CN101257922A - 主要包含Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2糖形式的免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫球蛋白糖蛋白组合物，其在免疫球蛋白糖蛋白上具有赋予特定效应物功能的主要N－聚糖结构。另外，本发明涉及包含具有特定的富集的N－聚糖结构的抗体的药物组合物，其中所述N－聚糖结构选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

Description

主要包含Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2糖形式的免疫球蛋白

发明领域

本发明涉及生产具有特定N-连接的糖基化模式的糖蛋白的组合物和方法。特别地，本发明涉及包含具有特定N-聚糖结构的多种N-聚糖的免疫球蛋白糖蛋白的组合物，更特别地，涉及包含免疫球蛋白糖蛋白的组合物，其中所述免疫球蛋白上在所述多种中存在一种或多种主要糖形式，其调节或促进特定的效应物功能。

发明背景

糖蛋白在人类和其他哺乳动物中介导许多必需的功能，包括催化、信号转导、细胞-细胞通信，以及分子识别和缔合。在真核生物中糖蛋白构成了非胞质蛋白的主要部分(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。在前二十年，许多糖蛋白已经被采用用于治疗目的，天然发生的糖蛋白的重组版本成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Cumming etal.，1991，Glycobiology 1：115-130)。随着作为潜在的预防试剂和治疗试剂产生的重组蛋白接近临床，重组生产的糖蛋白的糖基化模式中的变化近来在科学界是大量关注的主题。

抗体或免疫球蛋白(Ig)是在体液免疫反应中起到中心作用的糖蛋白。抗体可以被看作衔接分子，其提供了体液和细胞防御机制之间的连接。抗体的抗原特异性识别引起免疫复合物的形成，其可以活化多种效应机制，引起所述复合物的消除和破坏。免疫球蛋白G(IgG)分子由具有恒定区和可变区的Fab(抗原结合片段)结构域和Fc(结晶的片段)结构域组成。Fc结构域包括CH2结构域，其在天冬酰胺残基上含有将N-聚糖连接到Ig分子的N-连接的糖基化的单个位点，通常在残基Asn-297处(Kabat et al.，Sequences of proteins of immunological interest Fifth Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。

N-连接的低聚糖的结构和功能方面的分析是生物学感兴趣的，有三个主要原因：(1)CH2结构域的糖基化在进化中是保守的，表明了低聚糖的重要作用；(2)免疫球蛋白分子充当了低聚糖异质性分析的模型系统(Rademacher and Dwek，1984；Rademacher et al.，1982)；以及(3)抗体包含两条重链的二聚缔合，其将两个低聚糖单位置于相互直接接触中，从而免疫球蛋白分子包括了特殊的蛋白-碳水化合物和碳水化合物-碳水化合物相互作用。

类似于其他糖蛋白中糖基化的作用，Ig的低聚糖侧链影响这种糖蛋白的功能。例如，已经显示了具有降低的海藻糖基化N-连接的聚糖的免疫球蛋白组合物提高了对人类FcγRIII的结合并因而增强了抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)(Shields et al.，2002，J.Biol Chem，277：26733-26740；Shinkawa et al.，2003，J.Biol.Chem.278：3466-3473)。Raju显示了CHO细胞中产生的海藻糖基化G2(Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)IgG的匀质形式将CDC活性提高到比异质抗体更大的程度(Raju，2004，美国专利申请No.2004/0136986)。很感兴趣的是Clynes等人的发现，其表明针对肿瘤的最佳的抗体将是优先地结合并活化Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)并且最低限度地结合抑制性FcγRIIb受体的抗体(Clynes et al.，2000，Nature，6：443-446)。

已经显示了Ig的不同糖基化模式与不同的生物学性质相关联(Jefferis and Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65：111-128；Wright and Morrison，1997，Trends Biotechnol.，15：26-32)。然而，仅少数的特定糖形式已知赋予期望的生物学功能。因此，富集Ig糖蛋白的特定糖形式的能力是高度期望的。

一般地，糖蛋白低聚糖的糖基化结构将取决于表达宿主和培养条件而变化。在非人类宿主细胞中产生的治疗性蛋白可能含有非人类糖基化，其可能在人类中引发免疫原性反应，例如，酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)；植物中的α(1，3)-海藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al.，1999，Glycobiology，9：365-372)；中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi et al.，1995.J.Biochem.117：5-62)；以及，小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaecket al.，1993，Immun.Today，14：477-479)。此外，半乳糖基化可以随细胞培养条件而变化，取决于它们的特定半乳糖模式，其可以使得某些免疫球蛋白组合物有免疫原性(Patel et al.，1992.Biochem J.285：839-845)。非人类哺乳动物产生的糖蛋白的低聚糖结构倾向于与人类糖蛋白的那些更紧密地相关。因而，大多数商业上的免疫球蛋白在哺乳动物细胞中产生。然而，哺乳动物细胞作为蛋白质生产的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，在哺乳动物细胞中表达蛋白的过程产生了糖形式的异质性群体，具有低的体积滴度(volumetric titers)，并且需要进行中的(ongoing)病毒防范和大量时间来产生稳定的细胞系。

要理解的是，不同的糖形式可以深刻地影响治疗剂的性质，包括药物动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶向(Graddis et al.，2002.Curr Pharm Biotechnol.3：285-297)。特别是，对于抗体，低聚糖结构可以影响与蛋白酶抗性有关的性质、FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、与补体复合物Cl的结合，其诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，以及与FcγR受体的结合，其对调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)途径、吞噬作用和抗体反馈负责(Nose and Wigzell，1983；Leatherbarrowand Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walker et al.，1989；Carter etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289)。

由于不同的糖形式与不同的生物学性质相关，富集特定糖形式的能力可以用于阐明特定糖形式和特定生物学功能之间的关系。因而，产生对于特定糖形式富集的糖蛋白组合物是高度期望的。

发明概述

本发明提供了包含多种免疫球蛋白(a plurality of immunoglobulins)的组合物，每种免疫球蛋白包含与之连接的至少一种N-聚糖(at least oneN-glycan attached thereto)，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖(the predominant N-glycan)选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂(图1)构成的组。

在一个实施方式中，大于50摩尔百分比、优选的75摩尔百分比、更优选的90摩尔百分比或更多所述多种N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。在另一个实施方式中，所述多种N-聚糖包含Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂的混合物。在其他优选的实施方式中，所述Man₇GlcNAc₂and Man₈GlcNAc₂N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述多种N-聚糖的第二主要N-聚糖结构约5摩尔百分比到约50摩尔百分比。

本发明还提供了通过富集免疫球蛋白上的特定糖形式(例如Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂)来提高对FcγRIIIa受体的结合亲和性以及降低对FcγRIIb受体的结合的方法。

优选的实施方式提供了产生包含多种免疫球蛋白的组合物的方法，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组，所述方法包括培养宿主细胞、优选的低等真核宿主细胞的步骤，所述宿主细胞被工程化或被选择来表达所述免疫球蛋白或其片段。在本发明的再其他的实施方式中，低等真核宿主细胞包含编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主细胞被工程化或被选择来表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

在本发明的优选的实施方式中，包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组，其中所述免疫球蛋白展现对FcγRIIb受体的降低的结合亲和性。在本发明的其他优选的实施方式中，包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组，其中所述免疫球蛋白展现对FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的提高的结合亲和性。在本发明的再另一个优选的实施方式中，包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组，其中所述免疫球蛋白展现提高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytoxicity，ADCC)。

在一个实施方式中，本发明的免疫球蛋白基本上没有(essentiallyfree of)海藻糖。在另一个实施方式中，本发明的免疫球蛋白缺乏海藻糖。本发明的组合物还包含药物组合物和药学上可接受的载体。本发明的组合物还包含免疫球蛋白的药物组合物，所述免疫球蛋白被纯化并掺入到诊断试剂盒中。

因而，本发明提供了材料和方法，用于产生具有预定糖基化结构的糖蛋白、特别是具有选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的N-聚糖的免疫球蛋白或抗体分子的组合物。

附图的简要说明

附图1是具有Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂聚糖结构的IgG的示意图。

附图2显示了DX-IgG的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，所述DX-IgG在野生型NRRLY-11430中表达并在蛋白A柱2.0μg蛋白/泳道上从培养基纯化。

附图3显示了DX-IgG的MALDI-TOF光谱，所述DX-IgG在野生型NRRLY-11430中表达，用α-1，2甘露糖苷酶处理，显示了主要的Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂N-聚糖。

附图4显示了FcγRIIIa-LF与DX-IgG和

的ELISA结合分析的结果。

附图5显示了FcγRIIIa-LV与DX-IgG和的ELISA结合分析的结果。

附图6显示了FcγRIIb与DX-IgG和

的ELISA结合分析的结果。

发明的详细说明

除非在此另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语和用语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步的，除非上下文另外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地，相关使用的命名，以及在此描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域公知和通常使用的。根据本领域公知的常规方法以及如各种一般的和更具体的参考文献的描述一般地进行本发明的方法和技术，这些参考文献在本说明书中被引证和讨论，除非另有陈述。参见，例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，andSupplements to 2002)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor and Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington BiochemicalCorp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，VolI，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring HarborLaboratory Press(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6^th Edition，2004，Garland Publishing，New York)

在此提及的所有公开物、专利和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。

除非另有说明，以下术语应当理解为具有以下含义：

如在此使用的，术语“N-聚糖”、“聚糖”和“糖形式”可互换地使用，是指N-连接的低聚糖，例如，作为N-乙酰葡萄糖胺残基的低聚糖、或通过连接到蛋白中天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰葡萄糖胺残基附着的低聚糖。糖蛋白中存在的主要糖类是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白糖类基团的加工与翻译共同地发生于ER的腔中，并在高尔基体中继续。

N-聚糖具有共同的Man₃GlcNAc₂的五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰葡萄糖胺)。N-聚糖根据包含外周糖类(例如，GlcNAc、半乳糖、海藻糖和唾液酸)的分支(触角)的数目而不同，所述外周糖类被添加到Man3GlcNAc₂(“Man3”)核心结构，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖核心”。N-聚糖根据它们的分支的成分(例如，高甘露糖、复合或杂合)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多甘露糖残基。“复合”型N-聚糖一般具有附着到1，3甘露糖臂的至少一个GlcNAc，和附着于“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的至少一个GlcNAc。复合N-聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选地用唾液酸或衍生物修饰(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)。复合N-聚糖还可以具有链内的取代，包括“分叉”GlcNAc和核心海藻糖(“Fuc”)。复合N-聚糖还可以在“三甘露糖核心”上具有多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc，以及三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的零个或多个甘露糖。各种N-聚糖也被称为“糖形式(glycoform)”。

