LeachJE,LeungH.2008.Ricelesionmimicmutantswithenhancedresistancetodiseases.MolGenetGenomics279,605-619.）。在已鉴定基因的这类突变体中，SPL11的突变给与了水稻对稻瘟病病菌和白叶枯病病菌的广谱抗性（YinZ,ChenJ,ZengL,GohM,LeungH,KhushGS,WangGL.2000.Characterizingricelesionmimicmutantsandidentifyingamutantwithbroad-spectrumresistancetoriceblastandbacterialblight.MolPlantMicrobeInteract13,869-876.）；SPL28的突变传递给植株对一些稻瘟病病菌和白叶枯病病菌的抗性（QiaoY,JiangW,LeeJ,ParkB,ChoiMS,PiaoR,WooMO,RohJH,HanL,PaekNC,SeoHS,KohHJ.2010.SPL28encodesaclathrin-associatedadaptorproteincomplex1,mediumsubunitmicro1(AP1M1)andisresponsibleforspottedleafandearlysenescenceinrice(Oryzasativa).NewPhytol185,258-274.）；GF14e的基因沉默水稻植株对一种水稻黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryza）毒性菌株呈现除了高水平的抗性（ManosalvaPM,BruceM,LeachJE.2011.Rice14-3-3protein(GF14e)negativelyaffectscelldeathanddiseaseresistance.PlantJ68,777-787.）；NLS1的半显性突变导致水稻中防御反应的组成性激活（TangJ,ZhuX,WangY,LiuL,XuB,LiF,FangJ,ChuC.2011.Semi-dominantmutationsintheCC-NB-LRR-typeRgene,NLS1,leadtoconstitutiveactivationofdefenseresponsesinrice.PlantJ66,996-1007.）。斑点叶/类病斑突变体的基因克隆和研究对揭示防御反应途径具有重要的作用，也为利用基因工程的手段创造广谱抗性植株提供了线索。

发明内容

本发明的目的在于一种水稻斑点叶性状的突变体spl29基因。

本发明的目的还在于提供上述spl29基因及其对应的野生型控制基因SPL29的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

斑点叶突变体spl29是在经过愈伤组织培养而生成的中花11植株中发现了一个斑点叶突变体，该突变体从苗期开始，突变体的叶片在出现类病斑斑点后，会快速的衰老死亡。本发明采用图位克隆的方法将spl29基因定位为LOC_Os08g10600，spl29基因发生了一个G到T的点突变，导致氨基酸编码从甘氨酸（Gly）变为半胱氨酸（Cys）。LOC_Os08g10600基因的功能互补实验恢复了spl29的表型，表明LOC_Os08g10600就是要找的SPL29基因，SPL29为UDPGP基因家族中的UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因（UAP1）。进一步研究SPL29基因的点突变与叶片早衰和植株抗性的关系发现：水稻斑点叶突变体spl29在出现斑点叶表型后，叶片中叶绿素下降，叶绿体破裂和溶解，衰老转录因子和衰老相关基因表达上调；同时，水稻斑点叶突变体spl29对白叶枯病的抗病能力大大增强，抗病基因表达上调。即SPL29基因的点突变，导致了植物叶片的加速衰老和死亡，并提高了植株抗白叶枯病能力，诱导了体内的抗病反应，表明SPL29基因在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。

一种水稻斑点叶性状的突变体spl29基因，其编码核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。

所述的水稻斑点叶性状的突变体spl29基因的核苷酸序列还包括在SeqIDNo.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的核苷酸序列。

spl29基因对应的野生型控制基因SPL29的编码核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。SPL29基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SeqIDNo.3所示。SPL29基因所在的基因组核苷酸序列如SeqIDNo.4所示，SeqIDNo.4所示序列包含功能互补实验所用的启动子序列、基因区序列和终止子序列，共7888bp。

