CN101001876A - 包含占优势的GlcNacMAN5GLCNAC2糖形的免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在免疫球蛋白糖蛋白上具有赋予其特定效应物功能的占优势的N－聚糖结构的免疫球蛋白糖蛋白组合物。此外，本发明涉及含有具有特定的富集的N－聚糖结构的抗体的药物组合物，其中所述N－聚糖结构是GlcNAcMan₅GlcNAc₂。

Description

包含占优势的GlcNacMAN5GLCNAC2糖形的免疫球蛋白

相关申请

本申请要求2004年7月21日提交的美国临时申请No.60/589,988和2004年7月21日提交的美国临时申请No.60/589,981的权益；并且是2003年2月20提交的美国申请系列No.10/371,877的部分继续申请，No.10/371,877是2001年6月27日提交的美国申请系列No.09/892,591的部分继续申请，No.09/892,591要求2000年6月28日提交的美国临时申请系列No.60/214,358、2000年6月30日提交的美国临时申请No.60/215,638和2001年3月30日提交的美国临时申请No.60/279,997的权益。在此全文引入上述每一个申请作为参考。

发明领域

本发明涉及具有特定N-连接的糖基化模式的糖蛋白的组合物及其制备方法。具体地，本发明涉及包含多个具有特定N-聚糖结构的免疫球蛋白糖蛋白的组合物，更具体地，涉及包含免疫球蛋白糖蛋白的组合物，其中在免疫球蛋白上具有一个或多个占优势的糖形结构，其调节，如促进特定效应物功能。

发明背景

糖蛋白介导人和其它哺乳动物中的很多重要功能，包括催化作用、信号传递、细胞-细胞交通和分子识别和关联。糖蛋白组成真核生物中的大多数非胞质溶胶蛋白(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。为了治疗目的开发了很多糖蛋白，在过去20年中，天然存在的糖蛋白的重组形式成为了生物技术工业的大部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Cumming et al，1991，Glycobiology 1：115-130)。重组生产的糖蛋白的糖基化模式的变化最近成为了科学领域的很多关注的话题，作为接近临床的可能预防和治疗而生产的重组蛋白。

抗体或免疫球蛋白(Ig)是在体液免疫应答中起中心作用的糖蛋白。可以将抗体看作是在体液和细胞防御机制中提供联系的衔接分子。由抗体进行的抗原特异性识别导致可能激活多个效应物机制的免疫复合物的形成，导致复合物的除去和破坏。在免疫球蛋白的大类中，可以从生化和功能上区分五类抗体，即，IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，而更细微的差异限于可变区，其导致抗原结合的特异性。在这五类Igs中，仅仅存在两种类型的轻链，它们称作lambda(λ)和kappa(κ)。在具有λ或κ链的抗体之间没有发现功能差异，并且两类轻链的比例在各物种之间不同。存在5类重链或同种型，这些决定了抗体分子的功能活性。免疫球蛋白的5个功能分类是：免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。每一同种型在免疫应答中具有特定功能，它们的独特功能特性是由重链的羧基末端部分赋予的，在此处它不与轻链缔合。IgG是血浆中最充足的免疫球蛋白同种型(参见，例如，Immunobiology，Janeway et al，6^th Edition，2004，GarlandPublishing，New York)。

免疫球蛋白G(IgG)分子包含Fab(片段抗原结合)结构域和恒定和可变区，以及Fc(片段定型的)结构域。每个重链的CH2结构域在连接N-聚糖与Ig分子的天冬酰胺残基上，通常是在残基Asn-297上含有N-连接的糖基化的单一位点(Kabat et al.，Sequences ofproteins of immunological interest，Fifth Ed.，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。

出于三个主要原因，N-连接的寡糖的结构和功能方面的分析具有生物学意义：(1)CH2结构域的糖基化在进化过程中是保守的，表明寡糖的重要作用；(2)免疫球蛋白分子作为分析寡糖异质性的模型系统；和(3)抗体包含两个重链的二聚缔合，其使得两个寡糖单位直接彼此接触，从而免疫球蛋白分子参与特定蛋白-碳水化合物和碳水化合物-碳水化合物相互作用。

已经证明，Igs的不同糖基化模式与不同的生物性质相关(Jefferisand Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65：111-128；Wrightand Morrison，1997，Trends Biotechnol，15：26-32)。但是，已知仅有少数特定糖形赋予需要的生物功能。例如，据报道，在N-连接的聚糖上的岩藻糖基化减少的免疫球蛋白组分与人FcγRIII的结合增强，因此增强了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Shields et al，2002，J.Biol Chem，277：26733-2674O；Shinkawa et al，2003，J.Biol.Chem.278：3466-3473)。并且，据报道，CHO细胞中产生的岩藻糖基化的G2(Gal₂GlcNAc₂-Man₃GlcNAc₂)IgG使补体依赖性细胞毒性(CDC)活性增加的程度高于异源性抗体的组合物增加的程度(Raju，2004，美国专利申请No.2004/0136986)。也已经提示，抗肿瘤的最优抗体将是优先结合以激活Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)并且最少结合抑制性的FcγRIIb受体的抗体(Clynes et al，2000，Nature，6：443-446)。因此，在Ig糖蛋白上富集特定糖形的能力是高度需要的。

概言之，糖蛋白上的糖基化结构(寡糖)将依赖于表达宿主和培养条件而改变。在非人宿主细胞中产生的治疗性蛋白很可能含有非人糖基化，其可能在人体中引发免疫应答-如酵母中的高甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)；植物中的α(1，3)-岩藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al，1999，Glycobiology，9：365-372)；中国仓鼠卵巢细胞中的N-羟乙酰神经氨酸(Noguchi etal.，1995.J.Biochem.117：5-62)和小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck et al.，1993，Immun.Today，14：477-479)。此外，糖基化可能随着细胞培养条件而改变，这可能使得一些免疫球蛋白组合物成为免疫原性，这取决于它们的特定半乳糖模式(Patel et al.，1992.Biochem J.285：839-845)。由非人哺乳动物产生的糖蛋白的寡糖结构容易与人类糖蛋白的寡糖结构更密切相关。因此，大多数商业化的免疫球蛋白是在哺乳动物细胞中产生。但是，哺乳动物细胞作为蛋白生产的宿主细胞具有一些重要的缺点。除了昂贵，在哺乳动物细胞中表达蛋白的过程产生了异质性的糖形群体，具有低的体积测定滴度，并且需要不断进行的病毒污染和大量时间来产生稳定的细胞系。

已知不同的糖形可以显著影响治疗特性，包括药动学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶定(Graddis et al.，2002，Curr PharmBiotechnol.3：285-297)。具体地，对于抗体，寡糖结构会影响与蛋白酶抗性相关的性质、由FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、与补体复合物C1(其诱导补体依赖性细胞毒性(CDC))的结合、以及与FcγR受体(其负责调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)途径、吞噬作用和抗体反馈)的结合(Nose and Wigzell，1983；Leatherbarrow and Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walkeret al，1989；Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.ScL USA，89：4285-4289)。

由于不同的糖形与不同的生物性质相关，富集一种或多种特定糖形的能力可以用于阐释特定糖形和特定生物功能之间的关系。在将需要的生物功能与特定糖形模式进行关联后，可以产生对有利的糖形结构进行了富集的糖蛋白组合物。因此，非常需要生产对特定糖形进行了富集的糖蛋白组合物的能力。

发明概述

本发明提供了包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。在一种优选实施方案中，所述多个N-聚糖的50摩尔百分比以上基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。更优选地，所述多个N-聚糖的75摩尔百分比以上基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。最优选地，所述多个N-聚糖的90摩尔百分比以上基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。在其它优选实施方案中，所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖结构以比所述多个N-聚糖中其次最占优势的N-聚糖结构多约5摩尔百分比-约50摩尔百分比的水平存在。

本发明也提供了通过富集免疫球蛋白上的特定糖形(如GlcNAcMan₅GlcNAc₂)增加与FcγRIIIa和FcγRIIIb受体结合和减少与FcγRIIb受体结合的方法。一种优选的实施方案提供了制备包含多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成，所述方法包括培养经过工程化或经过选择以表达所述免疫球蛋白或其片段的宿主细胞的步骤。另一种优选的实施方案提供了制备包含多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成，所述方法包括培养经过工程化或经过选择以表达所述免疫球蛋白或其片段的低等真核宿主细胞的步骤。在本发明的其它实施方案中，宿主细胞包含编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主细胞经过工程化或经过选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。在本发明的其它实施方案中，低等真核宿主细胞包含编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主细胞经过工程化或经过选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

在本发明的优选实施方案中，提供了包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白表现出与FcγRIIb受体的结合亲和力减少。在本发明的其它优选实施方案中，提供了包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GicNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白表现出与FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的结合亲和力增加。在本发明的另一种优选实施方案中，提供了包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增加。

在一种实施方案中，本发明的组合物包含基本不含岩藻糖的免疫球蛋白。在另一种实施方案中，本发明的组合物包含缺乏岩藻糖的免疫球蛋白。本发明的组合物也包括药物组合物和可药用的载体。本发明的组合物也包括免疫球蛋白的药物组合物，所述免疫球蛋白进行了纯化，并且装入诊断试剂盒中。

因此，本发明提供了制备具有预定的糖基化结构的糖蛋白，特别是具有基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成的N-聚糖的免疫球蛋白或抗体分子的组合物的材料和方法。

附图简述

图1.具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的IgG的示意图。

图2.在YAS385-1中表达(如实施例2所述)并且在蛋白A柱(第1道)和苯基琼脂糖凝胶柱(第2道)上从培养基纯化(如实施例3所述)的JC-IgG的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶(2.5μg蛋白/泳道)。

图3.在YAS385-1中表达(如实施例2所述)并且在蛋白A柱(第1道)和苯基琼脂糖凝胶柱(第2道)上从培养基纯化(如实施例3所述)的DX-IgG的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶(2.5μg蛋白/泳道)。

图4A.在YAS385-1中表达的JC-IgG的MALDI-TOF谱，用β-半乳糖苷酶处理，表明主要是GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖。B.在YAS385-1中表达的DX-IgG的MALDI-TOF谱，用β-半乳糖苷酶处理，表明主要是GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖。

图5A.FcγRIIIb与JC-IgG和Rtuximab的ELISA结合测定。B.FcγRIIIb与DX-IgG和Rituximab的ELISA结合测定。(GM5＝GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖)。

图6.FcγRIIIa-158F与JC-IgG和Rituximab的ELISA结合测定。(GM5＝GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖)。

图7A.FcγRIIb与JC-IgG和Rituximab的ELISA结合测定。图7B.FcγRIIb与DX-IgG和Rituximab的ELISA结合测定(GM5＝GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖)。

