KR20180132981A - 표면 단백질에 단순화된 당화를 가진 바이러스 입자의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

구조 단백질 또는 표면 단백질에 단순화된 당화를 가진 바이러스 입자의 생산 방법을 제공한다. 백신 생산의 타겟으로서 사용되는 경우, 이들 부위의 보존적인 특성으로 바이러스 돌연변이에 대해 민감성이 낮은 백신이 제조된다. 단순화된 당화 프로파일을 가진 바이러스를 생산함에 있어 당화 저해제의 사용을 기술한다. 인플루엔자 바이러스에 대한 예시적인 내용과 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 입자의 생산 방법이 제공된다. A형 인플루엔자 바이러스, NIBRG-14 (H5N1)의 모노-당화된 형태의 생산 방법이 제공된다.

Description

표면 단백질에 단순화된 당화를 가진 바이러스 입자의 생산 방법 {METHODS FOR PRODUCING VIRUS PARTICLES WITH SIMPLIFIED GLYCOSYLATION OF SURFACE PROTEINS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 11월 4일자 미국 가출원번호 61/410,257의 "모노-당화된 인플루엔자 바이로스 헤마글루티닌의 생산 방법"에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 바이러스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단순화된 글리칸을 가진 바이러스 입자를 생산하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단순 당화된 인플루엔자 바이러스 입자의 생산에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 입자 생산에 관한 것이다.
본 발명은 모노-당화된 인플루엔자 바이러스에 대한 예시적인 제조 방법 측면에서 본원에 기술된다. 동일한 방법을 사용하여, 인간 면역결핍성 바이러스 (HIV)와 같은 레트로바이러스, 및 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스 (HCV) 등의 플라비비리대 (flaviviridae) 등의 단순화된 글리칸 구조를 가진 기타 바이러스를 생산할 수 있는 것으로 간주된다.
인플루엔자는 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스에 의해 발병한다. 이러한 바이러스에는 3가지 타입이 있으며, 3가지, 즉 A형, B 형 및 C형의 다른 타입의 인플루엔자를 야기한다. A형의 인플루엔자 바이러스는 포유류 (인간, 돼지, 흰담비, 말) 및 조류를 감염시킨다. 이것은 전세계적인 유행병을 야기하는 타입의 바이러스이기 때문에, 인류에게 매우 중요하다. B형 인플루엔자 바이러스 (간단히, B형 인플루엔자라고도 함)는 인간에게만 감염된다. 이것은 이따금 국지적인 독감 유행을 발생시키기도 한다. C형 인플루엔자 바이러스 역시 인간에게만 감염된다. 이것은 대부분 나이가 어린 시기에 인간에게 감염되며, 드물게는 중증 질환을 발생시킨다.
A형 인플루엔자 바이러스는 인간, 말, 돼지, 흰담비 및 조류 등의 매우 광범위한 포유류에 감염된다. 이것은 유행성 및 대유행성과 연관된 주요 인간 병원체이다. 적어도 15종의 헤마글루티닌(HA: hemagglutinin) 혈청형이 공지되어 있으며, 9종의 뉴라미니다제(NA: neuraminidase) 혈청형이 공지되어 있다. 돼지와 조류가, 인간과 동물 간의 긴밀한 접촉을 통해 인간 개체로 다시 옮겨지는, 유전학적으로, 그리고 항원적으로 다양한 바이러스 풀을 형성하는, 특히 중요한 보고처로 여겨진다. B형 인플루엔자 바이러스는 인간에게만 감염되어 질환을 야기하지만, 보통은 A형 만큼 중증이진 않다. A형 인플루엔자 바이러스와는 다르게, B형 인플루엔자 바이러스는 구분가능한 혈청형을 가지고 있지 않다. 또한, C형 인플루엔자 바이러스도 포유류에만 감염되며, 질환이 발병되는 경우는 드문 편이다. 이것은 A형 및 B형 타입들과 유전학적으로, 그리고 형태학적으로 구분된다.
인플루엔자 바이러스에는, 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 뉴클레오캡시드 (NA) 및 매트릭스 (M) 및 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)인, 4가지 항원이 존재한다. NP는 인간 인플루엔자 바이러스를 분류하는 기준으로 제공되는 3가지 형태, 즉 A, B, C로 확인되는, 타입-특이 항원이다. 매트릭스 단백질 (M 단백질)은 뉴클레오캡시드를 둘러싸고 있으며, 입자 매스의 35-45%를 차지하고 있다. 표면에는 막대형의 돌출부로서 2종의 표면 당단백질이 있다. 헤마글루티닌 (HA)는, 각각 단백질분해 반응을 통해, 하나의 이황화 결합에 의해 공유 결합으로 함께 묶여있던 2개의 서브유닛이, 즉 HA1 및 HA2로 처리되어지는, 3개의 동일한 단백질 체인을 포함하는, 삼량체 전구체 (HAO)로서 먼저 합성된다. HA는 세포 수용체에 대한 바이러스의 부착을 매개한다. 뉴라미니다제 (NA) 분자는 외막에 소량 존재한다. 순환하는 인간 균주들은 해마다 돌연변이를 축적하여, 재발성 유행병을 발생시키는 경향으로 악명이 높다.
진핵 생물에서, 당 잔기들은 통상 4종의 여러가지 아미노산 잔기들과 연결된다. 이들 아미노산 잔기들은 O-연결된 (세린, 트레오닌 및 하이드록시라이신) 및 N-연결된 (아스파라긴)으로 분류된다. O-연결된 당은 골지나 조면 소포체에서 뉴클레오티드 당으로부터 합성된다. N-연결된 당은 공통 전구체로부터 합성된 다음 가공된다. N-연결된 탄수화물 체인의 부가는 당단백질의 폴딩, 소포체에서의 분해 방지, 올리고머화, 생물 활성 및 이동에 중요하다. 특정 Asn 잔기에 N-연결된 올리고사카라이드의 부가는 바이러스의 성숙형 단백질의 활성, 안정성 또는 항원성을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당한다 (Opdenakker G. et al FASEB Journal 7, 1330-1337 1993). 또한, N-연결된 당화가 당단백질의 폴딩, 이동, 세포 표면 발현, 분비 (Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265 1994), 단백질 분해로부터 보호 및 당단백질 용해성 강화에 필수적인 것으로 시사된 바 있다 (Doms et al., Virology 193, 545-562 1993). 바이러스 표면의 당단백질은 정확한 단백질 폴딩 뿐만 아니라 "글리칸 쉴드 (glycan shield)"로서 중화 항체로부터 이를 보호하는데에도 필요하다. 그 결과, 강력한 숙주-특이적인 선택은 거의 잠재적인 N-연결된 당화가 이루어지는 코돈 위치와 연계되어 있다. 따라서, N-연결된 당화 부위는 균주들 및 클레이드(clade) 전체에 보존되는 경향을 보인다.
A형 인플루엔자 바이러스의 유행은 전세계적으로 광범위한 발병과 사망을 계속적으로 야기하고 있다. 미국에서만도, 인구의 5 내지 20%가 매년 A형 인플루엔자 바이러스에 감염되는 것으로 추산되고 있으며, 이로 인해 대략 200,000명이 입원하고, 36,000명이 사망하고 있다. 포괄적인 백신접종 정책들로 인플루엔자 발병율을 억제하기 위한 효과적인 방안이 확립되어 있다. 그러나, 바이러스의 잦은 유전자 변이로 인해 해마다 백신을 재설정하여야 하며, 백신에 존재하는 바이러스 균주와 유행하는 균주가 일치되지 않을 가능성도 존재한다. 따라서, 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 요법은 질환 중증도 뿐만 아니라 전염을 제한하기 위한 중요한 툴이다.
