MX2013004996A - Metodos para producir particulas de virus con glucosilacion simplificada de proteinas de superficie. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para producción de partículas de virus con glucosilación simplificada en proteínas estructurales o de superficie. Cuando se utilizan como objetivos para producción de vacunas, la naturaleza conservada de dichos sitios genera vacunas que son más sensibles a mutaciones víricas. Se describe el uso de inhibidores de glucosilación para producción de virus con perfiles de glucosilación simplificados. Se proporciona una descripción de ejemplo de los virus de la influenza y métodos para producción de partículas de virus de influenza monoglucosilada. Se proporcionan métodos para producción de formas monoglucosiladas de virus de influenza A, NIBRG-14 (H5N1).

Description

MÉTODOS PARA PRODUCIR PARTÍCULAS DE VIRUS CON GLUCOSILACION SIMPLIFICADA DE PROTEÍNAS DE SUPERFICIE REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente provisional Estadounidense No. de Serie 61/410,257, presentada el 4 de noviembre, 2010 y titulada "MÉTODOS PARA PRODUCIR HEMAGLUTININA CON VIRUS DE INFLUENZA MONOGLUCOSILADO" cuyos contenidos se incorporan aquí en su totalidad como referencia.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con virus y en particular con la producción de partículas de virus con glucanos simplificados. En particular, la presente invención se relaciona con la producción de partículas de virus de influenza con glucosilación simplificada. Específicamente, la invención se relaciona con métodos para producción de partículas de virus de influenza monoglucosilada .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se describe aquí en términos de la preparación de ejemplo de virus de influenza monoglucosilados . Se contempla que se pueden utilizar los mismos métodos para preparar otros virus con estructura de glucano simplificada que incluyen retrovirus tales como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y flaviviridae tal como virus de dengue, virus del Nilo Occidental, virus de hepatitis C (HCV) y similares.

La influenza es provocada por un virus de ARN de la familia ortomixoviridae . Existen tres tipos de estos virus y provocan tres tipos diferentes de influenza: tipo A, B y C. Los virus de influenza tipo A infectan los mamíferos (humanos, cerdos, hurones, caballos) y aves. Esto - es muy importante para la humanidad, ya que este es el tipo de virus que ha provocado pandemias en todo el mundo. El virus de la influenza tipo B (también conocido simplemente como influenza B) infecta solo los humanos. Ocasionalmente provoca brotes locales de virus flu. Influenza C que también infectan solo a los humanos. Infectan la mayoría de las personas cuando son jóvenes y no suelen provocar enfermedades graves.

Los virus de influenza A infectan una amplia variedad de mamíferos, que incluyen hombres, caballos, cerdos, hurones y aves. Los principales patógenos humanos se asocian con epidemias y pandemias. Existe por lo menos 1 serotipo de hemaglutinina (H) conocido y 9 serotipos de neuraminidasa (N) conocidos. Se considera que los cerdos y aves son reservorios particularmente importantes, que generan grupos de virus genética y antigenéticamente diversos que se trasfieren de nuevo a la población humana a través de contacto cercano entre humanos y animales. Los virus de influenza B infectan solo a los mamíferos y provocan enfermedades, pero generalmente no tan graves como los tipos A. A diferencia del virus de influenza A, el virus de influenza B no tienen serotipos que se puedan distinguir. Los virus de influenza C también infectan . solo a los mamíferos, pero raramente provocan enfermedad. Ellos se distinguen genética y morfológicamente de los tipos A y B.

Existen 4 antígenos presentes en el virus de influenza, la hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , nucleocápsido (NA) , la matriz (M) y las proteínas de nucleocápsido (NP) . El NP es un antígeno de tipo específico que ocurre en 3 formas, A, B y C, que proporcionan la base para la clasificación de virus de influenza humanos. La proteína de matriz (proteína M) rodea el nucleocápsido y compensa el 35-45% de la masa de partícula. Se observan dos glucoproteínas de superficie sobre la superficie como proyecciones en forma de barra. La hemaglutinina (HA) se sintetiza inicialmente como un precursor trimérico (HAO) que contiene tres cadenas de proteína idénticas, cada una de las cuales se procesa proteolíticamente en dos subunidades, HAl y HA2, que se mantienen juntas covalentemente mediante un enlace de disulfuro único. El HA media la adhesión del virus al receptor celular. Las moléculas de neuraminidasa (NA) están presentes en menores cantidades en la envoltura. Las cepas humanas circulantes son notorias por su tendencia a acumular mutaciones año tras año y provocan epidemias recurrentes.

En los eucariotas, los residuos de azúcar se ligan comúnmente a cuatro diferentes residuos de aminoácidos. Estos residuos de aminoácidos se clasifican como ligados a O (serina, treonina, y hidroxilisina) y ligados a N (asparagina) . Los azúcares ligados a o se sintetizan en el Golgi o Retículo Endoplasmático rugoso (ER) a partir de azúcares de nucléotido. Los azúcares ligados a N se sintetizan a partir de un precursor común, y se procesan posteriormente. Se sabe que la adición de cadenas de carbohidrato ligadas a N es importante para la estabilización del plegado, prevención de degradación en el retículo endoplasmático, oligomerización, actividad biológica, y transporte de glucoproteínas . La adición de oligosacáridos ligados a N para especificar residuos de Asn cumple una función importante en regular la actividad, estabilidad o antigenicidad de las proteínas maduras de virus (Opdenakker G. et al FASEB Journal 7, 1330-1337 1993) . También se sugiere que se requiere glucosilación ligada a N para plegado, transporte, expresión de superficie celular, secreción de glucoproteínas (Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265 1994), protección de la degradación proteolítica y mejora de la solubilidad de glucoproteina (Doms et al., Virology 193, 545-562 1993) . Las glucoproteinas víricas de superficie no se requieren para plegado correcto de proteína, pero tampoco proporciona protección contra los anticuerpos de neutralización como un "escudo de glucano". Como resultado, la fuerte selección específica de anfitrión se asocia frecuentemente con las posiciones de codón de la glucosilación ligada a N potencial. Por consiguiente los sitios de glucosilación ligada a N tienden a ser conservados a través de cepas y subtipos.

Los brotes de virus de influenza A continúan provocando morbilidad generalizada y mortalidad en todo el mundo. Solo en los Estados Unidos un estimado de 5 a 20% de la población está infectado por virus de influenza A anualmente, provocando aproximadamente 200,000 hospitalizaciones y 36,000 muertes. El establecimiento de políticas integrales de vacunación ha sido una medida eficaz para limitar morbilidad por influenza. Sin embargo, la deriva genética frecuente del virus requiere reformulación anual de la vacuna, potencialmente conduce a un desajuste entre la cepa vírica presente en la vacuna y aquella que circula. Por lo tanto, las terapias antivíricas contra el virus de la influenza son importantes herramientas para limitar la severidad de la enfermedad así como también su transmisión.

Los virus de la influenza H5N1 altamente patogénicos han provocado brotes en aves de corral y aves silvestres desde el 2003 (Li K S et al. (2004) Nature 430:209-213). Desde febrero de 2010, estos virus han infectado no solo las especies aviares sino también más de 478 humanos, de los cuales 286 casos han probado ser fatales (www. who . int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_ 2010_02_ 111 en/index.html) . El H5N1 altamente patogénico y los virus de influenza de origen porcino A (H1N1) del 2009 han provocado brotes globales y han planteado una gran preocupación de que pueda ocurrir cambios adicionales en los virus que lleven a una pandemia mortal (Garten R J, et al. (2009) Science 325: 197-201, Neumann G, et al. (2009) Nature 459:931-939). Surge una gran preocupación de que un virus de la influenza pudiera adquirir la capacidad de propagarse de forma eficiente entre los humanos, convirtiéndose por lo tanto en una amenaza de pandemia. Una vacuna contra la influenza, por lo tanto, debe ser una parte integral de cualquier plan de preparación para una pandemia.