在此使用的缩写具有本领域通用的用途，参见，例如，上述的糖类缩写。其他常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“糖苷酶”，其都是指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合聚合物)是基本上从其天然宿主细胞中天然伴随该天然多核苷酸的其他细胞组分中分离的多核苷酸，例如核糖体、聚合酶和它天然相关的基因组序列。该术语包括(1)从其天然发生环境移出的，(2)不与自然中从中发现该“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分相关的，(3)与自然中不与之连接的多核苷酸可操作连接的，或(4)不在自然界存在的核酸或多核苷酸。术语“分离的”或“基本上纯的”还可以用于指代重组或克隆的DNA分离物、化学上合成的多核苷酸类似物、或通过异源系统生物学合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不必然需要这样描述的核酸或多核苷酸本身从它的天然环境物理地移出。例如，如果异源序列被放置邻近于内源的核酸序列，从而该内源核酸序列的表达被改变，有机体的基因组中的内源核酸序列在此被认为是“分离的”。在这方面，异源序列是不天然地邻近于内源核酸序列的序列，无论该异源序列本身是内源的(来自相同的宿主细胞或其子代)或外源的(来自不同的宿主细胞或其子代)。举例来说，启动子序列可以取代(例如，通过同源重组)宿主细胞的基因组中基因的天然启动子，从而该基因具有改变的基因表达模式。这种基因选择将变为“分离的”，因为它从天然侧翼于它的至少某些序列分离。

如果核酸含有对基因组中相应核酸的非天然发生的任何修饰，核酸被认为是“分离的”。例如，如果含有人工地、例如通过人的干预引入的插入、删除或点突变，内源编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸，以及作为游离体存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料、或培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学物质前体或其他化学物质。

如在此使用的，用语参考核酸序列的“简并变体”涵盖核酸序列，其根据标准遗传密码可以被翻译以提供与从参考序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”被用于表示能够与目标核酸序列杂交的寡核苷酸，其不一定在序列上是相同的但是在一个或多个特定片段内是相互相同的。

术语“序列同一性百分比”或“同一性”在核酸序列的上下文中是指当进行最大相应性比对时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是在至少约九个核苷酸、通常至少约20个核苷酸、更通常地至少约24个核苷酸、一般地至少约28个核苷酸、更一般地至少约32个核苷酸、优选的至少约36个或更多核苷酸的区段上。存在着本领域已知的、可以用于测量核苷酸序列同一性的多种不同算法。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit来比较多核苷酸序列，其是Wisconsin PackageVersion 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。FASTA提供了在查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的对准和序列同一性百分比。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(通过完全引用完全合并在此)。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用GCG版本6.1中提供的FASTA用其缺省参数(6的字大小，NOPAM因子用于计分矩阵)，或使用Gap用其缺省参数来测定，通过引用合并在此。做为选择，可以使用计算机程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul et al.，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang and Madden，Genome Res.7：649-656(1997))、特别是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(1997))来比较序列。

术语“基本上同源”或“基本上相似”当用于核酸或其片段时，表明，如以上讨论的通过任何公知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或Gap所测量的，当通过合适的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳对准时，在至少约50％、更优选的60％的核苷酸碱基，通常至少约70％、更通常至少约80％、优选的至少约90％、更优选的至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基上存在核苷酸序列同一性。

做为选择，当核酸或其片段与另一个核酸、与另一个核酸的链、或与其互补链在严格杂交条件下杂交时，存在基本上的同源性或相似性。在核酸杂交实验的上下文中的“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”取决于多种不同的物理参数。核酸杂交将受到这些条件的影响，如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区域的长度、杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数量，这是本领域技术人员容易理解的。具有本领域普通技术的人员将知道如何改变这些参数来实现特定的杂交严格度。

一般地，“严格杂交”在特定的条件组合下在低于特定DNA杂交体的热熔点(Tm)约25℃下进行。“严格洗涤”在特定的条件组合下在比特定DNA杂交体的热熔点(Tm)低约5℃的温度下进行。Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度。参见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，page 9.51，通过引用合并在此。为此，“严格杂交”被定义为液相杂交，如在6X SSC(其中20X SSC含有3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)、1％SDS中在65℃8-12小时、随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃20分钟两次洗涤的水性杂交(即，没有甲酰胺)。技术人员要理解的是，取决于许多因素，包括杂交的序列的长度和同一性百分比，在65℃下杂交将以不同的速度发生。

术语“突变的”当应用于核酸序列时是指核酸序列中的核苷酸与参考核酸序列相比可以被插入、删除或改变。可以在基因座上进行单个改变(点突变)，或可以在单个基因座上插入、删除或改变多个核苷酸。此外，可以在核酸序列内任何数量的基因座上进行一个或多个改变。通过本领域已知的任何方法核酸序列可以被突变，包括但不限于诱变技术，如“error-prone PCR”(在DNA聚合酶的复制精确度低的条件下进行PCR的过程，从而在PCR产物的整个长度上获得高比率的点突变，参见，例如Leung et al.，Technique，1：11-15(1989)and Caldwell and Joyce，PCRMethods Applic.2：28-33(1992))；和“寡核苷酸指导的诱变”(允许在感兴趣的任何克隆DNA片段中产生位点特异性突变的过程；参见，例如Reidhaar-Olson and Sauer，Science 241：53-57(1988))。

如在此使用的，术语“载体”是指能够转运与之连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指在其中可以连接其他DNA片段的环状双链DNA环。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种载体是病毒载体，其中其他DNA片段可以连接到病毒基因组中(以下更详细地讨论)。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在导入宿主细胞中时被整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这些载体在此被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

如在此使用的，术语“感兴趣的序列”或“感兴趣的基因”是指核酸序列，一般编码蛋白，其通常在宿主细胞中产生。在此公开的方法容许一种或多种感兴趣的序列或感兴趣的基因稳定整合到宿主细胞基因组中。感兴趣的序列的非限制性实例包括编码具有酶活性的一种或多种多肽的序列，例如在宿主中影响N-聚糖合成的酶，例如甘露糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、UDP-N-乙酰半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和海藻糖转移酶。

术语“标记物序列”或“标记物基因”是指能够表现活性的核酸序列，其容许对于宿主细胞内存在或不存在所述序列的正选择或负选择。例如，P.pastoris URA5基因是标记物基因，因为它的存在可以通过含有该基因的细胞在缺少尿嘧啶的情况下生长的能力来选择。它的存在还可以针对含有该基因的细胞不能在存在5-FOA的情况下生长来选择(美国专利申请NO.2004/0229306)。标记物序列或基因不一定需要同时显示正和负选择能力。来自P.pastoris的标记物序列或基因的非限制性实例包括ADE1、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，通常使用卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素和匀霉素抗性基因来允许在存在这些抗生素的情况下生长。

“可操作连接的”表达控制序列是指一种连接，其中表达控制序列与感兴趣的基因是连续的，以控制感兴趣的基因，以及以反式起作用或以一定距离来控制感兴趣基因的表达控制序列。

如在此使用的术语“表达控制序列”是指多核苷酸序列，其是影响与它们可操作连接的编码序列的表达所必需的。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后翻译事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效力的序列(例如，核糖体结合位点)；提高蛋白质稳定性的序列；和当期望时，提高蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质取决于宿主有机体而不同，在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括，至少，其存在对于表达是必需的所有组件，还可以包括其存在是有益的其他组件，例如，前导序列和融合配体序列。

如在此使用的，术语“重组宿主细胞(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意图指已经导入重组载体的细胞。要理解的是，这种术语不仅仅意图指特定的接受细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响在继承的一代中可能出现某些改变，实际上，这种子代可能不与母细胞相同，但仍然包括在此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或可以是存在于活组织或有机体中的细胞。

术语“真核的”是指有核细胞或有机体，包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。

术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、环-鞭毛虫、小孢子虫、alveolates(例如，甲藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、苔藓)和其他原生生物。酵母和真菌包括但不限于：Pichia sp.，例如Pichia pastoris，Pichiafinlandica，Pichia trehalophila，Pichia koclamae，Pichia membranaefaciens，Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)，Pichia opuntiae，Pichiathermotolerans，Pichia salictaria，Pichia guercuum，Pichia pijperi，Pichiastiptis and Pichia methanolica；.Saccharomyces sp.，例如Saccharomycescerevisiae；Hansenula polymorpha，Kluyveromyces sp.，例如Kluyveromyces lactis；Candida albicans，Aspergillus nidulans，Aspergillusniger，Aspergillus oryzae，Trichoderma reesei，Chrysosporium lucknowense，Fusarium sp.，例如Fusarium gramineum，Fusarium venenatum；Physcomitrella patens和Neurospora crassa。

如在此使用的术语“肽”是指短的多肽，例如，典型地长度低于约50个氨基酸、更典型地长度低于约30个氨基酸的肽。在此使用的术语涵盖类似物和模拟物，其模拟了结构和因而模拟了生物学功能。

术语“多肽”涵盖天然发生的和非天然发生的蛋白和其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。进一步的，多肽可以包含多个不同的结构域，每个结构域具有一种或多种不同的活性。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是一种蛋白或多肽，它的起源或衍生来源(1)不与在其天然状况中伴随它的天然相关成分相关，(2)以自然中不存在的纯度存在，该纯度可以根据其他细胞材料的存在来判断(例如，没有来自相同物种的其他蛋白)，(3)被来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然中不存在(例如，它是在自然中发现的多肽的片段，或它包括自然中不存在的氨基酸类似物或衍生物或除标准肽键之外的连接)。因而，化学合成的或在不同于它天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是从它天然相关成分“分离的”。通过使用本领域公知的蛋白纯化技术分离，多肽或蛋白也可以变为基本上没有天然相关的成分。如这样定义的，“分离的”不一定需要这样描述的蛋白、多肽、肽或寡肽物理上从它的天然环境移出。

在此使用的术语“多肽片段”是指与全长多肽相比具有删除，例如氨基末端和/或羧基末端删除的多肽。在优选的实施方式中，多肽片段是连续的序列，其中该片段的氨基酸序列与天然发生的序列中的相应位置相同。片段一般是长度至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，优选的长度至少12、14、16或18个氨基酸，更优选的长度至少20个氨基酸，更优选的至少25、30、35、40或45个氨基酸，再更优选的长度至少50或60个氨基酸，以及再更优选的长度至少70个氨基酸。

“修饰的衍生物”是指多肽或其片段，其在基本结构序列上是基本上同源的，但其包括，例如体内或体外化学和生物化学修饰，或者其包括在天然多肽中不存在的氨基酸。这种修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、遍在化、标记，例如用放射性核素，各种酶修饰，这将是本领域技术人员容易理解的。标记多肽的各种方法以及用于这种目的的取代基或标记物是本领域公知的，包括放射性同位素，例如125I、32P、35S和3H，结合标记的抗配体(antiligand)(例如，抗体)的配体，荧光基团，化学发光试剂，酶，和可以充当标记的配体的特异性结合配对成员的抗配体。标记物的选择取决于需要的敏感性、与引物结合的容易度、稳定性需求和可用的检测设备。标记多肽的方法是本领域公知的。参见，例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates(1992，and Supplements to 2002)(hereby incorporatedby reference)。

