JP7110119B2 - 改変インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの修飾 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年6月3日に出願された米国仮出願第62/345,502号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の全体が参照によって本明細書に援用される。
(i)改変HAポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変HAポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
(ii)別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、改変HAポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、改変HAポリペプチドの頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する配列に基づいて、一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のN結合型グリコシル化部位を改変HAポリペプチドに挿入することと、
(iii)一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位(RBS)の15オングストローム以内(例えば、10、9、8、7、6、5オングストローム以内など)に導入することであって、RBSは三次元(3-D)構造において、W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、あるいは、RBSは、モノクローナル抗体CH65のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がCH65のエピトープに隣接して(例えば、100アミノ酸残基以内、75アミノ酸残基以内、50アミノ酸残基以内、40アミノ酸残基以内、30アミノ酸残基以内、25アミノ酸残基以内、20アミノ酸残基以内、15アミノ酸残基以内、10アミノ酸残基以内、5アミノ酸残基以内などで)存在する、該導入することと、
(iv)表4、表5、表6、表7、表8、または表9に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、改変HAポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生じさせる、該方法を提供する。
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して記載されている。
(発明を実施するための形態)
本発明を用いて、種々の組換え技術を使用して生成される任意のHAポリペプチドを含めた任意の改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドを修飾することができる。本発明の実施形態を、当業者によって使用される任意の方法の産物に適用して、ワクチン目的のための改良した特性を備えたHAポリペプチドを生成することができる。本発明の実施形態で使用するための改変HAポリペプチドを生成するのに適用可能な方法には、COBRA(コンピュータ最適化広域反応性抗原:computationally optimized broadly reactive antigens)技術、モザイク技術、逆行遺伝学、タンパク質工学、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および/もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせによる、HA改変ポリペプチドの生成が含まれる。これらの先行の検討には、米国仮特許出願第62/005,670号、国際公開第2012/177760号、国際公開第2013/148164号、米国特許出願公開第20140147459号、国際公開第2013/043729号、米国特許出願公開第20140286981号、米国特許出願公開第2014-0050759号、米国特許第8685410号、国際公開第2015/028478号、米国特許出願公開第2010-0074915号に記載のものが含まれ、これらの各々は参照により本明細書に援用される。
本発明の実施形態を用いて、改変HAポリペプチドの免疫原性プロファイルを修正または変更することができ、詳細には、改変HAポリペプチドが免疫応答(例えば、中和抗体応答)を誘発することができる対象となるインフルエンザ株の多様性を拡充することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、循環インフルエンザ株に含まれる配列変異のin silico分析から推定した、抗原領域のマッピングから推定した、ならびに/または異なるまたは別個の免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドと比較した場合のHAペプチドのエピトープパターンおよび構造分析から推定した修飾に基づくものである。既知の免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドの種々のアミノ酸残基位置および/または特定の領域で、標的修飾を、別の免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来の対応する配列に基づいて導入することで、改良され、よりバランスの取れた免疫プロファイルを備えた新規のHAポリペプチドを得ることができる。修飾の位置、種類、および数を選択し、組み合わせて、特定の免疫応答を誘発するように調整された免疫原性プロファイル(例えば、バランスの取れた免疫プロファイル、パンデミック株に対する改良された「より多くのパンデミック」応答など)を有する再設計されたHAポリペプチドを生成することができる。一部の実施形態では、修飾戦略は、受容体結合部位(RBS)の近傍領域において操作された修飾を持つ宿主HAポリペプチドのRBSの特定の残基を、総じて保持するように策定されている。修飾戦略の例を以下に説明する。
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRXXEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(配列番号2)
一部の実施形態では、改変HAポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、既知の免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、別の免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドのステム領域に融合することに基づいている。例えば、本発明の方法は、既知の免疫プロファイルを備えた改変HAポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変HAポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、を含み得る。一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変HAポリペプチドの選択された頭部領域は、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドのステム領域に融合され得る。逆に、一部の実施形態では、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた改変HAポリペプチドの選択された頭部領域が、支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドのステム領域に融合されてもよい。
MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(配列番号1)