序列简述

SEQ ID NO：1编码DX-IgG1轻链的鼠可变区和人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2编码DX-IgG1重链的鼠可变区和人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3编码IgG1轻链的人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4编码IgG1重链的人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5-19编码用于通过聚合酶链反应(PCR)合成Dx-IgG1的鼠轻链可变区的15个重叠的寡核苷酸。

SEQ ID NO：20-23编码用于连接DX-IgG1鼠轻链可变区与人轻链恒定区的4个寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：24-40编码用于通过PCR合成DX-IgG1的鼠重链可变区的17个重叠的寡核苷酸。

SEQ ID NO：41-44编码用于连接DX-IgG1鼠重链可变区与人重链恒定区的4个寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：45编码的核苷酸序列编码具有N-末端EcoRI位点的Kar2(Bip)信号序列。

SEQ ID NO：46-49编码用于连接Kar2信号序列与DX-IgG1的轻链和重链的4个寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：50编码相应于JC-IgG1轻链的鼠IgG1可变区的核苷酸序列(GenBank#AF013576)。

SEQ ID NO：51编码相应于JC-IgG1重链的鼠IgG1可变区的核苷酸序列(GenBank#AF013577)。

SEQ ID NO：52-63编码用于PCR合成JC-IgG1的鼠轻链可变区的12个重叠的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO：64-75编码用于PCR合成JC-IgG1的鼠重链Fab片段的12个重叠的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO：76-87编码用于PCR合成JC-IgG1的鼠重链Fc片段的12个重叠的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO：88编码相应于Fc片段的3’末端的3′Kpnl引物。

SEQ ID NO：89编码人血清白蛋白(HSA)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：90编码用于本发明的凝血酶裂解的核苷酸序列。

发明详述

除非本文另有定义，本发明相关使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行。通常，与本文记载相关使用的命名，以及本文记载的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交技术是本领域中众所周知的而且普遍使用的。除非另有说明，本发明的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更为具体的参考文献中所记载的常规方法进行。参见例如Sambrook et al.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992，以及2002增刊)；Harlowand Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor andDrickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Seetion A Proteins，VolI，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6^th Edition，2004，Garland Publishing，New York)。

本文所提及的所有出版物、专利和其它参考文献均被引入作为参考。

除非另有说明，下列术语应被理解成具有以下含义：

如本文使用的，术语“N-聚糖”、“聚糖”和“糖形”可以互换使用，是指N-连接的寡糖，例如，通过与蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基而连接的寡糖。糖蛋白上占优势的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(如N-乙酰-神经氨酸(NANA))。糖基团加工在ER腔共翻译地发生，且在高尔基体中继续而成为N-连接的糖蛋白。

N-聚糖含有共同的Man₃GlcNAc₂五糖核心(“Man”表示甘露糖；“Glc”表示葡萄糖；而“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)。N-聚糖的差别在于包含添加至MaB₃GlcNAc₂(“Man3”)核心结构的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角)数目不同，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。N-聚糖可根据其分支的组分进行分类(例如，高甘露糖、复合或杂合)。“高甘露糖”型N-聚糖含有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常含有至少一个与1，3甘露糖臂附着的GlcNAc和至少一个与“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂附着的GlcNAc。复合N-聚糖还可含有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，所述残基任选地被唾液酸或衍生物(如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸而“Ac”是指乙酰基)修饰。复合N-聚糖还可含有包含“二等分(bisecting)”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖还可含有在“三甘露糖核心”上多个触角，其通常被称为“多触角性聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端至少有一个GlcNAc，且在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上有零个或多个甘露糖。多种聚糖也可以称作“糖形”。

本文所使用的缩写具有本领域通用的用法，参见例如，上述糖的缩写。其它通用的缩写法包括“PNG酶(PNGase)”，或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”，其表示肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合聚合物)是指基本与其它细胞成分分离的核酸或多核苷酸，其它细胞成分是在天然宿主细胞中与天然多核苷酸天然伴随的那些成分，例如与所述核酸天然结合的核糖体、聚合酶和基因组序列。该术语包括如下核酸或多核苷酸，所述核酸或多核苷酸(1)已从其天然存在的环境中取出，(2)与多核苷酸的全部或部分不结合，在自然界中从该多核苷酸发现“分离的多核苷酸”，(3)可操作地连接于其天然不相连接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。术语“分离的”或“基本上纯的”还用于是指重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或异源系统生物合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不一定要求如此所述的核酸或多核苷酸本身从其自然环境中物理地取出。例如，如果异源序列置于内源核酸序列的附近，使得该内源核酸序列的表达改变，则生物体基因组中的该内源核酸序列在此认为是“分离的”。在这里，异源序列为不天然接近该内源核酸序列的序列，而不管该异源序列本身是否是内源的(源于相同的宿主细胞或其子代)或外源的(源于不同的宿主细胞或其子代)。举例来说，启动子序列可用于代替(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中天然的基因启动子，使得该基因具有改变的表达模式。该基因目前将成为“分离的”，因为其与天然位于其侧翼的至少一些序列分离开。

如果核酸包含基因组中相应核酸并不天然存在的任何修饰，则其也认为是“分离的”。例如，如果内源的编码序列包含人工，例如通过人为干预引入的插入、缺失或点突变，则其认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源部位整合入宿主细胞染色体的核酸以及作为附加体存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”可基本上无其他的细胞材料，或当通过重组技术产生时基本上无培养基，或当化学合成时基本上无化学前体或其他化学试剂。

如此处所用的，参照核酸序列的“简并变体”包括可根据标准遗传密码翻译而提供与翻译自参照核酸序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能与靶核酸序列杂交的寡核苷酸，其不一定在序列上相同但在一个或多个特定的片段内相互是同源的。

在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性的百分比”或“同一的”指两个序列中的残基当用于最大对应比对时是相同的。序列同一性比较的长度可超过至少约九个核苷酸，通常至少约20个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸，并且优选至少约36或更多核苷酸的范围。本领域有许多已知可用于测量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，多核苷酸序列可利用FASTA、Gap或Bestfit比较，其为Wisconsin PackageVersion 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。FASTA提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对以及序列同一性百分比。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(在此通过引用整体引入)。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可利用FASTA以缺省参数(字长为6以及计分矩阵的NOPAM因数)或利用Gap以GCG Version 6.1提供的缺省参数确定，在此引入作为参考。或者，序列可利用计算机程序，BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul等.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7：649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul 等.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))比较。

如上所述，当指核酸或其片段时，术语“显著的同源性”或“显著的相似性”表明，当与另一个核酸(或其互补链)以适当的核苷酸插入或缺失而最佳比对时，如通过任何熟知的序列同一性算法测量的，如FASTA、BLAST或Gap，存在核苷酸碱基的至少约50％、更优选核苷酸碱基的60％、通常至少约70％、更通常至少约80％、优选至少约90％以及更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性。

或者，当核酸或其片段在严格杂交条件下杂交与另一核酸、另一核酸的链，或其互补链杂交时，存在显著的同源性或相似性。核酸杂交实验上下文中的“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”取决于许多不同的物理参数。如本领域技术人员很容易理解的，核酸杂交将受以下条件如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区域的长度以及杂交核酸之间错配核苷酸碱基的数目的影响。本领域普通技术人员知道如何变化这些参数以实现特定的杂交严格度。

通常，“严格杂交”在特定的条件设置下，在比具体DNA杂交物的热解链温度(Tm)低约25℃时进行。“严格洗涤”在特定的条件设置下，在比具体DNA杂交物Tm低约5℃的温度进行。Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。参见Sambrook等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，page 9.51，在此引入作为参考。对于此处的目的，液相杂交的“严格条件”定义为在6X SSC(其中20X SSC包含3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)，1％SDS中，在65℃ 8-12小时的水相杂交(即无甲酰胺)，随后为0.2XSSC，0.1％SDS中65℃20分钟两次洗涤。技术工作者将理解取决于许多因数包括杂交序列的长度和同一性百分比，在65℃将存在不同速率的杂交。

术语“突变的”当应用于核酸序列时指相比参照核酸序列，可插入、缺失或改变核酸序列中的核苷酸。在一个位点可产生单个改变(点突变)或在单个位点可插入、缺失或改变多个核苷酸。此外，可在核酸序列内的任何数目的位点产生一个或多个改变。核酸序列可通过本领域已知的任何方法突变，包括但不限于诱变技术如“易错PCR”(用于在其中DNA聚合酶的复制保真度较低，使得顺着PCR产物的全长获得高比率的点突变的条件下进行PCR的方法；参见例如.，Leung等，Technique，1：11-15(1989)和Caldwell and Joyce，PCR MethodsApplic.2：28-33(1992))；以及“定位于寡核苷酸的诱变”(能在任何克隆的目的DNA片段中产生位点特异性突变的方法；参见例如，Reidhaar-Olson and Sauer，Science 241：53-57(1988))。

如此处所用的术语“载体”用来指能转运与之连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，指另外的DNA片段可以连接进入其中的环状双链DNA环。其他的载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。载体的另一种类型为病毒载体，其中另外的DNA片段可连接进入该病毒基因组(下文更详细地论述)。某些载体能在它所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他的载体可在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组中，并且由此随着宿主基因组一起重复。此外，某些优选的载体能指导与之可操作连接的基因的表达。所述载体此处称为“重组表达载体”(或简单地称为“表达载体”)。

如此处所用的，术语“目的序列”或“目的基因”指核酸序列，一般编码通常不在宿主细胞中产生的蛋白质。此处公开的方法允许一个或多个目的序列或目的基因稳定整合入宿主细胞基因组中。目的序列的非-限制性例子包括编码具有酶活性的一种或多种多肽的序列，例如影响N-聚糖在宿主中合成的酶如甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、UDP-N-乙酰半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶、以及岩藻糖基转移酶。

术语“标记序列”或“标记基因”是指能够表达允许对宿主细胞内序列的存在或不存在进行阳性或阴性选择的活性的核酸序列。例如，巴斯德毕赤氏酵母URA5基因是一种标记基因，因为可以通过含有该基因的细胞在不存在尿嘧啶的条件下生长的能力进行选择。也可以通过含有该基因的细胞不能在5-FOA存在下生长而选择其存在。标记序列或基因不一定需要同时表现阳性和阴性选择性。来自巴斯德毕赤氏酵母的标记序列或基因的非限定性实例包括ADE1，ARG4，HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，常采用卡那霉素、新霉素、庆大霉素(或G418)、巴龙霉素和潮霉素抗性基因，以便允许在这些抗生素存在下生长。

“可操作连接的”表达调控序列指其中表达调控序列与目的基因相是相邻的，以控制目的基因的连接，以及以反式或在一定的距离内作用而控制目的基因的表达调控序列。

如此处所用的术语“表达调控序列”指影响与之可操作连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达调控序列为控制核酸序列转录、转录后事件以及翻译的序列。表达调控序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。所述调控序列的性质因宿主生物体而不同；原核生物中，所述调控序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“调控序列”用来包括，至少其存在是用于表达必不可少的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