上述水稻斑点叶性状的突变体spl29基因在控制水稻植株早衰和/或抗病方面的应用。

与spl29基因对应的野生型控制基因SPL29在调控水稻植株衰老和/或抗病方面的应用。

水稻和其它物种中的与SPL29同源的基因在调控衰老和/或抗病方面的应用；所述的与SPL29同源的基因为编码与SeqIDNo.3所示的氨基酸序列同源性高于30%且行使的功能与SPL29的功能相似的同源基因。

本发明的水稻斑点叶突变体spl29的控制基因SPL29，在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。揭示了衰老与抗病性的新途径，为阐明衰老的机制和创造高抗病性作物方面提供了新的可靠的理论依据，也为利用基因工程调控衰老与抗病性提供了新的靶标。SPL29基因在用于基因工程或遗传工程方法，来调控生物个体的衰老和抗病能力时，拥有重要的潜在利用价值。

附图说明

图1为野生型WT和突变体spl29的表型。（A）植株苗期约28天时的表型；（B）植株分蘖期约50天时的表型；（C）植株成熟期约115天时的表型；（D）苗期叶片表型，对应图A植株依先后顺序（从下而上）长出的第二叶；（E）分蘖期叶片表型，对应图B植株主茎从上向下的第一、二、三、四叶；（F）成熟期约90天时的剑叶表型，方框部分进行放大展示。

图2为SPL29基因的图位克隆和功能互补。（A）初步定位，采用44颗F₂突变株，将SPL29定位在第8号染色体的分子标记M1037和M1230之间，并与M1077紧密连锁；（B）精细定位，利用870颗F₂突变株，将SPL29定位在新开发的分子标记S8和S26之间97kb的候选区域内，并与S15和S19紧密连锁；（C）在水稻基因组注释项目（RiceGenomeAnnotationProject）上查询，候选区域内有10个开放阅读框（ORFs）；（D）SPL29的候选基因的基因结构：该基因含有15个外显子，G到T的点突变（箭头指示）发生在第8个外显子上，导致氨基酸编码从甘氨酸变为半胱氨酸；（E）功能互补的载体构建：互补载体pSPL29C上构建入一个7888bp的包含LOC_Os08g10600的启动子（Pro，2214bp）、基因（SPL29，4674bp）和终止子（Ter，1000bp）的基因组片段；空载体pEmvC作为对照，利用农杆菌转化法将pSPL29C和pEmvC转入spl29的愈伤中，分化成苗；（F）互补载体pSPL29C的转基因植株；（G）空载体pEmvC的转基因植株；（H）载体pSPL29C和pEmvC的转基因植株叶片；（I）载体pSPL29C和pEmvC的转基因植株阳性检测：Bar178：扩增的转基因筛选标记基因（Bar），长度178bp，野生型ZH11的DNA作为阴性对照，含Bar基因的空载体质粒作为阳性对照；（J）突变体spl29中的点突变位点在pSPL29C和pEmvC的转基因植株中的碱基序列检测：该碱基位点在恢复表型的pSPL29C转基因植株中同时含有G和T，在未恢复表型的空载体pEmvC转基因植株中仍为T。