一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号1の残基63~278、125~277、または135~269に相当するアミノ酸配列を含むように選択される。本明細書で使用される場合、用語「相当する」は、対象となるHAポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置/同一性を示すのに使用される。簡略化を目的として、HAポリペプチドの残基は、基準関連ポリペプチドに基づくカノニカルナンバリングシステムを使用して指定され、それによって、例えば63位の残基に「相当する」アミノ酸は、実際には必ずしも特定のアミノ酸鎖における63番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ基準ポリペプチドの63番目に見出される残基に相当するということを、当業者は認識しているであろう。当業者であれば、どのようにして「相当する」アミノ酸を特定するかを、例えば種々の配列アライメントツールを用いることによって容易に認識するものである。一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号1のアミノ酸残基63~278、125~277、または135~269に、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、改変HAポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、HAポリペプチドの球状頭部領域における予測または推定N結合型グリコシル化部位に関連する残基への修飾に基づくものである。通例、推定または予測N結合型グリコシル化部位は、NxS/Ty(式中、xとyはPではない)のコンセンサス配列によって定義されている。季節性HAポリペプチドは通例、パンデミックまたはパンデミック様のHAポリペプチドと比較すると、追加のN結合型グリコシル化部位を受容体結合部位(RBS)の領域に含む。標的季節性または季節性様の改変HAポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、グリコシル化部位を切断し、より多くのパンデミックグリコシル化プロファイルを改変HAポリペプチドに付与するように変異され得る。特定の実施形態では、標的季節性または季節性様の改変HAポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、標的HAポリペプチドのグリコシル化および免疫原性プロファイルが、よりパンデミックとなるように変更することを目的として、パンデミックまたはパンデミック様のHAポリペプチド(例えば、カリフォルニア/07/2009)の対応する位置で観察される残基に変異され得るか、または置換され得る。
一部の実施形態では、改変HAポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更することは、一つ以上のアミノ酸置換を、RBS領域またはRBS領域に隣接した領域に導入することによって成し遂げられ得る。例えば、一つ以上のアミノ酸置換は、標的の改変HAポリペプチドの(CA09ナンバリング)の60および291に相当する残基を包含する領域内のアミノ酸位置に導入され得る。一つ以上のアミノ酸置換を、受容体結合部位(RBS)であって、三次元(3-D)構造において、保存残基W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内(例えば、10、9、8、7、6、5オングストローム以内)の全てのアミノ酸残基として定められている、該RBSの15オングストローム以内(例えば、10、9、8、7、6、5オングストローム以内)に導入することができる。例えば、修飾がRBSの10オングストローム内で生じる実施形態では、修飾は保存されたW167から15~25オングストロームの間で生じる。一部の実施形態では、RBSは広範に中和するモノクローナル抗体CH65に結合するエピトープによって定義され得る(例えば、Whittle JR,et al.Broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin.Proc Natl Acad Sci USA.2011;108:14216-21を参照)。こうした実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換がCH65のエピトープに隣接して(例えば、100アミノ酸残基以内、75アミノ酸残基以内、50アミノ酸残基以内、40アミノ酸残基以内、30アミノ酸残基以内、25アミノ酸残基以内、20アミノ酸残基以内、15アミノ酸残基以内、10アミノ酸残基以内、5アミノ酸残基以内などで)存在するか、またはCH65のエピトープの15オングストローム内に存在する。一部の実施形態では、各アミノ酸置換は、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイル(例えば、循環季節性またはパンデミックのインフルエンザ株)を備えたHAポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む。例えば、支配的季節性免疫プロファイルを備える改変HAポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、よりパンデミックになるように変更され得る。逆に、支配的パンデミック免疫プロファイルを備える改変HAポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、より季節性になるように変更され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の種々の方法に従って生成した、修飾された組換えHAポリペプチドを、所望の発現および構造について評価することができる。スクリーニング法は、当該技術分野で周知であり、細胞フリーアッセイ、細胞ベースアッセイ、および動物アッセイを含む。in vitroアッセイは、固体状態または溶解性の標的分子検出法であり、当該技術分野で既知の様々な方法で実施することができ、標的分子(例えば、免疫グロブリン)に結合する改変HAポリペプチドを特定することができる標識または検出基の使用を含むものである。検出標識を、本発明の改変HAポリペプチドを用いたアッセイと併用して使用することができる。例えば、本明細書に記載の組換えHAポリペプチドを、2015年5月29日に出願された「Expression and Conformational Analysis of Engineered Influenza Hemagglutinin」と題する国際特許出願PCT/US2015/033205号に記載のアッセイにより測定された発現および構造的特徴に基づいて選択することができる。
本明細書に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチドは、当該技術分野で既知の分子生物学的方法を用いて核酸分子から産生され得る。核酸分子は、適正な宿主細胞に導入された際にHAポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適正な宿主細胞として、以下に限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞が挙げられる。DNA断片をベクターに挿入するための当業者に既知の方法のいずれかを用いて、転写/翻訳制御シグナルの制御下で、本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術および合成技術、ならびにin vivo組換えが含まれ得る(Sambrook et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory;Current Protocols in Molecular Biology,Eds.Ausubel,et al.,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NYを参照)。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えHAポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を提供する。インフルエンザVLPは、一部の実施形態では、HAタンパク質、NAタンパク質、およびウイルス構造(例えば、HIVgag)タンパク質から構成されるのが一般的である。インフルエンザVLPの産生については、当該技術分野で知られており、本開示を読む当業者に容易に明らかになるであろう。例えば、インフルエンザVLPは、HAタンパク質、NAタンパク質、およびHIVgagタンパク質をコードするプラスミドを用いた、宿主細胞のトランスフェクションによって産生することができる。一例を挙げると、好適な宿主細胞にはヒト細胞(例えば、HEK293T)が含まれる。タンパク質の発現を可能にするのに適正な時間の間(およそ72時間の間など)トランスフェクトされた細胞をインキュベートした後に、VLPを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザVLPを、インフルエンザワクチンとして用いて、H1N1インフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発することができる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えHAポリペプチドおよび/または関連実体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、修飾された組換えHAポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかるポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、かかるポリペプチドもしくは断片に結合するおよび/またはこれらと競合する抗体、かかるポリペプチドもしくは該ポリペプチドに結合するグリカンと相互作用または競合する少分子などが、本発明の医薬組成物に含まれる。