如此处所用的，术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简单地称“宿主细胞”)用来指其中已导入重组载体的细胞。应该理解的是所述术语不仅用来指特定的主题细胞而且指所述细胞的子代。因为由于突变或者环境影响而造成某些修饰可能在继代中存在，实际上所述子代可能不同于亲本细胞，但仍然包括在如此处所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或培养基中生长的细胞系或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。

术语“真核”是指具核的细胞或生物，包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。

术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、领鞭毛虫(collar-flagellates)、微孢子虫、alveolates(例如，甲藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(rhodophyta)(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、藓类)以及其它原生生物。酵母和真菌包括，但不限于：毕赤氏酵母属物种，如巴斯德毕赤氏酵母、Pichiafinlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichiakoclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、柳毕赤氏酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)和甲醇毕赤氏酵母；糖酵母属物种，如啤酒糖酵母；多形汉逊氏酵母、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces sp.)，如乳克鲁维氏酵母；白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种(Fusarium sp.)，如禾赤镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙链孢霉。

如此处所用的术语“肽”指短的多肽，例如通常小于约50个氨基酸长并且更通常小于约30个氨基酸长的多肽。如此处所用的术语包括模拟结构并且因此具有生物学功能的类似物和模拟物。

术语“多肽”包括天然-存在的和非-天然存在的蛋白质，以及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或多聚体的。此外，多肽可包括许多不同的结构域，每个具有一种或多种不同的活性。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”为根据其来源或衍生来源的蛋白质或多肽，其(1)与在天然状态下伴随其的天然缔合的组分不相缔合，(2)以自然界未发现的纯度存在，其中可根据其他细胞材料的存在判定纯度(例如，无来自相同种的其他蛋白质)(3)通过来自不同种的细胞表达，或(4)自然界不存在(例如，其为自然界中发现的多肽的片段或其包括自然界中未发现的氨基酸类似物或衍生物或不是标准肽键的连接)。因此，化学合成的或在不同于多肽天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然缔合组分相“分离的”。利用本领域熟知的蛋白质纯化技术，还可通过分离使多肽或蛋白质基本上无天然缔合组分。如由此定义的，“分离的”不一定要求如此描述的该蛋白质、多肽、肽或寡肽已从其天然环境中物理取出。

如此处所用的术语“多肽片段”指具有缺失，例如相比全长多肽具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在一优选的实施方案中，该多肽片段为其中该片段的氨基酸序列与天然存在序列的相应位点相同的连续序列。片段通常至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，更优选至少25、30、35、40或45个氨基酸，甚至更优选至少50或60个氨基酸长，并且甚至更优选至少70个氨基酸长。

“修饰的衍生物”指多肽或其片段，其一级结构序列基本上同源但其包括例如，体内或体外的化学和生化修饰或其掺入天然多肽中未发现的氨基酸。如本领域技术人员很容易理解的，所述修饰包括例如，乙酰化、羧基化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、标记，例如用放射性核素标记，以及各种酶促修饰。用于标记多肽的各种方法以及可用于所述目的的取代基或标记物为本领域所熟知，并且包括放射性同位素如¹²⁵I、³²P、³⁵S和³H、结合被标记抗配体的配体(例如，抗体)、荧光团、化学发光剂、酶以及可用作被标记配体的特异性结合对成员的抗配体。标记物的选择取决于所需要的灵敏度、与引物结合的容易度、稳定性要求和可得到的设备。用于标记多肽的方法为本领域所熟知。参见，例如，Ausubel等.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992和2002的增刊)(在此引入作为参考)。

术语“融合蛋白”指包括偶联至异种氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白由于其可被构建而包含来自两种或更多不同的蛋白质的两种或更多所需的功能元件而是有用的。融合蛋白包括来自目的多肽的至少10个连续的氨基酸，更优选至少20或30个氨基酸，甚至更优选至少40、50或60个氨基酸，而更优选至少75、100或125个氨基酸。包括本发明蛋白质整体的融合蛋白具有特定的功用。包括在本发明融合蛋白内的异种多肽为至少6个氨基酸长度，常常至少8个氨基酸长度，并且有用地至少15、20和25个氨基酸长度。包括更大多肽如免疫球蛋白Fc片段，或者免疫球蛋白Fab片段，或甚至整个蛋白，如绿色荧光蛋白(“GFP”)生色团的蛋白或全长免疫球蛋白的融合体具有特定功用。融合蛋白可通过将编码多肽或其片段的核酸序列与编码不同蛋白质或肽的核酸序列构建在读框内并且随后表达该融合蛋白而重组产生。或者，融合蛋白可通过将多肽或其片段交联至另一种蛋白质而以化学方法产生。

此处使用的术语“抗体”、“免疫球蛋白”、“Ig”和“Ig分子”可以互换使用。每个抗体分子具有独特结构，使其能够与其特异性抗原结合，但如此处描述，所有抗体/免疫球蛋白具有相同的总体结构。已知基本的抗体结构单位包括亚基的四聚体。每个四聚体具有相同的两对多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责识别抗原。每条链的羧基端部分确定恒定区，其主要负责效应物功能。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并且分别限定抗体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。轻链和重链细分为可变区和恒定区(通常参见FundamentalImmunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(在此引入作为参考)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体外，两个结合位点是相同的。所述链均表现出由三个高变区，也称作互补决定区或CDRs连接的相对保守的构架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDRs是通过构架区排列的，使得能够与特异性表位结合。该术语包括天然存在的形式，以及片段和衍生物。该术语的范围还包括各类Igs，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。IgGs的亚型也包括在该术语的范围内，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。以最宽的含义使用该术语，并且包括单个的单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和结合于多个表位或抗原的抗体组合物。该术语特别地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们包括或经过修饰而包括重链免疫球蛋白恒定区的C_H2结构域的至少一部分，所述恒定区包含C_H2结构域的N-连接的糖基化位点或其变体。该术语包括含有Fc区的分子，如免疫粘附素(美国专利申请No.2004/0136986)、融合体和抗体样分子。或者，这些术语可以称作至少具有至少含有N-连接的糖基化位点的Fab区的抗体片段。

术语“Fc”片段是指含有C_H2和C_H3结构域的抗体的“片段定型的”C端区(图1)。术语“Fab”是指含有VH、CH1、VL和CL结构域的抗体的“片段抗原结合”区(图1)。

此处使用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指获自基本同质的抗体群的抗体，即，构成群体的各个抗体是相同的，只是可能小量存在天然突变。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原性位点。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每个mAb针对抗原上的单个决定簇。除了特异性，单克隆抗体的有利之处在于可以通过杂交瘤培养合成它们，不受到其它免疫球蛋白的污染。术语“单克隆”表明的抗体特征是获自基本同质的抗体群，并且不应该解释为需要通过任何特殊方法生产抗体。例如，可以通过首先由Kohler et al，(1975)Nature，256：495描述的杂交瘤法或可以通过重组DNA法(参见例如Cabilly等的美国专利No.4,816,567)制备用于本发明的单克隆抗体。

此处的单克隆抗体包括杂合和重组抗体，它们是通过以下方法制备的：将抗体的可变(包括高变)区与恒定区(如“人源化”抗体)，或轻链与重链，或来自一个物种的链与来自另一个物种的链剪接在一起，或与异源蛋白融合，而不论来源的物种或免疫球蛋白类或亚类名称是什么(参见Cabilly等的美国专利No.4,816,567，Mage andLamoyi，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。此处的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于第一物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于不同物种或属于不同抗体类或亚类的抗体以及所述抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们含有或经过修饰而含有至少一个C_H2。非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有来源于人免疫球蛋白的序列。抗体的Fv片段是抗体的保留了完整分子的结合特征和特异性的最小单位。Fv片段是抗体重链和轻链的可变区的非共价缔合的异二聚体。F(ab)′₂片段是含有由二硫桥连接的Fab片段的两个臂的片段。

人源化抗体的最常见形式是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的具有需要的特异性、亲和力和容量的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体，也不存在于输入的CDR或构架序列中的残基。进行了这些修饰，以进一步调整抗体性能，并使其最大化。概言之，人源化抗体将基本包含至少一个，一般是两个可变区的全部，其中所有或基本所有的CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本所有的CDR区是人免疫球蛋白共有序列的CDR区。人源化抗体优选也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型是人免疫球蛋白的该部分。进一步的细节参见Jones et al，1986，Nature 321：522-524；Reichmann et al，1988，Nature 332：323-327，和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

在术语抗体或免疫球蛋白范围内的“片段”包括通过多种蛋白酶消化产生的那些，通过化学裂解和/或化学解离产生的那些，和重组产生的那些，只要片段保持能够特异性结合于靶分子。这些片段包括Fc、Fab、Fab′、Fv、F(ab′)₂和单链Fv(scFv)片段。

本发明的抗体的感兴趣的靶包括生长因子受体(如FGFR，PDGFR，EGFR，NGFR和VEGF)及其配体。其它靶是G蛋白受体，并且包括K物质受体、血管紧张素受体、α-和β-肾上腺素能受体、5-羟色胺受体和PAF受体。参见，例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56：625-649(1987)。其它靶包括离子通道(如钙、钠、钾通道)、毒草碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体和多巴胺受体(参见Harpold，U.S.5,401,629和U.S.5,436,128)。其它靶是粘附蛋白如整联蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白超家族成员(参见Springer，Nature346：425-433(1990)。Osborn，Cell 62：3(1990)；Hynes，Cell 69：11(1992))。其它靶是细胞因子，如白介素IL-1-IL-13、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、肿瘤生长因子β(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GMCSF)。参见HumanCytokines：Handbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，Blackwell Scientific，Boston，MA 1991)。其它靶是激素、酶和细胞内和细胞间信使，如腺苷酸环化酶、鸟氨酸环化酶和磷脂酶C。感兴趣的其它靶是白细胞抗原，如CD20和CD33。药物也可以是感兴趣的靶。靶分子可以是人、哺乳动物或细菌分子。其它靶是抗原，如来自微生物病原体(病毒和细菌)的蛋白、糖蛋白和碳水化合物，以及肿瘤。其它靶描述于U.S.4,366,241。

此处讨论的免疫Fc受体可以包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcRn(新生受体)。术语FcγRI可以指任何FcγRI亚型，除非指出相反的意思。术语FcγRII可以指任何FcγRII亚型，除非指出相反的意思。术语FcγRIII可以指任何FcγRIII亚型，除非指出相反的意思。

在该术语范围内的衍生物包括在序列上已被修饰，但仍然能特异性结合靶分子的抗体(或其片段)，包括：种间嵌合的和人源化的抗体；抗体融合物；异聚抗体复合物和抗体融合物，如双抗体(双特异性抗体)、单链双抗体和内体(参见，例如.，Intracellular Antibodies：Research and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-VerlagNew York，Inc.，1998)，在此引入其公开内容作为参考)。