图3为UAP基因的系统进化树以及编码蛋白的同源性分析。（A）系统树基于UAP和UGP基因编码的全长氨基酸序列构建。UAP：UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶；UGP：UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。GanBank号如下：ZmUAP1，玉米（Zeamays，AFW56989.1）；SbUAP1，高粱（Sorghumbicolor，XP_002444024.1）；OsUAP1（SPL29），水稻（Oryzasativa，NP_001061242.1）；OsUAP2，水稻（Oryzasativa，NP_001053857.1)；ZmUAP2，玉米（Zeamays，NP_001266496.1）；SbUAP2，高粱（Sorghumbicolor，XP_002448519.1）；AtUAP1，拟南芥（Arabidopsisthaliana，NP_564372.3）；AtUAP2，拟南芥（Arabidopsisthaliana，NP_181047.1）；GmUAP1，大豆（Glycinemax，XP_003524811.1）；GmUAP2，大豆（Glycinemax，XP_003531103.1）；PtUAP1，毛果杨（Populustrichocarpa，XP_002303345.2）；PtUAP2，毛果杨（Populustrichocarpa，XP_006369046.1）；HsUAPA，人（Homosapiens，NP_003106.3,isoformA）；HsUAPB，人（Homosapiens，Q16222.3,isoformB）；LmUAP1，飞蝗（Locustamigratoria，JX484802.1）；LmUAP2，飞蝗（Locustamigratoria，JX484803.1）；DmUAPA，黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster，NP_609032.1,isoformA）；DmUAPB，黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster，NP_723183.1,isoformB）；ScUAP，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae，NP_010180.1）；CeUAP1，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，NP_497777.1）；CeUAP2，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，NP_500511.2）；OsUGP1，水稻（Oryzasativa，NP_001063879.1）；OsUGP2，水稻（Oryzasativa，NP_001045689.1）；AtUGP2，拟南芥（Arabidopsisthaliana，NP_197233.1）；AtUGP1，拟南芥（Arabidopsisthaliana，NP_186975.1）；EcGlmU，大肠杆菌（Escherichiacoli，P0ACC7.1)。（B）各蛋白与SPL29的氨基酸序列一致性的比对结果，对应展示在蛋白名称后面；“no”表示无序列一致性。

图4为野生型WT和突变体spl29中叶绿素Ca+b含量变化。（A）苗期叶片中的叶绿素Ca+b含量测定；（B）分蘖期叶片中的叶绿素Ca+b含量测定。

图5为野生型WT和突变体spl29中叶绿体的超微结构。（A-C）野生型细胞中的叶绿体；（D-F）突变体细胞中破裂的叶绿体，图中箭头所指为叶绿体膜的破裂；（G-I）突变体细胞中溶解的叶绿体，图中箭头所指为溶解状态的叶绿体。

图6为野生型WT和突变体spl29中衰老转录因子和衰老相关基因的相对表达情况。（A-B）衰老转录因子在苗期和分蘖期的相对表达情况；（C-D）衰老相关基因在苗期和分蘖期的相对表达情况。三个水稻基因（UBC、Profilin-2和Actin1）用作内参分析，各基因在野生型中的表达量调为1，数据指示三个生物学重复的平均值（mean）±标准差（SD），星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异（**P<0.005，***P<0.0005；斯图登检验（student’stest））。

图7为野生型WT和突变体spl29的抗病能力检测。（A）接种白叶枯病菌PXO99后12天的病菌侵染叶，双向箭头指示病斑侵染部分；（B）白叶枯病菌PXO99侵染12天的平均叶病斑长度，数据来自5-7颗独立植株的平均值（mean）±标准差（SD），星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异（***P<0.0005，斯图登检验（student’stest））；（C-D）防御反应相关基因在苗期和分蘖期的相对表达情况，三个水稻基因（UBC、Profilin-2和Actin1）用作内参分析，各基因在野生型中的表达量调为1，数据指示三个生物学重复的平均值（mean）±标准差（SD），星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异（***P<0.0005，斯图登检验（student’stest））。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，下面提供了水稻斑点叶突变体（spl29）的实施实例。这些实施实例仅仅是说明性的、而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。

实施例1

1、水稻材料：

水稻（Oryzasativa）斑点叶突变体spl29（spottedleaf29），保存于湖北省农作物种质资源中期库（保存号HB2014001，湖北省农业科学院粮食作物研究所）；其野生型（WT）品种为粳稻品种“中花11”。

水稻斑点叶突变体spl29是中花11在组织培养过程中突变产生的。突变表型为斑点叶和加速的叶衰老死亡。从苗期到植株发育后期的每一片叶都呈现这种突变表型。经多代繁殖，spl29突变表型稳定遗传。表型结果如图1所示。

2、群体构建和遗传分析

以突变体spl29为父本，分别以广占63s和岳恢9113为母本，进行杂交，3个组合F₁表型均为正常绿叶表型，F₁自交，得到F₂群体。在3个F₂群体中，非斑点表型叶与斑点表型叶植株数目均符合3:1的分离比，表明突变性状受细胞核隐性单基因控制。结果如下表所示：

