BR112013011198B1 - Métodos para produzir vírus influenza monoglicosilado e antígeno viral monoglicosilado, antígeno ha do vírus influenza monoglicosilado e seu uso - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS COM GLICOSILAÇÃO SIMPLIFICADA DE PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE. Métodos para produção de partículas virais com glicosilação simplificada em proteínas estruturais ou de superfície são fornecidos. Quando usadas como alvos para produção de vacinas, a natureza conservada de tais sítios gera vacinas que são menos sensíveis a mutações virais. É discutido o uso de inibidores de glicosilação para produção de vírus com perfis de glicosilação simplificada. São fornecidos uma descrição ilustrativa do vírus da influenza e métodos para a produção de partículas do vírus da influenza monoglicosiladas. São fornecidos métodos para a produção de formas monoglicosiladas do vírus da influenza A, NIBRG-14 (H5Nl).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade de U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61/410,257, depositado em 4 de novembro de 2010 e intitulado “METHODS FOR PRODUCING MONO-GLYCOSYLATED INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININ”, cujos conteúdos são aqui incorporados em sua totalidade por referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção diz respeito a vírus e especificamente à produção de partículas virais com glicanos simplificados. Em particular, a presente invenção refere-se à produção de partículas do vírus da influenza com glicosilação simplificada. Especificamente, a invenção diz respeito a métodos para produção de partículas do vírus influenza monoglicosiladas.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[003] A invenção é descrita aqui em termos da preparação ilustrativa de vírus influenza monoglicosilados. Considera-se que os mesmos métodos podem ser usados para preparar outros vírus com estrutura de glicanos simplificada incluindo retrovírus tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a família Flaviviridae como o vírus da dengue, o vírus da febre do Nilo ocidental, o vírus da hepatite C (HCV) e o equivalente.

[004] A influenza é causada por um vírus de RNA da família Orthomyxoviridae. Há três tipos desses vírus e eles causam três diferentes tipos de influenza: tipos A, B e C. O vírus influenza tipo A infecta mamíferos (humanos, suínos, furões, equinos) e aves. Isto é muito importante para a espécie humana, visto que este é o tipo de vírus que tem causado pandemias mundiais. O vírus da influeza tipo B (também conhecido simplesmente como influenza B) infecta somente humanos. Eventualmente causa surtos locais de influenza. O vírus da influenza C também infecta somente humanos. Ele infecta a maioria das pessoas quando são jovens e raramente causa doença de caráter grave.

[005] O vírus da influenza A infecta uma ampla variedade de mamíferos, incluindo o homem, equinos, suínos, furões e aves. É o principal patógeno humano associado a epidemias e pandemias. Há pelo menos 15 sorotipos de hemaglutinina (H) e nove sorotipos de neuraminidase (N) conhecidos. Acredita-se que suínos e aves são particularmente reservatórios importantes, gerando acúmulo de vírus geneticamente e antigenicamente diversos que foram transferidos para a população humana mediante contato entre humanos e animais. Os vírus da influenza B infectam apenas mamíferos e causam doença, mas geralmente não tão grave quanto os tipos A. Ao contrário dos vírus da influenza A, os vírus da influenza B não possuem sorotipos distinguíveis. Os vírus da influenza C também infectam mamíferos apenas, mas raramente causam doença. Eles são genética e morfologicamente distintos dos tipos A e B.

[006] Há 4 antígenos presentes no vírus influenza, a hemaglutinina (HA), a neuraminidase (NA), o nucleocapsídeo (NA), a matriz (M) e as proteínas do nucleocapsídeo (NP). NP é o antígeno tipo-específico que ocorre em 3 formas, A, B e C, que fornecem a base para a classificação dos vírus da influenza humana. A proteína da matriz (proteína M) circunda o nucleocapsídeo e compõe até 35-45% da massa da partícula. Duas glicoproteínas de superfície são vistas na superfície como projeções em forma de bastonete. A hemaglutinina (HA) é inicialmente sintetizada como um precursor trimérico (HA0) contendo três cadeias de proteínas idênticas, cada uma das quais é processada proteoliticamente em duas subunidades, HA1 e HA2, que são mantidas covalentemente unidas por uma única ligação dissulfeto. HA atua como mediador da ligação do vírus com o receptor celular. Moléculas de neuraminidase (NA) estão presentes em menos quantidade no envoltório. Cepas humanas circulantes são notórias quanto a sua tendência em acumular mutações de um ano para o seguinte e causar epidemias recorrentes.

[007] Em eucariotas, resíduos de açúcar são comumente ligados a quatro diferentes resíduos de aminoácidos. Esses resíduos de aminoácidos são classificados como O-ligados (serina, treonina e hidroxilisina) e N-ligados (asparagina). Os açúcares O-ligados são sintetizados no aparelho de Golgi e no retículo endoplasmático rugoso (ER) a partir de açúcares do nucleotídio. Os açúcares N-ligados são sintetizados a partir de um precursor comum e subsequentemente processados. Sabe-se que a adição de cadeias de carboidratos N-ligados é importante para estabilização de dobramento, prevenção de degradação no retículo endoplasmático, oligomerização, atividade biológica e transporte de glicoproteínas. A adição de oligossacarídios N-ligados a resíduos Asn específicos desempenha um importante papel na regulação da atividade, da estabilidade ou da antigenicidade de proteínas virais maduras (Opdenakker G. et al. FASEB Journal 7, 1330-1337). Também foi sugerido que glicosilação N-ligada é necessária para dobramento, transporte, expressão de superfície celular, secreção de glicoproteínas (Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265 1994), proteção de degradação proteolítica e aumento de solubilidade glicoproteica (Doms et al., Virology 193, 545-562 1993). Glicoproteínas da superfície viral não somente são necessárias para corrigir dobramento de proteínas, mas também fornecem proteção contra anticorpos neutralizantes como um “escudo de glicano”. Como resultado, seleção efetiva específica do hospedeiro está frequentemente associada a posições no códon de potencial glicosilação N- ligada. Consequentemente, os locais de glicosilação N- ligada tendem a ser conservados através de cepas e classes.

[008] Surtos do vírus da influenza A continuam a causar morbidade e mortalidade em todo o mundo. Nos Estados Unidos somente, estima-se que 5 a 20% da população é infectada pelo vírus da influenza A anualmente, causando cerca de 200.000 hospitalizações e 36.000 mortes. O estabelecimento de políticas de vacinação abrangente tem sido uma medida eficaz para limitar morbidade relacionada com influenza. Entretanto, a frequente flutuação genética do vírus requer reformulação anual da vacina, resultando potencialmente em um desequilíbrio entre a cepa viral presente na vacina e a circulante. Desse modo, terapias antivirais contra o vírus influenza são importantes ferramentas para limitar tanto a gravidade da doença quanto a transmissão.

[009] Os vírus influenza H5N1 altamente patogênicos têm causado surtos em aves domésticas e aves silvestres desde 2003 [Li K S et al. (2004) Nature 430:209-313]. Em fevereiro de 2010, esses vírus infectaram não apenas espécies aviárias como também mais de 478 pessoas, das quais 286 casos comprovadamente foram fatais (www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/country/casestabl e20100217/en/index.html). O vírus da influenza A H5N1 altamente patogênico e o vírus da influenza A de origem suína em 2009 (H1N1) causaram surtos globais e motivaram uma grande preocupação de que possam ocorrer alterações adicionais nos vírus resultando em uma pandemia implacável [Garten R J, et al. (2009) Science 325:197-201, Neumann G, et al. (2009) Nature 459:931-939]. Há grande preocupação de que um vírus influenza possa adquirir a capacidade de disseminar-se eficientemente entre seres humanos, tornando- se portanto uma ameaça pandêmica. Um vacina contra influenza deve, portanto, ser parte integral de qualquer plano de preparação em caso de pandemia.