本実施例は、インフルエンザHAタンパク質の球状頭部領域(RBSを含む)を受容体HAステムに融合することによって免疫学的プロファイルに関する範囲が増加した、改変HAポリペプチドの設計および評価について説明する。季節性免疫プロファイルを示すHAポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、パンデミック様株(ニュージャージー/1976、サウスカロライナ/1918、カリフォルニア/07/2009、および新規な改変パンデミックHA)由来のHA分子のステム領域に融合した。HAの球状頭部の三つの異なる領域(RBS00、RBS01、およびRBS02と定義されている、図1)を融合に関して評価した。
固定された細胞を洗浄し、200マイクロリットルのPBSに再懸濁してから、BDハイスループットサンプラー(High-Throughput Sampler)を用いてサンプルを取得するためにディープウェル96ウェルプレートに移した。サンプルの分析を、488nmレーザー(Alexa Fluor(登録商標)488励起用)と635nmレーザー(LIVE/DEAD近赤外色素励起用)とを備えたBD FACS Caliburフローサイトメーターを用いて行った。Alexa Fluor(登録商標)488の二次抗体で染色したが、一次抗体のない模擬トランスフェクト細胞サンプルを用いて、最適な取得設定条件を決定した。特定の前方散乱(FSC)増幅利得、側面散乱(SSC)電圧、およびFSC閾値を調整して、HEK293FT細胞集団の規模を示し、不必要な壊死組織片を排除した。細胞集団をFSC対SSCプロットでゲーティングして、さらに壊死組織片を排除した。さらに蛍光検出器の設定を、二次抗体のみで染色された模擬トランスフェクトされた細胞を用いて調整した。詳細には、FL1検出器(Alexa Fluor(登録商標)488蛍光検出用)とFL4検出器(LIVE/DEAD近赤外色素蛍光検出用)の電圧を調整して、ゲーティングした細胞集団の蛍光発光を第一対数に据えた。Alexa Fluor(登録商標)488とLIVE/DEAD近赤外色素との間にスペクトルのオーバーラップがないため、この蛍光体の組み合わせには補償調整が必要ではなかった。全てのサンプルを、模擬対照と同一の取得設定を用いて取得した。FSC対SSCゲート内の少なくとも10,000個の細胞を各サンプルに対してカウントし、データをFCSデータファイルとして保存した。
本実施例は、予想N結合型グリコシル化部位と関連する残基を修飾し、RBSと接するループにリジンを導入することによって、改変HAポリペプチドの免疫学的範囲を増加させるための第二の戦略を説明する。季節性インフルエンザ株は、パンデミック株に比べて、さらなる推定N結合型グリコシル化部位を含んでいる。グリコシル化は、免疫応答を変えるHA内で抗原部位をブロックする可能性がある。こうしたグリコシル化部位は、配列モチーフNxS/Ty(式中、xおよびyはプロリン(P)ではない)により特定される。このN結合型グリコシル化パターンにおけるアスパラギンは、受容体結合部位の142と177と(CA09ナンバリング)に相当する残基の近傍またはこれらの残基におけるHAポリペプチド内で見つけられ得る(図6;左のパネルは野生型パンデミックH1N1株の関連配列と、改変HAポリペプチドの例(「DO2」)の対応するグリコシル化配列とを示している)。
本実施例は、HAのRBS領域またはRBSに近接した領域における、アミノ酸置換の導入による改変HAポリペプチドへの修飾を説明する。アミノ酸置換は位置特異的であり、循環インフルエンザウイルスA型におけるHAの頭部領域の分析から特定される残基に由来する。表6には、残基60~291(CA/09ナンバリングに準拠)を包含する特定位置の残基のプールが記載されており、そこから、HAの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。残基137~262(CA/09ナンバリングに準拠)を包含する特定位置の残基のより少ないプールは表7に記載されており、そこから、HAの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。表8には、RBSの10オングストローム以内の残基に対してHAの免疫学的プロファイルの標的修飾をするために使用される、残基のプールが記載されている。これらの残基を、図9のシェーディングで示している。
この実施例は、本明細書に記載の方法により修飾された改変HAポリペプチドが、いくつかのインフルエンザ株に対する広範な抗体応答の形で免疫応答を誘発することを示すものである。
インフルエンザVLPを、無血清Freestyle293培地で、HEK293T細胞の3種プラスミド一過性トランスフェクションにより調製する。改変HAポリペプチド配列コードするプラスミドと、NA配列のプラスミドと、HIVgagのプラスミドとを、1:1:1の比率で混合し、HEK293T細胞を一過性トランスフェクトするのに使用する。培養上清をトランスフェクションの120時間後に回収し、上清中のVLPを超遠心分離法により20%スクロースクッション上にペレット化し、PBSで再懸濁する。
改変モザイクHAデザインの免疫原性を評価するために、6~8週齢の雌のBALB/cマウスグループを5μgのインフルエンザVLPまたは媒体単体(PBS)で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、総量100μlで皮下に送達される。各グループは最初の免疫接種の21日後に同様のブースター投与を受ける。免疫化前(0日目)と免疫化後(35日目)の血清を各動物から採取する。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて30分間インキュベートする。続いて、各血清/ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の0.5%のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから(約30分)、プレートをスコア化する。HAI力価を、評価したウェルの50%で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、ウイルスの100の50%組織培養感染用量(TCID50)と混合し、37℃で1時間インキュベートする。続いて、各血清/ウイルス混合物をMadin Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞の融合単層に加えて、37℃で24時間インキュベートする。次に単層を固定して、インフルエンザ核タンパク質のELISA検出に基づいて、感染したウェルを特定する。MN力価を、評価したウェルの50%でウイルス感染の完全な中和をもたらす血清の最大希釈として定義する。
HAIアッセイを、受容体ステム領域に融合されたRBS領域、推定N結合型グリコシル化部位を除去もしくは改変する修飾、および/またはRBS領域の残基への標的修飾を備えた、修飾された組換えHAポリペプチドを用いて行う。これらの修飾された組換えHAポリペプチドは、広範な免疫応答を誘発する。
この実施例は、本明細書に記載の種々の方法を用いて生成された修飾組換えHAポリペプチドの例を示すものである。
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本出願はまた、本明細書に記載の配列のいずれか一つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有する修飾された組換えHAポリペプチドを包含する。
DO2a脱グリコシル化/RBS修飾がパンデミックA/カリフォルニア/09チャレンジに対する抗体応答の範囲および防御に及ぼす影響を評価するために、さらなるデザインを選択した。SMARtDO2a RBSの再設計によって、抗体を広範に中和することによる認識が改善されたが、これはMFIアッセイにおいて脱グリコシル化構築物に結合する4K8の増加によって示されている(図10)。元のSMARt DO2aデザインは、in vivoでの評価に基づいて季節性に偏っており、発明者らはそのデザインを修飾して、パンデミック株にまで範囲を拡張した。mAbのパネルを用いたin vitroアッセイは、パンデミックmAbが、修飾されたデザインのうちのいくつかに結合することを示した。デザインのサブセットを、A/カリフォルニア/07/2009に対するマウスチャレンジモデルで評価した。その結果は、修飾がパンデミックA型インフルエンザに対する免疫プロファイルを改善することを示している。