表1.突变体spl29的遗传分析

表注：杂交组合：母本/父本；肉眼观察野生型和突变体表型；χ²<χ² _0.05=3.84表示符合3:1的性状分离比；P>0.05表示可信。

3、用图位克隆的方法定位SPL29基因

定位群体采用spl29与广占63s的F₂群体。植株种于田间约40d，突变表型很明显时取样，每株取0.5g左右的叶片，用来提取基因组DNA。基因组DNA的提取采用CTAB法，获得的DNA沉淀溶解于100μL超纯水中。图位克隆的每个PCR反应用0.5μLDNA样品。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭（EB）染色来进行检测。

CTAB法提取基因组DNA的步骤如下：

1）用液氮将约0.5g的所取叶片粉碎成细粉，置于2mL的EP管中。

2）加600μL的CTAB溶液（2%（m/V）CTAB，100mmol/LTris-Cl，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl；PH8.0），置于65℃的水浴锅内1h。

3）用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提，颠倒使充分混匀，于10000r/min离心5min，回收上（水）相。

4）取上清，加入十分之一体积的3M乙酸钠，0.6体积的异丙醇（或2倍体积无水乙醇）沉淀DNA，充分混匀，于-20℃放置30min以上。4℃，10000r/min离心10min。

5）用75%乙醇洗涤沉淀物2次，干燥，用100μL超纯水重悬溶解。

图位克隆的PCR反应体系（25μL）为：ddH₂O16μL，DNA模板0.5μL，引物P1/引物P21/1μL，dNTP（各2.5mM）1μL，TagDNA聚合酶（ThermoScientific）0.5μL，10×Tag缓冲液（含(NH₄)₂SO₄）2.5μL，MgCl₂2.5μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

SPL29基因的初步定位：根据已公布的粳稻和籼稻之间可能存在差异的SSR和InDel分子标记，用spl29和广占63s的基因组DNA，筛选出了近似均匀分布于12条染色体的多态性分子标记。在F₂定位群体中选取44个隐性个体，提取DNA，利用筛选出的多态性分子标记进行PCR扩增，检测分子标记在每个隐性个体中的带型分布，将SPL29初步定位在第8号染色体上M1037和M1230两个SSR标记之间（如图2A所示）。引物序列见表2。

SPL29基因的精细定位：进一步在M1037和M1230之间的区域中开发出可用的多态性分子标记（S1、S6、S8、S15、S19、S26、S32、S33和S40）。在F₂定位群体中选取870个隐性个体，提取DNA，最终将SPL29基因精细定位在分子标记S8和S26之间这个97kb的区域内，并与S15和S19这两个分子标记紧密连锁（如图2B所示）。引物序列见表2。

表2.定位引物及序列

4、候选基因的确定

根据得到的97kb的精细定位区间，在水稻基因组注释项目（RiceGenomeAnnotationProject，http://rice.plantbiology.msu.edu/）上进行预测，发现共有10个开放阅读框（ORFs）。利用PCR的方法，将突变体spl29和野生型中花11中这10个ORFs所在的基因组序列扩增出来，测序分析，发现只有在第五个ORF所在的基因（LOC_Os08g10600）上发现了一个G到T的单碱基突变。该突变发生在基因的第八个外显子上，导致蛋白质产物上该位点的氨基酸编码从甘氨酸变为半胱氨酸（如图2C和D所示）。因此将候选基因LOC_Os08g10600进行功能互补验证。

上述PCR反应体系（50μL）为：ddH₂O17.5μL，基因组DNA1μL，引物P1/引物P21/1μL，dNTP（各2.5mM）4μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶（TaKaRa）0.5μL，2×PrimeSTARGC缓冲液25μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，60℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