고병원성 H5N1 인플루엔자 바이러스는 2003년 이래 가축과 야생 조류에서 유행되었다 (Li K S et al. (2004) Nature 430:209-213). 2010년 2월부로, 이들 바이러스가 조류 종들 뿐만 아니라 인간 478명에게도 감염된 것으로 확인되었으며, 이중 286건이 치명적인 것으로 확인되었다 (www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html). 고병원성 H5N1 바이러스와 2009 돼지-기원의 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스가 대유행하였으며, 바이러스에서의 추가적인 변화가 치명적인 유행병을 발생시킬 수 있다는 중대한 우려를 가지게 되었다 (Garten R J, et al.(2009) Science 325:197-201, Neumann G, et al. (2009) Nature 459:931-939). 인플루엔자 바이러스가 인간들 간에 효율적으로 전파되는 능력을 획득함으로써, 유행 위협이 되고 있다는 것이 가장 크게 우려된다. 따라서, 인플루엔자 백신은 어떠한 유행에도 대비된 계획의 필수 성분이어야 한다.
인플루엔자 감염을 이해하는데 있어 주요한 도움은, 호흡관에서 특이적으로 시알화된 글리칸 수용체에 결합하여 바이러스가 세포로 도입될 수 있게 하는 바이러스 막 당단백질인, 헤마글루티닌 (HA)에 대한 연구로부터 기인하였다 (Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397; Maines TR, et al. (2009) Science 325:484-487; Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Rev Biochem 69:531-569; van Riel D, et al.(2006) Science 312:399-399). 조류 HA는, 종 장벽을 넘어 인간 개체에 감염되기 위해서는, 수용체-결합 선호성이 α2,3(조류)-연결에서 α2.6(인간)-연결된 시알산 모티프를 포함하는 말단 시알화된 글리칸으로 바뀌어야 하며 (Connor RJ, et al. (1994) Virology 205:17-23), 이러한 전환은 1918년 유행에서와 같이 오직 2번의 돌연변이를 통해 이루어질 수 있다 (Tumpey TM, et al.(2007) Science 315:655-659). 즉, 글리칸 수용체에 대한 인플루엔자의 결합성에 영향을 미치는 인자에 대한 이해가, 유행 가능성이 있는 임의의 미래 크로스오버 인플루엔자 균주들에 대한 방제 방법을 개발하는데, 중요하다.
인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA)은 구형 헤드와 스템 영역으로 구성된 엑토도메인을 가진 동형삼량체성 막 관통 단백질이다 (Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397). 이들 2개의 영역은 N-연결된 올리고사카라이드를 보유하고 있는데 (Keil W, et al. (1985) EMBO J 4:2711-2720), 이 부분이 HA의 기능적인 특성에 영향을 미친다 (Chen ZY, et al. (2008) Vaccine 26:361-371; Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725). HA는 바이러스가 숙주 세포의 수용체에 부착하여, 바이러스 외막이 내포성 소포(endocytic vesicle) 막과 융합하여 감염되는 과정을 개시하는, 비리온 표면 당단백질이다 (Crecelius D. M., et al. (1984) Virology 139, 164-177). 이것은 또한 예방 항체들의 생성을 자극하는 비리온 구성 성분이기도 하다. HA의 당화 특성과 그 수준은, 이의 수용체 결합 특성과 세포변성 (Aytay S., Schulze I. T.(1991) J. Virol . 65, 3022-3028) 및 병독성 (Deshpande K. L., et al. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 84, 36-40)이 강화된 바이러스 변이체의 출현, 및 항원성 부위의 은폐 (Skehel J. J., et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 81, 1779-1783)와 관련된 변이에 연루되어 있다. HA 당화 부위를 돌연변이를 통해 제거하면 바이러스의 수용체 결합성에 영향을 줄 수 있다 (Gunther I, et al. (1993) Virus Res 27:147-160).
HA의 아미노산 서열과, 이의 N-당화 부위의 위치는 바이러스 게놈에 의해 결정된다. 이들 올리고사카라이드의 구조는, HA에서의 이들의 위치(Keil W., et al. (1985) EMBO J. 4, 2711-2710)와 바이러스가 생육하는 숙주 세포로부터 제공받는 생합성 효소 및 트리밍 효소들에 의해, 결정되는 것으로 보인다. 바이러스 게놈의 유연성(plasticity) 및 숙주-특화된 당화 기구는, 이들 한가지 프로세스에 의해 발생될 수 있는 것에 비해, 구조적으로, 그리고 기능적으로, 보다 이종성이 높은 바이러스 집단들을 만들어낼 수 있다. 이들 바이러스의 생존성과, 중화 항체 및 항바이러스제의 저해 효과를 극복하는 능력은, 이러한 다양성 덕분인 것으로 보인다.
HA는 당화되어야 하는 부위, 올리고사카라이드가 없어야하는 다른 부위, 그리고 당화가 바이러스의 생존에 유익하거나 유해할 수 있는 또 다른 부위를 가지고 있는 것으로 보인다. 다양한 동물 및 인간으로부터 분리된 A형 인플루엔자 바이러스의 HA에 특정 위치의 당화 부위들이 고도로 보존되어 있어, 따라서 기능성 HA의 형성 및/또는 유지에 필연적인 것으로 생각된다 (Gallagher P. J., et al. (1992) J. Virol . 66, 7136-7145). 역으로, HA의 특정 영역내 당화 부위의 형성은 세포 표면으로의 이동과, 이의 안정성 및/또는 기능성을 감소시킨다 (Gallagher P., et al. (1988) J. Cell Biol . 107, 2059-2073). 올리고사카라이드 다양성이 바이러스가 생육할 것으로 예상되는 특정 환경에 따라 주된 선택 효과를 가질 수 있는 것은, 당화가 기능성 HA의 형성에 방해가 되지 않거나 또는 필수적이지 않은 영역내에서이다.
당화 부위나 그 근처에서의 펩타이드의 서열 변화는 HA의 3차 구조를 바꾸며, 따라서, 수용체-결합 특이성과 친화성이 달라질 수 있다. 실제, 여러가지 H5N1 서브타입들 유래 HA들이 상이한 글리칸-결합 패턴을 나타낸다 (Stevens J, et al. (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). 전체 바이러스 시스템에서 H1 및 H3의 당화 부위에 대한 돌연변이 유발이 연구되었다 (Chandrasekaran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Deom CM, et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3771-3775). 당화에 있어 변화는 특히 가장 유행성이 높은 H5N1 HA에 대한 수용체-결합 특이성 및 친화성에 영향을 미칠 수 있었다.
헤마글루티닌의 훨씬 저빈도의 당화 영역 또는 비-당화 영역은 숙주 면역 시스템을 피하기 위해 계속적으로 돌연변이가 이루어진다. 미국 특허 공개공보 2010/0247571 (Wong et al.)에는 모노-당화된 HA를 이용한 백신 설계가 개시되어 있다. 이에, 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 입자들을 생산하기 위한 새롭고 효율적인 방법들이 요구되고 있다.
본 발명은 모노-당화된 인플루엔자 바이러스의 예시적인 생산 방법을 제공한다. 본 방법은 구조 단백질에 단순화된 글리칸을 가진 바이러스를 생산하는데에도 동일하게 적용가능한다. 고도로 당화된 구조 단백질의 보존된 영역은, 이 부위에 존재하는 당화 패턴이 모노-, 디-, 트리- 또는 기타 당화된 영역으로 단순화되면, 백신 설계를 위한 타겟이 될 수 있다.
구체적으로, 현재와 미래에 제조되는 백신에는, 교차 중화 에피토프의 품질과 항원성을 유지 또는 강화하는 백신 생산 공정을 설계하고 검증하는데 이용할 수 있는, 교차 중화성 단일클론 항체가 요구되고 있다. 항원에 대한 항체 결합성이 구조 완전성과 항원 가능성을 반영한다고 가정하여, 모노-당화된 HA 폴리펩타이드와 같은, 교차 중화 항체의 결합을 시도하여, 이의 교차 중화 가능성을 정량적으로 평가하고자 하였다. 모노-당화된 인플루엔자 HA 유도체에 대해 제조된 백신은 유니버셜 에피토프에 대한 면역원성을 증가시킬 것으로 예상된다.