[010] Importantes contribuições para o entendimento de infecções pelo vírus influenza originaram-se dos estudos sobre hemaglutinina (HA), uma proteína de revestimento viral que se liga a receptores de glicano sializado específicos no trato respiratório, permitindo que o vírus penetre na célula [Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394397; Maines TR, et al. (2009) Science 325:484-487; Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Ver Biochem 69:531-569; van Riel D, et al. (2006) Science 312:399-399]. Para cruzar a barreira entre espécies e infectar a população humana, a HA aviária deve alterar sua preferência de ligação a receptor de um glicano sializado no terminal que contém motivos de ácido siálico ligados a α2,3 (aviário) e ligados a α2,6 (humano) [Connor RJ, et al. (1994) Virology 205:17-23], e esse desvio poderia ocorrer somente por meio de duas mutações, como na pandemia de 1918 [Tumpey TM, et al. (2007) Science 315:655-659]. Portanto, a compreensão dos fatores que interferem na ligação do vírus influenza a receptores de glicano é fundamental para o desenvolvimento de métodos destinados a controlar qualquer recombinação futura de cepas do vírus influenza com potencial pandêmico.

[011] A hemaglutinina (HA) do vírus influenza é uma proteína transmembrana homotrimérica com um ectodomínio composto de uma parte frontal globular e uma região peduncular [Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397]. Ambas as regiões transportam oligossacarídios N-ligados [Keil W, et al. (1985) EMBO J 4:2711-2720], que interferem nas propriedades funcionais da HA [Chen ZY, et al. (2008) Vaccine 26:361-371; Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725]. HA é a glicoproteína de superfície do vírion que une o vírus a seus receptores em células hospedeiras e funde o envoltório viral com as membranas de vesículas endocíticas para iniciar o processo de infecção [Crecelius D. M., et al. (1984) Virology 139, 164-177]. É também o componente do vírion que estimula a formação de anticorpos protetores. A natureza e a extensão da glicosilação da HA foram implicadas em alteração de suas propriedades de ligação ao receptor e no aparecimento de variantes virais com citopatogenicidade [Aytay S., Schulze I. T. (1991) J. Virol. 65, 3022-3028] e virulência (Deshpande K. L., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 36-40] aumentadas e ocultação de seus locais antigênicos [Skehel J. J., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 1779-1783]. Deleção de mutações de locais de glicosilação de HA pode interferir na ligação ao receptor viral [Gunther I, et al. (1993) Virus Res 27:147-160].

[012] A sequência de aminoácido da HA, e portanto a localização de seus sítios de N-glicosilação, é determinada pelo genoma viral. As estruturas desses oligossacarídios parecem ser determinadas por sua posição na HA [Keil W., et al. (1985) EMBO J. 4, 2711-2710] e pelas enzimas biossintéticas e de restrição fornecidas pela célula hospedeira em que o vírus está em crescimento. A plasticidade do genoma viral e a maquinaria de glicosilação especificada do hospedeiro podem, em conjunto, criar populações de vírus com estrutura e função mais heterogêneas do que poderia ser desenvolvido por um ou outro processo isoladamente. Essa diversidade é considerada responsável pela sobrevivência desses vírus e pela sua capacidade de superar os efeitos inibidores de anticorpos neutralizantes e agentes antivirais.

[013] A HA parece possuir regiões que devem ser glicosiladas, outras que devem ser isentas de oligossacarídios e ainda outras em que a glicosilação pode ser vantajosa ou prejudicial para a sobrevivência do vírus. Os locais de glicosilação em determinadas posições na HA de vírus influenza A isolados de diversos animais e seres humanos são altamente conservados e, portanto, parecem ser essenciais para a formação e/ou manutenção de HA funcional [Gallagher P. J., et al. (1992) J. Virol. 66, 7136-7145]. Por outro lado, a geração de locais de glicosilação em determinadas regiões da HA reduz seu transporte para a superfície celular e sua estabilidade e/ou função [Gallagher P., et al. (1988) J. Cell Biol. 107, 2059-2073]. É nas regiões em que a glicosilação não é nem proibida nem requerida para a formação de HA funcional que a diversidade de oligossacarídios pode exercer um efeito seletivo principal, dependendo do ambiente específico em que se espera crescimento do vírus.

[014] Alterações na sequência de peptídios em sítios de glicosilação ou próximo a eles podem modificar a estrutura 3D da HA e, portanto, a especificidade e a afinidade de ligação ao receptor. De fato, HAs de diferentes subtipos de H5N1 têm diferentes padrões de ligação a glicano [Stevens J, et al. (2008) J Mol Biol 381:1382-1394].

[015] Mutagênese de locais de glicosilação em H1 e H3 foi estudada em todo o sistema viral [Chandrasekaran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Deom CM, et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3771-3775]. Alterações na glicosilação poderiam interferir na especificidade e na afinidade de ligação ao receptor, especialmente no que diz respeito à HA da maioria dos H5N1 patogênicos.

[016] Regiões de hemaglutinina menos altamente glicosiladas ou não glicosiladas continuam a desenvolver mutações para escapar do sistema imune do hospedeiro. Modelos de vacina que empregam HA monoglicosilada são descritos em US Pat. App. Pub. No. 2010/0247571 (Wong et al.). Desse modo, há uma necessidade de novos e eficientes métodos para produção de partículas virais de influenza monoglicosiladas.

RESUMO DA INVENÇÃO

[017] A descrição aqui fornece demonstração ilustrativa de produção de vírus influenza monoglicosilados. Os métodos descritos são igualmente aplicáveis à produção de vírus com glicanos simplificados em proteínas estruturais. Regiões de proteínas estruturais conservadas com alta glicosilação podem servir como alvo para modelo de vacina uma vez que os padrões de glicosilação presentes nesses locais são simplificados para regiões mono-, di-, tri- ou outras glicosiladas.

[018] Especificamente, há uma necessidade para geração de anticorpos monoclonais de neutralização cruzada que podem ser usados no modelo e validação dos processos de produção de vacina que mantenham ou aumentem a qualidade e a antigenicidade de epítopos de neutralização cruzada em vacinas fabricadas atualmente e no futuro. Pressupondo-se que a ligação do anticorpo ao antígeno reflete a integridade estrutural e o potencial antigênico, poder-se- ia tentar a ligação de anticorpos de neutralização cruzada, tais como polipeptídios de HA monoglicosilada e avaliar quantitativamente seu potencial de neutralização cruzada. Espera-se que vacinas contra derivados monoglicosilados de HA de influenza aumentem a imunogenicidade rumo a epítopos universais.