5、功能互补载体的构建与转基因功能互补

以野生型中花11的基因组DNA为模板，用3对引物SPL29Pro（F：cagtGCTCTTCatagcgtttgaccagatgtcggaa，R：cagtGCTCTTCaaggagagaggctgctgctgc），SPL29Gene（F：cagtGCTCTTCacctactaataatctccccaagat，R：cagtGCTCTTCattgaaaaaggaaaatgtgta）和SPL29Ter（F：cagtGCTCTTCacaagtttgcaatacaattaatgc，R：cagtGCTCTTCagacgttctacagcggttcagtgt）（3对引物中的有下划线的加粗斜体部分为用于酶切和连接的SapI内切酶接头序列，其中大写部分为SapI内切酶识别位点，非下划线部分为对应的基因组DNA特异引物序列）分别PCR扩增出LOC_Os08g10600（SPL29）基因的2214bp的上游启动子所在序列（SPL29Pro片段），4674bp的基因所在基因组序列（SPL29Gene片段）和1000bp的下游终止子所在序列（SPL29Ter片段）。用凝胶回收试剂盒（BioSpinGelExtractionKit，BioFlux）回收3种PCR片段，以SapI为酶切位点，用酶切连接一步法构建进入双元载体pBWA(V)B（购于武汉伯远生物科技有限公司；http://www.biorun.net/）。

上述PCR体系和反应程序与本实施例第4步（候选基因的确定）中的相同。

上述酶切连接体系（20μL总体积）为：ddH₂O9μL，T4DNA连接酶（ThermoScientific）1μL，10×T4DNA连接酶缓冲液2μL，pBWA(V)B质粒1μL，SPL29Pro片段2μL，SPL29Gene片段2μL，SPL29Ter片段2μL，SapI/LguI（ThermoScientific）1μL。

酶切连接步骤为：37℃5min，22℃10min；40个循环。产物转化进入大肠杆菌DH10B。

重组载体中7888bp的基因组片段经测序与野生型中花11的基因组对应序列完全一致（如SeqIDNo.4所示），则该互补用载体在实验中命名为pSPL29C；空载体在实验中重新命名为pEmvC（载体示意图如图2E所示）。将pSPL29C和pEmvC分别转化进入农杆菌，浸染突变体spl29的愈伤组织，进行转基因互补实验。转基因过程由武汉伯远生物科技有限公司（http://www.biorun.net/）代理进行。

对转基因再生植株进行连续观察，转候选基因互补载体pSPL29C的植株恢复了正常表型（如图2F和H），而转空载体pEmvC的植株还是呈现斑点叶及早衰的表型（如图2G和H）。为了进一步确认转基因植株阳性，转基因植株的基因组DNA用引物Bar178F：AGAAACCCACGTCATGCCAGT和Bar178R：ACGCTCTACACCCACCTGCT来PCR扩增草甘膦筛选基因Bar，结果如图2I所示，转化了pSPL29C和pEmvC的植株都为转基因阳性；同时用spl29突变位点两端的引物SPL29MutationF：CCCATTCTTCCATCATTCCG和SPL29MutationR：CATATTTCACACCTCTTCCAGCC对转基因植株中的突变位点附近序列进行PCR测序分析，结果如图2J所示，转pSPL29C的表型恢复植株中该位点同时存在G和T，而转空载体pEmvC的植株中该位点仅是与spl29一样的T。基因LOC_Os08g10600所在的基因组序列成功挽救了spl29突变体的表型，说明LOC_Os08g10600就是所要找的SPL29基因。

上述检测和测序用的PCR体系和反应程序与本实施例第3步（用图位克隆的方法定位SPL29基因）中的图位克隆用的PCR体系和反应程序相同。

6、SPL29的生物信息学分析与系统进化树分析

野生型中功能的SPL29有15个外显子，编码489个氨基酸的蛋白质（序列见SeqIDNo.3）。突变体中由于G到T的点突变，导致编码的第238个氨基酸由甘氨酸（Gly）变为半胱氨酸（Cys）。根据Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/）分析，SPL29是UDPGP基因家族中的一个成员。根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的基因注释信息，SPL29编码一个UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP1）蛋白。该蛋白的同源物在植物、动物、真菌和原生生物等真核生物中广泛存在，表明其可能是一个功能保守的重要蛋白。