항원은, (고도로 보존되어 있으며, 변이되지 않거나 또는 적극적으로 변이되지 않는) 당화 부위를 노출시키기 위해, 바이러스 당단백질로부터 당을 일부 제거하고, 동시에, 당단백질의 3차 구조를 유지하는데 적절한 당을 유지시킴으로써, 제조한다. 부분적으로 당화된 바이러스 당단백질은, 특정 당화 부위가 1, 2 또는 3개의 당 유닛을 유지하도록, 당단백질을 부분 탈당화함으로써, 제조된다. 일부 측면들에서, 상기 부분 당화된 당단백질은, 하나 이상의 특정 당화부위에 비당화된 단백질 또는 폴리펩타이드를 제공하는 단계, 및 상기 당화 부위에 모노-, 디- 또는 트리-사카라이드를 접합시키는 단계를 통해, 제조할 수 있다.
하나 이상의 부분 당화된 HA 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신을 개시한다. 일부 구현예들에서, 상기 부분 당화된 HA 당단백질은 부분 당화된 인플루엔자 바이러스 HI, H3 및 H5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 탈당화된 HA 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신을 인플루엔자 의심 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다. 일부 구현예들에서, 상기 탈당화된 HA 당단백질은 HI, H3 및 H5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 탈당화는 당단백질의 하나 이상의 당화 부위에 모노-당화를 잔류시킨다 (당 1개 잔류). 일부 구현예들에서, 탈당화는 당단백질의 하나 이상의 당화 부위에 디-당화를 잔류시킨다 (당 2개 잔류). 일부 구현예들에서, 탈당화는 당단백질의 하나 이상의 당화 부위에 트리-당화를 잔류시킨다 (당 3개 잔류). 일부 구현예들에서, 탈당화는 당단백질의 하나 이상의 당화 부위에 모노-당화, 디-당화와 트리-당화 중 한가지 이상을 잔류시킨다.
일부 구현예들에서, 인플루엔자 HA 항원은 세포 배양물에서 재조합에 의해 제조된다. 세포 배양은 MDCK 세포, Vero 세포 또는 PER.C6 세포를 포함한다. 재조합 인플루엔자 HA 항원을 보유한 숙주 세포에 키푸넨신(kifunensine)이 첨가된다.
일부 측면들에서, α-만노시다제 I의 저해로 Man9(GlcNAc)2를 가진 당단백질이 형성된다.
다른 구현예들에서, 인플루엔자 HA 항원은 전체 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 전체 인플루엔자 바이러스는 특정 병원체가 없는 (SPF) 닭 부화란(embryonated chicken egg)에서 배양한다.
그런 후, 키푸넨신을 특정 병원체가 없는 (SPF) 닭 부화란의 요막강(allantoic cavity)에 첨가한다.
일부 측면들에서, 상기 키푸넨신은 0.005 내지 0.5 mg/ml의 농도로 첨가된다.
회수한 인플루엔자 바이러스 HA 항원은 약 0.1 내지 약 100 ㎍/mL의 Endo H로 처리한다.
일부 측면들에서, 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스는 밀도 구배 초원심분리를 포함하는 방법을 통해 분리한다.
일부 측면들에서, 상기 방법은 한외여과를 포함하는 방법을 통해 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 한외여과는 0.2 ㎛의 필터의 사용을 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 방법은 전자 현미경을 통해 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 분석하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 방법은 PNGase 처리를 포함하는 방법을 통해 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 정량하는 단계를 더 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 방법은 SDS-PAGE 일렉트로크로마토그래피를 통해 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 정량하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 방법은 질량 분광측정을 포함하는 방법으로 분리한 모노-당화된 인플루엔자 바이러스의 글리칸 조성을 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의 방법에 의해 제조되는 (전체 바이러스 또는 재조합) 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원에 관한 것이다.
본 발명은 백신 제조에 있어, 본원에 개시된 임의 방법에 의해 제조되는 (전체 바이러스 또는 재조합) 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 컨셉에 대한 사상과 범위로부터 이탈되지 않는 범위내에서 변형과 수정이 가해질 수 있지만, 이들 측면들과 그외 측면들은 첨부된 도면과 더불어 바람직한 구현예에 대한 하기 내용을 통해 명확해질 것이다.
아래 도면은 본 발명의 내용의 일부이며, 본 발명의 특정 측면들을 더욱 설명하기 위해 포함되며, 본원에 제공된 구체적인 구현예들에 대한 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 이들 도면을 참조함으로써 본 발명은 더 잘 이해될 것이다. 특허 또는 출원 파일에는 유색으로 작성된 도면이 하나 이상 포함되어 있다. 유색 도면이 첨부된 특허 또는 특허 출원 공개공보의 카피본은 요청서와 필요 비용을 납부함으로써 사무국으로부터 제공받을 수 있을 것이다.
도 1은 모노-당화된 NIBRG-14 바이러스의 제조를 나타낸 것이다. (도 1A) 바이러스를 여러가지 농도의 N-당화 프로세싱 저해제인 키푸넨신 존재하에 배양하였다. (도 1B) 고만노스(high mannose)-당화된 바이러스를 여러가지 농도의 Enod H에 의해 모노-당화된 바이러스로 분해하였다. (도 1C) 완전-당화된 정제 바이러스와 비교하여, 모노-당화된 정제 바이러스에서는 HA1과 HA2 둘다의 명백한 하향 이동이 나타났다. 이들 샘플은 항-H5 HA 토끼 항-혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하였다.
도 2는 완전 당화된 바이러스와 모노-당화된 바이러스의 전자 현미경 사진이다. (도 2A) 완전 당화된 NIBRG-14. (도 2B) 모노-당화된 NIBRG-14. 바이러스 입자를 2% 텅스텐산 메틸아민로 염색하여, 투과 전자 현미경으로 분석하였다.
도 3은 헤마글루티닌의 정량화를 나타낸 것이다. NIBRG-14 바이러스의 헤마글루티닌의 양은 SDS-PAGE에서 PNGase F에 의해 탈당화된 HA1의 밀도로 결정하였다.
도 4는 모노-당화된 NIBRG-14 헤마글루티닌의 당펩타이드 분석 결과를 나타낸 것이다. (도 4A) NIBRG-14 헤마글루티닌의 당화 부위는 아미노산 잔기 번호로 표시되어 있다. 구조는 PDB code 1jsm로 구하였으며, 당화 부위는 적색으로 표시한다. (도 4B) 모노-당화된 NIBRG-14 헤마글루티닌의 당펩타이드 분석. Endo H 절단 후, 당화 부위 대부분은 모노-당화된 상태였으나, 295 및 489의 당화 부위는 여전히 일부 (<10%) 고만노스-당화된 상태였다.
본 출원에서 사용되는 용어들은, 본 발명의 문맥에서, 그리고, 각 용어가 사용된 구체적인 문맥에서, 당해 기술 분야의 통상적인 의미를 통상적으로 가진다. 본 발명을 기술하기 위해 사용되는 특정 용어들은 하기 또는 명세서 전역에서 논의되어, 실무자에게 본 발명의 내용에 대한 추가적인 지침을 제공한다. 편의상, 특정 용어들은, 예컨대, 이탤릭체 및/또는 인용 표시로 강조 표시될 수 있다. 강조의 사용은 용어에 대한 범위 및 의미에는 영향을 미치지 않으며; 용어의 범위 및 의미는 강조 표시되거나 표시되지 않던 간에 동일 문맥에서 동일하다. 동일한 것을 2가지 이상의 방식으로 지칭될 수 있음은 자명할 것이다.