再設計されたモザイクHAデザインの免疫原性を評価するために、6~8週齢の雌のBALB/cマウスグループを3μgのインフルエンザVLPまたは媒体単体(PBS)で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、表10に示すように、総量100μlで筋肉内に送達される。各グループは最初の免疫接種の21日後および42日後に二つの同様のブースター投与を受ける。免疫化前の血清を0日目に各動物から採取する。免疫化後の血清を、42日目、56日目、および69日目に各動物から採取する。図11は、免疫化とそれに続くin vivo評価のスケジュールを示している。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
動物を10回チャレンジし、チャレンジ後に70日目のパンデミックA/カリフォルニア/2009のLD50と生存とをモニターした。媒体単体で免疫化した動物がチャレンジの6日後に100%の死亡率となったのに比べて、元のSMARtDO2aを用いた免疫化はA/カリフォルニア/09チャレンジに対して防御的であり、動物の80%がチャレンジの14日後に生存していた。次世代DO2a修飾により、元のSMARtDO2aと比べて生存率が改善しており、SMARtDO2a_m8による免疫化は評価した動物の100%の防御に効果的であった(図12)。
マウスを、ウイルス肺力価に関してチャレンジ4日後にさらにモニターした。SMARtDO2a構築物での免疫化により、ウイルス肺力価がPBSに比べて低くなった。SMARtDO2a_m8構築物により、肺力価がPBSに比べて1/10に減少し、他の全てのDO2a構築物よりも有意に低いウイルス肺力価となった(図14)
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて30分間インキュベートする。続いて、各血清/ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の0.5%のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから(約30分)、プレートをスコア化する。HAI力価を、評価したウェルの50%で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。SMARtDO2a_m8マウスにおけるA/カリフォルニア/09HAI応答は、PBSとは有意に異なる(P<0.001)が、6/24のマウスのみは、等しいか、または1:40よりも高いHAI力価を有した(図15)。全ての他のDO2a構築物に関する防御のメカニズムは明らかではない。
「第一」、「第二」、「第三」などの序数用語を、構成要素を修飾するために特許請求の範囲において使用することは、それ自体、いかなる優先度、優先順位、もしくは一構成要素の別の要素への優先順序、または方法の行為が実施される時間的順序を意味するものではないが、特定の名称を有する一構成要素を同一の名称(序数用語の使用を除いて)を有する別の要素と区別して、構成要素を識別するためのラベルとしてのみ使用されている。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチドであって、
支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変HAポリペプチド由来の改変頭部領域と、
パンデミック株由来のステム領域と、を含む、前記ポリペプチド。
(項目2)
前記改変頭部領域が、配列番号1(SMARt_DO2a配列)の135~269位、125~277位、または63~278位に相当するアミノ酸に対して少なくとも95%同一の配列を含む、項目1に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド
(項目3)
前記配列が、配列番号1(SMARt_DO2a配列)の135~269位、125~277位、または63~278位に相当するアミノ酸に対して少なくとも96%同一である、項目2に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目4)
前記配列が、配列番号1(SMARt_DO2a配列)の135~269位、125~277位、または63~278位に相当するアミノ酸に対して少なくとも98%同一である、項目2または項目3に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目5)
前記配列が、配列番号1(SMARt_DO2a配列)の135~269位、125~277位、または63~278位に相当するアミノ酸に対して同一である、項目2から項目4のいずれか1項に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目6)
前記ステム領域が天然に存在するパンデミック株由来である、先行項目のいずれか1項に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目7)
前記天然に存在するパンデミック株がA/カリフォルニア/07/2009、A/ニュージャージー/10/1976、またはA/サウスカロライナ/1/1918から選択される、項目6に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目8)
前記ステム領域がパンデミック免疫プロファイルを有する改変HAポリペプチド由来である、先行項目のいずれか1項に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目9)
パンデミック免疫プロファイルを有する前記改変HAポリペプチドが、COBRA(コンピュータ最適化広域反応性抗原:computationally optimized broadly reactive antigens)技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および/もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、項目8に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
(項目10)
支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来であり、かつNxS/Ty(xとyはPではない)のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位において、前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位が破壊されるように、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目11)
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来であり、かつNxS/Ty(xとyはPではない)のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の改変された推定N結合型グリコシル化部位を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上の改変された推定N結合型グリコシル化部位が、季節性株の対応する配列に基づいて、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変されている、組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目12)
前記ヘマグルチニンがA型インフルエンザに対応する、項目10または項目11に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
(項目13)
前記A型インフルエンザがサブタイプH1N1である、項目12に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
(項目14)
前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位が、(CA09ナンバリング)の142~145位および/または177~179位に相当する、項目10から項目13のいずれか1項に記載の組換えヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目15)