[019] O antígeno é gerado por remoção parcial de açúcares da glicoproteína viral para expor os locais de glicosilação (que são altamente conservados e não desenvolvem mutação ou não sofrem mutação de modo agressivo) e ao mesmo tempo manter açúcares adequados para preservar a estrutura terciária da glicoproteína. As glicoproteínas virais parcialmente glicosiladas são geradas por desglicosilação parcial das glicoproteínas de modo que determinado local de glicosilação mantém uma, duas ou três unidades de açúcar. Em alguns aspectos, a glicoproteína parcialmente glicosilada pode ser gerada mediante o fornecimento de uma proteína ou um polipeptídio não glicosilados em um ou mais determinados locais de glicosilação e de conjugação de um mono-, di- ou trissacarídio aos locais de glicosilação.

[020] É descrita uma vacina compreendendo pelo menos uma glicoproteína de HA parcialmente glicosilada e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas aplicações, a glicoproteína de HA parcialmente glicosilada é selecionada do grupo que consiste em vírus H1, H3 e H5 de influenza parcialmente glicosilados.

[021] É discutido um método compreendendo a administração a um indivíduo suscetível a influenza de uma vacina compreendendo pelo menos uma glicoproteína de HA desglicosilada e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas aplicações, a glicoproteína de HA desglicosilada é selecionada do grupo que consiste em H1, H3 e H5.

[022] Em algumas aplicações, a desglicosilação deixa uma monoglicosilação (permanência de um açúcar) em um ou mais locais de glicosilação na glicoproteína. Em algumas aplicações, a desglicosilação deixa uma diglicosilação (permanência de 2 açúcares) em pelo menos um local de glicosilação na glicoproteína. Em algumas aplicações, a desglicosilação deixa uma triglicosilação (permanência de 3 açúcares) em um ou mais locais de glicosilação na glicoproteína. Em algumas aplicações, a desglicosilação deixa pelo menos uma de uma monoglicosilação, uma diglicosilação e uma triglicosilação em pelo menos um local de glicosilação na glicoproteína.

[023] Em algumas modalidades, o antígeno HA da influenza é produzido por técnicas recombinantes em uma cultura celular. A cultura celular compreende células MDCK, células Vero ou células PER.C6. A kifunensina é adicionada à célula hospedeira que abriga um antígeno HA de influenza recombinanante.

[024] Em alguns aspectos, a inibição de α-manosidase I resulta em glicoproteínas com Man9(GlcNAc)2.

[025] Em outras modalidades, o antígeno HA de influenza compreende um vírus influenza total. O vírus de influenza total é cultivado em um ovo de galinha embrionado hospedeiro isento de patógeno específico (SPF).

[026] Então, a kifunensina é adicionada à cavidade alantoica do ovo de galinha embrionado isento de patógeno específico (SPF).

[027] Em alguns aspectos, a kifunensina é adicionada em uma concentração de 0,005 a 0,5 mg/ml.

[028] O antígeno HA do vírus influenza recuperado é tratado com cerca de 0,1 a cerca de 100 μg/ml de Endo H. Em alguns aspectos, o vírus influenza monoglicosilado é isolado por um método que compreende ultracentrifugação por gradiente de densidade.

[029] Em alguns aspectos, o método ainda compreende purificação do antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado por um método que compreende ultrafiltração. Em algumas modalidades, a ultrafiltração compreende o uso de um filtro com 2 μm.

[030] Em alguns aspectos, o método ainda compreende análise do vírus influenza monoglicosilado por microscopia eletrônica.

[031] Em alguns aspectos, o método ainda compreende quantificação do vírus influenza monoglicosilado por um método compreendendo tratamento com PNGase.

[032] Em alguns aspectos, o método ainda compreende quantificação do vírus influenza monoglicosilado por

[033] um método compreendendo eletrocromatografia com SDS-PAGE.

[034] Em alguns aspectos, o método ainda compreende análise da composição de glicano do vírus influenza monoglicosilado isolado por um método que compreende espectrometria de massa.

[035] A invenção relaciona-se com um antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado (vírus total ou recombinante) preparado por um método descrito aqui.

[036] A invenção relaciona-se com o uso de um antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado (vírus total ou recombinante) preparado por qualquer método descrito aqui, para a preparação de uma vacina.

[037] Estes e outros aspectos se tornarão evidentes com base na descrição a seguir da modalidade preferida considerada em conjunto com os desenhos que se a seguem, embora variações e modificações nesse sentido possam ser efetuadas sem se desviar do princípio e do objetivo dos novos conceitos da descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[038] Os desenhos que se seguem formam parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar ainda mais determinados aspectos da presente descrição, cujas invenções podem ser mais bem compreendidas por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui. A patente ou depósito de pedido contém pelo menos um desenho representado em cor. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) em cor serão fornecidas pelo Escritório conforme requisição e pagamento das taxas necessárias.

[039] A FIGURA 1 mostra a preparação do vírus NIBRG-14 Monoglicosilado. (Fig. 1A) O vírus foi cultivado em diferentes concentrações do inibidor de processamento de N- glicosilação kifunensina. (Fig. 1B) Vírus glicosilado com alto conteúdo de manose foi convertido para vírus Monoglicosilado por diferentes concentrações de Endo H. (Fig. 1C) Em comparação com vírus totalmente glicosilado purificado, o vírus monoglicosilado purificado teve redução óbvia no nível de atividade tanto em HA1 quanto em HA2. Tais amostras foram analisadas por análise de Western blot usando-se antissoro de coelho com HA anti-H5.

[040] A FIGURA 2 mostra as eletromicrografias de vírus totalmente glicosilados e monoglicosilados. (Fig. 2A) NIBRG-14 totalmente glicosilado. (Fig. 2B) NIBRG-14 monoglicosilado. As partículas virais foram coradas por tungstato de metilamina e analisadas por microscopia eletrônica de transmissão.

[041] A FIGURA 3 mostra a quantificação de Hemaglutinina. A quantidade de hemaglutinina do vírus NIBRG-14 foi determinada pela intensidade de PNGase F da HA1 desglicosilada em SDS-PAGE.

[042] A FIGURA 4 mostra análise de glicopeptídio da hemaglutinina de NIBRG-14 monoglicosilado. (Fig. 4A) Os locais de glicosilação da Hemaglutinina de NIBRG-14 são marcados com números de resíduos de aminoácido. A estrutura foi criada com código 1jsm do PDB e o local de glicosilação foi corado em vermelho. (Fig. 4B) Análise de glicopeptídio da hemaglutinina de NIBRG-14 monoglicosilado. Após conversão por Endo H, a maioria dos locais de glicosilação é monoglicosilada, à exceção de que os locais de glicosilação 295 e 489 estão ainda parcialmente (<10%) glicosilados com alto conteúdo de manose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] Os termos usados nesta especificação geralmente têm seus significados habituais no assunto, dentro do contexto da invenção e no contexto específico em que cada termo é usado. Determinados termos que são usados para descrever a invenção são discutidos adiante ou em outro local na especificação, para fornecer orientação adicional ao profissional a respeito da descrição da invenção. Para conveniência, determinados termos podem ser destacados, por exemplo usando-se itálicos e/ou aspas. O uso de destaque não tem influência sobre o propósito e o significado de um termo; o propósito e o significado de um termo são os mesmos, no mesmo contexto, esteja ele ou não destacado. Será considerado que a mesma coisa pode ser dita em mais de um modo.