따라서, 본원에 논의되는 임의의 하나 이상의 용어에 대해 이명 및 동의어가 사용될 수 있으며, 용어가 본원에서 설명 또는 논의되는지의 여부는 임의의 특별한 의미를 가지지 않는다. 하나 이상의 동의어에 대한 내용이 다른 동의어의 사용을 배제하지 않는다. 본원에 논의된 임의 용어들에 대한 예를 비롯한 본 명세서내 도처에서의 예들의 사용은 단순히 예일 뿐이며, 어떠한 방식으로도 임의의 예시된 용어나 본 발명의 범위나 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 제시된 다양한 구현예들로 한정되지 않는다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선한다. 아래 참조문헌들은 본 발명에 사용된 다수 용어들에 대한 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 연계하여 사용되는 용어법 및 이들 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 통상적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직 배양 및 형질전환 (예, 전기천공, 리포펙션)에 대해 표준 기법들이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기법들은 제조사의 설명서에 따라 또는 당해 기술 분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이, 수행된다. 본 발명의 실시는, 반대로 구체적으로 표시되지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적인 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법의 방법을 채택할 것이며, 이들 다수는 설명하기 위한 목적으로 아래에 기술되어 있다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 기술되어 있다. 예를 들어, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)을 참조한다.
용어 "인플루엔자 A 서브타입" 또는 "인플루엔자 A 바이러스 서브타입"은 상호 호환적으로 사용되며, 헤마글루티닌 (H) 바이러스 표면 단백질에 의해 특정되며, H의 번호로 표시되는, 예컨대 H1, H3 및 H5로 표시되는, A형 인플루엔자 바이러스를 지칭한다. 아울러, 서브타입은 뉴라미니다제 (N) 바이러스 표면 단백질로 추가로 특정되는데, N의 번호, 예컨대 N1 및 N2로 표시될 수 있다. 이처럼, 서브타입은 H와 N의 번호, 예컨대 H1N1, H5N1 및 H5N2로 지칭될 수 있다. 이 용어는, 특히, 통상적으로, 돌연변이를 초래하며 상이한 병원성 프로파일을 나타내는, 각 서브타입에 속하는, 모든 (멸종 균주 포함) 균주들을 지칭할 수 있다. 또한, 이러한 균주들은 모든 과거, 현재 및 미래 분리체를 비롯한, 바이러스 서브타입의 다양한 "분리체"로서 지칭될 수 있다. 따라서, 이러한 문맥에서, 용어 "균주" 및 "분리체"는 상호 호환적으로 사용된다. 서브타입은 A형 인플루엔자 바이러스를 기반으로 한 항원을 포함한다. 항원은 헤마글루티닌 바이러스 표면 단백질을 기반으로 할 수 있으며, "HA 항원"으로서 명명될 수 있다. 일부 예들에서, 이들 항원은 예컨대, H1 항원 및 H5 항원으로 각각 명명될 수 있는, H1 서브타입 및 H5 서브타입 등의 특정 서브타입의 단백질을 기반으로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탈당화된" 또는 "부분 당화된" 단백질은, 단백질이 완전 당화된 경우의 글리칸 구조에서 하나 이상의 당이 제거되고, 이의 천연 구조/폴딩을 실질적으로 유지하는 단백질을 지칭한다. "탈당화된" 단백질은, 탈당화 과정으로 당단백질에 존재하는 하나 이상의 당화 부위에 모노-당화, 디-당화 또는 트리-당화가 남게 되는, 부분 당화된 단백질을 포함한다.
"부분 당화된" 단백질은, 각 당화 부위에 하나 이상의 당을 보유하며, 각 부분 당화 부위가 당단백질이 완전히 당화된 경우의 부위와 비교하여 더 작은 (수개의 당 유닛을 포함함) 글리칸 구조를 포함하는, "탈당화된" 단백질을 포함하며, 부분 당화된 단백질은 실질적으로 이의 천연 구조/폴딩을 보유한다. "부분 당화된" 단백질은, 당단백질이 완전히 당화된 경우에서 하나 이상의 당화 부위의 글리칸 구조를 부분 탈당화시킴으로써, 제조한다. 또한, "부분 당화된" 단백질은, 부가되는 당화 서열이, 완전히 당화된 당단백질인 경우의 그 부위에서의 글리칸 구조 보다 더 작도록, 단백질의 비-당화된 부위에 당화를 도입함으로써, 제조된다. 또한, "부분 당화된" 단백질은, 바이러스 당단백질 서열 또는 이의 단편을 합성하고, 부가되는 글리칸 구조가 완전히 당화된 당단백질의 경우의 그 부위에서의 글리칸 구조 보다 더 작도록, 서열의 당화 부위들에 당화된 아미노산 유닛 (예, GlcNAc-아르기닌 모이어티들)을 도입함으로써, 제조된다.
바이러스의 전염은 인플루엔자의 바이러스 막 상에 존재하는 헤마글루티닌 (HA) 당단백질과, 숙주 세포 표면 상에 존재하는 글리칸을 포함하는 시알산 (SA) 간의 불가결간 상호작용으로 시작된다. 이러한 중요한 상호작용에 있어 HA 당단백질의 역할을 규명하기 위해, 다양하게 규정된 HA 당형태(glycoform)들을 제조하여, 이의 결합 친화성 및 특이성을 합성 SA 마이크로어레이를 이용하여 조사하였다. HA의 N-글리칸 구조의 단축(truncation)은 SA 결합 친화성을 증가시키며, 다른 SA 리간드에 대한 특이성은 감소시킨다. SA 리간드 구조내 각각의 단당류 및 설페이트기가 HA 결합 에너지에 기여하는 부분을 정량적으로 분석하였다. 설페이트기는 완전히 당화된 HA에 대한 결합 에너지를 거의 100배 (2.04 kcal/mol) 높인다는 것을 확인하였으며, 그래서 바이-안테나형(biantennary) 글리칸은 모노-당화된 HA 당형태가 된다. 각 당화 부위에 N-연결된 GlcNAc를 하나만 가지고 있는 HA 단백질에 대해 만든 항체가, 완전히 당화된 HA에 대한 항체에 비해, 인플루엔자 서브타입들에 대한 결합 친화성과 중화 활성이 우수하였다. 즉, 바이러스 표면 당단백질에서 구조적인 비필수 글리칸을 제거하는 것이, 인플루엔자 및 기타 인간 바이러스에 대한 백신 설계에 있어, 매우 효과적이고 범용적인 방식이다.
폴리펩타이드의 당화는 전형적으로 N-연결된 형태 또는 O-연결된 형태 중 한가지이다. N-연결은 탄화수소 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것이다. "세쿠온(sequon)"은 N-연결된-글리칸으로 지칭되는 다당류(당)에 대한 부착 부위로서 제공될 수 있는 단백질내 3개의 인접 아미노산들로 구성된 서열이다. 이것은 아스파라긴(Asn)의 측쇄에 있는 질소 원자를 통해 단백질에 다당류가 연결된 것이다. 세쿠온은 Asn-Xaa-Ser 또는 Asn-Xaa-Thr으로, 이때 Xaa는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다. 즉, 폴리펩타이드에 이들 트리펩타이드 서열 중 한가지가 존재하면 잠재적인 당화 부위가 구축된다. O-연결된 당화는 당, N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 또는 자일로스 중 한가지가 하이드록시 아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착된 것을 지칭하는데, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있다. 세쿠온 Asn-X-Ser/Thr은 N-연결된 올리고당이 당단백질에 부착하는데 절대적으로 필수적이지만 (Marshall RD, Biochemical Society Symposia 40, 17-26 1974), 이의 존재가 항상 당화가 이루어지도록 하는 것은 아니며, 당단백질내 일부 세쿠온은 비당화된 상태로 유지될 수 있다 (Curling EM, et al., Biochemical Journal 272, 333-337 1990).
본 발명의 일 측면은 단순화된 탄수화물 구조를 가진 비-천연 당단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
즉, 상기 방법은, HIV와 같은 레트로바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스과 같은 플라비바이러스 등에 적용가능하다.