Han surgido contribuciones importantes al entendimiento de las infecciones de influenza a partir de estudios sobre hemaglutinina (HA) , una glucoproteina de cubierta vírica que se une a los receptores de glucanos sialilados específicos en las vías respiratorias, lo que permite que el virus entre en la célula (Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397; Maines TR, et al. (2009) Science 325:484-487; Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Rev Biochem 69:531-569; van Riel D, et al. (2006) Science 312:399-399). Para cruzar la barrera de especie e infectar a la población humana, el HA aviar debe cambiar su preferencia de unión al receptor desde un glucano terminalmente sializado que contiene motivos de ácido siálico ligados a a2, 3 (aviar) a ligados a o¡2, 6 (humanos) (Connor RJ, et al. (1994) Virology 205:17-23), y este cambio podría ocurrir a través de sólo dos mutaciones, como en la pandemia de 1918 (Tumpey TM, et al. (2007) Science 315:655-659). Por lo tanto, la comprensión de los factores que afectan la influenza que se une a los receptores de glucanos es fundamental para el desarrollo de métodos para controlar cualesquier cepas de influenza de cruce futuras que tengan potencial pandémico.

La hemaglutinina del virus de influenza (HA) es una proteína de una cabeza globular y una región progenitora (Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397). Ambas regiones llevan oligosacáridos ligados a N (Keil W, et al. (1985) EMBO J 4:2711-2720), que afectan las propiedades funcionales de la HA (Chen ZY, et al. (2008) Vaccine 26:361-371; Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725). La HA es la glucoproteína de superficie de virión que adhiere el virus a sus receptores en las células anfitrionas y fusiona la envoltura vírica con las membranas de vesículas endocíticas para iniciar el proceso infeccioso. (Crecelius D. . , et al. (1984) Virology 139, 164-177) . También es el componente de virión que estimula la formación de anticuerpos protectores. La naturaleza y extensión de la glucosilación de la HA se han implicado en la alteración de sus propiedades de unión de receptor y en la emergencia de variantes víricas con citopatogenicidad mejorada (Aytay S., Schulze I. T. (1991) J. Virol. 65, 3022-3028) y virulencia (Deshpande K. L., et al.' (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 84, 36-40) y en enmascarar sus sitios antigénicos (Skehel J. J., et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 81, 1779-1783). La eliminación de mutación de los sitios de glucosilación de HA puede afectar la unión del receptor vírico (Gunther I, et al. (1993) Virus Res 27:147-160).

La secuencia de aminoácidos de la HA y por lo tanto se determina la ubicación de sus sitios de N-glucosilación por el genoma vírico. Parece que las estructuras de estos oligosacáridos se determina por su posición en la HA (Keil W., et al. (1985) EMBO J. 4, 2711-2710) y por las enzimas biosintéticas y enzimas de recorte proporcionadas por la célula anfitriona en la que se hace crecer el virus. La plasticidad del genoma vírico y la maquinaría de glucosilación específica a anfitrión juntos, pueden crear poblaciones de virus que son más heterogéneas en su estructura y función que pueden ser desarrolladas por cualquier proceso solo. Se considera que esta diversidad es responsable de la supervivencia de estos virus y de su capacidad de superar los efectos inhibidores de los anticuerpos de neutralización y agentes antivíricos.

Parece que la HA tiene regiones que se deben glucosilar, otras que se deben estar libres de oligosacáridos, y todavía otros en los que la glucosilación puede ser ventajosa o perjudicial para la supervivencia del virus. Los sitios de glucosilación en determinadas posiciones en la HA del virus de influenza A aislado a partir de varios animales y humanos están altamente conservados y por lo tanto parece ser esencial para la formación y/o mantenimiento del HA funcional (Gallagher P. J. , et al. (1992) J. Virol. 66, 7136-7145). Por el contrario, la generación de sitios de glucosilación en determinadas regiones de la HA reduce su transporte a la superficie celular, y su estabilidad y/o función (Gallagher P., et al. (1988) J. Cell Biol. 107, 2059-2073). Esta está en las regiones en las que la glucosilación no se prohibe ni se requiere para formación de HA funcionales que pueden tener diversidad de oligosacáridos con un mayor efecto selectivo, que depende del ambiente específico en que se espera que crezcan los virus.

Los cambios en la secuencia de péptidos en o cerca de los sitios de glucosilación puede alterar la estructura 3D del HA, y por lo tanto la especificidad y3afinidad de unión del receptor. En efecto, las HA de diferentes subtipos H5N1 tienen diferentes patrones de unión a glucano (Stevens J, et al. (2008) J Mol Biol 381: 1382-1394).

Se ha estudiado la mutagenia de sitios de glucosilación sobre Hl y en el sistema vírico completo system (Chandrasekaran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26: 107-113; Deom CM, et al. (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:3771-3775).

Los cambios en la glucosilación pueden afectar la afinidad y especificidad de la unión del receptor, especialmente con respecto a la mayor parte del H5N1 HA.

Las regiones menos altamente glucosiladas o no glucosiladas de la hemaglutinina continúan mutando para escapar del sistema inmune del anfitrión. El diseño de vacunas utilizando HA monoglucosilada se describe en la Publicación de Solicitud Patente Estadounidense No. 2010/0247571 (Wong et al) . Por lo tanto, hay una necesidad de nuevos y eficientes métodos para producción de partículas monoglucosiladas de virus de influenza.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La descripción aquí proporciona la demostración de ejemplo para producir virus de influenza de monoglucosilados . Los métodos de ejemplo son igualmente aplicables a la producción de virus con glucanos simplificados sobre las proteínas estructurales. Las regiones conservadas de las proteínas estructurales con alta glucosilación se pueden dirigir para el diseño de vacunas una vez los patrones de glucosilación presentes en estos sitios se simplifican a mono, di-, tri-, u otras regiones glucosiladas .

Específicamente, subsiste una necesidad de cruzar anticuerpos monoclonales de neutralización que se pueden utilizar en el diseño y la validación de los procesos de producción de vacunas que mantienen o mejoran la calidad y antigenicidad de epítopos de neutralización cruzada en las vacunas actuales o futuras. Asumiendo que la unión de anticuerpo a antígeno es reflectiva de la integridad estructural y potencial antigénico, uno podría intentar la unión de anticuerpos de neutralización, tales como polipéptidos HA monoglucosilados y evalúa cuantitativamente su potencial de neutralización cruzado. Se espera que las vacunas derivadas contra derivados de monoglucosilados de influenza HA incrementen la inmunogenicidad hacia los epítopos universales.

Se genera el antígeno al remover parcialmente los azúcares de la glucoproteina vírica para exponer los sitios de glucosilación (que se conservan altamente y no mutan o no mutan agresivamente) y al mismo tiempo retienen los azúcares adecuados para preservar la estructura terciaria de la glucoproteina. Las glucoproteínas víricas parcialmente glucosiladas se generan al desglucosilar parcialmente las glucoproteínas de tal manera que un sitio de glucosilación particular retiene uno, dos o tres unidades de azúcar. En algunos aspectos se puede generar la glucoproteina parcialmente al proporcionar una proteína o polipéptido no glucosilado en uno o más sitios de glucosilación particulares y conjugar un mono-, di- o tri-sacárido a los sitios de glucosilación .