[044] Consequentemente, linguagem e sinônimos alternativos podem ser usados por qualquer um ou mais dos termos discutidos aqui, nem é de nenhuma significância especial expor se um termo é ou não elaborado ou discutido aqui. Sinônimos para determinados termos são fornecidos. O emprego de um ou mais sinônimos não exclui o uso de outros sinônimos. O uso de exemplos em qualquer parte desta especificação incluindo exemplos de quaisquer termos discutidos aqui é ilustrativo apenas e de nenhum modo limita o propósito e o significado da invenção ou de qualquer termo exemplificado. Do mesmo modo, a invenção não se limita a várias modalidades fornecidas nesta especificação.

[045] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme é compreendido por um especialista no assunto a que esta invenção diz respeito. No caso de discordância, o presente documento, incluindo definições, prevalecerá. As seguintes referências fornecem para aquele com qualificações uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

[046] Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura celular e tecidual, biologia molecular e química e hibridização de proteína e de oligo- e polinucleotídio descritas aqui são aquelas bem conhecidas e usadas no assunto. Técnicas padrões são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídio e cultura e transformação tecidual (p. ex., eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizadas no assunto ou conforme descrito aqui. A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado especificamente ao contrário, métodos convencionais de virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas do DNA recombinante dentro dos métodos do assunto, muitos dos quais são descritos adiante a título de ilustração. Essas técnicas são explicadas integralmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

[047] Os termos “subtipo de influenza A” ou “subtipo do vírus influenza A” são usados de modo intercambiável e se referem a variantes do vírus influenza A que são caracterizadas por uma proteína da superfície viral do tipo hemaglutinina (H), sendo portanto marcadas por um número para H, tal como, por exemplo, H1, H3 e H5. Além disso, os subtipos podem ser ainda caracterizados por uma proteína da superfície viral do tipo neuraminidase (N), indicados por um número para N, tal como, por exemplo, N1 e N2. Desse modo, um subtipo pode ser referido por números tanto para H quanto para N, tal como, por exemplo, H1N1, H5N1 e H5N2. Os termos especificamente incluem todas as cepas (entre elas cepas extintas) dentro de cada subtipo, que usualmente resultam de mutações e exibem perfis patogênicos diferentes. Tais cepas serão também referidas como vários “isolados” de um subtipo viral, incluindo todos os isolados do passado, do presente e do futuro.

[048] Consequentemente, neste contexto, os termos “cepa” e “isolado” são usados de modo intercambiável. Os subtipos contêm antígenos baseados em um vírus influenza A. Os antígenos podem ser baseados em uma proteína da superfície viral do tipo hemaglutinina e podem ser designados como ”antígeno HA”. Em alguns casos, tais antígenos são baseados na proteína do subtipo particular, tal como, por exemplo, um subtipo H1 e um subtipo H5, que podem ser designados como um antígeno H1 e um antígeno H5, respectivamente.

[049] Conforme se usa na presente descrição, o termo proteína “desglicosilada” ou “parcialmente glicosilada” denota uma proteína que teve um ou mais açúcares removidos da estrutura do glicano de um estágio totalmente glicosilado da proteína e em que a proteína substancialmente mantém a conformação/dobramento nativos. Uma proteína “desglicosilada” inclui uma proteína parcialmente glicosilada em que o processo de desglicosilação deixa uma monoglicosilação, uma diglicosilação ou uma triglicosilação em um ou mais locais de glicosilação presentes na glicoproteína.

[050] Uma proteína “parcialmente glicosilada” inclui uma proteína “desglicosilada” em que um ou mais açúcares são mantidos em cada local de glicosilação, e cada local de glicosilação contém uma estrutura de glicano menor (com poucas unidades de açúcar) quando comparado com o local em um estágio totalmente glicosilado da glicoproteína, e a proteína parcialmente glicosilada substancialmente mantém a conformação/dobramento nativos. Uma proteína “parcialmente glicosilada” é gerada por desglicosilação parcial da estrutura do glicano de pelo menos um local de glicosilação de um estágio totalmente glicosilado da glicoproteína. Uma proteína “parcialmente glicosilada” também é gerada por introdução de glicosilação em um local não glicosilado de uma proteína de modo que a sequência de glicosilação adicionada é menor do que a estrutura do glicano naquele local em um estágio totalmente glicosilado da glicoproteína. Uma proteína “parcialmente glicosilada” também é gerada por síntese de uma sequência da glicoproteína viral, ou fragmento dela, introduzindo-se unidades de aminoácido glicosilado (p. ex., grupamentos GlcNAc-Arginina) em locais de glicosilação da sequência, de modo que a estrutura do glicano adicionado é menor que a estrutura do glicano naquele local em estágio totalmente glicosilado da glicoproteína.

[051] A transmissão viral tem início com uma interação crítica envolvendo glicoproteína do tipo hemaglutinina (HA), que está no revestimento viral do influenza, e ácido siálico (SA) contendo glicanos, que estão na superfície da célula hospedeira. Para elucidar o papel da glicosilação de HA nessa importante interação, várias glicoformas de HA definidas foram preparadas, e sua afinidade e especificidade de ligação foram estudadas pelo uso de uma microdistribuição sintética de SA. Truncamento das estruturas de N-glicano em HA aumentou as afinidades de ligação de SA ao mesmo tempo reduzindo a especificidade no que diz respeito a ligantes de SA incompatíveis. A contribuição de cada monossacarídio e do grupo sulfato dentro das estruturas do ligante de SA em relação à energia de ligação de HA foi quantitativamente examinada. Foi verificado que o grupo sulfato aumenta em aproximadamente 100 vezes (2,04 kcal/mol) a energia de ligação em relação a HA totalmente glicosilada, e desse modo o glicano biantenário em relação à glicoforma de HA monoglicosilada. Anticorpos aumentados contra proteína HA que conduzem apenas um único GlcNAc N-ligado em cada local de glicosilação mostraram melhor afinidade de ligação e atividade de neutralização contra subtipos de influenza do que HAs totalmente glicosiladas desencadeadas. Assim, a remoção de glicanos estruturalmente não essenciais em glicoproteínas da superfície viral é um procedimento muito eficaz e geral para modelos de vacina contra vírus influenza e outros vírus humanos.

[052] A glicosilação de polipeptídios é tipicamente N- ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à união do grupamento carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. Um “sequon” é uma sequência de três aminoácidos consecutivos em uma proteína que pode servir como o local de união a um polissacarídio (açúcar) denominado Glicano N- ligado. Este é um polissacarídio ligado à proteína pelo átomo de nitrogênio na cadeia lateral de asparagina (Asn). Um sequon é um Asn-Xaa-Ser ou Asn-Xaa-Thr, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto prolina. Assim, a presença de uma ou outra dessas sequências de tripeptídios em um polipeptídio cria um local de glicosilação em potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à união de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possa também ser usada. Embora o sequon Asn-X-Ser/Thr seja absolutamente requerido para a união de oligossacarídios N-ligados a uma glicoproteína (Marshall RD, Biochemical Society Symposia 40, 17-26 1974), sua presença nem sempre resulta em glicosilação, e alguns sequons em glicoproteínas podem permanecer não glicosilados (Curling EM, et al., Biochemical Journal 272, 333-337 1990).

[053] Um aspecto da presente invenção é um método de produção de glicoproteínas não nativas que possuem estruturas de carboidrato simplificadas.

[054] Consequentemente, o método é aplicável a retrovírus tais como HIV, flavivírus como o da hepatite C, da dengue e da febre do Nilo ocidental e o equivalente.