인간 면역결핍성 바이러스 (HIV)의 수용체-결합성 외막 단백질인 gp120의 분자량 중 대략 절반이 N- 연결된 글리칸이다. 이들 글리칸의 거의 절반이 고만노스형(high mannose type)이다. 이들 고만노스형 글리칸은 바이러스 표면에 만노스 잔기가 풍부한 지대를 제공하여, HIV에서 만노스-특이 렉틴과 면역 시스템 간의 상호작용에 주요 타겟이 된다.
C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 당단백질은 고도로 당화되어 있으며, E1과 E2에 일반적으로 N-연결된 글리칸이 각각 4개 및 11개 존재한다. 몇몇 글리칸은 HCVcc 조합 및/또는 감염성에 중요한 역할을 담당한다. E2 상의 적어도 5개의 글리칸 (E2N1, E2N2, E2N4, E2N6, 및 E2N11)은 HCV의 항체 중화 민감성을 상당히 낮춘다 (Helle F et al., J Virol. 2010 Nov;84(22):11905-15).
대부분의 플라비바이러스의 E 단백질은 잔기 153/154에서의 Asn-연결된 당화에 의해, 뎅기 바이러스 (DENV)의 4가지 혈청형의 경우에는 잔기 67번에서의 제2 글리칸에 의해 변형된다. 뎅기 바이러스의 경우, E 단백질 상의 N-연결된 글리칸은 고만노스형과 컴플렉스 글리칸이 혼합된 형태이다. 웨스트 나일 바이러스 외막 (E) 단백질에는 잔기 154번에 N-연결된 당화 부위 1개가 포함되어 있다. 이들 부위에서의 글리칸의 제거(ablation)는 감염성을 현저하게 감소시키지만 완전히 없애진 않으므로, 이 부위에 단순화된 당화가 존재하는 경우, 보존된 부위에 대해 타겟화된 백신은 바이러스의 돌연변이를 통한 변이에 덜 민감한 효과적인 치료를 발생시킬 수 있다.
글리코시다제 저해제
글리코시드 하이드롤라제 (글리코시다제 또는 글리코실 하이드롤라제로도 지칭됨)는 글리코시드 연결의 가수분해를 촉매하여 소형 당을 방출시킨다. 이것은, 항세균 방어 전략 (예, 라이소자임), 발병 기전 (예, 바이러스 뉴라미니다제) 및 정상적인 세포 기능 (예, N-연결된 당단백질 생합성에 참여하는 트리밍 만노시다제)에서, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 등의 바이오메스의 분해를 비롯하여, 천연에서 기능하는 일반 효소이다. 글리코실트랜스퍼라제와 더불어, 글리코시다제는, 글리코시드 결합(glycosidic bond)의 합성 및 분해에 대한 주요 촉매 기구를 구성하고 있다.
당화 저해제가 본 발명의 방법에 따라 사용되는 것으로 간주된다. 이러한 저해제의 예로는 카이네푸신 (Kinefusine), 오스트랄린 (Australine), 카스타노스페르민 (Castanospermine), 데옥시노지리마이신 (Deoxynojirimycin), 데옥시만노지리마이신 (Deoxymannojirimycin), 스와인소닌 (Swainsoninne), 만노스타틴 A (Mannostatin A) 등을 포함한다.
오스트랄린은 폴리하이드록시화된 피롤리지딘 알칼로이드로서, α-글리코시다제 아밀로글로코시다제에 대해서는 양호한 저해제 (5.8 μM에서 50% 저해) 인 반면, β-글루코시다제, α-만노시다제, β-만노시다제, α-갈락토시다제 또는 β-갈락토시다제는 저해하지 못한다. 카스타노스페르민은 α-글루코시다제 활성을 저해하며 글리코겐 분포를 변형시키는, 인돌리진 알칼로이드이다. 카스타노스페르민은 뎅기 바이러스의 감염을 방지한다 (Whitby K et al., J Virol. 2005 July; 79(14): 8698-8706).
다양한 타입의 N-연결된 올리고당 구조의 생합성은 일련의 2가지 반응들로 이루어진다: 1) GlcNAc, 만노스 및 글루코스를 돌리콜-P에 단계적으로 부가함으로써, 지질-연결된 사카라이드 전구체, Glc3Man9(GlcNAc)2-피로포스포릴-돌리콜의 생성; 및 2) 막-결합형 글리코시다제에 의한 글루코스와 만노스의 제거, 및 골지-국지화된 글리코실트랜스퍼라제에 의한 GlcNAc, 갈락토스, 시알산 및 푸코스의 부가에 의한, 여러가지 컴플렉스 올리고당 구조체의 제조.
여러 단계들에서 변형 반응(modification reaction)들을 차단하는 저해제를 사용하면, 세포는 탄수화물 구조들이 변이된 당단백질을 생산하게 된다. 당단백질 프로세스에 참여하는 글로코시다제 및 만노시다제에 대한 특이 저해제로서 다수의 알칼로이드-유사 화합물들이 동정되었다. 이들 화합물들은, 저해 부위에 따라, 글루코스-함유 고만노스 구조체, 또는 다양한 고만노스 또는 하이브리드 체인을 가진 당단백질이 만들어 되도록 작용한다 (Elbein AD FASEB J. 1991 Dec; 5(15):3055-3063).
N-연결된 당단백질의 프로세스에 작용하는 1차 효소 4종은 글리코시다제이다. GlcNAc-포스포트랜스퍼라제는 만노스 6-포스페이트 결정기의 합성에서 제1 단계를 촉매한다. 적절한 탄수화물 구조는 GlcNAc-포스포트랜스퍼라제에 의한 효율적인 인산화를 촉진시킨다. 인산화와 커플링된 탄수화물 구조는 고만노스형 N-글리칸인 GAA 분자에 대한 만노스-6-포스페이트 신호를 합성하는데 필수적이다.
몇몇 만노시다제 프로세싱 저해제들이 알려져 있다. 로코풀(locoweed)에서 분리된 스와인소닌은 골지 만노시다제 II에 대한 강력한 저해제이지만, 만노시다제 I에 대해서는 효과가 없는 것으로 입증되었다 (James, L. F., Elbein, A. D., Molyneux, R. J., and Warren, C. D. (1989) Swainsonine and related glycosidase inhibitors. Iowa State Press, Ames, Iowa). 데옥시만노지리마이신은 랫의 간 만노시다제 I에 대한 상당히 강력한 저해제이다. 무손상 세포에서, 데옥시만노지리마이신은 N-연결된 컴플렉스 타입의 올리고당의 합성을 차단하여, Man7-9(GlcNAc)2 구조를 가진 당단백질이 축적되게 하며, Man9(GlcNAc)2 올리고당이 주를 이루게 된다 (Elbein, A. D., et al. (1984) Arch . Biochem . Biophys . 235, 579-588). 만노스타틴 A는 미생물 스트렙토버티실리움 버티실러스(Streptoverticillium verticillus)에서 생산되는 대사산물로서, 이 화합물은 랫 부정소의 α-만노시다제에 대한 강력한 저해제인 것으로 보고되어 있다 (Aoyagi, T., et al. (1989) J. Antibiot. 42, 883-889).
키푸넨신 (Kif)은 방선균 키타사토스포리아 키푸넨스 9482 (Kitasatosporia kifunense)에서 최초로 분리된 것으로 (M. Iwami, O. et al. J. Antibiot ., 40, 612, 1987), 1-아미노-만노지리마이신의 사이클릭 옥사미드 유도체이다. 키푸넨신은 동물의 골지 효소인 만노시다제 I을 저해한다. 키푸넨신을 배양한 포유류 세포에 1 ㎍/ml 이상으로 첨가하면, 만노시다제 I에 대한 저해는 유지되면서, N-연결된 올리고당의 구조가 컴플렉스 체인에서 Man9(GlcNAc)2 구조로 전체적인 변동(complete shift)이 발생된다. 한편, 데옥시만노지리마이신은, 심지어 50 ㎍/ml에서도, 모든 컴플렉스 체인들의 형성을 방지하지 못한다 (Elbein, A. D., et al. (1990) Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol . Chem . 265, 15599-15605). 따라서, 키푸넨신은 가장 효과적인 당단백질 프로세싱 저해제 중 하나이다.