SPL29蛋白、SPL29蛋白在真核生物中的同源蛋白（UAP）、细菌中行使UAP酶活的蛋白以及植物UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）蛋白，它们的全长氨基酸序列用于系统进化树的构建。采用MEGA5.1构建NJ系统进化树，执行了1000次bootstrap重复。结果如图3A所示，植物、动物、真菌和原生生物等真核生物中的UAP蛋白在一个大的进化分支，表明它们的进化保守性；植物UGP蛋白在另一个进化分支；细菌中行使UAP酶活的蛋白（EcGlmU）跟真核生物的UAP蛋白不在一个分支。与SPL29的氨基酸序列同源性比较发现，所比较的真核生物UAP氨基酸与SPL29的氨基酸序列同源性在30%以上（图3B）。

实施例2SPL29基因的点突变导致的叶片早衰的鉴定

1、叶绿素含量的检测

在突变体spl29出现斑点叶后取叶片材料，取样时期分别为苗期（对应于图1D的叶片）和分蘖期（对应于图1E的第3叶），提取并计算叶绿素含量。叶绿素提取步骤如下：

将叶片剪碎用液氮研磨，取0.1g样品，加入5mL80%丙酮，4℃遮光抽提2h，再于4℃下14000rpm离心10min，取上清稀释5倍后，吸取200μL测定663nm和647nm处的吸光度，并计算叶绿素含量。计算公式如下：

Ca=12.25A663-2.79A647，

Cb=21.50A647-5.10A663，

Ca+b=7.15A663+18.71A647，

单位：μg/mL

故叶片中的叶绿素含量为：（5*5*Ca+b）/0.1，单位μg/gFW；FW：鲜重。

结果如图4所示，苗期和分蘖期的叶片在出现突变表型后，spl29叶片中的叶绿素含量都比野生型明显下降。叶片中叶绿素含量的降低，在生理水平上说明了spl29叶片的衰老。

2、叶绿体的超微结构观察

进一步对突变体spl29和野生型的叶片通过透射电镜做了叶绿体的超微结构观察。用于观察的超薄切片的制作方法如下：

苗期（对应于图1D的叶片）在突变体出现表型后取叶片，剪成小块，突变体spl29的样品块含有表型斑点。将样品置于含有2.5%戊二醛的PBS（pH7.2）溶液中，抽真空使叶块沉入EP管底，4℃下前固定4h。样品用PBS溶液洗涤，再后固定在含有1%（v/v）四氧化锇的PBS中。再用乙醇梯度液脱水，然后将样品浸透和包埋在Spurr树脂中。样品在用超微切片机切片，超薄切片再用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。制作好的超薄切片在透射电子显微镜下观察。

叶绿体电镜观察结果如图5显示，野生型的叶绿体发育完全，叶绿体膜完整（图5A-C）；spl29的叶绿体发育正常，但叶绿体膜破裂（图5D-F），有的细胞还出现叶绿体的溶解（图5G-I）。突变体spl29中叶绿体不可挽救的破坏与叶片快速衰老的表型一致。突变体中叶绿体的降解在细胞水平上说明了spl29的叶片衰老。

3、衰老的分子检测

叶片衰老在分子水平上受一些基因的控制，一些衰老转录因子和衰老相关基因在叶片衰老时会表达上调。实验采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法，检测这些基因的表达情况。

在植株苗期（对应于图1D的叶片）和分蘖期（对应于图1E的第3叶），叶片出现表型后，取叶片，立即在液氮中研磨粉碎，取约0.1g粉末到1mLTRIzol试剂（Invitrogen）中，存储于-80℃下以保护RNA的完整性。总RNA的提取按照TRIzol（Invitrogen）说明书进行。