前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位が、受容体結合部位(RBS)の15オングストローム以内にあり、前記RBSが、三次元(3-D)構造において、W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、項目10から項目13のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目16)
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表4から選択される、項目14に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目17)
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表5から選択される、項目14または項目16に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目18)
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記コンセンサス配列NxS/Tyをz 1 z 2 z 3 z 4 に修飾することを含み、式中、
z 1 は、N、D、K、またはSであり、
z 2 は、Yであるか、または変化せず、
z 3 は、E、D、またはNであり、
z 4 は、I、L、P、S、もしくはTであるか、または変化しない、項目10から項目17のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目19)
一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が誘導されるパンデミック株または季節性株が、循環インフルエンザ株である、項目10から項目18のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目20)
前記循環インフルエンザ株が、A/カリフォルニア/07/2009およびA/サウスカロライナ/1/1918からなる群から選択される、項目19に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目21)
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記NxS/Tyコンセンサス配列の1~5アミノ酸以内へのリジン(K)残基またはアルギニン(R)残基の挿入を含む、項目10から項目20のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目22)
前記リジン(K)残基またはアルギニン(R)残基が前記NxS/Tyコンセンサス配列の1~5アミノ酸3’内にある、項目21に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目23)
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、A/カリフォルニア/07/2009の147に相当する位置での挿入を含む、項目10から項目21のいずれかに記載の組換えHAポリペプチド。
(項目24)
147に相当する位置での前記挿入が、リジン(K)またはアルギニン(R)の挿入を含む、項目23に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目25)
支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来であり、かつ60と291と(CA09ナンバリング)に相当する位置の間に一つ以上のアミノ酸置換を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目26)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6から選択される、項目25に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目27)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、137と262と(CA09ナンバリング)に相当する位置の間にあり、前記一つ以上のアミノ酸置換が表7から選択される、項目25に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目28)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6または表7から選択される2個以上のアミノ酸置換を含む、項目25から項目27のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目29)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6または表7から選択される3個以上のアミノ酸置換を含む、項目25から項目28のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目30)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6または表7から選択される5個以上のアミノ酸置換を含む、項目25から項目29のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目31)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6または表7から選択される10個以上のアミノ酸置換を含む、項目25から項目30のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目32)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表6または表7から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、または10個の連続する置換を含む、項目25から項目31のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目33)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、244、245、および/または262(CA09ナンバリング)に相当する位置で起こる、項目25から項目32のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目34)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、137、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、244、および/または245(CA09ナンバリング)に相当する位置で起こる、項目25から項目33のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目35)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、および/または262(CA09ナンバリング)に相当する位置で起こる、項目25から項目33のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目36)
支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来であり、かつ受容体結合部位(RBS)の15オングストローム以内に一つ以上のアミノ酸置換を含み、前記RBSが、三次元(3-D)構造において、W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目37)