키푸넨신은 또한 α-만노시다제를 저해하는 가능성 있는 면역조절 활성이 입증되었다. 키푸넨신의 합성은 후지사와 파마슈티컬 코포레이션 (H. Kayakiri, et al., Tetrahedron Lett ., 31, 225, 1990; H. Kayakiri, et al., Chem . Pharm . Bull., 39, 1392, 1991)과 훌디리키 등 (J. Rouden and T. Hudlicky, J. Chem . Soc. Perkin Trans. 1, 1095, 1993; J. Rouden, T. et al., J. Am. Chem . Soc ., 116, 5099, 1994)에서 보고한 바 있다.
세포에 키푸넨신 (Kif)을 처리하면, 이들 세포에서 당단백질의 프로세싱은 저해된다 (Elbein et al (1991) FASEB J (5):3055-3063; 및 Bischoff et al (1990) J. Biol . Chem. 265(26):15599-15605). Kif는 변형된 단백질에 컴플렉스형 당이 부착되는 것을 차단한다. 그러나, 리소좀의 하이드롤라제에 대한 당단백질 프로세싱을 완전히 저해할 만큼 충분한 Kif가 사용된다면, 제조되는 하이드롤라제는 GlcNAc 포스포트랜스퍼라제 효소에 가장 효과적인 기질이 아닌, 만노스-9 구조를 가지게 된다.
Kif는 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75 및 이들 수치 사이에 존재하는 모든 수치를 비롯하여, 0.01 ㎍/ml 이상 내지 약 500 ㎍/ml 이상의 양으로, 세포에 첨가된다.
키푸넨신은 N-당화 경로에서 효소 α-만노시다제 I의 기능을 저해하여, Man9GlcNAc2 조성을 가진 당단백질이 만들어진다.
컴플렉스 탄화수소 구조체의 수준 및/또는 타입은 공지 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 당단백질과 이의 조합된 올리고당은 엔도글리코시다제를 이용하여 특정화하여, 고만노스형과 컴플렉스형 올리고당을 구별할 수 있다 (Maley et al (1989) Anal. Biochem. 180:195-204). 펩타이드-N4-(N-아세틸-l-β-글로코스아미닐)아스파라긴 아미다제 (PNGaseF)는 β-아스파르틸글루코실아민 결합에서 아스파라긴-연결된 (N-연결된) 올리고당을 가수분해하여, 암모니아, 아스파르트산 및 환원성 말단에 무손상 디-N-아세틸키토바이오스(di-N-acetlychitobiose)를 가진 올리고당이 만들어진다. 고만노스형, 하이브리드, 디-, 트리- 및 테트라안테나형 컴플렉스, 황산화된 및 폴리시알릴 올리고당들이 기질이 되기 때문에, PNGase은 특이성이 넓다. 부가적으로, α1,6-만노스 팔이 부착된 다른 만노스를 가지고 있다면, 엔도-β-N-아세틸 글루코스아미니다제 H (Endo H)는, 3개의 만노스 잔기에 존재하는 하이드리드- 및 만노스-함유 N-연결된 올리고당에서 키토바이오스 유닛을 효과적으로 가수분해한다. 컴플렉스 올리고당은 Endo H 분해에 내성을 나타낸다.
당단백질에 존재하는 N-연결된 올리고당의 타입을 특정화하기 위해, 단백질 분액을 환원 조건 하에 PNGaseF (0.5% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 50 mM NP-40, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 7.5) 또는 EndoH (0.5% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 50 mM 소듐 사이트레이트, pH 5.5)로 분해할 수 있다. 그런 후, 천연 단백질과 분해한 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 환원 조건 하에 분석하고, 상대적인 이동성을 비교한다. 당단백질에 고만노스형 올리고당만 포함되어 있다면, PNGaseF 및 EndoH로 처리 샘플은 무처리 단백질에 비해 더 높은 이동성을 가질 것이다. EndoH 처리 단백질은 각 N-연결된 당화 부위에 남아있는 하나의 N-아세틸글로스아민 때문에, 약간 높은 분자량을 가질 것이다. 당단백질에 컴플렉스형 올리고당만 함유되어 있다면, EndoH 처리 단백질은 무처리 단백질과 비교해 이동 변화가 없을 것이다. 컴플렉스형과 고만노스형 올리고당 둘다가 존재한다면, EndoH 처리 단백질은 무처리 당단백질 보다는 작지만, PNGaseF 처리 단백질 보다는 클 것이다. 그 차이는 잔류하는 N-아세틸글루코스민으로 계산할 수 있는 것 보다 클 것이다.
타겟 당단백질에 단순화된 글리칸을 형성시키기 위해, 엔도글리코시다제를 사용한다. 엔도글리코시다제는 당단백질 또는 당지질로부터 올리고당을 분리하는 효소이다. 또는, 접합된 단백질 및 지질 분자들로부터 올리고당을 분리하는 것이 보다 일반적이지만, 말단 잔기가 아닌 잔기들 간의 다당류 체인들을 주로 절단한다. 폴리머에서 2개의 당 단량체들 간의 글리코시드 결합을 파괴한다. 엔도글리코시다제의 예로는 엔도글리코시다제 D, 엔도글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 H 및 엔도글리코시다제 S를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
모노-당화된 인플루엔자 바이러스의 제조
고만노스형 당단백질을 가진 단백질을 제조하기 위해, 인플루엔자 바이러스를 보유한 세포를 Kif (및/또는 DMJ)에 노출시켜, 당단백질 프로세싱을 저해한다. 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위해서, 바이러스를 만노시다제 저해제, 예컨대 키푸넨신과 함께 병원체가 결핍된 닭 부화란의 요막강에 주입한다.
키푸넨신은 N-당화 경로에서 효소 α-만노시다제 I의 기능을 저해하여, Man9(GlcNAc)2 조성을 가진 당단백질이 만들어진다. 헤마글루티닌의 당화를 저해하는 키푸넨신의 농도는 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 ㎍/mL 내지 최대 500 ㎍/mL, 및 이들 사이의 모든 수치 범위이다.
약 1-3일 배양한 후, 키푸넨신 처리한 요막강을 회수하여, 엔도글리코시다제 (Endo H)를 처리하여, 고만노스형 글리칸을, 즉, Man9(GlcNAc)2를 단일 GlcNAc롤 변환시킬 수 있는 농도로 제거한다. 모노-당화된 헤마글루티닌를 제조하기 위한 요막강 유체내 Endo H의 농도는 요막강 유체 mL 당 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 500 ㎍ 이상의 범위이다.
그런 후, 모노-당화된 바이러스를 회수하여 정제한다.
모노-당화된 인플루엔자 바이러스의 이용
본원에 기술된 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역화에 사용할 수 있다. 상이한 분리체들 간의 교차 방어가, 인플루엔자 바이러스들에서, 특히 동일한 바이러스 혈청형을 가진 인플루엔자 바이러스들에서 이루어지는 것으로 공지되어 있어, 항원이 유래되는 구체적인 바이러스는 방어가 제공되어지는 특이 바이러스와 동일하거나 상이할 수 있다.
현재 사용되는 인플루엔자 백신은 전체 바이러스 (WV: whole virus) 백신 또는 서브비리온 (SV: subvirion) (또한, "분절" 또는 "정제된 표면 항원"으로 지칭됨)으로 표기된다. WV 백신은 완전한(intact) 불활화된(inactivated) 바이러스를 포함하는데 반해, SV 백신은 지질-함유 바이러스 외막을 용해시키는 디터전트로 바이러스를 파괴한 다음, 잔류 바이러스를 화학적으로 불활화한, 정제된 바이러스를 포함한다. 또한, 인플루엔자에 대한 약독화된 바이러스 백신도 개발 중에 있다. 일반적인 백신 제조 방법에 대한 내용은 Wright, P. F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D. M. et al. Ed.), 1464-65 (2001)에서 찾아볼 수 있다.