术语“非-肽类似物”指具有类似于参照多肽性质的化合物。非-肽化合物还可称为“肽模拟物”或“模拟肽”。参见，例如.，Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries：A Handbook，John Wiley(1997)；Bodanszky等.，Peptide Chemistry--A PracticalTextbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic Peptides：A Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans等.，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8：392-396(1985)；以及其中引用的参考文献，在此引入作为参考。所述化合物常常借助于计算机分子建模开发。结构类似于本发明有用的肽的肽模拟物可用于产生同等的作用并且因此属于本发明。

氨基酸取代可包括那些，其：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变结合亲和力而用于形成蛋白质复合物，(4)改变结合亲和力或酶活性，以及(5)给予或改进所述类似物的其他物理化学的或功能性的性质。

如此处所用的，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2^nd ed.1991)，在此引入其作为参考。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸以及其他的非常规氨基酸也可以为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基精氨酸以及其他的类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在此处所用的多肽注释中，根据标准用法和惯例，左手端对应氨基端而右手端对应羧基端。

如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二种蛋白质的核酸序列类似的序列，则该蛋白质与第二种蛋白质具有“同源性”或与之“同源”。或者，如果两种蛋白质具有“类似的”氨基酸序列，则一种蛋白质与第二种蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白质”定义指两种蛋白质具有类似的氨基酸序列。)在一种优选的实施方案中，同源蛋白质与野生型蛋白质具有至少65％的序列同源性，更优选至少70％的序列同源性。甚至更优选的为与野生型蛋白质具有至少75％、80％、85％或90％序列同源性的同源蛋白质。在又一个更优选的实施方案中，同源蛋白质具有至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。如此处所用的，两个氨基酸序列区域之间的同源性(尤其关于预测的结构相似性)解释为暗示功能的相似性。

当“同源”用于指蛋白质或肽时，公认的是不相同的残基位点常常以保守的氨基酸取代而不同。“保守的氨基酸取代”为其中氨基酸残基由具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)侧链(R基团)的另一种氨基酸残基取代的取代。通常，保守的氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能性质。如果两个或更多氨基酸序列彼此通过保守取代而不同，可调高序列同一性的百分比或同源性程度以修正保守的取代性质。用于进行该调节的方法为本领域技术人员所熟知。参见，例如.，Pearson，1994，Methods Mol.Biol.24：307-31 and 25：365-89(在此引入作为参考)。

下列六组每组包含彼此为保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，也称为序列同一性百分比，通常利用序列分析软件测量。参见，例如，Genetics Computer Group(GCG)的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，910University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白质分析软件利用指定至各种取代、缺失和其他修饰，包括保守氨基酸取代的同源性测量而匹配相似的序列。例如，GCG包含如“Gap”和“Bestfit”的程序，其以缺省参数使用以确定紧密相关的多肽之间，如来自不同生物体种类的同源多肽或野生型蛋白质和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如.，GCG Version 6.1。

当将特定的多肽序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库比较时优选的算法为计算机程序BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul 等.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7：649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。

用于BLASTp的优选的参数为：期望值：10(缺省)；过滤器：seg(缺省)；开放间隙的成本：11(缺省)；延长间隙的成本：1(缺省)；最大对比：100(缺省)；字长：11(缺省)；描述的编号：100(缺省)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

比较同源性的多肽序列长度通常为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，一般至少约28个残基，并且优选超过约35个残基。当搜索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。利用氨基酸序列搜索数据库可通过本领域已知的blastp以外的算法测量。例如，多肽序列可利用FASTA比较，GCG Version 6.1中的程序。FASTA提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。Pearson，MethodsEnzymol.183：63-98(1990)(在此引入其作为参考).例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可利用如GCG Version 6.1提供的FASTA以缺省参数(字长为2以及PAM250计分矩阵)确定，在此引入其作为参考。

“特异性结合”指两种分子先于结合环境中其他的分子而相互结合的能力。一般，“特异性结合”与反应中偶发的结合的区别是至少两倍，更通常至少10倍，常常至少100倍。通常，如通过解离常数定量的，特异性结合反应的亲和力或亲合力为约10^-7M或更强(例如，约10^-8M，10^-9M或甚至更强)。

如此处所用的术语“区域”指生物分子一级结构的物理上连续的部分。在蛋白质的情况下，区域定义为蛋白质氨基酸序列的连续部分。

如此处所用的术语“结构域”指对生物分子已知或怀疑的功能有贡献的生物分子的结构。结构域可以是与区域或其部分具有共同范围；也可包括生物分子不同的、非-连续的区域。

如此处所用的，术语“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂类等等，并且所述化合物可以为天然的或合成的。

此处用到的术语“包括”或其变化形式如“包含”将理解为暗示包含所述的整数或整数组而不是排除任何其他的整数或整数组。

此处用到的术语“基本由...组成”将理解为暗示包含所述的整数或整数组；而排除修饰或将实质上影响或改变所述的整数的其它整数。对于N-聚糖物质，术语“基本由所述的N-聚糖组成”将理解为包含该N-聚糖，而无论该N-聚糖在直接连接于糖蛋白的天冬酰胺残基的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上是否岩藻糖基化。

此处用到的术语“占优势”或变化形式，如“占优势的”，将理解为表示在用PNG酶处理糖蛋白并且通过质谱法例如MALDI-TOFMS分析释放的聚糖后具有总N-聚糖的最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。也就是说，术语“占优势”定义为各个实体，如特定糖形，以比任何其它实体高的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔百分比的种类A、35摩尔百分比的种类B和25摩尔百分比的种类C组成，该组合物包含占优势的种类A，种类B是其次占优势的物质。

此处用到的术语“基本不含”特定糖残基，如岩藻糖或半乳糖等，用于表示糖蛋白组合物基本不含包括所述残基的N-聚糖。以纯度形式表示，基本不含表示N-聚糖结构含有所述糖残基的量不超过10％，优选低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.5％，其中百分比是重量百分比或摩尔百分比。因此，本发明的糖蛋白组合物中的基本所有N-聚糖结构都不含岩藻糖或半乳糖，或这两者。

当任何时候N-聚糖结构上不存在可检测量的特定糖残基时，此处用到的糖蛋白组合物“缺乏”所述糖残基，如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选实施方案中，糖蛋白组合物是由上文定义的低等真核生物，包括酵母(如毕赤氏酵母属物种；啤酒糖酵母属物种；克鲁维氏酵母属物种；曲霉属物种)生产的，并且将“缺乏岩藻糖”，因为这些生物的细胞不具有产生岩藻糖基化的N-聚糖结构所需的酶。因此，术语“基本不含岩藻糖”包括术语“缺乏岩藻糖”。但是，即使组合物在一个时间含有岩藻糖基化的N-聚糖结构或含有上文所述有限的、但可检测量的岩藻糖基化的N-聚糖结构，组合物也可以是“基本不含岩藻糖”。

此处用到的术语“结合活性增加”可以与“结合亲和力增加”互换使用，表示IgG分子与受体或其它指出的分子的结合增加。

此处用到的术语“结合活性减少”可以与“结合亲和力减少”互换使用，表示IgG分子与受体或其它指出的分子的结合减少。

此处用到的术语“吞噬作用”定义为免疫复合物的清除。吞噬作用是免疫细胞，包括但不限于巨噬细胞和中性粒细胞的免疫学活性。

抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用和多种应答，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)、免疫复合物的清除(吞噬作用)、B细胞的抗体产生和IgG血清半衰期在以下文献中分别定义：Daeron et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234；Ward and Ghetie，1995，TherapeuticImmunol.2：77-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13：339-345；Heyman，2003，Immunol.Lett.88：157-161；和Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9：121-125。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。以下描述了示例性方法和材料，尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施本发明并且它们对于本领域技术人员而言是显而易见的。本文所述的所有出版物和其它参考文件均全文引入作为参考。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。材料、方法和实施例仅为例举说明而并非意在限制。

重组Ig-GlcNAcMan₅GlcNAc₂分子

本发明提供了包含糖基化Igs群体的组合物，所述Igs具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-连接的糖形。本发明也提供了具有占优势的、介导抗体效应物功能，如受体结合的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-连接的糖形的Igs和Ig组合物。优选地，本发明的Ig和FcγRIII受体之间的相互作用提供了直接结合活性的增加。并且，优选地，本发明的Ig和FcγRIIb受体之间的相互作用提供了直接结合活性的减少(或缺乏)。在另一种实施方案中，本发明的Ig或Ig组合物表现出结合活性增加，这是由糖形结构的富集/占优势而赋予的。本发明的突出特征是它提供了具有占优势的、介导抗体效应物功能的特定糖形的Igs和Ig组合物，所述效应物功能例如ADCC活性增加或B细胞产生抗体增加。在另一种实施方案中，本发明的Ig或Ig组合物表现出ADCC活性增加或B细胞产生抗体增加，这是通过一种糖形的富集/占优势而赋予的。此外，本领域技术人员容易理解，产生具有占优势的糖形的Ig组合物的一个优点是它避免了产生具有不利糖形的Igs和/或产生可能诱导不利作用和/或稀释更有效的Ig糖形浓度的Igs。因此，考虑包含具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的Igs的药物组合物将具有有益的特征，包括但不限于减少与FcγRIIb的结合，和增加与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合，因此在更低的剂量将是有效的，因此具有更高的效力/效能。

在一种实施方案中，本发明的Ig分子在Ig分子中的介导抗体效应物功能的Fc区上的重链的C_H2结构域的Asn-297上包含至少一种GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构。优选地，GlcNAcMan₅GlcNAc₂结构位于二聚化Ig的每个CH2区的每个Asn-297上(图1)。在另一种实施方案中，本发明提供了包含Igs的组合物，所述Igs占优势地由基本上由Asn-297上的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构组成的N-聚糖糖基化(图1)。或者，可以将一个或多个存在于Ig分子上的碳水化合物部分缺失和/或添加到分子上，由此添加或减少Ig上的糖基化位点数。此外，Ig分子的C_H2区域内的N-连接的糖基化位点的位置可以通过在分子内的不同位置导入天冬酰胺(Asn)或N-糖基化位点而改变。尽管Asn-297是通常存在于鼠和人IgG分子中的N-糖基化位点(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991)，但该位点不是可以预见的唯一位点，该位点也不一定是行使功能所必须保留的。采用公知的诱变方法，技术人员可以改变编码本发明的Ig的DNA分子，使得Asn-297上的N-糖基化位点缺失，并且可以进一步改变DNA分子，使得在Ig分子内的其它位置可以建立一个或多个N-糖基化位点。优选的是在Ig分子的C_H2区域内建立N-糖基化位点。但是，在30％的血清抗体中描述了Ig的Fab区的糖基化-通常在Asn-75(Rademacher et al，1986，Biochem.Soc.Symp.，51：131-148)。Ig分子的Fab区内的糖基化是一个额外位点，可以与Fc区内的N-糖基化组合在一起或是单独的。