提取的RNA，用DNaseI（ThermoScientific）处理，消化掉DNA，再用氯仿萃取去除DNaseI后，用无水乙醇沉淀RNA，最后溶于50μL无RNase污染的水中。取1μL样品，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完成性，呈现明亮的28S和18S两条带。

取5μg左右RNA，以Oligod(T)₁₈为引物，用M-MLV反转录酶（Promega）将RNA反转录成cDNA。反转录操作按说明书进行。

以稀释10倍的cDNA为模板，设计引物进行qRT-PCR，实验所用仪器为Bio-RadCFX96^TM实时系统（Real-timesystem），试剂为iQ^TMSYBRGreenSupermix（Bio-Rad），定量PCR结果经Bio-RadCFXManager软件分析，所有定量表达结果都以3种内参基因（UBC，Profilin-2和Actin1）作为对照。用于qRT-PCR检测的基因引物如表3所示。

表3.qRT-PCR引物

上述qRT-PCR反应体系10μL，由下列成分组成：ddH₂O2.8μL，cDNA模板2μL，2×iQ^TMSYBRGreenSupermix（Bio-Rad）5μL，引物P1/引物P2（10μM）0.2μL。qRT-PCR反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃10s，72℃15s，40个循环；然后从65℃到95℃做溶解曲线。

基因的相对表达结果如图6所示，在spl29表型出现后，无论是苗期还是分蘖期的叶片，spl29中衰老转录因子（OsWRKY23，OsWRKY72和OsNAC2）表达上调（图6A-B）；spl29中衰老相关基因（Osl2，Osl30，Osl43和Osl85）表达也上调（图6C-D）。这在分子水平上说明了spl29中衰老的发生。这也说明了spl29的快速叶衰老是一个主动调节的过程。

实施例3SPL29基因的点突变导致植株抗性水平的提高

1、抗白叶枯病的检测

菲律宾白叶枯病菌小种PXO99用于接种实验。PXO99病原菌在PSA培养基上于28℃培养72h，将培养好的白叶枯病菌用无菌水重悬，使600nm处的光吸收值为0.5，采用剪叶法接种到田间生长约45天处于分蘖期的植株叶片上。白叶枯菌接种5-7颗水稻植株，每个植株上各个分蘖的完全展开的第二、三叶用于接种。接种后12天观察并测量病斑长度。结果如图7A所示，突变体spl29植株叶片呈现了很好的白叶枯病菌抗性；根据不同种类的白叶枯病菌，突变体的平均叶病斑长度为0.02-1.53cm，而在野生型叶片中为1.87-9.87cm。

上述PSA培养基配置方法：300g去皮马铃薯煮沸，纱布过滤；加入0.5g硝酸钙，2g磷酸二氢钠，15g蔗糖，5g蛋白胨，20g琼脂粉，加水至1L；pH6.8-7.0。

2、抗性基因的表达情况

进一步利用qRT-PCR的方法，检测了spl29和野生型叶片中4个防御反应相关的抗性基因（PR1a，PBZ1，PO-C1和OsWRKY45）的表达情况。取材、RNA提取、cDNA的合成以及qRT-PCR操作和分析，与实施例2中的相同。用于qRT-PCR的基因引物见表3。结果如图7B和C显示，无论是苗期还是分蘖期，突变体spl29出现表型后，这4个防御反应相关的抗性基因（PR1a，PBZ1，PO-C1和OsWRKY45）在spl29中都表达上调。这说明与出现的类病斑表型相对应，突变体spl29的自身防御反应也被积极地启动了。

虽然以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的实施例。本领域技术人员应当理解，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的修改和变化，均属于本发明所要保护的范围。另外，本发明说明书和权利要求书中所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。

Claims (2)

1.一种水稻斑点叶性状的突变体spl29基因，其特征在于：该水稻斑点叶性状的突变体spl29基因的编码核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，其所对应的野生型控制基因SPL29的编码核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。

2.权利要求1所述的水稻斑点叶性状的突变体spl29基因在控制水稻植株早衰和/或抗水稻白叶枯病方面的应用。