Se describe una vacuna que comprende por lo menos una glucoproteina HA parcialmente glucosilada y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas implementaciones , la glucoproteina HA parcialmente se selecciona del grupo que consiste de virus de la influenza parcialmente glucosilado Hl, H3, y H5.

Se describe un método que comprende administrar a un sujeto susceptible de influenza una vacuna que comprende por lo menos una glucoproteina HA desglucosilada y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas implementaciones , la glucoproteina HA desglucosilada se selecciona del grupo que consiste de HI, H3, y H5.

En algunas implementaciones la desglucosilación conduce a monoglucosilación (un azúcar restante) en uno o más sitios de glucosilacion en la glucoproteina. En algunas implementaciones la desglucosilación conduce a diglucosilación (2 azúcares restantes) en por lo menos un sitio de glucosilacion en la glucoproteina. En algunas implementaciones la desglucosilación conduce a triglucosilación (3 azúcares restantes) en uno o más sitios de glucosilacion en la glucoproteina. En algunas implementaciones la desglucosilación conduce a por lo menos una monoglucosilación, una diglucosilación y- una triglucosilación en por lo menos un sitio de glucosilacion en la glucoproteina.

En algunas modalidades, el antigeno de influenza HA se produce de forma recombinante en un cultivo celular. El cultivo celular comprende células MDCK, células Vero o células Vero PER.C6. La kifunensina se agrega a la célula anfitriona que aloja un antigeno de influenza HA recombinante.

En algunos aspectos, la inhibición de -mannosidasa' I resulta en glucoproteinas con Man9 (GlcNAc) 2. En otras modalidades, el antígeno de influenza HA comprende un virus completo de la influenza. El virus completo de la influenza se hace crecer en un anfitrión de huevo de pollo embrionado libre de patógeno especifico (SPF) .

Luego, la kifunensina se agrega a la cavidad alantoica del huevo de pollo embrionado libre de patógeno especifico (SPF) .

En algunos aspectos, la kifunensina se agrega a una concentración de 0.005 a 0.5 mg/ml.

El virus recuperado del antigeno de influenza HA se trata con aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 pg/mL EndoH.

En algunos aspectos, el virus monoglucosilado de la influenza se aisla mediante un método que comprende ultracentrifugación de gradiente de densidad.

En algunos aspectos, el método adicionalmente comprende purificar el virus monoglucosilado del antigeno de influenza HA mediante un método que comprende ultrafiltración . En algunas modalidades, la ultrafiltración comprende el uso de un filtro de 0.2 µ??.

En algunos aspectos, el método adicionalmente comprende analizar el virus monoglucosilado de la influenza mediante microscopía electrónica.

En algunos aspectos, el método adicionalmente comprende cuantificar el virus monoglucosilado de la influenza mediante un método que comprende tratamiento con PNGasa. En algunos aspectos, el método adicionalmente comprende cuantificar el virus monoglucosilado de la influenza mediante un método que comprende electrocroatografia SDS-PAGE.

En algunos aspectos, el método adicionalmente comprende analizar la composición de glucano- del virus monoglucosilado aislado de la influenza mediante un método que comprende espectrometría de masa.

La invención se relaciona con un virus monoglucosilado del antígeno de influenza HA (virus completo o recombinante) preparado mediante cualquier método descrito aquí.

La invención se relaciona con el uso de un virus monoglucosilado del antígeno de influenza HA (virus completo o recombinante) preparado mediante cualquier método descrito aquí, para la preparación de una vacuna.

Estos y otros aspectos serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la modalidad preferida tomada en conjunto con los siguientes dibujos, aunque se pueden efectuar variaciones y modificaciones de las mismas sin apartarse del espíritu y alcance de los conceptos novedosos de la divulgación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos hacen parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente descripción, cuyas invenciones se pueden entender mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas aquí. La patente o archivo de solicitud contiene por lo menos un dibujo realizado en color. Se proporcionarán copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color por la Oficina luego de solicitud y pago de la tarifa necesaria .

La FIGURA 1 muestra la preparación de virus 14 NIBRG mono-glucosilado . (Figura 1A) El virus se hace crecer en diferente concentración de inhibidor de procesamiento de N-glucosilación, kifunensina. (Figura IB) El virus glucosilado de alta mañosa se digiere a virus monoglucosilado mediante diferentes concentraciones de Endo H. (Figura 1C) Comparado con el virus glucosilado completamente purificado, el virus monoglucosilado purificado tiene un cambio descendente obvio en ambos HAl y HA2. Estas muestras se analizan mediante análisis Western blot que utiliza un anti- suero de conejo HA anti-H5.

La FIGURA 2 muestra las . micrografías electrónicas de virus completamente glucosilados y monoglucosilados . (Figura 2A) NIBRG-14 completamente glucosilado. (Figura 2B) NIBRG-14 monoglucosilado. Las partículas de virus se tiñen con 2% de tungstato de metilamina y se analiza mediante microscopía electrónica de transmisión.

La FIGURA 3 muestra la cuantificación de hemaglutinina . La cantidad de hemaglutinina del virus NIBRG-14 se determina or intensidad de PNGasa F desglucosilada HAl en SDS-PAGE.

La FIGURA 4 muestra análisis de glucopéptido de hemaglutinina NIBRG-14 monoglucosilada. (Figura 4A) Los sitios de glucosilación de hemaglutinina NIBRG-14 se etiquetan con números de residuos de aminoácidos. La estructura se crea con código PDB ljsm, y el sitio de glucosilación se colorea en rojo. (Figura 4B) Análisis de glucopéptido de hemaglutinina NIBRG-14 monoglucosilada. Después de digestión de Endo H, la mayoría de los sitios de glucosilación son monoglucosilados, excepto que los sitios de glucosilación 295 y 489 son todavía parcialmente (<10%) glucosilados ricos en mañosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos utilizados en esta especificación tienen generalmente sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de la invención, y en el contexto específico donde se utiliza cada término. Ciertos términos que se utilizan para describir la invención se discuten adelante, o en otro lugar en la especificación, para proporcionar orientación adicional para el practicante con respecto a la descripción de la invención. Por conveniencia, ciertos términos pueden destacarse, por ejemplo mediante cursiva y/o comillas. El uso de resaltado no tiene influenza en el alcance ni en el significado de un término; el alcance y significado de un término es el mismo, en el mismo contexto, ya sea que se resalte o no. Se apreciará que lo mismo se puede decir en más de una forma.

Por consiguiente, se puede utilizar lenguaje y sinónimos alternativos para uno cualquiera o más de los términos discutidos aquí, ni tienen ningún significado especial para que se le ponga ya sea o no que el término sea discutido o tratado aquí. Se proporcionan sinónimos de ciertos términos. Una mención de uno o más sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier lugar en esta especificación que incluye ejemplos de cualquiera de los términos discutidos aquí es sólo ilustrativo, y de ninguna manera limita el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. Del mismo modo, la invención no se limita a las diversas formas de modalidades dadas en esta especificación.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona medianamente versada en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, el presente documento, que incluye las definiciones lo regirá. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & argham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991) .

Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, y proteínas y química de oligo-o polinucleótido e hibridación descritos aquí son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos , y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se logran en la técnica o como se describe aquí. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experticia de la técnica, muchos de los cuales se describen adelante con el propósito de ilustración. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds . , 1985); Transcription and Translatxon (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal cell culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) .

Los términos "influenza subtipo A" o "virus de influenza subtipo A" se utilizan de forma intercambiable, y se refieren a variantes del virus de influenza A que se caracterizan por una proteína de superficie vírica de hemaglutinina (H) , y así se etiquetan por un número H, tal como, por ejemplo, Hl, H3, y H5. Adicionalmente , los subtipos se pueden caracterizar adicionalmente por una proteina de superfice vírica de neuraminidasa (N) , indicada por un número N, tal como, por ejemplo, NI y N2. Como tal, un subtipo se puede denominar por ambos números de N y H, tales como, por ejemplo, H1N1, H5N1, y H5N2. Los términos incluyen específicamente todas las cepas (que incluyen cepas extintas) dentro de cada subtipo, que generalmente resultan de mutaciones y muestran diferentes perfiles de patógenos. Estas cepas también se conocerán como varios "aislados" de un subtipo vírico, incluyendo todas las cepas pasadas, presentes y futuras.

De acuerdo con lo anterior, en este contexto, los términos "cepa" y "aislado" se utilizan de forma intercambiable. Los subtipos contienen antígenos basados en un virus de influenza A. Los antígenos se pueden basar en una proteína de superficie vírica de hemaglutinina y se puede ser designar como "antígeno HA". En algunos casos, dichos antígenos se basan en la proteína de un subtipo particular, tal como, por ejemplo, un subtipo Hl y un subtipo H5, que puede ser designado un antígeno Hl y un antígeno H5, respectivamente .

Como se utiliza en la presente descripción, el término proteína "desglucosilada" o "parcialmente glucosilada" denota una proteína que tiene uno o más azúcares retirados de la estructura de glucano de un caso completamente glucosilado de la proteína y en la que la proteína retiene sustancialmente su conformación/plegado natural. Una proteína "desglucosilada" incluye una proteína parcialmente glucosilada en la que el proceso de desglucosilacion conduce a monoglucosilación, diglucosilación o triglucosilación en uno o más sitios de glucosilación presentes en la glucoproteína .

Una proteína "parcialmente glucosilada" incluye una proteína "desglucosilada" en la que se retienen uno o más azúcares en cada sitio de glucosilación, y cada sitio de glucosilación parcial contiene una estructura de glucano más pequeña (que contiene pocas unidades de azúcar) en comparación con el sitio en un caso totalmente glucosilada de la glucoproteína, y la proteína parcialmente glucosilada retiene sustancialmente su conformación/plegado nativo. Una proteína "parcialmente glucosilada" se genera mediante desglucosilacion parcial de la estructura de glucano de por lo menos un sitio de glucosilación de un caso completamente glucosilado de la glucoproteína. Una proteína "parcialmente glucosilada" también se genera al introducir glucosilación en un sitio no glucosilada de una proteína de tal manera que la secuencia de glucosilación agregada es más pequeña que la estructura de glucano en ese sitio en un caso completamente glucosilado de la glucoproteína. Una proteína "parcialmente glucosilada" también se genera al sintetizar una secuencia de glucoproteina vírica, o fragmento de la misma, al introducir unidades de aminoácidos glucosilados (por ejemplo, unidads estructurales de GlcNAc-Arginina) en los sitios de glucosilación de la secuencia, de tal manera que la estructura de glucano agregada es menor que la estructura de glucano en ese sitio en un caso completamente glucosilado de la glucoproteina.

La transmisión vírica comienza con una interacción crítica entre la hemaglutinina (HA) de la glucoproteina, que está en la cubierta vírica de la influenza, y el ácido siálico (SA) que contiene glucanos, que están en la superficie celular del anfitrón. Para dilucidar la función de la glucosilación HA en esta importante interacción, se preparan diversas glucoformas HA definidas, y se estudia su afinidad de unión y especificidad al utilizar una micromatriz SA sintética. El truncamiento de las estructuras de N-glucano en HA aumenta las afinidades de unión SA, mientras que reduce la especificidad hacia diferentes ligandos SA. Se analiza cuantitativamente la contribución de cada monosacárido y grupo sulfato dentro de las estructuras de ligando SA a energía de unión Ha. Se encuentra que el grupo sulfato agrega casi 100 veces (2.04 kcal/mol) energía de unión a la HA completamente glucosilada, y así el glucano biantenario a la glucoforma HA monoglucosilada . Los anticuerpos producidos contra la proteína HA que llevan solo un GlcNAc ligado a N en cada sitio de glucosilación muestran mejor afinidad de unión y la actividad de neutralización contra los subtipos de influenza que las HA completamente glucosiladas dilucidadas. Por lo tanto, la eliminación de glucanos estructuralmente no esenciales en las glucoproteínas de superficie vírica es un método muy eficaz y general para el diseño de vacunas contra la influenza y otros virus humanos.

La glucosilación de polipéptidos es típicamente ya sea ligada a N o ligada a 0. Ligado a N se refiere a la unión de la unidad estructural de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Un "sequon" es una secuencia de tres aminoácidos consecutivos de una proteína que puede servir como el sitio de adhesión a un polisacárido (azúcar) denominado un Glucano ligado a N. Este es un polisacárido unido a la proteína a través del átomo de nitrógeno en la cadena lateral de la asparagina (Asn) . Un sequon es ya sea Asn-Xaa-Ser o Asn-Thr-Xaa, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto prolina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación ligada a 0 se refiere a la adhesión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Mientras que el sequon Asn-X-Ser/Thr es absolutamente necesario para la adhesión de oligosacáridos ligados a N a una glucoproteina (Marshall RD, Biochemical Society Symposia 40, 17-26 1974), su presencia no siempre resulta en la glucosilación y algunos sequons en las glucoproteinas pueden permanecer no glucosilados . (Curling EM, et al., Biochemical Journal 272, 333-337 1990) Un aspecto de la presente invención es un método para producir glucoproteinas no naturales que tienen estructuras de carbohidrato simplificadas.

De acuerdo con lo anterior el método se puede aplicar a retrovirus tales como VIH, flavivirus tales como hepatitis C, Dengue y Nilo Occidental, y similares.

Aproximadamente la mitad de la masa molecular de gpl20, la proteina de la envoltura de unión al receptor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , consiste de glucanos ligados a N. Casi la mitad de estos glucanos son del tipo ricos en mañosa. Estos glucanos ricos en mañosa proporcionan un rico bosque de residuos de mañosa en la superficie del virus que hace del VIH un objetivo primordial para la interacción con lectinas especificas de mañosa del sistema inmune .

Las glucoproteínas de la envoltura del virus de la hepatitis (VHC) son altamente glucosiladas, con generalmente 4 y 11 glucanos ligados a N en El y E2, respectivamente. Varios glucanos cumplen una función importante en el montaje y/o infectividad de HCVcc. Por lo menos cinco glucanos en E2 (denotados E2N1, E2N2, E2N4, E2N6 y E2N11) reducen fuertemente la sensibilidad del VHC a la neutralización de anticuerpos. (Helle F et al, J Virol 2010 Nov; 84 (22) .11905-1915) .