术语“融合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列联结的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建以含有来自两种或多种不同蛋白的两种或多种期望的功能元件。融合蛋白包含来自目标多肽的至少10个连续氨基酸，更优选的至少20或30个氨基酸，再更优选的至少40、50或60个氨基酸，又更优选的至少75、100或125个氨基酸。包括本发明的蛋白的整体的融合物具有特别的实用性。包括在本发明的融合蛋白内的异源多肽是充当至少6个氨基酸，通常长度至少8个氨基酸，有用地长度至少15、20和25个氨基酸。包括大的多肽，例如免疫球蛋白Fc片段，或免疫球蛋白Fab片段或甚至整个蛋白，例如含有绿色荧光蛋白(“GFP”)发色团的蛋白或全长免疫球蛋白的多肽具有特别的实用性。通过构建核酸序列，所述核酸序列编码多肽或其片段，与编码不同蛋白或肽的核酸序列处于读码框内，然后表达融合蛋白，可以重组地产生融合蛋白。做为选择，融合蛋白可以通过将多肽或其片段交联到另一个蛋白来化学地产生。

如在此使用的，术语“抗体”、“免疫球蛋白”、“Ig”和“Ig分子”可互换地使用。每种抗体分子具有独特的结构，其容许它结合它的特异性抗原，但是所有抗体/免疫球蛋白具有在此描述的相同的整体结构。基础的抗体结构单位已知包含亚单位的四聚体.每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每个对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括主要对抗原识别负责的约100到110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分划定了主要对效应物功能负责的恒定区。轻链被分类为kappa或lambda。重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，并分别定义了抗体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。轻链和重链再分为可变区和恒定区(一般参见Fundamental Immunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(incorporated by reference in its entirety for all purposes)。每个轻链/重链配对的可变区形成抗体结合位点。因而，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点是相同的。链都展现了由三个高变区、也称为互补决定区或CDR连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。每个配对的两条链的CDR通过框架区对准，允许与特定的表位结合。该术语包括天然发生的形式，以及片段和衍生物。包括在该术语的范围内的是Ig种类，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。还包括在该术语的范围内的是IgG表达亚型，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该术语按照广义使用，包括单一的单克隆抗体(包括激动性和拮抗性抗体)，以及将结合多个表位或抗原的抗体组合物。该术语特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们含有或被修饰含有免疫球蛋白重链恒定区的CH2结构域的至少部分，所述部分包含CH2结构域的N-连接的糖基化位点或其变体。包括在该术语内的是包含Fc区的分子，例如免疫粘附素(美国专利申请NO.2004/0136986)、Fc融合物和抗体样分子。做为选择，这些术语可以指代至少Fab区域的抗体片段，其至少含有N-连接的糖基化位点。

术语“Fc”片段是指含有CH2和CH3结构域的抗体的“片段结晶的”C-末端区域(附图1)。术语“Fab”片段是指含有VH、CH1、VL和CL结构域的抗体的“片段抗原结合”区域(附图1)。

此处使用的术语“单克隆抗体(mAb)”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变之外，包含所述群体的单独的抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个的抗原性位点。此外，与常规的(多克隆的)抗体制品相比，每个mAb针对抗原上的单个决定因子，常规的抗体制品一般地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除它们的特异性之外，单克隆抗体的益处是它们可以通过杂交瘤培养来合成，没有被其他免疫球蛋白污染。术语“单克隆”表明了抗体是从基本上同质的抗体群体获得的特性，不能被看作是需要通过任何特别的方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等(1975)，Nature，256：495首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，Cabilly等的美国专利No.4,816,567)。

此处的单克隆抗体包括杂交和重组抗体，通过剪接抗体的可变(包括高变)结构域与恒定区(例如，“人源化”抗体)，或轻链与种类，或来自一个物种的链与来自另一个物种的链，或与异源蛋白质的融合物，不考虑来源物种或免疫球蛋白类型或子类名称，(参见，例如，Cabilly等的美国专利No.4,816,567；Mage and Lamoyi，in Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987).)此处的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分相同于或同源于来自第一物种的或属于特定抗体种类或子类的抗体中的序列，而链的其余部分相同于或同源于来自不同种类或属于不同抗体种类或子类的抗体中的序列，以及这样的抗体的片段，只要它们含有或被修饰以含有至少一个CH2。非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是特定的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自人免疫球蛋白的序列。抗体的Fv片段是保持了结合特征和完整分子的特异性的抗体的最小单位。Fv片段是抗体重链和轻链的可变区的非共价缔合的异二聚体.F(ab)′2片段是含有通过二硫键连接的两条Fab片段的臂的片段。

人源化的抗体的最常见形式是人免疫球蛋白(受者抗体)，在其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的、具有期望的特异性、亲合性和接受力(capacity)的CDR的残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不在接受者抗体中、又不在引入的CDR或框架序列中存在的残基。进行这些修饰以进一步改善和最大化抗体性能。一般地，人源化抗体包括基本上所有至少一个，一般地是两个可变区，其中，所有的或基本上所有的、相应于非人人免疫球蛋白的CDR区的CDR区，和所有的或基本上所有的CDR区是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体最理想地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。进一步的细节参见Jones et al.，1986，Nature 321：522-524；Reichmann et al.，1988，Nature 332：323-327，and Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

在术语抗体或免疫球蛋白的范围内的术语“片段”包括通过用各种蛋白酶消化产生的那些，通过化学裂解和/或化学解离产生的那些，以及重组地产生的那些，只要该片段仍然能够特异性结合目标分子。在这些片段中由Fc、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2和单链Fv(scFv)片段。

本发明的抗体的感兴趣的靶点包括生长因子受体(例如，FGFR、PDGFR、EGFR、NGFR和VEGF)和它们的配体。其他靶点是G蛋白受体，包括物质K受体、血管紧张素受体、α-和β-肾上腺素能受体、血清紧张素受体和PAF受体。参见，例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56：625-649(1987)。其他靶点包括离子通道((例如，钙、钠、钾通道)、毒蕈碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体和多巴胺受体(参见Harpold，U.S.5,401,629和U.S.5,436,128)。其他靶点有粘附蛋白，例如整联蛋白、选择素和免疫球蛋白超家族成员(参见Springer，Nature346：425-433(1990).Osborn，Cell 62：3(1990)；Hynes，Cell 69：11(1992))。其他靶点有细胞因子，例如白细胞介素IL-1到IL-13、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、肿瘤生长因子β(TGF-β)集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GMCSF)。参见Human Cytokines：Handbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，BlackwellScientific，Boston，MA 1991)。其他靶点有激素、酶以及细胞内和细胞间信使，例如腺苷酸环化酶、脒基环化酶和磷脂酶C。感兴趣的其他靶点有白细胞抗原，例如CD20和CD33。药物也可能是感兴趣的靶点。靶点分子可以是人类、哺乳动物或细菌的。其他靶点是抗原，例如来自微生物病原体包括病毒和细菌以及肿瘤的蛋白、糖蛋白、碳水化合物。在U.S.4,366,241中描述了再其他的靶点。

此处讨论的免疫Fc受体可以包括：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcRn(新生受体)。术语FcγRI可以指代任何FcγRI亚型，除非另外指定。术语FcγRII可以指代任何FcγRII受体，除非另外指定。术语FcγRIII是指任何FcγRIII亚型，除非另外指定。

“衍生物”在该术语的范围内包括抗体(或其片段)，其在序列上被修饰但仍然能够特异性结合目标分子，包括：种间嵌合的和人源化抗体；抗体融合物；异聚抗体复合物和抗体融合物，例如双抗体(diabody)(双特异性抗体)、单链双抗体和内抗体(intrabody)(参见，例如Intracellular Antibodies.：Research and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-Verlag New York，Inc.，1998)。

术语“非肽类似物”是指具有类似于参考多肽的性质的性质的化合物。非肽化合物也可以称为“肽模拟物”或“拟肽”。参见，例如Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries：A Handbook，JohnWiley(1997)；Bodanszky et al.，Peptide Chemistry--A Practical Textbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic Peptides：A Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger，TrendsNeurosci.，8：392-396(1985)；和上述每一个中引用的参考文献，通过引用合并在此。这种化合物通常借助计算机化的分子建模来开发。结构上类似于本发明的有用肽的肽模拟物可以用于产生等同的效果，并因而预想是本发明的一部分。

氨基酸取代可以包括(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性或酶活性，和(5)赋予或修改这种类似物的其他物理化学或功能性质的那些。

如在此使用的，二十种常规的氨基酸和它们的缩写按照常规使用。参见Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2^nd ed.1991)，通过引用将它合并在此。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-、α-双取代的氨基酸、N-乙酰基氨基酸以及其他非常规氨基酸也可以是用于本发明的多肽的适合的成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基精氨酸，以及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在此处使用的多肽符号中，根据标准的使用和常规，左侧末端相应于氨基末端，右侧末端相应于羧基末端。

如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白的核酸序列相似的序列，蛋白具有与第二蛋白的同源性或同源于第二蛋白。做为选择，如果两种蛋白具有“相似的”氨基酸序列，具有与第二蛋白的同源性。(因而，术语“同源蛋白”被定义为是指两种蛋白具有相似的氨基酸序列。)在优选的实施方式中，同源的蛋白是展现了与野生型蛋白至少65％的序列同源性、更优选的的至少70％序列同源性的蛋白。再更优选的是展现了与野生型蛋白的至少75％、80％、85％或90％序列同源性的蛋白。在再更优选的实施方式中，同源的蛋白展现了至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。如在此使用的，氨基酸序列的两个区域之间的同源性(特别是对于预测的结构相似性)被解释为暗示功能上的相似性。

当针对蛋白或肽使用“同源”时，公认的是不相同的残基位置通常差异是保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是一种替换，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一种氨基酸残基替换。一般地，保守性氨基酸替换将基本上不改变蛋白的功能性质。在两种或多种氨基酸序列相互不同在于保守性替换时，序列同一性百分比或同源性程度可以被调高以修正替换的保守性性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如Pearson，1994，Methods Mol.Biol.24：307-31和25：365-89(通过引用合并在此)。

以下的六组各自包含相互是典型的保守性替换的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，其也被称为序列同一性百分比，一般使用序列分析软件来测量。参见，例如，the Sequence Analysis Software Package ofthe Genetics Computer Group(GCG)，University of WisconsinBiotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白质分析软件利用分配给各种取代、删除和其他修饰，包括保守性氨基酸替换的同源性的度量来匹配相似的序列。例如，GCG含有程序如“Gap”和“Bestfit”，其可以与缺省参数使用来确定紧密相关的多肽，例如来自不同物种的有机体的同源多肽之间、或野生型蛋白和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1。

当比较特定多肽序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库时，优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul et al.，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang and Madden，Genome Res.7：649-656(1997))、特别是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(1997))。