前記パンデミック株が循環インフルエンザウイルスである、項目36に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目38)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、受容体結合部位(RBS)の10オングストローム以内にある、項目36に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目39)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される、項目36に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目40)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される2個以上のアミノ酸置換を含む、項目38または項目39に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目41)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される3個以上のアミノ酸置換を含む、項目38から項目40のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目42)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される5個以上のアミノ酸置換を含む、項目38から項目41のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目43)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される10個以上のアミノ酸置換を含む、項目38から項目42のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目44)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表8から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、または10個の連続する置換を含む、項目38から項目43のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目45)
前記一つ以上のアミノ酸置換が、137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、および/または214(CA09ナンバリング)に相当する位置で起こる、項目38から項目44のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目46)
支配的季節性免疫プロファイルを備えたHAポリペプチド由来であり、かつ表9から選択される一つ以上のアミノ酸修飾を含む、改変頭部領域を備えた、組換えインフルエンザヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
(項目47)
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記HAポリペプチドまたは支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが、COBRA(コンピュータ最適化広域反応性抗原:computationally optimized broadly reactive antigens)技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および/もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、先行項目のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目48)
前記組換えHAポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発する、先行項目のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目49)
前記組換えHAポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対する、よりバランスの取れた免疫原性プロファイルによって特徴付けられている、先行項目のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチド。
(項目50)
先行項目のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチドをコードする単離された核酸。
(項目51)
項目50に記載の核酸を含むベクター。
(項目52)
項目51に記載のベクターを含む単離された細胞。
(項目53)
前記細胞がヒトである、項目52に記載の単離された細胞。
(項目54)
項目1から項目47のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)。
(項目55)
インフルエンザノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)gagタンパク質、またはその両方をさらに含む、項目49に記載のインフルエンザVLP。
(項目56)
項目1から項目47のいずれか1項に記載の組換えHAポリペプチドを含む医薬組成物。
(項目57)
項目54または項目55に記載のインフルエンザVLPを含む医薬組成物。
(項目58)
季節性およびパンデミックのインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、項目56または項目57に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目59)
改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
前記改変HAポリペプチドの頭部領域を選択することと、
前記改変HAポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域を置換し、それによって、変更された免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生成することと、を含む、前記方法。
(項目60)
前記改変HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有する、項目59の方法。
(項目61)
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記改変HAポリペプチドの前記選択された頭部領域が、配列番号1(SMARt_DO2a配列)の残基63~278、125~277、または135~269に相当する、項目60に記載の方法。
(項目62)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号2(完全長野生型NC09(A/カリフォルニア/07/2009HA配列)配列)の63~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の63~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目64)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の63~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目65)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号2(完全長野生型NC09配列)の125~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目66)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の125~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目67)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の125~277の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目68)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号2(完全長野生型NC09配列)の135~269の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目69)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の135~269の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目70)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の135~269の残基を含む、項目61に記載の方法。
(項目71)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドが、野生型インフルエンザウイルス由来のHAポリペプチドである、項目61から項目70のいずれか1項に記載の方法。