[055] Aproximadamente metade da massa molecular da gp120, a proteína do envoltório de ligação ao receptor do vírus da imunodeficiência humana (HIV), consiste em glicanos N-ligados. Cerca de metade desses glicanos são do tipo de alto conteúdo de manose. Esses glicanos com alto conteúdo de manose fornecem uma rica gama de resíduos de manose à superfície do vírus tornando o HIV um alvo primordial para interação com lectinas específicas de manose do sistema imune.

[056] As glicoproteínas do envoltório do vírus da hepatite C (HCV) são altamente glicosiladas, em geral com 4 e 11 glicanos N-ligados em E1 e E2, respectivamente. Vários glicanos desempenham um importante papel na montagem de HCVcc e/ou na infectividade. Pelo menos cinco glicanos em E2 (denotados por E2N1, E2N2, E2N4, E2N6 e E2N11) reduzem fortemente a sensibilidade do HCV a neutralização por anticorpos [Helle F et al., J Virol. 2010 Nov;84(22):11905- 15].

[057] A proteína E da maioria dos flavivírus é modificada por glicosilação Asn-ligada no resíduo 153/154 e nos quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV) por um segundo glicano no resíduo 67. No vírus da dengue, glicanos N-ligados na proteína E são uma mistura de glicanos com alto conteúdo de manose e complexos. A proteína do envoltório (E) do vírus da febre do Nilo ocidental contém um único local de glicosilação N-ligada no resíduo 154. Como a remoção de glicanos nesses locais reduz marcadamente, mas não elimina, a infectividade, vacinas que têm como alvo os locais conservados quando elas são apresentadas com glicosilação simplificada podem resultar em terapia eficaz que é menos sensível a variações de mutação no vírus.

[058] Inibidores da glicosidase

[059] Hidrolases de glicosídios (também denominadas glicosidases ou glicosil-hidrolases) catalisam a hidrólise da ligação glicosídica para liberar açúcares menores. Elas são enzimas comuns com papéis na natureza incluindo degradação de biomassa como celulose e hemicelulose, em estratégias de defesa antibacteriana (p. ex., lisozima), em mecanismos de patogenia (p. ex., neuraminidases virais) e em função celular normal (p. ex., manosidases de restrição envolvidas em biossíntese de glicoproteína N-ligada). Juntamente com glicosiltransferases, glicosidases formam a principal maquinaria catalítica para a síntese e ruptura de ligações glicosídicas.

[060] Inibidores de glicosilação são considerados para uso de acordo com os métodos da invenção. Exemplos de tais inibidores incluem Kifunensina, Australina, Castanospermina, Desoxinojirimicina, Desoximanojirimicina, Swainsonina, Manostatina A e o equivalente. Australina é um alcaloide pirrolizidínico poli-hidroxilado que é um bom inibidor da alfa-glicosidase-amiloglicosidase (inibição de 50% em 5.8 microM), mas não inibe beta-glicosidase, alfa- ou beta-manosidase ou alfa- ou beta-galactosidase. Castanospermina é um alcaloide indolisínico que inibe atividades de alfa-glicosidase e altera a distribuição de glicogênio. Castanospermina inibe infecção pelo vírus da dengue [Whitby K et al., J Virol. 2005 July; 79(14):8698- 8706].

[061] A biossíntese dos vários tipos de estruturas de oligossacarídios N-ligados envolve duas séries de reações: 1) a formação do precursor de sacarídio ligado a lipídio, Glc3Man9(GlcNAc)2-pirofosforil-dolicol, pela adição gradual de GlcNAc, manose e glicose a dolicol-P; e 2) a remoção de glicose e manose por glicosidases ligadas à membrana e a adição de GlcNAc, galactose, ácido siálico e fucose por glicosiltransferases localizadas no Golgi para produzir diferentes estruturas oligossacarídicas complexas.

[062] O uso de inibidores que bloqueiam as reações de modificação em diferentes etapas estimula a célula a produzir glicoproteínas com estruturas de carboidrato alteradas. Foram identificados diversos compostos semelhantes a alcaloides que são inibidores específicos das glicosidases e manosidases envolvidas em processamento de glicoproteínas. Esses compostos causam a formação de glicoproteínas com estrutura de conteúdo elevado de manose contendo glicose ou várias cadeias com alto conteúdo de manose ou híbridas, dependendo do local de inibição [Elbein AD FASEB J. 1991 Dec; 5(15):3055-3063].

[063] As primeiras quatro enzimas que funcionam no processamento de glicoproteínas N-ligadas são glicosidases. GlcNAc-fosfotransferase catalisa a primeira etapa na síntese do determinante de manose-6-fosfato. Uma estrutura apropriada de carboidrato facilita substancialmente a fosforilação eficiente por GlcNAc-fosfotransferase. A estrutura do carboidrato acoplado a fosforilação que é necessária para a síntese de um sinal da manose-6-fosfato sobre a molécula de GAA é um N-glicano com alto conteúdo de manose.

[064] Diversos inibidores do processamento de manosidase são conhecidos. Foi mostrado que a swainsonina, isolada do astrágalo, é um potente inibidor da manosidase II do Golgi, mas não exerce efeito sobre a manosidase I [James, L. F., Elbein A. D., Molyneux, R. J., and Warren, C. D. (1989) Swainsonine and related glycosidase inhibitors. Iowa State Press, Ames, Iowa]. Desoximanojirimicina é um inibidor razoavelmente potente da manosidase hepática do rato. Em células intactas, a desoximanojirimicina bloqueou a síntese de tipos complexos de oligossacarídios e causou o acúmulo de glicoproteínas que possuem estruturas de Man7-9(GlcNAc)2, com predomínio de oligossacarídios de Man9(GlcNAc)2 [Elbein A. D., et al. (1984) Arch. Biochem. Biophys. 235, 579-588].

[065] Manostatina A é um metabólito produzido pelo microrganismo Streptoverticillium verticillus, tendo sido relatado que esse composto é um potente inibidor de α- manosidase do epidídimo de ratos [Aoyagi, T., et al. (1989) J. Antibiot. 42, 883-889].

[066] A kifunensina (Kif) foi primeiramente isolada do actinomiceto Kitasatosporia kifunense No. 9482 (M. Iwami, O. et al. J. Antibiot. 40, 612, 1987) e é um derivado oxamídico cíclico de 1-amino-manojirimicina. A kifunensina inibe a enzima manosidase I do Golgi de animais. Quando kifunensina é adicionada a células cultivadas de mamíferos em concentrações de 1 μg/ml ou mais elevadas, ela causa uma substituição completa na estrutura dos oligossacarídios N- ligados de cadeias complexas para estruturas Man9(GlcNAc)2, de acordo com sua inibição da manosidase I. Por outro lado, a desoximanojirimicina, mesmo em 50 μg/ml, não impede a formação de todas as cadeia complexas [Elbein A. D., et al. (1990) Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J. Biol. Chem. 265, 15599-15605]. Portanto, a kifunensina é um dos mais eficazes inibidores do processamento de glicoproteínas.

[067] Também foi mostrado que a kifunensina promove atividade imunomoduladora na inibição de α-manosidase. A síntese de kifunensina foi relatada tanto por Fujisawa Pharmaceutical Co. (H. Kayakiri, et al., Tetrahedron Lett., 31, 225, 1990; H. Kayakiri, et al., Chem. Pharm. Bull., 39, 1392, 1991) quanto por Hudlicky et al. (Rouden and T. Hudlicky, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1095, 1993; J. Rouden, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 5099, 1994).