La proteina E de la mayoría de los flavivirus se modifica por glucosilación ligada a Asn en el residuo 153/154 y en el caso de los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV) por un segundo glucano en el residuo 67. En el virus del dengue, los glucanos ligados a N en la proteína E son una mezcla de glucanos ricos en mañosa y complejo. La envoltura de la proteína del virus del Nilo Occidental (E) contiene un único sitio de glucosilación ligada a N en el residuo 154. Dado que se reduce notablemente la ablación de glucanos en estos sitios, pero no se elimina, la inefectividad, las vacunas objetivadas a los sitios conservados cuando se presentan con glucosilación simplificada pueden conducir a una terapia eficaz, que es menos sensible a las variaciones de mutaciones en el virus.

Inhibidores de Glucosidasa Las hidrolasas de glucósido (también llamadas glucosidasas o la glucosil hidrolasas) catalizan la hidrólisis del enlace glucosidico para liberar azúcares más pequeños. Son enzimas comunes con funciones en la naturaleza, que incluyen degradación de la biomasa, tales como celulosa y hemicelulosa, en estrategias de defensa anti-bacterianas (por ejemplo, lisozima) , en mecanismos de patogénesis (por ejemplo, neuraminidasas víricas) y en la función celular normal (por ejemplo, recorte de manosidasas involucradas en la biosíntesis de glucoproteínas ligadas a N) . Junto con glucosiltransferasas, las glucosidasas forman la maquinaria catalítica principal para la síntesis y la degradación de los enlaces glucosídicos .

Los inhibidores de glucosilación se contemplan para uso de acuerdo con los métodos de la invención. Ejemplos de dichos inhibidores incluyen Kinefusina, Australina, Castanospermina, Desoxinojirimicina, Desoximanoj irimicina, Swainsoninna, Mannostatina A, y similares.

La Australina es un alcaloide de pirrolizidina polihidroxilada que es un buen inhibidor de la alfa-glucosidasa amiloglucosidasa (inhibición del 50% a 5.8 micro ) , pero no inhibe la beta-glucosidasa, alfa-o beta- manosidasa, o alfa-o beta-galactosidasa . La castanospermina es un alcaloide indolizina que inhibe las actividades de alfa-glucosidasa y altera la distribución de glucógeno. La castanospermina inhibe la infección por virus del dengue (Whitby et al, J Virol 2005 julio; 79 (14):.. 8.698-8706).

La biosintesis de los diversos tipos de estructuras de oligosacáridos ligados a N implica dos series de reacciones: 1) la formación del precursor de sacárido ligado a lipido, Glc3Man9 (GlcNAc) 2-pirofosforil-dolicoi, mediante la adición gradual de GlcNAc, mañosa y glucosa a dolicol-P, y 2) la eliminación de la glucosa y mañosa por glucosidasas unidas a la membrana y la adición de GlcNAc, galactosa, ácido siálico, y fucosa por glucosiltransferasas localizadas en el aparato de Golgi para producir diferentes estructuras de oligosacáridos complejos.

El uso de inhibidores que bloquean las reacciones de modificación en diferentes etapas, provocan que la célula produzca glucoproteinas con estructuras de carbohidratos alteradas. Se ha identificado un número de compuestos similares a alcaloides que son inhibidores específicos de las glucosidasas y manosidasas involucradas en el procesamiento de glucoproteína . Estos compuestos provocan la formación de glucoproteinas con estructuras ricas en mañosa que contiene glucosa, o varias cadenas de alto contenido en mañosa o híbridas, dependiendo del sitio de inhibición. (Elbein AD FASEB J. 1991 diciembre, 5 (15): 3055-3063).

Las primeras cuatro enzimas que funcionan en el procesamiento de glucoproteínas ligadas a Nson glucosidasas . La GlcNAc-fosfotransferasa cataliza la primera etapa en la síntesis del determinante de mañosa 6-fosfato. Una estructura de carbohidrato adecuado facilita en gran medida la fosforilación eficiente por GlcNAc-fosfotransferasa . La estructura de carbohidrato acoplada a la fosforilación necesaria para la síntesis de una señal de manosa-6-fosfato en la molécula de GAA es un N-glucano rico en mañosa.

Se conocen varios inhibidores de procesamiento de manosidasa. La swainsonina, aislada de marihuana ha demostrado ser un potente inhibidor de la manosidasa II de Goígi, pero no tiene ningún efecto en manosidasa 1 (James, LF, Elbein, AD, Molyneux, RJ, y arren, C.D. (1989) Swainsonine and related inhibidor de glucosidasas. Iowa State Press, Ames, Iowa). La desoximanoj irimicina es un inhibidor muy potente de manosidasa I de hígado de rata. En células intactas, la desoximannoj inimicina bloquea la síntesis de tipos de complejos de oligosacáridos ligados a N y provoca la acumulación de glucoproteínas que tienen estructuras Man7-9 (GlcNAc)2, con oligosacáridos anc9 (GlcNAc) 2 predominantes (Elbein, AD, et al. (1984;. Arch Biochem. Biophys. 235, 579- 588). La mannostatina A es un metabolito producido por el microorganismo, Streptoverticillium verticillus, y se reporta que este compuesto es un potente inhibidor de la a-manosidasa de epididimo de rata (Aoyagi, T., et al. (1989) J. Antibiot 42, 883-889).

La Kifunensina (Kif) fue aislado por primera vez del actinomiceto, Kitasatosporia kifúñense No. 9482 (M. Iwami, 0. et al. J. Antibiot., 40, 612, 1987) y es un derivado de oxamida cíclico de 1-amino-manno irimicina . La kifunensina inhibe la enzima manosidasa I del aparato de Golgi de célula animal. Cuando se agrega kifunensina a las células de mamífero en cultivo a concentraciones, de 1 pg/ml o más, se produce un cambio completo en la estructura de los oligosacáridos ligados a N de las cadenas complejas a Mane) las estructuras (GlcNAc 2), de acuerdo con su inhibición de manosidasa I. Por otro lado, la desoximanoj irimicina, incluso a 50 ]iq/mlr no impide la formación de todas las cadenas complejas chains (Elbein, A. D. , et al. (1990) Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol. Chem. 265, 15599-15605). Por lo tanto, la kifunensina es uno de los inhibidores más eficaces de procesamiento de glucoproteína .

La kifunensina también ha demostrado actividad inmunomoduladora prometedora en la inhibición de a- manosidasa. Se ha reportado la síntesis de kifunensina por Kayakiri, et al, Tetrahedron Lett. , 31, 225, 1990; H. Kayakiri, et al., Chem. Pharm. Bull., 39, 1392, 1991) y Hudlicky et al. (J. Rouden y T. Hudlicky, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1095, 1993; J. Rouden, T. et al., J. Ara. Chem. Soc, 116, 5099, 1994).

El tratamiento de las células con kifunensina (Kif) resulta en la inhibición del procesamiento de glucoproteina en esas células (Elbein et al (1991) FASEB JD (5) : 3055-3063, y Bischoff et al (1990) J. Biol . Chem. 265 (26): 15.599 a 15.605). La Kif bloguea la adhesión de complejo de azúcar de proteínas modificadas. Sin embargo, si se utiliza suficiente Kif para inhibir completamente el procesamiento glucoproteina de hidrolasas lisosomales, las hidrolasas resultantes tienen estructuras de manosa-9, gue no son los sustratos más eficientes para la enzima fosfotransferasa GlcNAc.