백신이 2종 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 상이한 균주들을 전형적으로 각각 배양하고, 바이러스를 회수하여 항원을 준비한 후 혼합한다. 다른 구현예에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 상이한 분리체의 다른 세그먼트들을 조합하여, 다능성(multipotent) 백신을 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 인플루엔자 바이러스(들)는 재배열 균주(reassortant strain)일 수 있거나, 및/또는 역유전자 기법을 통해 수행되어질 수 있다. 바이러스(들)는 약독화될 수 있다. 바이러스(들)는 온도-민감성일 수 있다. 바이러스(들)는 저온-적응(cold-adapted)성일 수 있다. 병원성 균주로부터 HA 및/또는 NA 바이러스 세그먼트와, 비-병원성 균주로부터 나머지 6개 또는 7개의 세그먼트를 포함하는, 재배열 균주가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역 조성물에 사용되는 인플루엔자 바이러스 항원은 생바이러스 형태이거나, 또는 불활화된 바이러스의 형태일 수 있다. 바이러스의 불활화는, 전형적으로, 포르말린 또는 β-프로피오락톤과 같은 화합물을 이용한 처리를 포함한다. 불활화된 바이러스를 사용하는 경우, 항원은 전체 바이러스, 분절(split) 바이러스 또는 바이러스 서브유닛일 수 있다. 분절 바이러스는 비리온에 디터젼트 (예, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 등)을 처리하여, 서브비리온 조제물을 제조함으로써, 수득한다. 서브유닛 백신은 인플루엔자 표면 항원인 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 중 한가지 또는 둘다를 포함한다. 또한, 인플루엔자 항원은 비로솜(virosome) 형태로 존재할 수 있다.
인플루엔자 바이러스로부터 항원을 준비하는 경우 (즉, 인플루엔자 바이러스의 생육을 수반하지 않는 재조합 또는 합성 시스템으로 제조되는 것이 아닌 경우), 바이러스를 난(egg) 또는 세포 배양으로 배양할 수 있다. 특이 병원체가 없는 부화란에서 배양이 백신 제조용 인플루엔자 바이러스를 배양하는 전통적인 경로이며, 세포 배양은 최근에 개발된 것이다. 세포 배양을 이용하는 경우, 인플루엔자 바이러스 백신은 전형적으로 MDCK 세포, Vero 세포 또는 PER.C6 세포 등의 포유류 세포에서 배양하게 될 것이다. 이들 세포주들은, 다양한 곳에서, 예를 들어 미국 타입 세포 배양 (ATCC) 콜렉션 또는 코넬 세포 저장처(Coriell Cell Repositories)로부터 입수가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587의 다양한 여러가지 Vero 세포들을 제공하고 있으며, MDCK 세포를 카탈로그 번호 CCL-34로 제공하고 있다. 암닭 유래 세포주, 예컨대 닭 배아 섬유모세포 (CEF) 등의 조류 세포주에서의 배양도 가능하다.
이처럼, 바이러스 (예, HIV, HCV, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스 등)는 하나 이상의 글리코시다제 저해제 (예, 키네푸신, 오스트랄린, 카스타노스페르민, 데옥시노지리마이신, 데옥시만노지리마이신, 스와인소니, 만노스타틴 A 등)의 존재 하에 세포 배양물에서 배양할 수 있다. 이들 바이러스를 배양하기 위한 세포 배양 시스템들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 웨스트 나일 바이러스는 원숭이 신장 상피 세포나 닭의 배야 세포 조직 배양물에서 배양할 수 있다. HIV는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 배양물에서 배양할 수 있다. HC는 인간의 간암 세포주 유래 세포, Huh-7에서 배양할 수 있다.
본 발명의 면역 조성물과 의학 조성물은 환자에게 투여하기 적합하다. 이는, 비제한적인 예로서, 진피내 주사; 경피 투여 및 국소 투여 등의 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 이는 예컨대 에머리지(emery paper)에 의해 또는 미세마모제를 사용함으로써, 피부 마모(skin abrasion)와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 면역 조성물 및 의학 조성물은 바람직하게는 백신으로서 제공된다.
본 발명의 조성물은 보강제를 포함할 수 있다. 인플루엔자 백신에 사용되고 있는 보강제로는 알류미늄 염, 키토산, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 CpG 7909, 수중유 에멀젼, 예컨대 MF59, 수중유중수 에멀젼, E. coli 열 민감 독소 및 이의 독소 제거된 돌연변이체, 모노포스포릴 지질 A 및 이의 3-O-탈아실화된 유도체, 백일해 독소 돌연변이, 뮤라밀(muramyl) 디펩타이드 등을 포함한다.
실시예들
본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 구현예들에 따른 예시적인 기구들, 장치들, 방법 및 이와 관련된 결과들을 아래에 제시한다. 표제 또는 하위 표제들은 읽는 이의 편의상 예로서 사용될 수 있으나, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다는 것에 유념한다. 아울러, 특정 이론들이 본원에 제시 및 기술되지만, 임의의 특정한 이론 또는 작동에 상관없이 본 발명에 따라 본 발명이 실시되는 한, 이들이 옳은지 그른지의 여부는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.
실시예 1: 완전-당화된 바이러스와 모노-당화된 바이러스의 제조
A형 인플루엔자 바이러스, NIBRG-14 (H5N1) (Nicolson C, et al. (2005) Vaccine 23(22):2943-2952)를 10일된 특이 병원체가 없는 (SPF) 닭의 부화란의 요막강에 (200 ㎕ PBS 중의 1000 TCID50 (50% 조직 배양 감염 용량)) 주입하여, 일반적인 완전-당화된 바이러스를 제조하였다 (WHO (2005) WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. (World Health Organization, Geneva)).
모노-당화된 바이러스를 만들기 위해, 바이러스를 요막강에 키푸넨신 (Cayman Chemical) 0.2 mg/ml과 함께 주입하였다. 키푸넨신은 N-당화 경로에서 효소 α-만노시다제의 기능을 저해하므로, Man9GlcNAc2 조성을 가진 당단백질이 만들어진다 (Elbein AD, et al. (1990) J Biol Chem 265(26):15599-15605).
헤마글루티닌의 당화를 저해하기 위한 키푸넨신의 농도 의존도를 분석하였다 (도 1A). 배양 3일 후, 요막강액을 회수하고, 3,000g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하였다. 그런 후, 키푸넨신 처리된 요막강액에 엔도글리코시다제 Endo H를 (요막강액 ml 당 20 ㎍) 4℃에서 12시간 처리하여, 고만노스형의 글리칸을 제거하였으며, 즉 Man9GlcNAc2를 단일 GlcNAc로 제조하였다. 모노-당화된 헤마글루티닌를 제조하기 위해 요막강액내 Endo H의 농도 의존성을 분석하였다 (도 1B).
그 후, 모노-당화된 바이러스를 46,000 g로 90분간 초원심분리를 수행하여 펠렛화하고, 이를 PBS에 재현탁한 다음, 불연속 슈크로스 밀도 구배 (25%, 40%)에 의해 270,000 g로 90분간 정제하였다. 밀도 구배에서 바이러스를 수집하고, 120,000 g로 90분간 초원심분리하여 펠렛화하였다. 마지막으로, 펠렛을 PBS에 재현탁하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다 (CDC (1982) Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance (U.S. Dept. of Health and Human Services., Washington, DC); Harvey R, et al. (2008) Vaccine 26(51):6550-6554). 정제한 완전-당화된 바이러스와 비교하여, 정제한 모노-당화된 바이러스는 HA1 및 HA2 둘다에서 명백한 하향 이동(downshift)이 나타났다 (도 1C).