BLASTp的优选的参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；打开缺口的代价：11(默认)；延伸缺口的代价：1(默认)；最大比对：100(默认)；字大小：11(默认)；描述的NO.：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

同源性比较的多肽序列的长度一般是至少约16个氨基酸残基、通常至少约20个残基、更通常地至少约24个残基、一般地至少约28个残基、以及优选的超过约35个残基。当搜索含有来自许多不同有机体的序列的数据库时，优选的是比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可以通过本领域已知的除了blastp之外的算法来调整。例如，多肽序列可以使用GCG Version 6.1中的程序FASTA来比较。FASTA提供了在查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的对准和序列同一性百分比。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(通过引用合并在此)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可以使用GCG版本2.1中提供的FASTA用其缺省参数(2的字大小，PAM250计分矩阵)来测定，通过引用合并在此。

“特异性结合”是指两种分子优先于结合环境中的其他分子相互结合的能力。一般地，“特异性结合”在反应中区别于不定的结合达至少两倍、更一般地至少10倍、通常至少100倍。一般地，特异性结合反应的亲和性或亲合力如通过离解常数定量的，是约10^-7M或更强(例如，约10^-8M、10^-9M或更强)。

在此使用的术语“区域”是指生物分子的一级结构的物理连续部分。对于蛋白来说，区域由该蛋白的氨基酸序列的连续部分来定义。

在此使用的术语“结构域”是指生物分子的结构，其对生物分子的已知的或怀疑的功能有贡献。结构域可以与区域或其部分共同延伸；结构域也可以包括生物分子的不同的、非连续的区域。

如在此使用的，术语“分子”是指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白、糖蛋白、糖类、核苷酸、核酸、脂质，等等，这样的化合物可以是天然的或合成的。

如在此使用的，术语“包含(comprise)”或变形如“comprises”或“comprising”将被理解为蕴涵包括声称的整体或整体的群体(inclusionof a stated integer or group of integers)，而不排除任何其他的整体或整体的组。

如在此使用的，术语“基本上由......组成”将理解成暗指包含声称的整体或整体的群体；而排除了将物质上影响或改变该声称的整体的修饰物或其他整体。对于N-聚糖种类，术语“基本上由”声称的N-聚糖“组成”将理解为包括N-聚糖，不管该N-聚糖是否在与糖蛋白的天冬酰胺残基直接连接的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)处海藻糖基化。

如在此使用的，术语“主要地((predominantly))”或变体如“主要”或“主要的是”将被理解为意思是，在糖蛋白用PNGase处理、通过质谱法例如MALDI-TOF MS分析释放的聚糖之后，在总的N-聚糖中具有最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。换句话说，用语“主要地”被定义为单个实体，例如特定的糖形式，其以比任何其他的单独实体更高的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔百分比的A种类、35摩尔百分比的B种类和25摩尔百分比的C种类组成，该组合物主要地包含A种类，B种类将是第二主要的种类。

如在此使用的，术语“基本上没有”特定糖残基，例如海藻糖等等，被用于表明该糖蛋白组合物基本上缺少含有这种残基的N-聚糖。按照纯度来表示，基本上没有是指含有这种糖残基的N-聚糖结构的数量不超过10％，优选的低于5％，更优选的低于1％，最优选的低于0.5％，其中所述百分比是按照重量或按照摩尔百分比。因而，在根据本发明的糖蛋白组合物中基本上所有的N-聚糖没有海藻糖、或半乳糖、或两者。

如在此使用的，当在任何时候没有可检测数量的这些糖残基存在于N-聚糖结构上时，糖蛋白组合物“缺少”或“缺乏”特定的糖残基，例如海藻糖。例如，在本发明的优选的实施方式中，所述糖蛋白组合物通过如以上定义的低等真核生物产生，包括酵母[例如，Pichia sp.；Saccharomyces sp.；Kluyveromyces sp.；Aspergillus sp.]，并且将“缺乏海藻糖”，因为这些有机体不具有产生海藻糖基化N-聚糖结构所需的酶。因而，术语“基本上没有海藻糖”涵盖术语“缺少海藻糖”。然而，即使组合物曾经含有海藻糖基化N-聚糖结构或含有有限但可检测数量的如上所述的海藻糖基化N-聚糖结构，组合物可以是“基本上没有海藻糖”。

如在此使用的，用语“提高的结合活性”与“提高的结合亲和性”可互换地使用，是指IgG分子与受体或其他指明的分子的结合方面的提高。

如在此使用的，用语“降低的结合活性”与“降低的结合亲和性”可互换地使用，是指IgG分子与受体或其他指明的分子的结合方面的降低。

如在此使用的，用语“吞噬作用”被定义为免疫复合物的清除。吞噬作用是免疫细胞的免疫活性，所述免疫细胞包括但不限于巨噬细胞和嗜中性细胞。

抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用以及反应的变化，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)、免疫复合物的清除(吞噬作用)、B细胞的抗体生产以及IgG血清半衰期分别在以下文献中定义：Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.2：77-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13：339-345；Heyman，2003，Immunol.Lett.88：157-161；and Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9：121-125。

除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明相关技术领域的一个普通技术人员通常所理解的相同含义。以下描述了示范性的方法和材料，然而与在此描述的那些相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践并对于本领域技术人员是显而易见的。在此提及的所有公开物和其他参考文件通过引用完全合并在此。在冲突的情况下，当前的说明书，包括定义，是支配性的。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。

重组Man ₇ GlcNAc ₂ /Man ₈ GlcNAc ₂  Ig分子

本发明提供了包含糖基化的Ig群体的组，所述Ig具有选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的N-连接的糖形式。本发明还提供了Ig和Ig组合物，其具有介导抗体效应物功能，例如受体结合的、选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的N-连接的糖形式。优选的，本发明的Ig和FcγRIII受体之间的相互作用提供了直接结合活性的提高。并且，优选的，本发明的Ig和FcγRIIb受体之间的相互作用提高了降低的直接结合活性(或缺少直接结合活性)。在另一个实施方式中，本发明的Ig或Ig组合物展现了由糖形式结构的富集或主要性赋予的提高的结合活性。本发明的显著特征在于，它提供了具有主要的、特定糖形式的Ig或Ig组合物，所述糖形式介导抗体功能，例如提高ADCC活性或提高B细胞的抗体产生。在另一个实施方式中，本发明的Ig或Ig组合物展现了提高的ADCC活性或B细胞抗体产生，由糖形式或特定糖形式的富集/主要性赋予。此外，对于熟练技术人员显而易见的是，产生具有主要糖形式的Ig或Ig组合物的益处是，它避免了具有非期望糖形式的Ig的产生和/或可能诱导非期望效果的Ig的异质混合物的产生和/或稀释更有效的糖形式。因而，提供的是包含主要具有Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂糖形式的Ig的药物组合物将具有有益的特征，包括但不限于，对FcγRIIb的降低的结合以及对FcγRIII的提高的结合，因而可能在更低剂量是有效的，从而具有更高的效能/效力。

在一个实施方式中，本发明的Ig分子在介导抗体效应物功能的Fc区域的CH2结构域上包含至少一种Man₇GlcNAc₂或Man₈GlcNAc₂聚糖结构。优选的，所述Man₇GlcNAc₂或Man₈GlcNAc₂聚糖结构是在二聚的Ig分子的每个Asn-297位点上(附图1)。在另一个实施方式中，本发明提供了包含Ig的组合物，所述Ig在Asn-297处被选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的N-聚糖结构被主要地糖基化(附图1)。做为选择，Ig分子上存在的一种或多种碳水化合物部分可以被删除或添加到所述分子，因而添加或删除Ig上糖基化位点的数量。进一步的，Ig分子的CH2区域内的N-连接的糖基化位点的位置可以通过在分子内的变化位置引入天冬酰胺(Asn)或N-糖基化位点来变化。虽然Asn-297是一般存在于鼠和人类IgG分子中的N-糖基化位点(Kabat et al.，Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest，1991)，这个位点不是可预期的唯一位点，也不必为了功能来维持该位点。使用已知的诱变方法，熟练技术人员可以改变编码本发明的Ig的DNA分子，从而删除Asn-297处的N-糖基化位点，并可以进一步改变所述DNA分子，从而在Ig分子内的其他位置创建一个或多个N-糖基化位点。然而，优选的是在IgG分子的CH2区域内创建N-糖基化位点。然而，Ig的Fab区域的糖基化已经在30％的血清抗体中描述了——通常在Asn-75发现(Rademacher et al.，1986，Biochem.Soc.Symp.，51：131-148)。在Fab区域中的糖基化是可以与Fc区域中的N-糖基化组合的、或单独的其他位点。

在一个实施方式中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构(the next predominant glycan structure of therecombinant Ig composition)至少约5摩尔百分比。在优选的实施方式中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构至少约10摩尔百分比到约25摩尔百分比。在更优选的实施方式中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构至少约25摩尔百分比到约50摩尔百分比。在优选的实施方式中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构大于约50摩尔百分比。在另一个优选的实施方式中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构大于约75摩尔百分比。在又一个实施方式中中，本发明提供了具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组Ig组合物中第二主要的聚糖结构大于约90摩尔百分比。主要具有Man₇GlcNAc₂(33％)和Man₈GlcNAc₂(55％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析在附图3中示出。

提高的Ig对FcγRIII受体的结合

与FcγRIIIa结合的免疫球蛋白的效应物功能如ADCC的活化由Ig分子的Fc区域介导。不同的功能由这个区域内的不同结构域介导。因而，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域具有能够进行效应物功能的主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖。在一个实施方式中，所述具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的Fc区域赋予了结合FcγRIIIa受体方面的提高(附图4、5)。在另一个实施方式中，Fc具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖。对于熟练技术人员显而易见的是，包含Fc区域的分子，例如免疫粘附素(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenaziand Chamow，1997，Curr Opin.Immunol.9：195-200)、Fc融合物和抗体样分子也被包括在本发明中。

Ig分子对Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过分析来测定。与IgG的FcγRIII结合分析的实例在实施例6中公开。本领域技术人员知道，这种公开的分析可以容易地适应涉及任何免疫球蛋白分子的需求。

如附图4和附图5显示的，分别与相比，主要包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的本发明的DX-IgG，具有大约3.5到6倍提高的对FcγRIIIa-LF和FcγRIIIa-LV的结合活性。最有趣地，FcγRIIIa基因二态性产生两种同种型：FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall’Ozzo et al.，2004，Cancer Res.64：4664-4669)。FcγRIIIa-158V的基因型纯合子与对

的更高临床反应相关(Cartron et al.，2002，Blood，99：754-758)。然而，在人类中存在的最常见的多态性变体是FcγRIIIa-158F，使得对于通过FcγRIIIa结合的ADCC诱导对于大多数人群不太有效。然而，当在缺乏岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中表达时，