De acuerdo con la invención, un inhibidor de glucosidasa tal como Kif, se agrega a las células en la cantidad de por lo menos 0.01 pg/ml a aproximadamente por lo menos 500 iq mi, que incluye 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75 y todos los valores entre ellos.

La kifunensina inhibe la función de la enzima -manosidasa I en la ruta de N-glucosilación y resulta en glucoproteinas con composiciones Man9GlcNAc2.

Se pueden medir los niveles y/o tipos de estructuras de carbohidratos de complejos utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las glucoproteinas y sus oligosacáridos asociados se pueden caracterizar utilizando endoglucosidasas para diferenciar entre los oligosacáridos ricos en mañosa y del tipo de complejos (Maley et al (1989) Anal. Biochem. 180:195-204). El péptido-N4- (N-acetileno-l^-glucosaminil ) asparagina amidasa (PNGasa F) es capaz de hidrolizar oligosacáridos ligados a asparaginas (ligada a N) en el enlace ß-aspartilglucosilamina para producir amoniaco, ácido aspártico y un oligosacárido con una di-N-acetilquitobiosa intacta en el extremo reductor. La especificidad de PNGasa es amplia debido a que los oligosacáridos ricos en mañosa, híbridos, di-, tri- y tetraantenarios complejos, sulfatados y polisialolo son sustratos. Adicionalmente, la endo-ß-?-acetilglucosaminidasa H (EndoH) hidroliza eficazmente la unidad de quitobiosa en oligosacáridos ligados a N híbridos, que contienen mañosa que poseen en tres residuos de mañosa, siempre que la ramificación 1,6-manosa tenga otra mañosa adherida. Los oligosacáridos complejos son resistentes a digestión con EndoH.

Para caracterizar el tipo de oligosacáridos ligados a N presentes en las glucoproteinas, una alícuota de proteína se puede digerir con PNGasa F (0.5% de SDS, 1% de ß-mercaptoetanol, 50 mM de NP-40, 50 mM de Fosfato de Sodio, pH 7.5) o EndoH (0.5% de SDS, 1% de ß-mercaptoetanol , 50 mM de Citrato de Sodio, pH 5.5) bajo condiciones de reducción. Las proteínas naturales y digeridas luego se analizan por electroforesis en poliacrilamida SDS en condiciones de reducción y se comparan las movilidades relativas. Si la glucoproteína contiene sólo oligosacáridos ricos en mañosa las muestras tratadas con PNGasaF y EndoH tendrán una mayor movilidad que las de proteína no tratada. La proteína tratada con EndoH tendrá un peso molecular ligeramente más alto debido a la única N-acetilglucosamina restante en cada sitio de glucosilación ligada a N. Si una glucoproteína sólo contiene oligosacáridos complejos, la proteína tratada con EndoH no tendrá un cambio en la migración en comparación con la proteína no tratada. Si hay oligosacáridos complejos y ricos en mañosa, entonces, la proteína tratada con EndoH será más pequeña que la glucoproteína no tratada pero más grande que la proteína tratada con PNGasaF. La diferencia será mayor que la que se puede por la N-acetilglucosamina restante.

Para generar los glucanos simplificados sobre las glucoproteínas objetivo, se utilizan endoglucosidasas . Una endoglucosidasa es una enzima que libera oligosacáridos desde glucoproteínas o glucolípidos . O simplemente divide cadenas de polisacáridos entre residuos que no son el residuo terminal, a pesar de que liberan oligosacáridos de la proteína conjugada y moléculas de lípidos que son más comunes. Esto rompe los enlaces glucosídicos entre dos monómeros de azúcar en un polímero. Ejemplos de endoglucosidasas incluyen, pero no se limitan a, endoglucosidasa D, endoglucosidasa F, endoglucosidasa Fl, endoglucosidasa F2, endoglucosidasa H, y endoglucosidasa S.

Preparación de virus monoglucosilado de influenza Para producir proteínas con glucoproteínas ricas en mañosa, las células que alojan virus de la influenza se exponen a Kif (y/o DMJ) para inhibir el procesamiento de glucoproteínas. Para producir virus monoglucosilado de influenza, el virus se inyecta en la cavidad alantoidea de huevos de pollo embrionados libres de patógenos con unos inhibidores de manosidasa, tales como kifunensina.

La kifunensina inhibe la función de la enzima o¡-manosidasa I en la ruta de N-glucosilación y resulta en glucoproteínas con composiciones Manc9 (GlcNAc) 2. La concentración de kifunensina en la inhibición de la glucosilación de hemaglutinina varía entre 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 g/mL y hasta 500 pg/mL y todos los valores entre los mismos.

Después de alrededor de 1 a 3 días de incubación, se cosecha la kifunensina tratada fluido alantoideos y se digiere con endoglucosidasa (Endo H) para eliminar los glucanos de tipo ricos en mañosa, es decir, concentraciones capaces de convertirse desde Manc9 (GlcNAc) 2 hasta solo GlcNAc. La concentración de Endo H en el fluido alantoideo para producir hemaglutinina mono-glucosilada varía por lo menos de aproximadamente aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 500 o más µg/mL de fluido alantoideo. Posteriormente, se recupera y purifica el virus monoglucosilado.

Uso de virus monoglucosilado de influenza Se pueden utilizar los antígenos del virus monoglucosilado de influenza aquí descritos para inmunizar contra la infección por virus de la influenza. El virus específico del que se derivan los antígenos puede ser el mismo o diferente del virus específico para el que se está proporcionando la protección, debido a que se sabe que ocurre protección cruzada entre diferentes aislados con los virus de influenza, en particular dentro de los mismos subtipos víricos .

La vacuna contra la influenza actualmente en uso se designan vacuna o subvirión (SV) de virus completo (WV) (también denominado "división" o "antígeno de superficie purificado") . La vacuna WV contiene virus inactivado, intacto, mientras que la vacuna SV contiene virus purificado interrumpido con detergentes que solubilizan la envoltura vírica que contiene lípidos, seguido por la inactivación química de los virus residuales. También se encuentran en desarrollo vacunas víricas atenuadas contra la influenza. Una discusión de los métodos de preparación de vacuna convencional se puede encontrar en right, P. F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D. M. et al. Ed. ) , 1464-65 (2001) .

Cuando una vacuna incluye más de una cepa de influenza, las diferentes cepas se cultivan típicamente por separado y se mezclan después de que se han cosechado los virus y se han preparado los antígenos. Alternativamente, se pueden combinar diferentes segmentos de diferentes aislados de virus de la influenza para generar una vacuna multipotente . El virus de la influenza (es) utilizado en los procesos de la invención pueden ser cepas reordenadas, y/o se pueden haber obtenido mediante técnicas de genética inversa. Se puede atenuar el virus (s) . El virus (s) puede ser sensible a la temperatura. El virus (s) se puede adaptar al frío. Una cepa reordenada que incluye segmentos víricos HA y/o NA de una cepa patógena y se pueden utilizar los restantes seis o siete segmentos de una cepa no patógena.

El antígeno devirus de la influenza utilizado en la composición inmunogénica de acuerdo con la invención puede estar en la forma de un virus vivo o, preferiblemente, un virus inactivado. La inactivación del virus típicamente involucra el tratamiento con un producto químico tal como formalina o ß-propiolactona . Cuando se utiliza un virus inactivado, el antígeno puede ser un virus completo, un virus dividido, o subunidades víricas. Los virus divididos se obtienen al tratar viriones con detergentes (por ejemplo, éter de etilo, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Tritón X-100, Tritón N 101, bromuro de cetiltrimetilamonio, etc.) para producir preparaciones de subviriones. Las vacunas de subunidades comprenden uno o ambos antígenos de hemaglutinina y neuraminidasa de superficie de influenza. También se pueden preparar antígenos de influenza en la forma de virosomas.