[068] Tratamento de células com kifunensina (Kif) resulta na inibição de processamento de glicoproteínas nessas células [Elbein et al (1991) FASEB J (5):3055-3063; e Bisshoff et al (1990) J. Biol. Chem. 265(26):15599- 15605]. A Kif bloqueia a união de açúcar complexo a proteínas modificadas. Entretanto, se Kif suficiente for utilizada para inibir completamente o processamento de glicoproteínas em hidrolases lisossômicas, as hidrolases resultantes têm estruturas de manose-9, que não são os substratos mais eficientes para a enzima GlcNAc- fosfotransferase.

[069] De acordo com a invenção, um inibidor de glicosidase, tal como Kif, é adicionado às células na quantidade de pelo menos 0,01 μg/ml a cerca de pelo menos 500 μg/ml, incluindo 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75 e todos os valores entre estes.

[070] A kifunensina inibe a função da enzima α- manosidase I na via de N-glicosilação e resulta em glicoproteínas com composições de Man9GlcNAc.

[071] Níveis e/ou tipos de estruturas de carboidrato complexo podem ser medidos usando-se métodos conhecidos. Por exemplo, glicoproteínas e seus oligossacarídios associados podem ser caracterizados com o emprego de endoglicosidases para diferenciar entre oligossacarídios com alto conteúdo de manose e do tipo complexos [Maley et al (1989) Anal. Biochem. 180:195-204]. A peptídio-N4(N- acetil-1-β-glicosaminil)asparagina-amidase (PNGase F) é capaz de hidrolisar oligossacarídios ligados a asparagina (N-ligados) na ligação de β-aspartilglicosilamina para produzir amônia, ácido aspártico e um oligossacarídio com um di-N-acetilquitobiose no terminal de redução. A especificidade da PNGase é ampla porque oligossacarídios sulfatados e polissializados, complexos híbridos, di- trie tetra-antenários com alto conteúdo de manose são substratos. Além disso, endo-β-N-acetilglicosaminidase H (Endo H) efetivamente hidrolisa a unidade de quitobiose em oligossacarídios híbridos e contendo manose N-ligados que possuem três resíduos de manose, desde que o braço de α- 1,6-manose tenha outra manose unida. Oligossacarídios complexos são resistentes a digestão por Endo H.

[072] Para caracterizar o tipo de oligossacarídios N- ligados presentes em glicoproteínas, uma alíquota da proteína pode ser digerida com PNGase F (SDS a 0,5%, β- mercaptoetanol a 1%, NP-40 50 mM, Fosfato de Sódio 50 mM, pH de 7.5) ou Endo H (SDS a 0,5%, β-mercaptoetanol a 1%, Citrato de Sódio 50mM, pH de 5.5) em condições de redução. As proteínas nativas e digeridas são então analisadas por eletroforese de SDS-poliacrilamida em condições de redução e as mobilidades comparadas. Se a glicoproteína contém somente oligossacarídios com alto conteúdo de manose, as amostras tratadas com PNGase F e Endo H terão maior mobilidade que a proteína não tratada. A proteína tratada com Endo H terá peso molecular ligeiramente mais elevado em razão da única N-acetilglicosamina remanescente em cada local de glicosilação N-ligada. Se uma glicoproteína contém apenas oligossacarídios complexos, a proteína tratada com Endo H não terá uma troca na migração em comparação com a proteína não tratada. Se houver ambos os complexos e oligossacarídios com alto conteúdo de manose, então a proteína tratada com Endo H será menor do que a glicoproteína não tratada porém maior do que a proteína tratada com PNGase F. A diferença será maior do que aquela que pode contribuir para a N-acetilglicosamina remanescente.

[073] Para gerar os glicanos simplificados nas glicoproteínas alvos, são usadas endoglicosidases. Uma endoglicosidase é uma enzima que libera oligossacarídios de glicoproteínas ou glicolipídios. Ou ela meramente cliva cadeias polissacarídicas entre resíduos que não são os resíduos terminais, embora a liberação de oligossacarídios de proteína conjugada ou moléculas lipídicas seja mais comum. Ela rompe as ligações glicosídicas entre dois monômeros de açúcar em um polímero. Exemplos de endoglicosidases incluem, mas não se limitam a, endoglicosidase D, endoglicosidase F, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase H e endoglicosidase S.

[074] Preparação de vírus influenza monoglicosilado

[075] Para produzir proteínas com glicoproteínas de alto conteúdo de manose, as células que abrigam vírus influenza são expostas a Kif (e/ou DMJ) com a finalidade de inibir processamento da glicoproteína. Para produzir vírus influenza monoglicosilado, o vírus é injetado na cavidade alantoica de ovos de galinha embrionados isentos de patógenos com um inibidor da manosidase, como kifunensina.

[076] A kifunensina inibe a função da enzima α- manosidase I na via de N-glicosilação e resulta em glicoproteínas com composições de Man9(GlcNAc)2. A concentração de kifunensina na inibição da glicosilação de hemaglutinina varia entre 5, 10, 25, 75, 100, 200, 500 μg/ml e acima de 500 μg/ml e todos os valores entre estes.

[077] Após cerca de 1-3 dias de incubação, o fluido alantoico tratado com kifunensina é coletado e digerido com endoglicosidase (EndoH) para remover glicanos do tipo de alto conteúdo de manose, isto é, concentrações capazes de converter Man9(GlcNAc)2 em GlcNAc único. A concentração de Endo H no fluido alantoico para produzir hemaglutinina monoglicosilada varia de pelo menos cerca de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 500 ou mais μg/ml de fluido alantoico. Subsequentemente, o vírus monoglicosilado é recuperado e purificado.

[078] Uso de vírus influenza monoglicosilado

[079] Os antígenos do vírus influenza monoglicosilado descritos aqui podem ser usados para imunizar contra infecção pelo vírus influenza. O vírus específico do qual os antígenos são derivados pode ser o mesmo ou diferente do vírus específico contra o qual está sendo fornecida proteção, porque se sabe que proteção cruzada entre diferentes isolados pode ocorrer com vírus influenza, particularmente dentro dos mesmos subtipos virais.

[080] As vacinas contra influenza atualmente em uso são designadas como vacinas de vírus total (WV) ou subvírion (SV) (também denominado “separado” ou “antígeno de superfície purificado”). A vacina WV contém vírus inativado intacto, ao passo que a vacina SV contém vírus purificado rompido com detergentes que solubilizam o envoltório viral contendo lipídio, seguindo-se inativação química do vírus residual. Vacinas virais atenuadas contra influenza estão também em desenvolvimento. Uma discussão de métodos de preparação da vacina convencional pode ser encontrada em Wright, P. F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D. M. et al. Ed.)1464-65 (2001).

[081] Onde uma vacina inclui mais de uma cepa de influenza, as diferentes cepas são em geral cultivadas separadamente e são misturadas depois de os vírus terem sido coletados e os antígenos terem sido preparados. Alternativamente, diferentes segmentos de diferentes isolados do vírus influenza podem ser combinados para gerar uma vacina multipotente. O(s) vírus influenza usado(s) nos processos da invenção pode(m) ser cepas recombinantes e/ou pode(m) ter sido obtido(s) por técnicas genéticas reversas. O(s) vírus pode(m) ser atenuado(s). O(s) vírus pode(m) ser sensível(eis) a temperatura. O(s) vírus pode(m) estar adaptados ao frio. Uma cepa recombinante incluindo os segmentos virais de HA e/ou NA de uma cepa patogênica e os seis ou sete segmentos remanescentes de uma cepa não patogênica pode ser usada.