(項目72)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドが、改変HAポリペプチドである、項目61から項目70のいずれか1項に記載の方法。
(項目73)
別の免疫原性プロファイル(支配的パンデミック)を備えた前記HAポリペプチドが、配列番号5(DO1Aの完全長配列)を含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記改変HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有する、項目59の方法。
(項目75)
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記改変HAポリペプチドの選択された頭部領域が、
配列番号2(完全長野生型NC09(A/カリフォルニア/07/2009HA配列)配列)の63~277の残基と、
配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の63~277の残基と、
配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の63~277の残基と、
配列番号2(完全長野生型NC09配列)の125~277の残基と、
配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の125~277の残基と、
配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の125~277の残基と、
配列番号2(完全長野生型NC09配列)の135~269の残基と、
配列番号3(完全長野生型SC1918配列)の135~269の残基と、
配列番号4(完全長野生型NJ1976配列)の135~269の残基と、からなる群から選択される、項目74に記載の方法。
(項目76)
別の免疫原性プロファイル(支配的季節性)を備えた前記HAポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号1(SMARt_DO2aの完全長配列)の残基63~278、125~277、または135~269を含む、項目74または項目75に記載の方法。
(項目77)
前記再設計されたHAポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目59から項目76のいずれかに記載の方法。
(項目78)
前記再設計されたHAポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目59から項目76のいずれかに記載の方法。
(項目79)
改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変HAポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、
前記改変HAポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のN結合型グリコシル化部位を挿入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを有する再設計されたHAポリペプチドを生じさせることと、を含む方法。
(項目80)
前記一つ以上の推定または追加のN結合型グリコシル化部位が、NxS/Ty(xとyはPではない)のコンセンサス配列によって定められる、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記改変HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変HAポリペプチドに導入されて、前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊し、
前記再設計されたHAポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目79または項目80に記載の方法。
(項目82)
前記改変HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変HAポリペプチドに導入されて、追加のN結合型グリコシル化部位を挿入し、
前記再設計されたHAポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目79または項目80に記載の方法。
(項目83)
前記再設計されたHAポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目79から項目82のいずれか1項に記載の方法。
(項目84)
前記再設計されたHAポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目79から項目83のいずれか1項に記載の方法。
(項目85)
改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位(RBS)の15オングストローム以内に導入することであって、前記RBSが、三次元(3-D)構造において、W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、前記導入することを含んでおり、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生じさせる、前記方法。
(項目86)
別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが循環の季節性インフルエンザ株またはパンデミックインフルエンザ株由来である、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記改変HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記再設計されたHAポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目85または項目86に記載の方法。
(項目88)
前記改変HAポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、前記再設計されたHAポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目85または項目86に記載の方法。
(項目89)
前記再設計されたHAポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目85から項目88のいずれか1項に記載の方法。
(項目90)
前記再設計されたHAポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目85から項目89のいずれか1項に記載の方法。
(項目91)
改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
表4、表5、表6、表7、表8、または表9に示されている修飾から選択される一つ以上の修飾を、前記改変HAポリペプチドの一つ以上対応する位置に導入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生じさせることを含む、前記方法。
(項目92)
前記一つ以上の修飾が、137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、244、245、および/または262(CA09ナンバリング)に相当する位置で生じる、項目91に記載の方法。
(項目93)
前記一つ以上の修飾が、137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、および/または214(CA09ナンバリング)に相当する位置で生じる、項目91または項目92に記載の方法。
(項目94)
前記一つ以上の修飾が、表4、表5、表6、表7、表8、または表9で示した修飾から選択される2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、または10個以上の修飾を含む、項目91から項目93のいずれか1項に記載の方法。
(項目95)
前記再設計されたHAポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目91から項目94のいずれか1項に記載の方法。
(項目96)
前記再設計されたHAポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目91から項目95のいずれか1項に記載の方法。
(項目97)