对于通过FcγRIIIa-158F和FcγRIIIa-158V提高ADCC是相等地有效的(Niwa et al.，2004，Clin.Canc Res.10：6248-6255)。本发明的抗体是在P.pastoris中表达的，是一种天生缺乏海藻糖的酵母(实施例1、2)。因此，预期的是，缺乏海藻糖并且具有提高的对FcγRIIIa-LF的结合的本发明的抗体对于治疗展现了对

降低的临床反应的许多患者是特别有用的。

降低的Ig对FcγRIIb受体的结合

与FcγRIIb结合的免疫球蛋白的效应物功能如提高的B细胞抗体产生和提高的ADCC活性由Ig分子的Fc区域介导。不同的功能由这个区域内的不同结构域介导。因而，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域具有能够进行效应物功能的主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖。在一个实施方式中，具有主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的Ig的Fc区域赋予了结合FcγRIIb受体方面的降低。对于熟练技术人员显而易见的是，包含Fc区域的分子，例如免疫粘附素(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr Opin.Immunol.9：195-200)、Fc融合物和抗体样分子也被包括在本发明中。

Ig分子对Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过分析来测定。与IgG1的FcγRIIb结合分析的实例在实施例5中公开。本领域技术人员知道，这种公开的分析可以容易地适合涉及任何免疫球蛋白分子的需求。

如附图6显示的，分别与相比，主要包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的本发明的DX-IgG，具有大约4倍提高的对FcγRIIb的结合活性。

提高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

在又一个实施方式中，具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖作为主要N-聚糖的Ig分子或组合物的FcγRIIIa-LF和FcγRIIIa-LV结合方面的提高可以赋予FcγRIIIa介导的ADCC方面的提高。很好地确定了的是FcγRIII(CD16)受体对ADCC活性负责(Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。

在另一个实施方式中，具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂作为主要N-聚糖的Ig分子或组合物的FcγRIIb结合方面的降低可以赋予FcγRIIb介导的ADCC方面的提高(Clynes et al.，2000)。本发明的Ig分子或组合物可以展现由主要Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc聚糖的存在赋予的提高的ADCC活性。

在实施例7中公开了测量B细胞耗尽的体外分析和Chromium释放ADCC分析的实例。本领域技术人员知道，这种公开的分析可以容易地适合涉及任何免疫球蛋白分子的需求。此外，来自Borchmann et al.，2003，Blood，102：3737-3742，Niwa et al.，2004，Cancer Research，64：2127-2133和实施例7的动物模型中的体内ADCC分析可以适应任何特定的Ig。

B细胞的提高的抗体产生

已经显示了抗体对抗肿瘤的战斗通过FcγR途径调节(Clynes et al.，2000，Nature，6：443-446)。特别地，已知的是，当FcγRIIb与含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的受体例如B细胞受体(BCR)、FcγRI、FcγRIII和FcγRI共交联时，它抑制ITAM介导的信号(Vivier andDaeron，1997，Immunol.Today，18：286-291)。例如，添加FcγRII特异性抗体阻断Fc结合FcγRIIb，引起增加的B细胞增殖(Wagle et al.，1999，JofImmunol.162：2732-2740)。因而，在一个实施方式中，本发明的Ig分子可以介导FcγRIIb受体结合方面的降低，引起B细胞的活化，其随后催化浆细胞的抗体产生(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11：331-360)。在实施例6中公开了使用IgG1测量B细胞的抗体产生的分析的实例。本领域技术人员知道，这种公开的分析可以容易地适应于与任何免疫球蛋白分子的分析一同使用。

其他免疫学活性

在嗜中性细胞上效应物细胞分子的改变的表面表达已经显示了对细菌性感染的提高的敏感性(Ohsaka et al.，1997，Br.J.Haematol.98：108-113)。已经进一步证明了的是，结合FcγRIIIa效应细胞受体的IgG条件肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达(Blom et al.，2004，Arthritis Rheum.，48：1002-1014)。此外，FcγR诱导的TNF-α还提供嗜中性细胞结合和吞噬IgG包被的红血球的能力(Capsoni et al.，1991，J.Clin.Lab Immunol.34：115-124)。因而预期的是，在与FcγRIII结合方面显示了提高的本发明的Ig分子和组合物可以赋予TNF-α表达的提高。

FcγRIII受体活性的提高已经显示了提高溶酶体β-葡糖醛酸酶以及其他溶酶体酶的分泌(Kavai et al.，1982，Ady.Exp Med.Biol.141：575-582；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.，2：77-94)。比外，在免疫受体通过它们的配体交战之后的重要的步骤是它们的内在化和向溶酶体的递送(Bonnerot et al，1998，EMBO J.，17：4906-4916)。因而预期的是，在与FcγRIIIa结合方面显示了提高的本发明的Ig分子或组合物可以赋予溶酶体酶分泌的提高。

本发明提供了免疫球蛋白分子，其包含选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc构成的组的N-聚糖；以及提供了包含免疫球蛋白和多种与之连接的N-聚糖的组合物，其中所述多种N-聚糖内的主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc构成的组。如在此显示的，除了与FcγRIIIa-LF和FcγRIIIa-LV的改进的结合以及与FcγRIIb的降低的结合之外，在免疫球蛋白上所述Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc N-聚糖的主要性优选地赋予了期望的效应物活性。

免疫球蛋白子类

IgG子类已经显示具有对于Fc受体的不同的结合亲和性(Huizinga，et al.，1989，J.of Immunol.，142：2359-2364)。每种IgG子类可以在本发明的不同方面提供特别的优势。因而，在一个方面，本发明提供了包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc作为主要N-聚糖的IgG 1组合物。在另一个方面，本发明提供了包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc作为主要N-聚糖的IgG2组合物。在又一个方面，本发明提供了包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc作为主要N-聚糖的IgG3分子。在另一个方面，本发明包括包含Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc作为主要N-聚糖的IgG4分子。

做为选择，本发明可以应用于所有五种主要免疫球蛋白种类：IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。本发明的优选的免疫球蛋白是人类IgG，并优选的来自亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之一。本发明的更优选的免疫球蛋白是IgG1分子。

介导抗体效应物功能和活性的重组免疫球蛋白(Ig)分子的生产

在一个方面，本发明提供了生产在CH2结构域的Asn-297处具有选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的主要N-聚糖的重组Ig分子的方法，其中所述Ig分子介导抗体效应物功能和活性，以及类似地，提供了生产免疫球蛋白组合物的方法，其中附着于所述免疫球蛋白的主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。在一个实施方式中，Ig的重链和轻链使用重叠寡核苷酸来合成，并单独地克隆到表达载体中用于在宿主细胞中表达(实施例1)。在优选的实施方式中，重组Ig重链和轻链在宿主菌株中表达，所述宿主菌株主要地催化Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂N-聚糖的添加。在一个实施方式中，这种糖形式结构更具体地表示为代表Man₇GlcNAc₂的{[(Manα1，6-Manα1，6-Manα1，3)][(Manα1，3)-(Manα1，6)-Manα1，6)]-Manβ1，4-GlcNAcβ1，4-GlcNAc}、以及代表Man₈GlcNAc₂的{[(Manα1，6-Manα1，6-Manα1，6-Manα1，3)][(Manα1，3)-(Manα1，6)-Manα1，6]-Manβ1，4-GlcNAcβ1，4-GlcNAc}，具有Ig糖蛋白的Fc区域上的氨基酸Asn-297的氮以及Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂N-聚糖上N-乙酰-β-D-葡糖胺的羟基之间的连键。在又一个实施方式中，这种主要聚糖(这些主要聚糖)的添加可以添加到Ig分子内除Asn-297以外的不同位点的天冬酰胺，或与Fab区域中的N-糖基化位点组合。

在低等真核生物中主要具有Man ₇ GlcNAc ₂ /Man ₈ GlcNAc ₂ 的Ig的生产

本发明的一个方面提供了重组低等真核宿主细胞，其可以用于生产主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂糖形式的免疫球蛋白或抗体分子，其与在不产生所述糖形式的哺乳动物细胞中表达的糖蛋白组合物相比是有益的。

本发明的另一个优点是，糖蛋白的组合物具有容易重现的预定糖基化模式。为了期望的性质评定和优化这种组合物的性质，而副作用可以被完全最小化或完全避免。

本发明还提供了生产重组宿主细胞的方法，所述重组宿主细胞被工程化或选择以表达一种或多种核酸，用于包含选自由由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂N-聚糖结构构成的组的N-聚糖的Ig分子的生产。在本发明的某些优选的实施方式中，重组宿主细胞、优选的重组低等真核宿主细胞被用于生产主要具有Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂N-聚糖的所述Ig分子和组合物。

在其他优选的实施方式中，本发明包含可从重组宿主细胞或通过本发明的方法获得的糖蛋白。

本发明的宿主细胞可以用编码期望的Ig区域的载体、以及用编码在此描述的一种或多种糖基化相关酶的载体转化，然后选择主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的重组Ig分子或组合物的表达。本发明的重组宿主细胞可以是真核的或原核的宿主细胞，例如，动物、植物、昆虫、细菌细胞等等，其已经被工程化以产生主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的Ig组合物。

在一个实施方式中，编码IgG1的载体，例如含有DX-IgG的AOX1/pPICZA载体被导入野生型酵母P.pastoris NRRL Y-11430菌株(实施例1、2)。从NRRL Y-11430表达和纯化并用α-1，2甘露糖苷酶处理(实施例3)的这种DX-IgG产生主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(附图3)。

做为选择，本发明的抗体可以使用本领域已知的几种方法表达(Monoclonal Antibody Production Techiniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。

在低等真核生物中糖基转移酶的表达和稳定遗传学整合

已经描述了使用可选择标记例如URA3、URA5、HIS4、SUC2、G418、BLA或SH BLA来导入和确认异源基因在低等真核宿主菌株(例如P.pastoris)中的整合的方法。当表达系统在低等真核生物中生产时，这种方法可以适合于生产本发明的Ig。另外，已经描述了一些方法，其容许重复使用URA3标记物来消除不希望的甘露糖基转移酶活性。Alani et al.，1987，Genetics，116：541-545和美国专利No.6,051,419描述了在P.pastoris中基于URA3基因的破坏的选择系统。优选的，PpURA3-或PpURA5-blaster盒被用于破坏URA3、URA5或尿嘧啶生物合成途径中的任何基因，根据对于尿嘧啶的营养缺陷和对5-氟乳清酸(5FOA)同时容许阳性和阴性选择(美国专利申请No.2004/0229306；Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet.，197：345-346)。因而，技术人员认识到，这种系统允许通过选择和对抗选择插入多个异源基因。

进一步的酶修饰

进一步的酶删除在低等真核生物中可能是有益的或必需的，以分离没有甘露糖基磷酸化或β-甘露糖基化的Ig，这可能在人类中赋予异常的免疫原性活性。如所提及的，美国专利申请NO.11/020808公开了消除甘露糖基磷酸化的方法，美国专利申请NO.11/118008公开了消除β-甘露糖基化的方法。对于从植物宿主细胞分离Ig，酶删除可能是有益的或必需的，例如，删除或破坏这些宿主细胞中木糖和/或海藻糖的产生。对于从哺乳动物宿主细胞分离Ig，酶删除可能是有益的或必需的，例如，删除或破坏这些宿主细胞中海藻糖和/或海藻糖基转移酶的产生。