在一种实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多至少约5摩尔百分比的水平存在。在一种优选实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多至少约10摩尔-约25摩尔百分比的水平存在。在一种更优选的实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多至少约25摩尔-约50摩尔百分比的水平存在。在一种优选实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多约50摩尔百分比以上的水平存在。在另一种优选实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多约75摩尔百分比以上的水平存在。在另一种优选实施方案中，本发明提供了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构以比重组Ig组合物中其次占优势的聚糖结构多约90摩尔百分比以上的水平存在。具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖(55.8％)的JC-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析示于图4A。具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖(60％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析示于图4B。

Ig-GlcNAcMan₅GlcNAc₂与FcγRIII受体的结合增加

Ig与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合的效应物功能，如激活ADCC，是由Ig分子的Fc区介导的。不同功能是由该区域中的不同结构域介导的。因此，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区中具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖，它能够行使效应物功能。在一种实施方案中，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的Fc区赋予了与FcγRIIIa(图6)和FcγRIIIb(图5)受体结合的增加。在另一种实施方案中，Fc具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖。技术人员容易理解，包含Fc区的分子，如免疫粘附素(Chamowand Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenazi andChamow，1997，Curr Opin.Immunol 9：195-200)、Fc融合蛋白和抗体样分子也包含在本发明中。

可以测定Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和力)。FcγRIII与IgG的结合测定的一个实例描述于实施例6。本领域技术人员理解，该测定可以容易地适于与任何免疫球蛋白分子的测定联合使用。

如图5A所示，与Rituximab相比，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的JC-IgG(根据本发明制备的一种Ig)与FcγRIIIb的结合活性增加了10倍，如图6所示，与FcγRIIIa的结合活性增加了10倍以上。如图5B所示，与Rituximab相比，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(根据本发明制备的另一种Ig)与FcγRIIIb的结合活性增加了约100倍。

最引人注意的是，FcγRIIIa基因二态性产生了两种同种型：FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall′Ozzo et al，2004，Cancer Res.64：4664-4669)。对于FcγRIIIa-158V纯合的基因型与对Rituximab的较高临床反应相关(Cartron et aL.，2002，Blood，99：754-758)。但是，大多数人群只携带一个FcγRIIIa-158F等位基因，使得Rituximab对于大多数人群通过FcγRIIIa结合诱导ADCC来说效率是较低的。但是，当Rituximab样抗CD20抗体在缺乏岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中表达时，该抗体对于通过FcγRIIIa-158F和FcγRIIIa-158V增强ADCC是同样有效的(Niwa et al.，2004，Clin.CaneRes.10：6248-6255)。本发明某些优选实施方案的抗体在不在N-聚糖上添加岩藻糖的宿主细胞中表达(如巴斯德毕赤氏酵母，即一种缺乏岩藻糖的酵母宿主；参见实施例1和2)。因此，考虑本发明的缺乏岩藻糖、并且与FcγRIIIa-158F的结合增强的抗体可能对于治疗很多表现出对Rituximab的反应减少的患者是特别有用的。

Ig-GlcNAcMan₅GlcNAc₂与FcγRIIb受体的结合减少

Ig与FcγRIIb结合的效应物功能，如B细胞产生抗体增加和ADCC活性增加，是由Ig分子的Fc区介导的。不同功能是由该区域中的不同结构域介导的。因此，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区中具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖，它能够行使效应物功能。在一种实施方案中，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的Ig的Fc区赋予了与FcγRIIb受体的结合减少。技术人员容易理解，包含Fc区的分子，如免疫粘附素(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr Opin.Immunol 9：195-200)、Fc融合蛋白和抗体样分子也包含在本发明中。

可以测定Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和力)。FcγRIIb与IgG1的结合测定的一个实例描述于实施例6。本领域技术人员理解，该测定可以容易地适于与任何免疫球蛋白分子的测定联合使用。

如图7A所示，与Rituximab相比，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的JC-IgG(本发明的一种Ig)与FcγRIIb的结合活性减少了大约8倍。如图7B所示，与Rituximab相比，具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(本发明的另一种Ig)与FcγRIIb的结合活性减少了约2-5倍。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性增加

在另一种实施方案中，FcγRIIIa或FcγRIIIb与具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为占优势的N-聚糖的Ig分子或组合物可以赋予FcγRIII介导的ADCC的增加。已经充分证明，FcγRIII(CD 16)受体负责ADCC活性(Daeron et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。在另一种实施方案中，具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为占优势的N-聚糖的Ig分子或组合物与FcγRIIb的结合减少，赋予了ADCC的增加(Clynes et al.，2000，supra)。在另一种实施方案中，本发明的Ig分子或组合物表现出ADCC活性增加，这是通过占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂的存在赋予的。

测量B细胞消耗的测定的一个实例和荧光释放ADCC测定公开于实施例7。本领域技术人员可以理解，这些公开的测定可以容易地适于与任何Ig分子的测定联合使用。此外，动物模型中的体内ADCC测定可以适合于任何特异性IgG，参见Borchmann et al，2003，Blood，102：3737-3742，Niwa et aL.，2004，Cancer Researeh，64：2127-2133和实施例7。

B细胞产生抗体增加

已经证明了抗体通过调节性FcγR途径抗肿瘤(Clynes et al，2000，Nature，6：443-446)。具体地，已知当FcγRIIb与含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的受体如B细胞受体(BCR)、FcγRI、FcγRIII和FcεRI共交联时，它抑制ITAM介导的信号(Vivierand Daeron，1997，Immunol.Today，18：286-291)。例如，FcgRII特异性抗体的添加阻断Fc与FcgRIIB的结合，导致B细胞增殖增加(Wagle et al，1999，J of Immunol 162：2732-2740)。因此，在一种实施方案中，本发明的Ig分子可以介导FcγRIIb受体结合的减少，导致B细胞的激活，其随后催化浆细胞产生抗体(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11：331-360)。测量B细胞产生抗体IgG1的测定的一个实例描述于实施例6。本领域技术人员可以理解，该测定可以容易地适于与任何免疫球蛋白分子的测定联合使用。

其它免疫学活性

已经表明中性粒细胞上效应细胞分子的表面表达改变，增加了对细菌感染的易感性(Ohsaka et al，1997，Br.J.Haematol.98：108-113)。进一步证明了IgG与FcγRIIIa效应细胞受体的结合调节了肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达(Blom.Et al，2004，Arthritis Rheum.，48：1002-1014)。此外，FcγR诱导的TNF-α也增加中性粒细胞结合和吞噬IgG包被的红细胞的能力(Capsoni et al，1991，J.Clin.Lab Immunol.34：115-124)。因此，认为本发明的表现出与FcγRIII的结合增加的Ig分子和组合物可以赋予TNF-α表达的增加。

已经证明FcγRIII受体活性的增加溶酶体β-葡糖苷酸酶和其它溶酶体酶的分泌(Kavai et al，1982，Adv.Exp Med.Biol.141：575-582；Ward和Ghetie，1995，Therapeutic Immunol，2：77-94)。此外，免疫受体被它们的配体占据的一个重要步骤是它们的内化和送递到溶酶体(Bonnerot et al，1998，EMBO J.，17：4906-4916)。因此，认为本发明的表现出与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合增加的Ig分子或组合物可以赋予溶酶体酶分泌的增加。

FcγRIIIb仅仅存在于中性粒细胞上，它在免疫复合物的组装中起主要作用，并且它的聚集激活吞噬作用、脱颗粒和呼吸爆发，导致被调理的病原体的破坏。中性粒细胞的激活导致相应于受体两个细胞外结构域的受体的蛋白水解裂解的可溶形式的分泌。可溶FcγRIIIb通过FcγR依赖性效应物功能的竞争性抑制并通过与补体受体CR3的结合施加调节功能，导致炎症介质的产生(Sautes-Fridman et al，2003，ASHI Quarterly，148-151)。

因此，本发明提供了包含基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成的N-聚糖的免疫球蛋白分子；并且提供了包含免疫球蛋白和多个与其连接的N-聚糖的组合物，其中所述多个N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。在任一种实施方案中，如本文中所示，所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖在免疫球蛋白上的优势优选赋予需要的治疗效应物活性，与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合改进，以及与FcγRIIb的结合减少。

免疫球蛋白亚类

已经证明IgG亚类具有对Fc受体的不同结合亲和力(Huizinga etal，1989，J.of Immunol，142：2359-2364)。每一种IgG亚类可以提供本发明不同方面的特定优点。因此，一方面，本发明提供了包括GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为与IgG1分子连接的占优势的N-聚糖的IgG1组合物。另一方面，本发明包括GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为与IgG2分子连接的占优势的N-聚糖的IgG2组合物。另一方面，本发明包括GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为与IgG3分子连接的占优势的N-聚糖的IgG3组合物。另一方面，本发明包括GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为与IgG4分子连接的占优势的N-聚糖的IgG4组合物。

或者，本发明可以应用于所有5类主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。本发明的优选免疫球蛋白是人IgG，优选是亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之一。更优选地，本发明的免疫球蛋白是IgG1分子。

制备介导抗体效应物功能和活性的重组免疫球蛋白分子

一方面，本发明提供了制备具有N-聚糖的重组Ig分子的方法，所述N-聚糖基本由C_H2结构域的Asn-297上的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构组成，其中所述Ig分子介导抗体效应物功能和活性，类似地，提供了免疫球蛋白组合物，其中与免疫球蛋白连接的占优势的N-聚糖是GlcNAcMan₅GlcNAc₂。在一种实施方案中，用重叠寡核苷酸合成Ig的重链和轻链，并且分别克隆到表达载体中(实施例1)，以便在宿主细胞中表达。在一种优选实施方案中，在主要催化GlcNAcMan₅GlcNAc₂添加的宿主株中表达重组Ig重链和轻链。在一种实施方案中，该糖形结构更具体称作[(GlcNAcβ1，2-Manα1，3)(Manα1，3 Manα1，6 Manα，6)Manβ1，4-GlcNAcβ1，4-GlcNAc]，在Ig上的Fc区的氨基酸Asn-297的氮和GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖上的N-乙酰-β-D-葡糖胺的羟基之间形成键。在另一种实施方案中，可以在Ig分子内的不同位点(不是Asn-297)，或与Fab区中的N-糖基化位点组合添加该占优势的聚糖。

在低等真核生物中制备具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂的Ig

本发明的一方面提供了重组的低等真核宿主细胞，其可以用于制备占优势地具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的免疫球蛋白或抗体分子，与天然以低产率产生所述糖形的哺乳动物细胞中表达的糖蛋白的组合物相比，GlcNAcMan₅GlcNAc₂是有利的。