실시예 2: 완전- 당화된 바이러스와 모노- 당화된 바이러스에 대한 전자 현미경 분석
바이러스 용액을 구리 그리드 (Electron Microscopy Sciences)의 콜로디온-탄소-피복된 표면에 두었다. 과량의 액체는 여과지로 제거하고, 2% 텅스텐산 메틸아민 (Ted Pella, Inc.)을 첨가하여 30초간 염색하였다. 과량의 액체는 여과지로 제거하고, 30초간 물로 세척하였다. 그런 다음, 그리드를 4시간 동안 공기 중에 건조하고, 바이러스 입자를 투과 전자 현미경 (Hitachi H-7000)으로 촬영하였다. 완전-당화된 바이러스와 모노-당화된 인플루엔자 NIBRG-14 바이러스는 크기와 형태 상 유사하였다 (도 2).
실시예 3: 바이러스에서 헤마글루티닌의 정량
바이러스를 변성 완충액 (5% SDS 및 10% β-머캅토에탄올)과 혼합하고, 10분간 끓인 다음, 샘플에 10% NP-40을 첨가하고, PNGase F (New England Biolabs)를 밤새 25℃에서 처리하였다. 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하여, 10분간 95도시로 가열한 다음, 겔에 로딩하였다. 겔은 Sypro ruby (Invitrogen)로 염색하고, Versa Doc 영상화 시스템 (Bio-rad)으로 분석하였다. SDS-PAGE를 분석하기 전에, PNGase F를 처리하여, 완전-당화된 바이러스 샘플에서 NP 단백질로부터 HA1을 분리한다. 이는, 바이러스에서 헤마글루티닌의 정량화를 위해, SDS-PAGE 상에서 완전-당화된 바이러스와 모노-당화된 바이러스 유래 HA1 단백질들을 직접 밀도 비교할 수 있다 (도 3).
실시예 4: LC-MS-MS를 이용한 당단백질 분석
질량 분광측정법을 사용하여 모노-당화된 바이러스의 글리칸 조성을 분석하였다. 바이러스 용액을 비-환원성 샘플 완충액과 혼합하고, 겔에 로딩하기 전에 10분간 95℃에서 끓였다. 겔을 코마시 블루로 염색하였다. HAO 밴드를 트립신으로 겔내 트립신 분해를 위해 작은 조각으로 잘랐다. 분해한 후, 샘플을 LC-MS-MS로 분석하였다 (Wu Y, et al. (2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24(7):965-972) (Agilent Technologies, Thermo Scientific). 인플루엔자 NIBRG-14 바이러스에는 N-당화 부위가 6개 존재한다. 잔기 295 (~10% Man6(GlcNAc)2)와 잔기 489 (~10% Man7-9(GlcNAc)2)에서의 낮은 비율로 고만노스형 글리칸이 존재하는 것을 제외하고는, 그외 모든 글리칸들은 모노-당화되어, 단일 GlcNAc 사카라이드 잔기가 부착되어 있었다 (도 4).
본 명세서에 인용된 모든 간행물들과 특허 출원들은, 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 표시된 바와 같이, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전술한 본 발명은 예시로서, 그리고 예컨대 명확한 이해를 위해 일부 상세하게 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 청구항의 사상 또는 범위로부터 이탈되지 않으면서 이에 대한 임의 변화 및 수정을 가할 수 있음은 자명할 것이다.

Claims (34)

  1. 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 (monoglycosylated influenza virus)의 생산 방법으로서,
    a) 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원을 유효량의 만노시다제 저해제와 함께 적합한 숙주에서 배양하는 단계로서, 상기 만노시다제 저해제의 농도는 N-당화 경로에서 α-만노시다제 I을 저해하는데 충분한 농도인 단계;
    b) 상기 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 회수하여, 엔도글리코시다제 (Endo H)와 접촉시키는 단계로서, 상기 Endo H의 농도는 고만노스형 글리칸 (high mannose type glycan)을 제거하는데 충분한 것인 단계; 및
    c) 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HA 항원은 고병원성의 H5N1 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 고병원성 H5N1 인플루엔자 바이러스가 NIBRG-14인 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 만노시다제 저해제가 키푸넨신 (kifunensine (Kif))인 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 만노시다제 저해제가 데옥시만노지리마이신 (deoxymannojirimycin (DMJ))인 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 HA 항원이 세포 배양물에서 재조합에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  7. 제7항에 있어서, 상기 세포 배양물이 MDCK 세포, Vero 세포 또는 PER.C6 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 α-만노시다제 I의 저해로 Man9(GlcNAc)2를 가진 당단백질이 제조되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 HA 항원이 전체 인플루엔자 바이러스(whole influenza virus)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전체 인플루엔자 바이러스는 특정 병원체가 없는 (SPF: specific pathogen free) 닭 부화란(embryonated chicken egg) 숙주에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키푸넨신이 상기 특정 병원체가 없는(SFP) 닭 부화란의 요막강(allantoic cavity)에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 키푸넨신이 재조합 인플루엔자 HA 항원을 보유하고 있는 숙주 세포에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 키푸넨신이 0.005 내지 0.5 mg/ml의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자 HA 항원의 회수는 상기 숙주 세포로부터 재조합에 의해 생산된 인플루엔자 HA 항원을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 인플루엔자 HA 항원의 회수는,
    인플루엔자 바이러스가 증식하는데 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및
    상기 인플루엔자 바이러스를 포함하는 요막강액 (allantoic fluid)을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 회수한 인플루엔자 바이러스 HA 항원에 약 0.1 내지 약 100 ㎍/mL의 Endo H를 처리하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스는 밀도 구배 초원심분리를 포함하는 방법으로 분리하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  18. 제1항에 있어서, 한외여과를 포함하는 방법을 통해 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 한외여과는 0.2 ㎛의 필터의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  20. 제1항에 있어서, 전자 현미경으로 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, PNGase를 이용한 처리를 포함하는 방법으로 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, SDS-PAGE 일렉트로크로마토그래피(SDS-PAGE electrochromatography)를 포함하는 방법으로 상기 모노-당화된 인플루엔자 바이러스를 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  23. 제1항에 있어서, 질량 분광측정을 포함하는 방법으로 상기 분리된 모노-당화된 인플루엔자 바이러스의 글리칸 조성을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 HA 항원이 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 H1, H3 및 H5 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한항에 따른 방법으로 제조되는 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원 (전체 바이러스 또는 재조합).
  26. 백신을 제조하기 위한,
    제1항 내지 제24항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 제조되는 모노-당화된 인플루엔자 바이러스 HA 항원 (전체 바이러스 또는 재조합)의 용도.
  27. 단순화된 글리칸(simplified glycan)을 가진 바이러스의 생산 방법으로서,
    a) 바이러스 유래 항원을 유효량의 당화 저해제와 함께 적합한 숙주에서 배양하는 단계로서, 상기 당화 저해제의 농도는 N-당화 경로에서 글리코시다제를 저해하는데 충분한 농도인 단계;
    b) 상기 바이러스 항원을 회수하여, 엔도글리코시다제와 접촉시키는 단계; 및
    c) 단순화된 글리칸을 가진 바이러스 항원을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 바이러스가 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 레트로바이러스 및 플라비바이러스(flavivirus)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 바이러스가 HIV, HCV, 뎅기 바이러스(Dengue virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 글리코시다제 저해제가 카이네푸신 (Kinefusine), 오스트랄린 (Australine), 카스타노스페르민 (Castanospermine), 데옥시노지리마이신 (Deoxynojirimycin), 데옥시만노지리마이신 (Deoxymannojirimycin), 스와인소닌 (Swainsoninne) 및 만노스타틴 A (Mannostatin A)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 세포 배양물에서 재조합으로 생산되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 전체 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 전체 바이러스가 세포 배양물에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  34. 제27항에 있어서, 상기 단순화된 글리칸이 모노-당화물(monoglycosylate)인 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
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