在其他蛋白表达系统中主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的Ig分子或组合物的生产

本领域技术人员理解的是，为异源蛋白质表达选择表达宿主系统(有机体)，其可能或可能不需要被工程化以表达具有主要聚糖结构的Ig。此处的实施例仅仅是一种方法的实例，用于进行在Asn-297或另一个N-糖基化位点、或在这两处具有特定聚糖的Ig的表达。本领域技术人员可以容易地采用本发明的这些细节和实例用于任何蛋白表达宿主系统(有机体)。

包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等等的其他蛋白表达宿主系统可以用于产生根据本发明的Ig分子和组合物。这些蛋白表达宿主系统可以被工程化以表达主要糖形式，或作为选择可以天然地产生具有主要聚糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖形式的糖蛋白的工程化蛋白表达宿主系统的实例包括基因敲除体/突变体(Shields et al.，2002，JBC，277：26733-26740.)；(et al.，1999.Nature Biotech.，17：176-180)中的遗传工程化或两者的结合。做为选择，某些细胞天然地表达主要糖形式，例如鸡、人类和牛(Raju et al.，2000，Glycobiology，10：477-486)。因而，根据本发明主要具有一种特定聚糖结构的Ig糖蛋白或组合物的表达可以由本领域技术人员通过选择多种比对宿主系统的至少一种来获得。本领域中存在的用于糖蛋白的生产的进一步的表达宿主系统包括：CHO细胞：Raju WO9922764A1和Presta WO03/035835A1；杂交瘤细胞：Trebak et al.，1999，J.Immunol.Methods，230：59-70；昆虫细胞：Hsu et al.，1997.JBC，272：9062-970和植物细胞：美国专利号6,040,498。

IgG的纯化

纯化和分离抗体的方法是本领域已知的和公开的。参见，例如，Kohler & Milstein，(1975)Nature 256：495；Brodeur et al.，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，New York，1987)；Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；和Jakobovits etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-255和Jakobovits etal.，(1993)Nature 362：255-258。在进一步的实施方式中，使用McCaffertyet al.(1990)Nature，348：552-554(1990)中描述的技术、使用感兴趣的抗原来选择适合的抗体或抗体片段，可以从抗体噬菌体库分离抗体或抗体片段。

根据本发明的方法产生的重组Ig分子可以根据实施例3、4中列出的方法来纯化。附图2显示了从NRRLY-11430纯化的DX-IgG的SDS-PAGE Coomassie染色的凝胶。在另一个实施方式中，纯化的Ig抗体具有Man₇GlcNAc₂and/or Man₈GlcNAc₂作为主要N-聚糖。对任何Ig分子的聚糖分析和分布可以通过本领域技术人员已知的几种质谱方法来测定：包括但不限于：HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOF MS。在优选的实施方式中，如实施例5中公开的，聚糖分布通过MALDI-TOFMS分析来测定。附图3显示了从NRRLY-11430纯化的并用α-1，2甘露糖苷酶处理的DX-IgG(实施例3)的MALDI-TOF光谱。这个MALDI-TOF显示了大约33摩尔％的总是Man₇GlcNAc₂，以及大约55摩尔％是Man₈GlcNAc₂。

药物组合物

本发明的抗体可以掺入药物组合物中，所述药物组合物包含抗体作为活性治疗试剂以及各种其他药学上可接受的成分。参见Remington′sPharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。取决于期望的制剂，组合物也可以包括药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂从而不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、佐剂，或无毒的、非治疗性、非免疫原性的稳定剂，等等。

用于肠胃外施用的药物组合物是无菌的、基本上等渗的、无热原的，并根据美国食品与药物管理局或类似机构的的GMP来制备。抗体可以作为在生理学地可接受的稀释剂中物质的溶液或悬浮液的可注射剂量来施用，具有可以是无菌液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇的药物载体。另外，辅助剂物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH值缓冲剂等等可以存在于组合物中。药物组合物的其他部分是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如，花生油、豆油和矿物油。一般地，乙二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。抗体可以以储库注射或植入物制品的形式施用，其可以以允许活性成分的持续释放的方式来配制。一般地，这种组合物被制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备为在注射之前适合于溶解于或悬浮于液体媒介物的固体形式。制品还可以乳化或密封在脂质体或微粒中，例如聚交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强的佐剂效果，如以上讨论的。(参见Langer，Science 249，1527(1990)and Hanes，Advanced Drug DeliveryReviews 28，97-119(1997)。

诊断产品

本发明的抗体也可以掺入到各种诊断试剂盒和其他诊断产品如阵列中。通常预先结合到固相来提供抗体，例如结合到微滴度平皿的孔。试剂盒还常常含有用于检测抗体结合的试剂，和提供试剂盒的使用说明的标签。免疫计或夹心分析是诊断试剂盒的优选的形式(参见US4,376,110，4,486,530，5,914,241和5,965,375)。例如US 5,922,615、US5,458,852、US 6,019,944和US 6,143,576中描述了抗体阵列。

治疗应用

本发明提供了糖蛋白组合物，其主要包含糖蛋白上的特定糖形式。本发明的特征是，当向哺乳动物包括人类施用时，在优选的实施方式中，当与具有类似一级结构的其他糖蛋白组合物相比时，包含新的糖蛋白组合物的药物组合物有益地展现了优越的体内性质。因而，本发明的新的组合物可以用于糖蛋白药物试剂当前使用的地方，并且可以有益地提供改善的性质以及在产品批次之间以及整个产品批次上的提高的均匀性。本发明的制品可以掺入溶液、单位剂型如用于口服递送的片剂和胶囊中，以及掺入悬浮液、软膏剂等等中，取决于特定的药物或药剂和它们的目标区域。

在特别的方面，本发明提供了糖蛋白药物试剂、药物或药剂的新组合物，其中所述糖蛋白包含免疫球蛋白分子和组合物，其主要包含糖蛋白试剂的特定糖形式。根据本发明的特定方面，提供了组合物，其包含主要具有在此描述的Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂聚糖结构的N-连接的低聚糖免疫球蛋白糖蛋白。在优选的方面，所述糖蛋白是抗体，特别是单克隆抗体。本发明进一步提供了用于生产本发明的组合物的方法和工具。

本发明进一步涵盖包含本发明的糖形式制品的药物组合物。所述组合物优选地是无菌的。当所述组合物是水溶液时，优选地，所述糖蛋白是可溶的。当所述组合物是冻干的粉未时，优选地，所述粉未可以在合适的溶剂中重构。

在其他方面，本发明涉及疾病状态的治疗方法，包括向需要它的哺乳动物施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物。本发明的进一步的目的是提供在工业物品中或试剂盒中的糖形式制品，其可以用于治疗疾病或失调的目的。

主要具有Man₇GlcNAc₂和/或Man₈GlcNAc₂N-聚糖的本发明的Ig分子对于适应症有许多治疗应用，例如癌症、炎症性疾病、感染、免疫疾病、自体免疫疾病，包括特发性血小板减少性紫癜、关节炎、全身性红斑狼疮和自身免疫性溶血性贫血。

以下是实施例，其参考Ig糖蛋白组合物的生产说明本发明的组合物和方法。这些实施例不应被看作限制性的，这些实施例仅为了说明的目的而包括。熟练技术人员认识到，对本文公开内容的大量的修饰和延伸，包括优化，是可能的。这些修饰和延伸被认为是本发明的一部分。

实施例1

用于在P.pastoris中表达的DX-lgG1的克隆

DX-IgG1(抗CD20IgG1)的轻链(L)和重链(H)由小鼠可变区和人类恒定区构成。公开了轻链为SEQ ID NO：1，重链为SEQ ID NO：2。使用购自Integrated DNA Technologies(IDT)的重叠寡核苷酸来合成重链和轻链序列。对于轻链可变区，购买15个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：5-19)，使用Extaq(Takada)在PCR反应中退火来产生具有5’MlyI位点的轻链可变区片段。这种轻链可变区片段然后通过重叠PCR使用5’MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO：20)、3′可变区/5′恒定区引物LfusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO：21)、3’恒定区引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO：22)和3’CD20L/lp(SEQ ID NO：23)与轻链恒定区(SEQ ID NO：3)(Gene Art，Toronto，Canada)连接。然后将最终的MlyI-轻链片段(其包括5’AG碱基对)插入pCR2.1topo载体(Invitrogen)，产生pDX343。对于重链，相应于小鼠重链可变区的17个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：24-40)购自IDT，并使用Extaq退火。这个重链可变区片段然后通过重叠PCR使用5’MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO：41)、5’可变区/恒定区引物HchainASTKGPS/up(SEQ ID NO：42)、3’可变区/恒定区引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO：43)和3’恒定区引物HFckpnl/lp(SEQ ID NO：44)与重链恒定区(SEQ ID NO：4)(Gene Art)连接。将最终的MlyI-重链片段(其包括5’AG碱基对)插入pCR2.1topo载体(Invitrogen)，产生pDX360。全长轻链和全长重链作为Mly1和Not1片段分离自相应的topo载体。这些轻链和重链片段然后各自连接到Kar2(Bip)信号序列(SEQ ID NO：45)，使用4个重叠寡核苷酸-P.BiPss/UP1-EcoRI、P.BiPss/LP1、P.BiPss/UP2和P.BiP/LP2(分别为SEQID NO：46-49)，然后连接到pPICZA的EcoRI-Not1位点，产生携带Kar2-轻链的pDX344以及携带Kar2-重链的pDX468。来自pDX344的BglII-BamHI片段然后亚克隆到含有AOX2启动子基因的pBK85中用于染色体整合，产生pDX458。来自携带重链的pDX468的BglII-BamHI片段然后亚克隆到pDX458中，产生pDX478，其含有处在AOX1启动子控制下的CD20重链和轻链。然后在转化到YAS309之前用SpeI将这个质粒线性化，用于利用Zeocin抗性选择的转化体整合到AOX2基因座中。(参见实施例2)

是购自Biogen-IDEC/Genentech，SanFrancisco，CA的抗CD20小鼠/人类嵌合IgG1。

PCR扩增。Eppendorf Mastercycl er用于所有PCR反应。PCR反应含有模板DNA、125μM dNTPs、0.2μM每种正向和反向引物、ExTaq聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.)和EX Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶缓冲液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。使用97℃15秒、55℃15秒、72℃90秒的30个循环，在97℃两分钟的起始变性步骤以及在72℃七分钟的最终延伸步骤，扩增DNA片段。

通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR样品，使用来自Qiagen的凝胶提取试剂盒提取并纯化DNA条带。所有的DNA纯化在10mM Tris、pH 8.0中洗脱，除了最后的PCR(重叠所有三个片段)之外，其在去离子H2O中洗脱。