本发明的另一个优点是糖蛋白的组合物是用容易再现的预定的糖基化模式提供的。评估了所述组合物的特性，并且优化得到需要的特性，而不利作用可以被一起最小化或避免。

本发明也提供了制备重组宿主细胞的方法，该宿主细胞被工程化或经过选择，以表达一种或多种核酸，用于生产包含基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成的N-聚糖的Ig分子和具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的Ig组合物。在本发明的某些优选实施方案中，用重组宿主细胞，优选是重组的低等真核宿主细胞制备所述Ig分子和具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖的组合物。

在其它优选实施方案中，本发明包括可以从重组宿主细胞或通过本发明的方法获得的糖蛋白。

可以用编码需要的Ig区的载体和用编码此处描述的一种或多种糖基化相关酶的载体转化本发明的宿主细胞，然后选择用于具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的重组Ig分子或组合物的表达。本发明的重组宿主细胞可以是真核或原核宿主细胞，如动物、植物、昆虫、细菌细胞等，其可以被工程化或经过选择，以制备具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的Ig组合物。

优选地，本发明的重组宿主细胞是低等真核宿主细胞，按照本领域的描述对其进行了遗传工程化(WO 02/00879，WO 03/056914，WO04/074498，WO 04/074499，Choi et al，2003，PNAS，100：5022-5027；Hamilton et al，2003，Nature，301：1244-1246和Bobrowicz et al，2004，Glycobiology，14：757-766)。具体地，WO 02/00879公开了具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白，WO 04/074499公开了具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白(并且具体公开了免疫球蛋白)。

在一种实施方案中，编码IgG1的载体，例如含有JC-IgG1的AOX1/pPICzA载体(实施例1)被导入巴斯德毕赤氏酵母YAS385-1株中。该YAS385-1株类似于除去了K3报道蛋白(Hamilton et al，2003，Science，301：1244-1246)，并且按照描述破坏了PNO1和MNN4b基因(美国专利申请No.11/020808)，并且按照描述导入了β-1，4半乳糖基转移酶I基因(美国专利申请No.11/108088)的YSH44株。ΔpnolΔmnn4b双破坏导致甘露糖基-磷酸化的去除。通过使酵母株在5-氟乳清酸(5-FOA)上生长(Guthrie and Fink，1991，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Vol.169，Academic Press，San Diego)而除去甘露糖酶II基因，所述基因是按照对YSH44的描述导入的(Hamilton et al.，2003)，其侧翼是URA5基因。甘露糖酶II基因的除去维持了五甘露糖核心结构，其末端α-1，3和α-1，6甘露糖连接于α-1，6甘露糖臂和α-1，3甘露糖上的β-1，2GlcNAc，并且末端β-1，4半乳糖连接于β-1，2GlcNAc。然后用在AMR2基因座上插入URA3基因的URA3敲除质粒(Guthrie and Fink，1991，supra)破坏AMR2基因，由此除去β-甘露糖甲基化(美国专利申请No.11/118008)。该YAS385-1株表达具有占优势的GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和GlcNAcMan₅GlcNAc₂的糖蛋白，得到具有占优势的GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和GlcNAcMan₅GlcNAc₂的JC-IgG。用β-半乳糖苷酶处理该具有占优势的GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和GlcNAcMan₅GlcNAc₂的JC-IgG(实施例3)，得到具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的JC-IgG(图4A)。

在另一种实施方案中，也将在含有DX-IgG的AOX1/pPICZA中编码IgG1的载体(实施例1)导入巴斯德毕赤氏酵母YAS385-1株(上文)，纯化，然后用β-半乳糖苷酶处理(实施例3)，得到具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(图4B)。

或者，可以用本领域公知的一些方法表达本发明的抗体(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

低等真核生物中的糖基转移酶表达和稳定的基因整合

已经描述过用诸如URA3，URA5，HIS4，SUC2，G418，BLA或SH BLA的选择标记在低等真核宿主株(巴斯德毕赤氏酵母)如中导入异源基因和证实其整合的方法。当在低等真核生物中产生表达系统时，所述方法适于制备本发明的Ig。此外，描述了允许重复使用URA3标记物除去不需要的甘露糖基转移酶活性的方法。Alani et al，1987，Genetics，116：541-545和美国专利No.6,051,419描述了基于破坏巴斯德毕赤氏酵母中的URA3基因的选择系统。优选地，用PpURA3或PpURA5-blaster盒破坏URA3、URA5或尿嘧啶生物合成途径中的任何基因，允许基于尿嘧啶的营养缺陷和对5-氟乳清酸(5FOA)的抗性进行阳性和阴性选择(Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet，197：345-346)。因此，技术人员可以理解，所示系统使得能够通过选择和负选择而插入多个异源基因。

进一步的酶促修饰

进一步的酶促缺失可能对于分离可能赋予人类中的异常免疫原性活性的、不具有半乳糖基磷酸化或β-甘露糖基化的Ig是有益或必要的。如所述的，美国专利申请No.11/020808公开了去除甘露糖基磷酸化的方法，美国专利申请No.11/118008公开了去除β-甘露糖基化的方法。

在其它蛋白表达系统中制备具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的Ig

本领域技术人员理解，选择表达宿主系统(生物)用于异源蛋白表达，所述宿主系统可能需要或不需要经过工程化以表达具有占优势的聚糖结构的Ig。此处提供的实例是进行Ig表达的一种方法的实例，所述Ig在Asn-297或另一N-糖基化位点或这两者具有特定的聚糖。本领域技术人员可以容易地修改本发明的这些细节和实例，使其适用于任何蛋白表达宿主系统(生物)。

可以采用其它蛋白表达宿主系统，包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等来制备本发明的Ig分子和组合物。所述蛋白表达宿主系统可以经过工程化，或经过选择，以表达占优势的糖形或可以天然产生具有占优势的聚糖结构的糖蛋白。产生具有占优势的糖形的工程化的蛋白表达宿主系统的实例包括基因敲除/突变(Shields et al，2002，JBC，277：26733-26740)；基因工程(Umafia et al，1999，Nature Biotech.，17：176-180)或这两者的组合。或者，某些细胞天然表达占优势的糖形-例如，鸡、人和牛(Raju et al，2000，Glycobiology，10：477-486)。因此，通过选择很多表达宿主系统中的至少一个，本领域技术人员可以获得本发明的具有占优势的一种特定聚糖结构的Ig糖蛋白或组合物的表达。本领域中发现的用于制备糖蛋白的其它表达宿主系统包括：CHO细胞：Raiu WO9922764A1和Presta WO03/035835A1；杂交瘤细胞：Trebak et al，1999，J.Immunol.Methods，230：59-70；昆虫细胞：Hsu et al，1997，JBC，272：9062-970，和植物细胞：Gerngrosset al，WO 04/074499A2。

IgG的纯化

纯化和分离抗体的方法是公知的，并且在本领域中有描述。参见，例如，Kohler & Milstein，(1975)Nature 256：495；Brodear et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；.Goding，MonoclonalAutibodies：Principles and Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；和Jakobovits et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-255以及Jakobovits et al，(1993)Nature 362：255-258。在进一步的实施方案中，可以从用McCafferty et al.(1990)Nature，348：552-554(1990)中描述的技术建立的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段，用感兴趣的抗原选择合适的抗体或抗体片段。

可以根据实施例3中概括的方法纯化根据本发明的方法制备的重组Ig分子。图2显示了从YAS385-1纯化的JC-IgG的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的凝胶。图3显示了从YAS385-1纯化的DX-IgG的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的凝胶。在另一种实施方案中，纯化的Ig抗体具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂作为占优势的N-聚糖。可以通过本领域技术人员公知的一些质谱法确定聚糖分析和在Ig分子上的分布，所述质谱法包括但不限于：HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOF MS。在一种优选实施方案中，通过实施例5公开的MALDI-TOF MS分析确定聚糖分布。图4A显示了从YAS385-1纯化，并且用β-半乳糖苷酶处理的JC-IgG的MALDI-TOF谱(实施例3)。该MALDI-TOF显示总N-聚糖的大约55.8摩尔％是GlcNAcMan₅GlcNAc₂。图4B显示从YAS385-1纯化，并且用β-半乳糖苷酶处理的DX-IgG的MALDI-TOF谱。该MALDI-TOF显示总N-聚糖的大约60摩尔％是GlcNAcMan₅GlcNAc₂。

药物组合物

可以将本发明的抗体掺入药物组合物，所示组合物包含作为活性治疗剂的抗体和多种其它可药用的成分。参见Remington′sPharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式取决于施用途径和治疗用途。根据需要的制剂，组合物也可以包括可药用的、无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的载体。选择稀释剂，以便不影响组合物的生物活性。所述稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲液、林格氏液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其它载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。

用于肠胃外施用的药物组合物是无菌的、基本等渗的、无致热源的，并且是根据FDA或相似机构的GMP制备的。可以在生理可接受的稀释剂和药学载体中施用可注射剂量的物质的溶液或悬浮液，所述载体可以是无菌液体，如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，组合物中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它成分是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油和矿物油。概言之，诸如丙二醇或聚乙二醇的多元醇是优选的液体载体，特别是用于可注射溶液。可以以储存注射或植入制剂的形式施用抗体，它们是以允许活性成分持续释放的方式配制的。典型地，制备可注射的组合物，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备固体形式，其适用于在注射前溶于或悬浮于液体载体。也可以将制剂乳化，或包被在脂质体或微粒如聚交酯、聚乙醇酸交酯或用于增强佐剂效果的共聚物中，如上文的讨论(参见Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-1191997)。

诊断产品

也可以将本发明的抗体掺入多种诊断试剂盒和其它诊断产品，如阵列。提供的抗体通常预先结合于固相，如微量滴定板的孔。试剂盒通常含有用于检测抗体结合的试剂和用于提供使用试剂盒的指导的标签。免疫测量或夹心测定是诊断试剂盒的优选形式(参见US4,376,110，4,486,530，5,914,241和5,965,375)。抗体阵列描述于例如US 5,922,615，US 5,458,852，US 6,01 9,944和US 6,143,576。

治疗用途

本发明提供了糖蛋白组合物，其包含在糖蛋白上占优势的特定糖形。本发明的一个特征是当给包括人的哺乳动物施用时，在优选实施方案中，与具有相似一级结构的其它糖蛋白组合物相比，包含新的糖蛋白组合物的药物组合物有利地表现出优越的体内特性。因此，本发明的新组合物可以用于目前采用糖蛋白药剂的场合，并且可以有利地提供改进的特性和在产品各批次中的增加的统一性。本发明的制剂可以掺入溶液、单位剂型，如用于口服的片剂和胶囊中，以及掺入悬浮液、油膏等，这取决于特定的药物或药剂及其目标领域。