Cuando se prepara un antígeno a partir de un virus de la influenza (es decir, en lugar de haber sido producido en un sistema recombinante o sintético que no involucre el crecimiento de virus de la influenza) , se puede cultivar el virus ya sea en cultivos de huevos o células. El crecimiento en los huevos embrionados libres de patógeno específico es la ruta tradicional por la cual se han cultivado los virus de influenza para la producción de vacuna, y el cultivo de células es un desarrollo más reciente. Cuando se utiliza cultivo de células luego, normalmente se cultivará el virus de vacuna contra la influenza en células de mamíferos, tales como células MDCK, células Vero o células PER.C6. Estas estirpes celulares están ampliamente disponibles por ejemplo, de la colección American Cell Culture Type (ATCC) , o Coriell Cell Repositories (Camden, NJ) . Por ejemplo, la ATCC suministra varias células Vero diferentes bajo los números de Catálogo de CCL-81, CCL-81.2, el CRL-186 y la CRL -1587, y que suministra las células MDCK bajo número de catálogo CCL-34. También es posible el crecimiento de estirpes celulares aviares, que incluyen estirpes celulares derivadas de gallina, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo (CEF) .

Del mismo modo, un virus (tal como el VIH, HCV, virus de dengue, virus de la influenza, flavivirus y similares) se puede hacer crecer en cultivos celulares en la presencia de uno o más inhibidores de la de glucosidasa (tales como Kinefusina, Australina, castanospermina, desoxinoj irimicina, desoximanoj irimicina, Swainsoninna, mannostatina A, y similares) . Los sistemas de cultivo de celulares para el crecimiento de estos virus son bien conocidos en la técnica. El virus del Nilo Occidental se puede cultivar en células epiteliales del riñon de mono o cultivos de tejido celular de embrión de pollo. El VIH se puede cultivar en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . Se puede cultivar el HC en células derivadas de estirpe celular de hepatoma humano Huh-7.

Las composiciones inmunogénicas y de medicamento de la invención son adecuadas para la administración a un paciente. Esto se puede lograr mediante varias maneras, que incluyen pero no se limitan a: inyección intradérmica; administración transdérmica; y administración tópica. Estaos se pueden utilizar en conjunto con abrasión de la piel por ejemplo, por papel de lija o por el uso de microabrasivos . Las composiciones inmunogénicas y de medicamento de la invención se presentan preferiblemente como vacunas.

Las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante. Los adyuvantes que se han utilizado en vacunas contra la influenza incluyen sales de aluminio, quitosano, oligodesoxinucleótidos CpG tal como CpG 7909, emulsiones de aceite-en-agua, tales como MF59, emulsiones de agua-en-aceite-en-agua, E. coli, toxina lábil al calor y sus mutantes desintoxicadas, monofosforil lipido A y su derivado 3-0-desacilado, mutantes de toxina pertussis, dipéptidos de muramilo, etc.

EJEMPLOS Sin intención de limitar el alcance de la invención, se proporcionan adelante los instrumentos, aparatos, métodos de ejemplo y sus resultados relacionados de acuerdo con las modalidades de la presente invención. Tenga en cuenta que se pueden utilizar títulos o subtítulos en los ejemplos para la comodidad de un lector, que de ningún modo deben limitar el alcance de la invención. Más aún, se proponen ciertas teorías y se describen aquí, sin embargo, de ninguna manera, ya sean correctas o incorrectas, deben limitar el alcance de la invención siempre y cuando la invención se practique de acuerdo con la invención sin tener en cuenta ninguna teoría o esquema particular de la acción.

EJEMPLO 1 : Preparación de los virus completamente glucosilados y monoglucosilados El virus de influenza A, NIBRG-14 (H5N1) (Nicolson C, et al. (2005) Vaccine 23(22) :2943- 2952), se inyecta (1000 TCID50 (50% de Dosis Infectada con cultivo de Tejido) en 200 µ? de PBS)en la cavidad alantoica de huevo de pollo embrionado libre de patógeno específico (SPF)de 10 días para producir el virus completamente glucosilado ordinario (WHO (2005) manual WHO sobre el diagnóstico y la supervivencia de influenza en animales . (Organización Mundial de la Salud, Génova) ) .

Para producir virus monoglucosilado, el virus se inyecta en la cavidad alantoica con 0.2 mg/ml de kifunensina (Cayman Chemical) . La kifunensina inhibe la función de la enzima a-mannosidasa I en la ruta de N-glucosilación y resulta en glucoproteinas con composiciones Man9GlcNAc2 (Elbein AD, et al. (1990) J Biol Chem 265 (26) : 15599-15605) .

Se analiza la dependencia de concentración de la kifunensina para inhibir la glucosilación de hemaglutinina (Figura 1A) . Después de 3 días de incubación se cosecha el fluido alantoico y se centrifuga para eliminar los desechos durante 10 min a 3,000 g. El fluido alantoico tratado con kifunensina luego se digiere con endoglucosidasa Endo H (20 µ por mi de fluido alantoico) durante 12 horas a 4 o C para eliminar los glucanos del tipo ricos en mañosa, es decir, desde Man9GlcNAc2 hasta GlcNAc único. Se analiza la dependencia de concentración de Endo H en el fluido alantoico para producir hemaglutinina monoglucosilada (Figura IB) .

Posteriormente, el virus monoglucosilado se sedimenta por ultracentrifugación durante 90 min a 46,000 g, se resuspende con PBS y se purifica mediante un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo (25%, 40%) durante 90 min a 270,000 g. El virus en el gradiente se recolecta y sedimenta mediante ultracentrifugación durante 90 min a 120,000 g. Por último, si sedimento se resuspende en PBS y se filtra mediante un filtro de 0.22 µ?? (CDC (1982) Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance (Departamento Estadounidense de Salud y Servicios Humanos, Washington, DC) ; Harvey R, et al. (2008) Vaccine 26(51) : 6550-6554). Comparado con el virus glucosilado completamente purificado, el virus monoglucosilado purificado tiene obvios cambios descendentes en ambos HA1 y HA2 (Figura 1C) .

EJEMPLO 2: Análisis de microscopía electrónica de los virus completamente glucosilados y monoglucosilados Se coloca la solución del virus sobre la superficie recubierta de colodión carbono de una rejilla de cobre (Electron Microscopy Sciences) . Se elimina el fluido en exceso con papel de filtro, y se agrega 2% de tungstato de metilamina (Ted Pella, Inc.) para teñir durante 30 sec. Se elimina el fluido en exceso con papel filtro, y se lava con H20 durante 30 sec. Luego, la rejilla se seca al aire durante 4 horas y se fotografían las partículas de virus mediante microscopía electrónica de transmisión (Hitachi H-7000) . Los virus NIBRG-14 de influenza monoglucosilados y completamente glucosilados son similares en tamaño y morfología (Figura 2) .