实施例2

IgG(pDX478)载体向P.pastoris菌株NRLL Y-11430中的转化。

通过添加醋酸钠到0.3M的终浓度来制备pDX478的载体DNA。百分之百的冰冷乙醇然后添加DNA样品中到70％的终浓度。通过离心将DNA团化(12000g×10分钟)，用70％冰冷乙醇洗涤两次。干燥DNA，重悬浮在50μl的10mM Tris、pH 8.0中。要转化的NRRL Y-11430(美国典型培养物保藏所，ATCC)酵母培养物通过在BMGY(缓冲的最小甘油：100mM磷酸钾、pH6.0；1.34％酵母氮基；4×10^-5％生物素；1％甘油)中扩增较小的培养物到～2-6的O.D.来制备。酵母细胞然后通过在1M山梨醇中洗涤3次并重悬浮在～1-2mL 1M山梨醇中来变成电感受态。载体DNA(1到2μg)与100μL的感受态的酵母混合，并在冰上孵育10分钟。然后使用BTX Electrocell Manipulator 600使用以下参数将酵母细胞电穿孔：1.5kV、129ohms和25μF。一毫升的YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1M山梨醇)添加到电穿孔的细胞。转化的酵母随后平铺在含有zeocin的选择性琼脂平板上。

P.pastoris中IgG1生产的培养条件

用pDX478转化的NRLLY-11430的单个集落接种到50ml Falcon离心管的10mL BMGY培养基中(由1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、1.34％酵母氮碱基、4×10^-5％生物素和1％甘油组成)。孵育培养物，同时在24℃/170-190rpm摇动48小时直到培养物饱和。然后将100ml的BMGY添加到500ml挡板烧瓶中。种子培养物然后转移到含有100mL BMGY培养基的挡板烧瓶中。这种培养物在24℃/170-190rpm摇动孵育24小时。烧瓶的内含物倾倒入两个50ml Falcon离心管中，在3000rpm离心10分钟。用没有甘油的20mL BMGY洗涤细胞团一次，随后用20ml BMMY柔和地重悬浮(BMGY具有1％MeOH代替1％甘油)。悬浮的细胞转移到250ml mL挡板烧瓶中。这种培养物在24℃/170-190rpm摇动孵育24小时。然后，烧瓶的内含物倾倒入两个50ml Falcon离心管中，在3000rpm离心10分钟。蛋白质分离之前，通过ELISA分析培养物上清液来测定近似的抗体滴度。

培养物上清液中抗体的定量通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行：高结合微量滴定板(Costar)用10mL PBS、pH 7.4中的24μg山羊抗人Fab(Biocarta，Inc，San Diego，CA)包被，在4℃孵育过夜。除去缓冲液，添加封闭缓冲液(PBS中的3％BSA)，然后在室温下孵育1小时。除去封闭缓冲液，用PBS洗涤平板3次。在最后一次洗涤之后，添加抗体递增体积数量的培养物上清液(0.4、0.8、1.5、3.2、6.25、12.5、25和50μL)，在室温下孵育1小时。然后用PBS+0.05％Tween20洗涤平板。在最后一次洗涤之后，添加抗人类Fc-HRP到1∶2000PBS溶液中，然后在室温下孵育1小时。然后用PBS-Tween 20洗涤平板4次。根据厂家的说明书使用TMB底物试剂盒(Pierce Biotechnology)分析平板。

实施例3

IgG1的纯化

使用STREAMLINE蛋白A柱从培养物上清液捕获单克隆抗体。在Tris-Glycine pH 3.5中洗脱抗体，使用1M Tris pH 8.0中和。使用疏水性相互作用层析(HIC)进行进一步纯化。HIC柱的特定类型取决于抗体。对于JC-IgG和DX-IgG，与20mM Tris(7.0)、1M(NH₄)₂SO₄缓冲液一同使用苯基sepharose柱(也可以使用辛基sepharose)，用1M到0M(NH₄)₂SO₄的线性梯度缓冲液洗脱。来自苯基sepharose柱的抗体级分被集中并且交换到50mM NaOAc/Tris pH 5.2缓冲液中用于最后通过阳离子交换(SPSEPHAROSE Fast Flow)(GE Healthcare)柱纯化。使用50mM Tris、1MNaCl(pH 7.0)用线性梯度洗脱抗体。

用α-1，2甘露糖苷酶处理Ig-高甘露糖

对于α-1，2甘露糖苷酶处理，5mg纯化的Ig-高甘露糖(DX-IgG)缓冲交换到50mM NH₄Ac，pH 5.0。在硅化试管中，将0.03Uα-1，2甘露糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)添加到50mM NH4Ac pH 5.0中的纯化的IgG中，在37℃孵育16-24小时。这个的样品蒸干，重悬浮在水中，通过MALDI-TOF分析。然后从α-1，2甘露糖苷酶中纯化抗体，之后是如上所述的苯基sepharose纯化。

实施例4

纯化的Ig的检测

根据厂家的说明书(NuPAGE bis-Tris Electrophoresis System；Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.)使用预制的凝胶剂将纯化的DX-IgG与合适体积的样品加载缓冲液混合并经历十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用考马斯亮蓝染料(BIO-RAD，Hercules，CA)来染色凝胶蛋白。参见附图2。

抗体浓度

蛋白层析级分的浓度使用白蛋白(Pierce，Rockford，IL)作为标准使用Bradford分析测定(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)。

实施例5

IgG1碳水化合物分析

飞行质谱法的基质辅助激光脱附电离时间(MALDI-TOF MS)。天冬酰胺连接的低聚糖的MALDI-TOF分析：使用Papac et al.，Glycobiology8，445-454(1998)的修改的步骤来从DX-IgG释放N-连接的聚糖。抗体的样品被还原并羧甲基化，封闭膜，用水洗涤反应孔三次。通过添加含有1mU N-聚糖酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)的30μl 10mMNH₄HCO₃(pH 8.3)将IgG蛋白脱糖基化。在37℃16小时之后，含有聚糖的溶液通过离心来除去并蒸干。来自每个反应孔的干燥的聚糖溶于15μL水中，将0.5μL点样到不锈钢样品平板上，与0.5μL的S-DHB基质(1∶1水/乙腈/0.1％三氟乙酸中的9mg/mL二羟基苯甲酸/1mg/mL的5-甲氧基-水杨酸)混合并容许干燥。通过4-ns脉冲时间的脉冲氮激光(337nm)的照射产生离子。以125ns延迟和20kV的加速电压以延迟提取方式操作仪器。栅极电压是93.00％，导波线电压是0.1％，内压力是低于5×10⁷托(1托＝133Pa)，低分子量门限是875Da。从总共100-200个激光脉冲产生光谱，用500-MHz数字转换器获得。(Man)5(GlcNAc)2低聚糖被用作外部分子量标准。使用仪器以阳离子模式产生全部光谱。

实施例6

抗原结合ELISA分析

高结合微量滴定板(Costar)用PBS、pH 7.4中的10μg抗原(CD20)包被，在4℃孵育过夜。除去缓冲液，添加封闭缓冲液(PBS中的3％BSA)，然后在室温下孵育1小时。除去封闭缓冲液，用PBS洗涤平板3次。在最后一次洗涤之后，添加从0.2ng到100ng递增数量的纯化的抗体，在室温下孵育1小时。然后用PBS+0.05％Tween20洗涤平板。在最后一次洗涤之后，添加抗人类Fc-HRP到1∶2000PBS溶液中，然后在室温下孵育1小时。然后用PBS-Tween 20洗涤平板4次。根据厂家的说明书使用TMB底物试剂盒(Pierce Biotechnology)分析平板。

Fc受体结合分析

对FcγRIIb和FcγRIIIa的Fc受体结合分析根据早先描述的方案进行(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，276：6591-6604)。对于FcγRIIIa-LV和FgRIIb结合(附图5、6)，融合蛋白是PBS、pH 7.4中1μg/ml或FcγRIIIa-LF(附图4)融合蛋白0.8μg/ml，在4℃在ELISA平板上包被48h(Nalge-Nunc，Naperville，IL)。平板用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)在25℃封闭1h。通过在25℃混合2∶1摩尔数量的DX-IgG和HRP结合的F(Ab’)₂抗F(Ab’)₂，在PBS中的1％BSA中制备DX-IgG二聚复合物。二聚复合物然后在1％BSA/PBS中以1∶2连续稀释，在25℃包被在平板上1小时。使用的底物是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(VectorLaboratories)。根据厂家的说明(Vector Laboratories)在450nm读取吸光度。

B细胞中抗体反馈的ELISPOT分析

如Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.46：10-15中描述的进行这项分析。BSA(牛血清白蛋白)首先结合到IgG抗体，产生BSA-IgG复合物。分泌BSA特异性IgG的B细胞的数目使用ELISPOT分析测定。从注射的小鼠移除脾脏，在DMEM(Gibco，New York)中用0.5％正常小鼠血清制备细胞悬液。一百微升细胞悬液施加到BSA包被的微量滴定板(参见上述ELISA方案)，37℃、5％CO₂孵阵育3.5h。洗涤平板，与在PBS-Tween中1/100稀释的50μl的碱性磷酸酶结合的绵羊抗小鼠IgG在4℃孵育过夜。样品点在50μl 5溴-4-氯-3-吲哚磷酸(Sigma-Aldrich)中在室温下显影1小时，在立体显微镜下计数。