[082] O antígeno do vírus influenza usado na composição imunogênica de acordo com a invenção pode estar na forma de um vírus vivo ou, preferivelmente, um vírus inativado. Inativação do vírus tipicamente envolve tratamento com uma substância química como formalina ou β-propiolactona. Onde um vírus inativado é usado, o antígeno pode ser um vírus total, um vírus separado ou subunidades virais. Vírus separados são obtidos mediante tratamento dos vírions com detergentes (p. ex., éter etílico, polissorbato 80, desoxicolato, tri-N-butilfosfato, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamônio etc.) para produzir preparações de subvírion. Vacinas de subunidades compreendem um dos antígenos ou ambos os antígenos de superfície hemaglutinina e neuraminidase do vírus influenza. Antígenos do vírus influenza podem também ser apresentados na forma de virossomos.

[083] Onde um antígeno é preparado a partir de um vírus influenza (isto é, em vez de ter sido produzido em um sistema recombinante ou sintético que não envolve cultura de vírus influenza), o vírus pode ser cultivado em ovos ou em cultura celular. Crescimento em ovos embrionados isentos de patógenos específicos é a via tradicional pela qual vírus influenza têm sido cultivados para produção de vacina, e cultura celular é um desenvolvimento mais recente. Onde é usada cultura celular, então as vacinas de vírus influenza são tipicamente cultivadas em células de mamíferos, como células MDCK, células Vero ou células PER.C6. Essas linhagens celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo, pela coleção da American Type Cell Culture (ATCC) ou pelo Coriel Cell Repositories (Camden, NJ). Por exemplo, a ATCC fornece várias diferentes células Vero sob números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL- 1586 E CRL-1587 e fornece células MDCK sob número de catálogo CCL-34. Cultivo em linhagens celulares aviárias, incluindo linhagens celulares derivadas de galinha, como fibroblastos de embrião de pinto (CEF), é também possível.

[084] Do mesmo modo, um vírus (como HIV, HCV, vírus da dengue, vírus influenza, flavivírus e o equivalente) pode ser cultivado em cultura celular na presença de um ou mais inibidores de glicosidase (como Kifunensina, Australina, Castanospermina, Desoxinojirimicina, Desoximanojirimicina, Swainsonina, Manostatina A e o equivalente). Sistemas de cultura celular para crescimento desses vírus são bem conhecidos no assunto. O vírus da febre do Nilo ocidental pode ser cultivado em células epiteliais de rim de macaco ou em cultura tecidual de células de embrião de pinto. HIV pode ser cultivado em cultura de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). HC pode ser cultivado em células derivadas da linhagem celular Huh-7 do hepatoma humano.

[085] As composições imunogênicas e medicamentosas da invenção são apropriadas para administração a um paciente. Isto pode ser conseguido de várias maneiras, incluindo mas não se limitando a: injeção intradérmica; administração transdérmica; e administração tópica. Elas podem ser usadas em conjunto com abrasão da pele - por exemplo, por papel abrasivo ou pelo uso de microabrasivos.

[086] As composições imunogênicas e medicamentosas da invenção são preferivelmente apresentadas como vacinas.

[087] As composições da invenção podem incluir um adjuvante. Adjuvantes que têm sido usados em vacinas contra influenza incluem sais de alumínio, quitosana, oligodesoxinucleotídios do tipo CpG como CpG 7909, emulsões óleo-em-água como MF59, emulsões água-em-óleo-em-água, toxina termolábil de E. coli e seus mutantes destoxificados, lipídio A monofosforilado e seus derivados 3-O-desacilados, mutantes da toxina de pertússis, dipeptídios de muramil etc. EXEMPLOS

[088] Sem pretender limitar o propósito da invenção, instrumentos, aparelhos, métodos e seus resultados relacionados ilustrativos de acordo com modalidades da presente invenção são fornecidos adiante. Observe que títulos ou subtítulos podem ser usados nos exemplos para conveniência de um leitor, o que de nenhum modo deve limitar o propósito da invenção. Além disso, determinadas teorias são propostas e discutidas aqui; entretanto, de nenhum modo elas, estejam certas ou erradas, devem limitar o propósito da invenção desde que a invenção seja praticada de acordo com a invenção sem dizer respeito a nenhuma teoria particular ou esquema de ação. Exemplo 1: Preparação do vírus totalmente glicosilado e monoglicosilado

[089] O vírus influenza A NIBRG-14 (H5N1) [Nicolson C, et al. (2005) Vaccine 23(22):2943-2952] foi injetado (1000 TCID50 [Dose Infectante de Cultura de Tecido a 50%] em 2000 μl de PBS) na cavidade alantoica de ovos de galinha embrionados isentos de patógeno específico (SPF) para produzir o vírus totalmente glicosilado habitual [WHO (2005) WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance (World Health Organization, Geneva)].

[090] Para produzir vírus monoglicosilado, o vírus foi injetado na cavidade alantoica juntamente com 0,2 mg/kg de kifunensina (Cayman Chemical). A kifunensina inibe a função da enzima α-monosidase I na via de N-glicosilação e resulta em glicoproteínas com composições de Man9(GlcNAc)2 [Elbein AD, et al. (1990) J Biol Chem 265(26):15599-15605].

[091] A dependência da concentração de kifunensina para inibir glicosilação de hemaglutinina foi analisada (Fig. 1A). Após 3 dias de incubação, o fluido alantoico foi coletado e centrifugado para remover fragmentos por 10 minutos a 3.000 g. O fluido alantoico tratado com kifunensina foi então digerido com endoglicosidase Endo H (20 μg por ml de fluido alantoico) por 12 horas a 4°C para remover glicanos do tipo de alto conteúdo de manose, isto é, de Man9(GlcNAc)2 para GlcNAc único. A dependência da concentração de Endo H no fluido alantoico para produzir hemaglutinina monoglicosilada foi analisada (Fig. 1B).

[092] Subsequentemente, o vírus monoglicosilado foi peletizado por ultracentrifugação durante 90 minutos a 46.000 g, ressuspenso com PBS e purificado por um gradiente de densidade de sacarose descontínuo (25%, 40%) durante 90 minutos a 270.000 g. O vírus no gradiente foi coletado e peletizado por ultracentrifugação durante 90 minutos a 120.000 g. Finalmente, o granulado foi ressuspenso em PBS e filtrado por filtro de 0,22 μm [CDC (1982) Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance (U.S. Dept. of Health and Human Services, Washington, DC); Harvey R, et al. (2008) Vaccine 26(51):6550-6554]. Em comparação com vírus totalmente glicosilado purificado, o vírus monoglicosilado purificado teve redução no nível de atividade em HA1 e HA2 (Fig. 1C). EXEMPLO 2: Análise por microscopia eletrônica dos vírus totalmente glicosilados e monoglicosilados