EJEMPLO 3 : Cuantificación de hemaglutinina en el virus El virus se mezcla con regulador desnaturalizado (5% de SDS y 10% de ß-mercaptoetanol) y se hierve durante 10 min, luego se agrega a la muestra 10% de NP-40 y se trata con PNGasa F (New England Biolabs) a 25° C durante la noche. La muestra se mezcla con regulador de muestra SDS-PAGE y se calienta a 95° C durante 10 min antes de cargar en el gel. El gel se tiñe con SYPRO RUBY® (Invitrogen) y se analiza por el sistema de formación de imágenes VERSA DOC® (Bio-Rad) . El tratamiento de la PNGasa F antes del análisis por SDS-PAGE es para separar el HAl de la proteina NP en la muestra de virus completamente glucosilada. Esto permite la comparación de intensidad directa de proteínas HAl de ambos virus completamente glucosilados y monoglucosilados en SDS-PAGE para cuantificación de hemaglutinina en el virus (Fig. 3) .

Ejemplo 4: análisis de glucopéptidos con LC-MS-MS Se utiliza espectrometría de masas para analizar la composición de glucano del virus de monoglucosilado . La solución de virus se mezcla con regulador de muestra no reductor y se calienta a 95° C durante 10 min. Antes de cargar en el gel. El gel se tiñe con azul Coomassie. La banda HAO se corta en piezas pequeñaa para la digestión tríptica en gel con tripsina. Después de la digestión, la muestra se analiza mediante LC-MS-MS (Wu Y, et al.. (2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24 (7) : 965-972) (Agilent Technologies, Thermo Scientific) . Hay seis sitios de N-glucosilación del virus de influenza NIBRG-14. Excepto para pequeños porcentajes de presencia de glucanos de tipo rico en mañosa en el residuo 295 (-10% an6 (GlcNAc) 2) y residuo 489 (-10% Man7-9 (GlcNAc) 2), todos los otros glucanos son monoglucosilados con residuo de sacárido GlcNAc único adherido (Fig. 4).

Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan mediante referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara especifica e individualmente para ser incorporada por referencia.

Aunque la anterior invención se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES Lo que se reivindica es:

1. Un método para producir virus monoglucosilado de influenza, el método comprende: a) hacer crecer un antigeno de hemaglutinina del virus de la influenza (HA) en un anfitrión adecuado con una cantidad efectiva de un inhibidor de mannosidasa, en donde la concentración del inhibidor de mannosidasa es suficiente para inhibir a-mannosidasa I en la ruta de N-glucosilación, y b) recuperar el virus de antígeno de influenza HA y ponerlo en contacto con endoglucosidasa (Endo H) , en donde la concentración de Endo H es suficiente para eliminar glucanos del tipo ricos en mañosa; y c) aislar un antigeno del virus monoglucosilado de la influenza HA.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el antigeno HA se deriva de un virus de la influenza H5N1 altamente patogénico.

3. El método de la reivindicación 2 , en donde el virus de la influenza H5N1 altamente patogénico es NIBRG-14.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de mannosidasa es kifunensina (Kif ) .

5. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de mannosidasa es desoximannoj irimicina (DMJ) .

6. El método de la reivindicación 1, en donde el antigeno de influenza HA se produce de forma recombinante en un cultivo celular.

7. El método de la reivindicación 7, en donde el cultivo celular comprende células MDCK, células Vero o células Vero PER.C6.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición de or-mannosidasa I resulta en glucoproteínas con Man9 (GlcNAc) 2.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno de influenza HA comprende un virus completo de la influenza.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el virus completo de la influenza se hace crecer en un anfitrión de huevo de pollo embrionado libre de patógeno específico (SPF) .

11. El método de la reivindicación 10, en donde la kifunensina se agrega a la cavidad alantoica del huevo de pollo embrionado libre de patógeno especifico (SPF) .

12. El método de la reivindicación 6, en donde la kifunensina se agrega a la célula anfitriona que aloja un antigeno de influenza HA recombinante .

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde la kifunensina se agrega a una concentración de 0.005 a 0.5 mg/ml .

14. El método de la reivindicación 6, en donde recuperar el antigeno de influenza HA comprende aislar el antigeno de influenza HA producido de forma recombinante desde la célula anfitriona.

15. El método de la reivindicación 10, en donde recuperar el antígeno de influenza HA comprende: incubar durante un tiempo suficiente para hacer crecer el virus de influenza; y luego aislar el fluido alantoico que comprende el virus de influenza.

16. El método de las reivindicaciones 14 o 15, en donde el virus recuperado del antigeno de influenza HA se trata con aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 yg/mL de Endo H.

17. El método de la reivindicación 15, en donde el virus monoglucosilado de la influenza se aisla mediante un método que comprende ultracentrifugación de gradiente de densidad.

18. El método de la reivindicación 1, comprende adicionalmente purificar el virus monoglucosilado del antígeno de influenza HA mediante un método que comprende ul.tra.filtración .

19. El método de la reivindicación 18, en donde la ultrafiltración comprende el uso de un filtro de 0.2 m.

20. El .método de la reivindicación 1, comprende adicionalmente analizar el virus monoglucosilado de la influenza mediante microscopía electrónica.

21. El método de la reivindicación 1, comprende adicionalmente cuantificar el virus monoglucosilado de la influenza mediante un método que comprende tratamiento con PNGasa.

22. El método de la reivindicación 1, comprende adicionalmente cuantificar el virus monoglucosilado de la influenza mediante un método que comprende electrocroatografia SDS-PAGE

23. El método de la reivindicación 1, comprende adicionalmente analizar la composición de glucano del virus monoglucosilado aislado de la influenza mediante un método que comprende espectrometría de masa.

24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en donde el virus de antígeno de influenza HA se selecciona del grupo que consiste de virus monoglucosilado de la influenza Hl, H3, y H5 glucoproteina .

25. Un virus monoglucosilado del antigeno de influenza HA (virus completo o recombinante) preparado mediante cualquier método de acuerdo con las reivindicaciones 1-24.

26. Uso de un virus monoglucosilado del antigeno de influenza HA (virus completo o recombinante) preparado mediante cualquier método de acuerdo con las reivindicaciones 1-24, para la preparación de una vacuna.

27. Un método para producir un virus con un glucano simplificado, el método comprende: a) hacer crecer un antigeno a partir de un virus en un anfitrión adecuado con una cantidad efectiva de un inhibidor de glucosilación, en donde la concentración del inhibidor de glucosilación es suficiente para inhibir una glucosidasa en la ruta de N-glucosilación, y b) recuperar el antígeno vírico y ponerlo en contacto con una endoglucosidasa; y c) aislar el antígeno vírico con el gitano simplificado.

28. El método de la reivindicación 27, en donde el virus se selecciona de un ortomixovirus, un retrovirus y un flavivirus.

29. El método de la reivindicación 27, en donde el virus se selecciona de VIH, HCV, virus de dengue, virus del Nilo Occidental y virus de la influenza.

30. El método de la reivindicación 27, en donde el inhibidor de glucosidasa se selecciona de Kinefusina, Australina, Castanospermina, Desoxinoj irimicina, Desoximannoj irimicina, Swainsoninna, y Mannostatina A.

31. El método de la reivindicación 27, en donde el antígeno vírico se produce de forma recombinante en un cultivo celular.

32. El método de la reivindicación 31, en donde el antígeno vírico comprende un virus completo.

33. El método de la reivindicación 32, en donde el virus completo se hace crecer en un cultivo celular.

34. El método de la reivindicación 27, en donde el glucano simplificado es un monoglucosilato.