在一个特定方面，本发明提供了新的组合物，用于糖蛋白药学试剂、药物或药剂，其中糖蛋白包括免疫球蛋白分子和包含糖蛋白剂的占优势的特定糖形的组合物。根据本发明的特定方面，提供了包含免疫球蛋白糖蛋白的组合物，该糖蛋白具有本文描述的占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂聚糖结构的N-连接的寡糖。在优选方面，糖蛋白是抗体，特别可以是单克隆抗体。本发明进一步提供了用于制备本发明的组合物的方法和工具。

本发明进一步包括包含本发明的糖形制剂的药物组合物。该组合物优选是无菌的。当组合物是水溶液时，糖蛋白优选是可溶的。当组合物是冻干的粉末时，粉末优选可以在合适的溶剂中重配。

在其它方面，本发明包括用于治疗疾病状态的方法，包括给有需要的哺乳动物施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物。本发明的进一步的目的是提供在制品或试剂盒中的糖形制剂，其可以用于治疗疾病或病症的目的。

本发明的具有占优势的GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的Ig分子具有很多治疗用途，用于以下适应症，如癌症、炎性疾病、感染、免疫疾病、自身免疫疾病，包括特发性血小板减少性紫癜、关节炎、系统性红斑狼疮和自身免疫性溶血性贫血。

以下是参考Ig糖蛋白组合物的制备而说明本发明组合物和方法的实施例。这些实施例不应被理解为是限制性的：包含该实施例的目的仅在于举例说明。本领域技术人员可以认识到，该公开内容的许多修改和延伸都是可能的。所述修改和延伸被认为是本发明的一部分。

实施例1

克隆DX-IgG1以在巴斯德毕赤氏酵母中表达

DX-IgG1(一种抗CD20的IgG1)的轻链(L)和重链(H)由小鼠可变区和人恒定区组成。轻链在SEQ ID NO：1中公开，重链在SEQ ID NO：2中公开。重链和轻链序列用购自Integrated DNATechnologies(IDT)的重叠寡核苷酸合成。对于轻链可变区，购买了15个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：5-19)，在PCR反应中用Extaq(Takada)退火，产生具有5’MlyI位点的轻链可变区片段。该轻链可变片段然后用5’MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO：20)，3’可变/5’恒定引物LfusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO：21)，3’恒定区引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO：22)和3’CD20L/lp(SEQ ID NO：23)通过重叠PCR与轻链恒定区(SEQ ID NO：3)(Gene Art，Toronto，Cabada)连接。最终的MlyI-轻链片段(其包括5’AG碱基对)然后被插入到pCR2.1 topo载体(Invitrogen)中得到pDX343。对于重链，相应于小鼠重链可变区的17个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：24-40)购自IDT，用Extaq退火。该重链可变片段然后用5’MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO：41)，5’可变/恒定引物HchainASTKGPS/up(SEQ ID NO：42)，3’可变/恒定引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO：43)和3’恒定区引物HFckpn1/lp(SEQ ID NO：44)通过重叠PCR与重链恒定区(SEQ ID NO：4)(Gene Art)连接。最终的MlyI-重链片段(其包括5’AG碱基对)然后被插入到pCR2.1 topo载体(Invitrogen)中得到pDX360。全长轻链和全长重链被从各自的topo载体中分离为MlyI和NotI片段。这些轻链和重链片段然后用4个重叠寡核苷酸——P.BiPss/UP1-EcoRI，P.BiPss/LP1，P.BiPss/LP2和P.BiP/LP2(分别为SEQ ID NO：46-49)连接到Kar2(Bip)信号序列(SEQ ID NO：45)上，然后连接到pPICZA的MlyI-NotI位点中，得到携带有Kar2-轻链的pDX344和携带有Kar2-重链的pDX468。pDX344的BglII-BamHI片段然后被亚克隆到含有用于染色体整合的AOX2启动子基因的pBK85中，得到pDX458。携带有重链的pDX468的BglII-BamHI片段然后被亚克隆到pDX458中，得到含有在AOX1启动子控制下的CD20的重链和轻链的pDX478。然后该质粒在转化前用SpeI线性化，以整合到AOX2基因座，用Zeocin抗性选择转化体。(参见实施例2)。克隆JC-IgG1以在巴斯德毕赤氏酵母中表达

JC-IgG1的轻链(L)和重链(H)由小鼠可变区和人恒定区组成。小鼠可变轻链在SEQ ID NO：50(GenBank#AF013576)中公开，小鼠可变重链在SEQ ID NO：51(GenBank#AF013577)中公开。重链和轻链序列用购自Integrated DNA Technologies(IDT)的重叠寡核苷酸合成。对于轻链，购买了12个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：52-63)，在PCR反应中用Extaq(Takada)退火，产生具有5’EcoRI位点和3’KpnI位点的660个碱基对的轻链。该轻链然后被亚克隆到pPICZA载体(Invitrogen)中，作为EcoRI-Kpn1片段。对于重链，购买相应于Fab片段的12个重叠寡核苷酸(SEQ ID No：64-75)，用Extaq退火，产生660个碱基对的Fab片段。Fc片段用12个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO：76-87)合成，其在类似的重叠PCR反应中退火。重链的Fab和Fc片段然后用相应于重链Fab片段的5’末端的5’EcoRI引物(SEQ ID NO：64)和相应于Fc片段的3’末端的3’KpnI引物(SEQ ID NO：88)，用pFU Turbo聚合酶(Stratagene)退火，产生1330个碱基对的重链。使用引物中编码的5’EcoRI和3’KpnI位点，重链被克隆到pPICZa载体中。AOX2启动子序列，其起整合基因座的作用，被亚克隆到最终的pPICZa载体中。接下来，含有AOX1启动子的BglII-BstBI片段和含有来自人肝脏cDNA文库的HAS序列(SEQ ID NO：89)的BstBI-BamHI片段，凝血酶位点(SEQ ID NO：90)和JC轻链均被亚克隆到该AOX2/pPICZa载体的BamHI位点处。然后另一个含有AOX1启动子的BglII-BstBI片段和含有HAS序列的BstBI-BamHI片段，凝血酶位点和JC重链被亚克隆到相同的pPICZa载体的BamHI位点处。最后的载体包括AOX2整合基因座，HAS标记的JC轻链和HAS标记的JC重链，得到pJC140。该表达盒被整合到巴斯德毕赤氏酵母菌株的AOX2基因座，转化体用Zeocin抗性选择。(参见实施例2)。

Rituximab/Rituxan是购自于Biogen-IDEC/Genentech，SanFrancisco，CA的抗CD20小鼠/人嵌合IgG1

PCR扩增

Eppendorf Mastercycler被用于所有PCR反应中。PCR反应包含模板DNA，125μM dNTP，0.2μM每种正向和反向引物，Ex Taq聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.)，和Ex Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶缓冲液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。DNA片段的扩增采用30个循环，每个循环是97℃15秒，55℃15秒和72℃90秒，起始去饱和步骤是97℃2分钟，最后的延伸步骤是72℃7分钟。

PCR样品通过琼脂糖凝胶电泳被分离，DNA条带用Qiagen的GelExtraction试剂盒提取并纯化。所有DNA纯化物用10mM Tris，pH8.0洗脱，除了最后的PCR(所有三种片段的重叠)，其用去离子水洗脱。

实施例2

IgG载体向巴斯德毕赤氏酵母菌株YAS385-1中的转化

通过加入乙酸钠至终浓度为0.3M而制备载体DNA。然后百分之百冰冷的乙醇被加入到DNA样品中至终浓度为70％。DNA通过离心(12000g×10分钟)而沉淀，并用70％冰冷的乙醇洗涤。DNA被干燥并重悬于50μl 10mM Tris，pH8.0中。通过将较少的培养物在BMGY(缓冲的最少的甘油：100mM磷酸钾，pH6.0；1.34％酵母氮基；4×5^-10％生物素；1％甘油)中扩增至O.D.为约2-6而制备要转化的YAS385-1酵母培养物(Choi et al，2003；Hamilton et al，2003)。然后酵母细胞在1M山梨醇中洗涤3次，重悬于约1-2ml 1M的山梨醇，从而被制成电感受态。DNA(1-2μg)与100μl感受态酵母混合并在冰上温育10分钟。然后酵母细胞用BTX Electrocell Manipulator 600进行电穿孔，参数是1.5kV，129ohms，和25μF。一毫升的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖，1M山梨醇)被加入到电穿孔的细胞中。随后转化的酵母被接种到含有zeocin的选择性琼脂平板上。

用于在巴斯德毕赤氏酵母中产生IgG1的培养条件

用pDX478或pJC140转化的YAS385-1的单菌落被接种到50mlFalcon Centrifuge管中的10ml BMGY培养基(由1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％酵母氮基；4×5^-10％生物素；1％甘油组成)中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养48小时直到培养物饱和。然后100ml的BMGY被加入到500ml的带挡板的烧瓶(baffled flask)中。然后种子培养物被转移到含有100mlBMGY培养基的带挡板的烧瓶中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养24小时。将烧瓶内物质轻轻移入两个50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm离心10分钟。细胞沉淀用20ml不含甘油的BMGY洗涤一次，然后用20ml的BMMY(用1％MeOH替换1％甘油的BMGY)轻轻重悬。该重悬的细胞被转移至250ml带挡板的烧瓶中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养24小时。然后烧瓶内物质被轻轻移入两个50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm离心10分钟。在蛋白质分离之前，培养物上清液用ELISA分析，确定近似抗体滴度(参见实施例3)。

培养物上清液中抗体的定量分析通过酶联免疫吸附检测(ELISA)进行：高结合力微量滴定板(Costar)用10ml PBS，pH7.4中的24μg山羊抗人Fab(Biocarta，Inc，San Diego，CA)包被，4℃温育过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(PBS中的3％BSA)，然后室温温育1个小时。除去封闭缓冲液，将板用PBS洗涤3次。最后一次洗涤之后，加入递增体积的抗体培养物上清液(0.4，0.8，1.5，3.2，6.25，12.5，25和50μl)，室温温育1小时。然后将板用PBS+0.05％Tween20洗涤。最后一次洗涤之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温温育1小时。然后板用PBS-Tween20洗涤4次。板用TMB底物试剂盒进行分析，根据制造商的说明书(PierceBiotechnology)操作。

实施例3

IgG1的纯化

单克隆抗体用Streamline蛋白A柱从培养物上清液中捕获。抗体在Tris-Glycine pH3.5中洗脱，用1M Tris pH8.0中和。进一步的纯化用疏水相互作用层析(HIC)进行。HIC柱的特定类型取决于抗体。对于JC-IgG和DX-IgG，使用苯基琼脂糖凝胶柱(也可以使用辛基琼脂糖凝胶)，使用20mM Tris(7.0)，1M(NH₄)₂SO₄缓冲液，用1M到6M(NH₄)₂SO₄线性梯度缓冲液洗脱。苯基琼脂糖凝胶柱的抗体级分被合并并交换到50mM NaOAc/Tris pH5.2缓冲液中，通过阳离子交换(SP Sepharose Fast Flow)柱进行最后的纯化。抗体用50mM Tris，1M NaCl(pH 7.0)进行线性梯度洗脱。