实施例7

对于ADCC分析，使用如Vugmeyster and Howell，2004，Int.Immunopharm.4：1117-1124中描述的血液基质研究(例如，B细胞耗尽)。耗尽血浆和红细胞(RBC)的全血在染色缓冲液(具有1％BSA和0.1％叠氮化钠的Hank’s平衡盐溶液(HBSS))中重构，产生染色缓冲液中的白细胞悬液。全血样品然后在1000g旋转5分钟，丢弃上清液(血浆)，团粒用氯化铵裂解(ACL)试剂处理，洗涤，重悬浮在等体积的染色缓冲液中。对于B细胞耗尽分析：10μl 100μg/ml的抗体溶液或染色缓冲液添加到90μl SB基质中，在37℃孵阵育1小时。样品立即用抗CD19-FITC和抗CD45-PE在25℃染色30分钟。样品然后固定在1％甲醛中，运行三份。B细胞耗尽的定量通过流式细胞计获得。B细胞耗尽的流式细胞计分析：装备有自动化FACS Loader和Cell Quest软件的FACS Calibur(BD Biosciences)仪器用于所有样品的获得和分析。细胞计QC和设置包括运行CaliBrite珠子和SpheroTech彩虹珠子(BDBiosciences)来确认仪器功能和检测器线性。伴随每个分析运行同种型和补偿对照来确认仪器设置。总淋巴细胞的B细胞百分数通过以下选通策略获得。在前向散射/侧向散射scattegram上标记淋巴细胞群体来划定区域1(R1)。使用R1中的事件，对CD19和CD45标记显示荧光强度斑点。荧光标记的同种型对照物被用于确定CD19和CD45阳性的相应边界点。使用CellQuest测定％B，作为具有CD19阳性、CD45阳性表型的R1区域中的细胞的分数。为每个处理组运行三份样品。B细胞耗尽百分比使用公式平均的[100*(1-用对照抗体处理的％B/平均的[用SB处理的％B])。荧光染料释放ADCC分析：PBMC分离：来自健康个体或血液供体(10-20位)的外周静脉血收集到肝素化的采血管(Becton DickinsonVacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中。植入2只小鼠需要大约5mL血液。外周血单核细胞(PBMC)通过根据厂家的说明书使用OptiPrep离心来分离。用由RPMI 1640、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素(Gibco/BRL)组成并补充有20％胎牛血清的完全培养基(CM)洗涤PBMC一次，然后以浓度1×10⁶/ml CM重悬浮，并转移到250ml培养烧瓶(Falcon，NJ，USA)中用于单核细胞耗尽。在37℃和5％CO₂孵育1小时之后，回收非粘附细胞，用培养基洗涤一次，外周血淋巴细胞(PBL)调节到2.5×10⁷/ml CM的浓度。荧光染料释放ADCC.ADCC分析的前提是，结合CD20抗原呈递目标细胞(Raji细胞系用于抗CD20Ig)的抗体刺激目标细胞结合效应细胞上的Fcγ受体。这接着促进呈递抗原的目标细胞的裂解，释放可以定量的内部荧光染料。Alamar蓝荧光被用于代替目标细胞的⁵¹Cr标记。50μl的CD20呈递Raji细胞悬液(1×10⁴个细胞)与50μl数量的抗DX-IgG(各种浓度)和50μl数量的如上分离的PBMC效应细胞(效应细胞比目标细胞比例可以是100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1)在96孔组织培养平板中组合，在37℃和5％CO₂孵育4h以便于Raji或BCL 1-3B3细胞的裂解。添加50μl的Alamar蓝，继续孵育另外5小时以容许染料的摄取和新陈代谢以进入它的荧光状态。平板在摇动器上冷却到室温，在荧光计中读取荧光，在530nm激发，在590nm发射。相对荧光单位(RFU)针对mAb浓度来标绘，根据使用对照抗体，例如的标准曲线来计算样品浓度。使用重度组合免疫缺陷(Severe Combined Immunodeficient，SCID)小鼠的体内ADCC(Niwa et al.，2004，Cancer Research，64：2127-2133).体内ADCC活性可以使用小鼠模型来分析，所述小鼠模型移接了来自健康供体的人类外周血单核细胞(PBMC)，所述健康供体包括杂合的(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和纯合的(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV和FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型。使用这种模型系统，分析了具有主要N-聚糖的Ig相比

或任何其他对照抗体的提高的ADCC活性。这种体内ADCC分析的详细和充分的方案在上文Niwa et al.，2004中找到。

<110>GlycoFi，Inc.

     Gerngross.Tillman

     Wildt.Stefan

     Li，Huijuan

<120>主要包含Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2糖形式的免疫球蛋白

<130>GF0027P

<150>PCT/IB2005/052964

<151>2005-09-09

<160>49

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>642

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠/人类嵌合IgG1轻链

<400>1

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<210>2

<211>1354

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠/人类嵌合IgG1重链

<400>2

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<210>3

<211>324

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人类IgG1的轻链恒定区

<400>3

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<210>4

<211>989

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人类IgG1的重链恒定区

<400>4

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actgctgctt tgggatgttt ggttaaggac tacttcccag agcctgttac tgtttcttgg 120

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ttgtactcct tgtcctccgt tgttactgtt ccatcctctt ccttgggtac tcagacttac 240

atctgtaacg ttaaccacaa gccatccaac actaaggttg acaagaaggc tgagccaaag 300

tcctgtgaca agacacatac ttgtccacca tgtccagctc cagaattgtt gggtggtcca 360

tccgttttct tgttcccacc aaagccaaag gacactttga tgatctccag aactccagag 420

gttacatgtg ttgttgttga cgtttctcac gaggacccag aggttaagtt caactggtac 480

gttgacggtg ttgaagttca caacgctaag actaagccaa gagaggagca gtacaactcc 540

acttacagag ttgtttccgt tttgactgtt ttgcaccagg attggttgaa cggaaaggag 600

tacaagtgta aggtttccaa caaggctttg ccagctccaa tcgaaaagac tatctccaag 660

gctaagggtc aaccaagaga gccacaggtt tacactttgc caccatccag agatgagttg 720

actaagaacc aggtttcctt gacttgtttg gttaaaggat tctacccatc cgacattgct 780

gttgagtggg aatctaacgg tcaaccagag aacaactaca agactactcc accagttttg 840

gattctgacg gttccttctt cttgtactcc aagttgactg ttgacaagtc cagatggaac 900

agggtaacgt tttctcctgt tccgttatgc atgaggcttt gcacaaccac tacactcaaa 960

agtccttgtc tttgtcccca ggtaagtaa                                   989

<210>5

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>5

aggagtcgta ttcaaatcgt cttgtctcaa tccccagcta ttttg                    45

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>6

tctgcttccc ctggagagaa ggtcaccatg acttgtagag cctct                   45

<210>7

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>7

tcctctgtct cttacattca ctggttccag caaaagccag gttcc                  45

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>8

tctccaaagc catggatcta cgctacttcc aacttggctt ccggt                  45

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>9

gttccagtta gattctctgg ttctggttcc ggtacctcct actct                  45

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>10

cttaccatct ccagagttga agccgaggac gctgctactt actac                   45

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>11

tgtcagcaat ggacttctaa cccaccaact ttcggtggtg gtacc                   45

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>12

aaattggaga ttaagagaac tgttgctgct ccatcc                             36

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>13

caacagttct cttaatctcc aatttggtac caccaccgaa agttg                   45

<210>14

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>14

gtgggttaga agtccattgc tgacagtagt aagtagcagc gtcct              45

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>15

cggcttcaac tctggagatg gtaagagagt aggaggtacc ggaac             45

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>16

agaaccagag aatctaactg gaacaccgga agccaagttg gaag              44

<210>17

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>17

tagcgtagat ccatggcttt ggagaggaac ctggcttttg ctgga            45

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>18

ccagtgaatg taagagacag aggaagaggc tctacaagtc atgg                    44

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>19

tgaccttctc tccaggggaa gcagacaaaa tagctgggga ttgag                    45

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

aggagtcgta ttcaaatcgt c                                               21

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

agaactgt tg ctgctccatc c                                             21

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

ggatggagca gcaacagttc                                        20

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

ctggtacctt aacactctcc tctgttgaag                              30

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

aggagtcgta ttcaagtcca gttgcaacag cctggtgccg agttg                45

<210>25

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

gtcaagccag gtgcttctgt taagatgtcc tgtaaggctt ctggt                   45

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

tacactttca cctcctacaa catgcactgg gtcaagcaaa ctcca         45

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ggtagaggtt tggagtggat tggtgccatc tacccaggta acggt         45

<210>28

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

gacacttctt acaaccaaaa attcaaggga aaggctactc ttacc            45

<210>29

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

gctgataagt cctcttccac cgcctacatg caattgtctt ccttg            45

<210>30

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

acttctgaag actctgctgt ttactactgt gctagatcca cctac    45

<210>31

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

tacggtggag actggtactt caacgtttgg ggtgctggta ccact    45

<210>32

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gtcaccgttt ccgctgcttc tactaaggga ccatcc                        36

<210>33

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

tagtagaagc agcggaaacg gtgacagtgg taccagcacc ccaaa                 45

<210>34

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

cgttgaagta ccagtctcca ccgtagtagg tggatctagc acag             44

<210>35

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

agtaaacagc agagtcttca gaagtcaagg aagacaattg catgt             45

<210>36

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

aggcggtgga agaggactta tcagcggtaa gagtagcctt tccct             45

<210>37

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

tgaatttttg gttgtaagaa gtgtcaccgt tacctgggta gatgg              45

<210>38

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

caccaatcca ctccaaacct ctacctggag tttgcttgac ccagt    45

<210>39

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

gcatgttgta ggaggtgaaa gtgtaaccag aagccttaca ggaca    45

<210>40

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

tcttaacaga agcacctggc ttgaccaact cggcaccagg ctgtt    45

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

aggagtcgta ttcaagtcca g                                    21

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

gcttctacta agggaccatc c                                  21

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

ggatggtccc ttagtagaag c                                     21

<210>44

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

ctggtattac ttacctgggg acaaagac                                  28

<210>45

<211>105

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有EcoRI的Kar2信号序列

<400>45

gaattcgaaa cgatgctgtc gttaaaacca tcttggctga ctttggcggc attaatgtat   60

gccatgctat tggtcgtagt gccatttgct aaacctgtta gagct                  105

<210>46

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

aattcgaaac gatgctgtct ttgaagccat cttggcttac tttggctgct ttgatgtacg 60

ctatgctttt                                                        70

<210>47

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

ccaaagtaag ccaagatggc ttcaaagaca gcatcgtttc g                    41

<210>48

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

ggttgttgtt ccatttgcta agccagttag agct                           34

<210>49

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

agctctaact ggcttagcaa atggaacaac aaccaaaagc atagcgtaca tcaaagcag  59

Claims (23)

1. 包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

2. 权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于50摩尔百分比选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

3. 权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于75摩尔百分比选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

4. 权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于90摩尔百分比选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

5. 权利要求1的组合物，其中所述选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组的N-聚糖以一定水平存在，所述水平超过第二主要的N-聚糖结构约5摩尔百分比到约50摩尔百分比。

6. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白展现对FcγRIIb受体的降低的结合亲和性。

7. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白展现对FcγRIII受体的提高的结合亲和性。

8. 权利要求7的组合物，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIa受体。

9. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白展现提高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。

10. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白基本上没有海藻糖。

11. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白缺乏海藻糖。

12. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白结合选自由生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α和TNF-β构成的组的抗原。

13. 权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白包含选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区域构成的组的Fc区域。

14. 包含权利要求1的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

15. 权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白基本上没有海藻糖。

16. 权利要求14的组合物，其中所述免疫球蛋白缺乏海藻糖。

17. 权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白包含抗体，所述抗体结合选自由生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α和TNF-β构成的组的抗原。

18. 权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白包含抗体，所述抗体结合选自由生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α和TNF-β构成的组的抗原。

19. 权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白包含选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区域构成的组的Fc区域。

20. 包含权利要求1的组合物的试剂盒。

21. 包含编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞被工程化或被选择来表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生包含多种免疫球蛋白的组合物，每种免疫球蛋白包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

22. 权利要求20的宿主细胞，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。

23. 在真核宿主中产生包含多种免疫球蛋白的组合物的方法，每种免疫球蛋白包含至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖选自由Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂构成的组。

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