改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
(i)前記改変HAポリペプチドの頭部領域を選択することと、前記改変HAポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
(ii)別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変HAポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、前記改変HAポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記HAポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊もしくは改変するか、または追加のN結合型グリコシル化部位を挿入することと、
(iii)一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位(RBS)の15オングストローム以内に導入することであって、前記RBSが、三次元(3-D)構造において、W167(CA09ナンバリング)に相当する位置の15オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、前記一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたHAポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む、前記導入することと、
(iv)表4、表5、表6、表7、表8、または表9に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、前記改変HAポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生じさせる、前記方法。
(項目98)
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生成することが、季節性インフルエンザ株および/またはパンデミックインフルエンザ株に対する一つ以上の抗頭部モノクローナル抗体の結合を増大させることを含む、項目59から項目97のいずれか1項に記載の方法。
(項目99)
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたHAポリペプチドを生成することが、パンデミックインフルエンザ株に対する抗頭部モノクローナル抗体の結合範囲を増大させることを含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
結合の増加を、哺乳類細胞の表面で発現した再設計されたHAポリペプチドに結合した前記モノクローナル抗体をフローサイトメトリーで検出することによって測定する、項目98または項目99に記載の方法。
(項目101)
モノクローナル抗体の結合のレベルを定量化することをさらに含む、項目100に記載の方法。
(項目102)
項目57から項目101のいずれか1項に記載の方法による再設計されたヘマグルチニン(HA)ポリペプチド。
Claims (17)
- 改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
a)改変HAポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位の有無を判定することであって、前記頭部領域が、カリフォルニア09ナンバリング(CA09ナンバリング)に従って配列番号1の残基63~278、125~277、または135~269に相当する位置の前記改変HAポリペプチドのセグメントである、ことと、
b)前記改変HAポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のN結合型グリコシル化部位を挿入し、それにより、前記改変HAポリペプチドと比較して変更された免疫原性プロファイルを有する再設計されたHAポリペプチドを生じさせることと、
c)前記改変HAポリペプチドの受容体結合部位(RBS)領域の前記領域内または前記RBS領域に隣接して一つ以上のアミノ酸の置換を導入すること、および/または、前記改変HAポリペプチドの前記RBSと接するループ(単数または複数)内にリジン(K)残基またはアルギニン(R)残基の挿入を導入することと、
を含む、方法。 - 前記再設計されたHAポリペプチドが、NxS/Tyコンセンサス配列の1~5アミノ酸以内に挿入されたリジン(K)残基またはアルギニン(R)残基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RBSが、モノクローナル抗体CH65のパラトープと結合するエピトープを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位または追加のN結合型グリコシル化部位が、NxS/Ty(xとyはプロリン(P)ではない)のコンセンサス配列によって定められる、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位が、CA09ナンバリングに従う配列番号1の142~145位および/もしくは177~179位に相当する位置にある、請求項1に記載の方法。
- 前記一つ以上の推定N結合型グリコシル化部位を破壊するための前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記コンセンサス配列NxS/Tyをz1z2z3z4に修飾することを含み、式中、
z1は、N、D、K、またはSであり、
z2は、Yであるか、または変化せず、
z3は、E、D、またはNであり、
z4は、I、L、P、S、もしくはTであるか、または変化しない、請求項2に記載の方法。 - 前記再設計されたHAポリペプチドの前記免疫原性プロファイルが、前記改変HAポリペプチドと比べてよりパンデミックである、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドの前記免疫原性プロファイルが前記改変HAポリペプチドと比べてより季節性である、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドが、CA09ナンバリングに従う残基137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、244、245、および/もしくは262に相当する位置に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドが、CA09ナンバリングに従う残基137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、および/もしくは214に相当する位置に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、請求項1から請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、請求項1から請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、請求項1から請求項11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドの前記変更した免疫原性プロファイルが、季節性インフルエンザ株および/またはパンデミックインフルエンザ株に対する一つ以上の抗頭部モノクローナル抗体の結合を増大させることを含む、請求項1から請求項12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再設計されたHAポリペプチドの前記変更した免疫原性プロファイルが、パンデミックインフルエンザ株に対する抗頭部モノクローナル抗体の結合範囲の増大を含む、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載の方法。
- 結合の増加が、哺乳類細胞の表面で発現した前記再設計されたHAポリペプチドに結合した前記モノクローナル抗体のフローサイトメトリー検出によって決定される、請求項13または請求項14に記載の方法。
- モノクローナル抗体の結合のレベルを定量化することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記改変HAポリペプチドが、コンピュータ最適化広域反応性抗原(COBRA)技術、モザイク技術、構造ドメインの欠失および/もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、請求項1に記載の方法。
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