[093] A solução de vírus foi colocada na superfície revestida de colódio-carbono de uma grade de cobre (Electron Microscopy Sciences). Fluido excedente foi removido com papel de filtro, e tungstato de metilamina a 2% (Ted Pella, Inc.) foi adicionado para coloração por 30 segundos. Fluido excedente foi removido com papel de filtro e lavado com H2O por 30 segundos. Então a grade foi seca ao ar por 4 horas e as partículas virais foram fotografadas por microscopia eletrônica de transmissão (Hitachi H-7000). Os vírus influenza NIBRG-14 totalmente glicosilados e monoglicosilados têm tamanho e morfologia semelhantes (Fig. 2). EXEMPLO 3: Quantificação de hemaglutinina no vírus

[094] O vírus foi misturado com tampão de desnaturação (SDS a 5% e β-mercaptoetanol a 10%) e fervido por 10 minutos, e então a amostra foi adicionada com NP-40 a 10% e tratada com PNGase F (New England Biolabs) a 25°C por uma noite. A amostra foi misturada com tampão de amostra por SDS-PAGE e aquecida a 95°C por 10 minutos antes de carregamento no gel. O gel foi corado por SYPRO RUBY® (Invitrogen) e analisado por sistema de imagem VERSA DOC® (Bio-rad). O tratamento com PNGase F antes de análise por SDS-PAGE é para separar proteína HA1 de NP na amostra de vírus totalmente glicosilada. Isto possibilita comparação da intensidade de proteínas HA1 tanto dos vírus totalmente glicosilados e quanto dos monoglicosilados em SDS-PAGE para quantificação de hemaglutinina no vírus (Fig. 3). EXEMPLO 4: Análise de glicopeptídio com LC-MS-MS

[095] Espectrometria de massa foi usada para analisar a composição de glicano do vírus monoglicosilado. A solução de vírus foi misturada com tampão de amostra de não redução e aquecida a 95°C por 10 minutos antes de carregamento no gel. O gel foi corado com azul de Coumassie. A faixa da HA0 foi seccionada em pequenos fragmentos para digestão tríptica em gel com tripsina. Após a digestão, a amostra foi analisada por LS-MS-MS [Wu Y, et al. (2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24(7):965-972) (Agilent Technologies, Thermo Scientifi)]. Houve seis locais de N-glicosilação do vírus influenza NIBRG-14. Exceto uma pequena percentagem da presença de glicanos do tipo de alto conteúdo de manose em resíduo 295 [~10% de Man6(GlcNAc)2] e no resíduo 489 [~10% de Man7-9(GlcNAc)2], todos o outros glicanos são monglicosilados com um único resíduo sacarídico GlcNAc ligado (Fig. 4).

[096] Todas as publicações e solicitações de patentes citadas nesta especificação são incorporadas aqui por referência como se cada publicação ou solicitação de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[097] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e compreensão, será prontamente perceptível para aqueles habitualmente especializados no assunto à luz dos ensinamentos desta invenção que determinadas alterações e modificações podem nela ser feitas sem se desviar do princípio ou do propósito das reivindicações anexas.

Claims (33)

1. Método para produzir um vírus influenza monoglicosilado caracterizado por compreender: a) produzir um antígeno do tipo hemaglutinina (HA) do vírus influenza em uma cultura de células in vitro ou ovo embrionado com uma quantidade eficaz de um inibidor de manosidase, em que a concentração do inibidor de manosidase é suficiente para inibir α-manosidase I na via de N- glicosilação; b) colocar em contato o antígeno HA do vírus influenza recuperado da etapa a) com a endoglicosidase H (Endo H), em que a concentração de Endo H é suficiente para remover glicanos do tipo de alto conteúdo de manose; c) isolar um antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado produzido na etapa b); e d) produzir uma composição imunogênica compreendendo o antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado da etapa (c) e um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antígeno HA ser derivado de um vírus influenza H5N1.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o vírus influenza H5N1 ser NIBRG-14.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o inibidor da manosidase ser kifunensina (Kif).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o inibidor da manosidase ser desoximanojirimicina (DJM).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura celular compreender células MDCK, células Vero ou células PER.C6.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a inibição de α-manosidase I resultar em glicoproteínas com Man9(GlcNAc)2.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antígeno HA de influenza fazer parte de um vírus influenza total, cultivado em um hospedeiro de ovo de galinha embrionado isento de patógeno específico (SPF).

9. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 8, caracterizado por o inibidor de manosidase estar presente na cavidade alantóica do ovo de galinha embrionado isento de patógeno específico (SPF).

10. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado por o inibidor de manosidase ser adicionado à célula hospedeira que abriga um antígeno HA de influenza recombinante.

11. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a kifunensina ser adicionada em uma concentração de 0,005 a 0,5 mg/ml.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o antígeno HA de influenza ser recuperado por um processo compreendendo: incubar por um tempo suficiente para crescimento do vírus influenza; e isolar o vírus influenza que compreende o antígeno HA de influenza a partir do fluido alantóico do ovo de galinha embrionado isento de patógeno específico (SPF).

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antígeno HA do vírus influenza recuperado ser tratado com 0,1 a 100 μg/mL de Endo H para produzir um vírus influenza compreendendo um antígeno HA monoglicosilado.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vírus influenza compreendendo o antígeno HA monoglicosilado ser isolado por um método que compreende ultracentrifugação por gradiente de densidade.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda purificar o antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado por um método que compreende ultrafiltração.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a ultrafiltração compreender o uso de um filtro de 0,2 μm.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda analisar o vírus influenza monoglicosilado por microscopia eletrônica.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda quantificar o antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado por um método que compreende o tratamento com PNGase.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda quantificar o antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado por um método que compreende eletrocromatografia por SDS-PAGE.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda analisar a composição de glicano do antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado isolado por um método que compreende espectrometria de massa.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o antígeno HA do vírus influenza ser selecionado do grupo que consiste nas glicoproteínas H1, H3 e H5 do vírus influenza.

22. Antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado caracterizado por ser preparado pelo método, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 21.

23. Uso de um antígeno HA do vírus influenza monoglicosilado preparado pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado por ser na preparação de uma vacina.

24. Método para produzir um antígeno viral monoglicosilado caracterizado por compreender: a) produzir um antígeno viral em um hospedeiro adequado com uma quantidade eficaz do inibidor de glicosidase, em que a concentração do inibidor de glicosidase é suficiente para inibir uma glicosidase na via de N- glicosilação; b) colocar em contato o antígeno viral recuperado da etapa a) com uma endoglicosidase para produzir o antígeno viral na forma monoglicosilada; c) isolar o antígeno viral monoglicosilado produzido na etapa b); e d) misturar o antígeno viral monoglicosilado da etapa (c) com um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante para produzir uma composição imunogênica.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o antígeno viral ser de um ortomixovírus, um retrovírus ou um flavivírus.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o antígeno viral ser de HIV, HCV, vírus da dengue, vírus da febre do Nilo ocidental ou vírus influenza.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o inibidor da glicosidase ser selecionado do grupo que consiste em Kifunensina, Australina, Castanospermina, Desoxinojirimicina, Desoximanojirimicina, Swainsonina e Manostatina A.

28. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o antígeno viral ser produzido de forma recombinante no hospedeiro adequado, que é uma cultura celular.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o antígeno viral fazer parte de um vírus total.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por todo o vírus ser cultivado no hospedeiro adequado, que é uma cultura celular.

31. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o inibidor da glicosidase ser um inibidor de manosidase.

32. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o hospedeiro adequado ser uma cultura de células in vitro.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a cultura de células in vitro compreender células MDCK, células Vero ou células PER.C6.

Images