用β-半乳糖苷酶处理Ig-GlcNAcMan₅GlcNAc₂

5mg纯化的IgG(JC-IgG或DX-IgG)被缓冲交换到50mM NH₄AcpH5.0中。在硅化管中，0.03Uβ-1，4-半乳糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)被加入到50mM NH₄Ac pH5.0中的纯化的IgG中，在37℃温育16-24小时。该样品被蒸发干燥，重悬于水中，用MALDI-TOF分析。然后用前述的苯基琼脂糖凝胶纯化将抗体从β-1，4-半乳糖苷酶中纯化出来。

实施例4

纯化IgG1的检测

纯化的JC-IgG或DX-IgG与适当体积的加样缓冲液混合，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，其中使用预制凝胶，根据制造商的说明书(NuPAGE双Tris电泳系统；InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif.)操作。凝胶蛋白质用考马斯亮蓝染料(Bio-Rad，Hercules，CA)染色。参见图2和3。

抗体浓度

蛋白质层析级分的浓度用Bradford测定(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)确定，去其中使用白蛋白作为标准(Pierce，Rockford，IL)。

实施例5

IgG1碳水化合物分析

基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。天冬酰胺连接的寡糖的MALDI-TOF分析：N-连接的聚糖通过修改的Papac et al.，Glycobiology 8，445-454(1998)的方法从JC-IgG和DX-IgG释放出来。抗体样品被还原并被羧甲基化，封闭膜，孔用水洗涤三次。IgG蛋白通过加入30μl含有1mU N-聚糖酶(EMDBiosciences，La Jolla，CA)的10mM NH₄HCO₃(pH8.3)被去糖基化。37℃温育16小时后，含有聚糖的溶液通过离心被取出并被蒸发干燥。每个孔的干燥的聚糖溶解于15μl水中，0.5μl点样在不锈钢样品板上，与0.5μl S-DHB基质(9mg/ml二羟基苯甲酸/1mg/ml 5-甲氧基-水杨酸以1∶1在水/乙腈/0.1％三氟乙酸中)混合，干燥。通过用脉冲氮激光器(337nm)以4-ns的脉冲时间照射产生离子。该仪器在延迟提取模式(delayed extraction mode)以125-ns的延迟操作，加速电压为20kV。栅极电压为93.00％，指示线电压(guide wire voltage)为0.1％，内压力是＜5×10^-7torr(1torr＝133Pa)，低质量门控(lowmass gate)是875Da。谱是从100-200个激光脉冲产生，用500-MHz的数字转换器获得。(Man)₅(GlcNAc)₂寡糖被用作外部分子量标准。所有谱用正离子模式的仪器产生。

实施例6

抗原结合ELISA测定

高结合微量滴定板(Costar)用PBS，pH7.4中的10μg抗原包被，4℃温育过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(PBS中3％BSA)，然后室温温育1个小时。除去封闭缓冲液，将板用PBS洗涤3次。最后一次洗涤之后，加入递增量的从0.2ng到100ng的纯化抗体，室温温育1小时。然后将板用PBS+0.05％Tween20洗涤。最后一次洗涤之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温温育1小时。然后用PBS-Tween20洗涤板4次。板用TMB底物试剂盒进行分析，根据制造商的说明书(Pierce Biotechnology)操作。

Fc受体结合测定

FcγRIIb，FcγRIIIa和FcγRIIIb的Fc受体结合测定根据以前描述的实验方法(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，276：6591-6604)进行。对于FcγRIII结合：PBS，pH 7.4中的1μg/ml的FcγRIIIb(图5)和FcγRIIb(图7)融合蛋白或者0.8μg/ml的FcγRIIIa-LF(图6)融合蛋白被包被到ELISA板(Nalge-Nunc，Naperville，IL)上，4℃48h。板用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)在25℃封闭1h。JC-IgG或DX-IgG二聚复合物通过将JC-IgG或DX-IgG和HRP-偶联的F(Ab’)2抗-F(Ab’)2以2∶1的摩尔量在25℃混合1h制备于含有1％BSA的PBS中。然后将二聚复合物以1∶2在1％的BSA/PBS中系列稀释，25℃包被到板上1小时。所使用的底物是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Vector Laboratories)。根据制造商(VectorLaboratories)的说明书读取450nm的吸光度。

B细胞中抗体反馈的ELISPOT测定

该测定如Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.46：10-15所述的方法实施。BSA(牛血清白蛋白)首先与IgG抗体偶联得到BSA-IgG复合物。分泌BSA-特异的IgG的B细胞的数量用ELISPOT测定确定。从注射的小鼠中除去脾，用0.5％正常小鼠血清在DMEM(Gibco，New York)中制备细胞悬液。一百毫升的细胞悬液被应用于BSA-包被的微量滴定板(参见上述的ELISA实验方法)上，在37℃，5％CO₂温育3.5h。板被洗涤并在4℃ o.n.与50μl在PBS-Tween中以1/100稀释的碱性磷酸酶结合的绵羊抗小鼠IgG温育。斑点在室温下在50μl的5溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(Sigma-Aldrich)中显影1小时，在立体显微镜下计数。

实施例7

对于用血液基质研究(blood matrix study)(例如B-细胞消耗) 测定的ADCC，如Vugmeyster and Howell，2004，Int.Immunopharm.4：1117-1124中所述。不含血浆和红细胞(RBC)的全血在染色缓冲液(含有1％BSA和0.1％叠氮化钠的Hank平衡盐溶液))，得到染色缓冲液中的白细胞悬液。然后全血样品在1000g旋转5分钟。上清液(血浆)被丢弃，沉淀用氯化铵裂解(ACL)试剂处理，洗涤，重悬于等量的染色缓冲液中。 对于B-细胞消耗测定：10μl 100μg/ml的抗体溶液或染色缓冲液被加入到90μlSB基质中，37℃温育1小时。样品立刻用抗-CD19-FITC和抗-CD45-PE在25℃染色30分钟。然后样品被固定于1％甲醛中，一式三份。B-细胞消耗的定量分析通过流式细胞术进行。 B-细胞消耗的流式细胞分析：装备有自动FACS加样器和Cell Quest软件的FACS Calibur(BD Biosciences)仪器被用于所有样品的获得和分析。Cytometer QC和设置包括运行CaliBrite珠和Sphero Tech彩虹珠(BD Biosciences)以确认仪器的功能性和探测器的线性。同种型和补偿控制对每个检测都被运行以确认仪器的设置。总淋巴细胞的B细胞的百分比由下述门控策略获得。淋巴细胞群体在前向散射/侧向散射散射图上被标记以定义区域1(T1)。用R1中的事件，显示CD19和CD45标记的荧光强度点图。荧光标记的同种型控制被用于确定CD19和CD45阳性各自的截止点。％B用CellQuest测定为具有CD19-阳性，CD45-阳性表型的R1区域中的细胞的级分。每个处理组的样品都是一式三份。B细胞消耗百分比用以下公式计算：平均值[100*(1-用对照抗体处理的％B/平均值[用SB处理的％B])。 荧光染料释放ADCC测定：PBMC分离：来自健康个体或者血液捐赠者(10-20)的外周静脉血被收集到肝素化的真空管(Becton Dickinson Vacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中。植入2只小鼠需要大约5ml的血。外周血单核细胞(PBMC)用OptiPrep根据制造商的说明书通过离心分离。PBMC用由RPMI 1640，2mML-谷胺酰胺，100IU/ml青霉素，100g/ml链霉素(Gibco/BRL)组成并补充了20％胎牛血清的完全培养基(CM)洗涤一次，然后以1×10⁶/mlCM的浓度重悬，并转移至250ml的培养瓶(Falcon，NJ，USA)中以使单核细胞消耗。在37℃和5％CO₂温育1小时以后，非贴壁细胞被除去，用培养基洗涤一次，外周血淋巴细胞(PBL)被调整至浓度为2.5×10⁷/mlCM。 荧光塞料-释放ADCC。ADCC检测的前提是与CD20或CD40抗原呈递靶细胞(分别是Raji细胞系或BCL1-3B3细胞)结合的抗体刺激靶细胞与效应细胞上的Fcγ受体结合。这依次促使呈递CD20或CD40抗原的靶细胞裂解，释放可以被定量检测的内部荧光染料。用Alamar-blue荧光代替靶细胞的⁵¹Cr标记。50μl的CD20呈递Raji细胞悬液(1x10⁴细胞)与50μl量的抗-DX-IgG或抗-JC-IgGmAb(各种浓度)混合，50μl量的PBMC效应细胞如上所述(效应物与靶细胞比率可以是100∶1，50∶1，25∶1和12.5∶1)在96孔组织培养板中分离，在37℃，5％CO₂温育4小时以便于Raji或BCL1-3B3细胞的裂解。加入5μl的Alamar蓝，继续再温育5小时，使得染料被吸收并代谢为荧光状态。将板在振荡器上冷却到室温，在荧光计上读取荧光值，在530nm激发，在590nm发射。相对荧光单位(RFU)相对于抗mAb浓度绘制，用对照抗体——例如Rituximab从标准曲线计算样品浓度。用严重的联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Niwa et al.，2004，Cancer Research，64：2127-2133)测定体内ADCC。体内ADCC活性可以用移植了来自包括杂合(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和纯合(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV和FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型的健康供体的人外周血单核细胞(PMBC)的小鼠模型检测。用该模型系统，检测了具有占优势的N-聚糖的Ig与Rituximab或任何其它对照抗体相比增强的ADCC活性。体内ADCC测定的详细的和充分的实验方法可以在Niwa et al.，2004，supra中找到。

                                              序列表

SEQIDN0：01(小鼠/人嵌合IgGl轻链)

caaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgtctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctcttcctctgt

ctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcctctccaaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtgtt

ccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctcttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctactact

actgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccaaattggagattaagagaactgttgctgctccatcc

gttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagaga

ggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggatt

ccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatca

gggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaa

SEQ ID NO：02(小鼠/人嵌合IgGl重链)

caagtccagttgcaacagcctggtgccgagttggtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggttacact

ttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaggtagaggtttggagtggttggtgccatctacccaggtaacgg

tgacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactctaccgctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtct

tccttgacttctgaagattctgctgtttactactgtgctagatccacctactacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgc

tggtaccactgtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtg

gtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtg

ttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcaga

cttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacac

atacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgat

gatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttga

cggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactg

ttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagac

tatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaacca

ggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaa

ctacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaaca

gggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagt

aa

SEQ ID NO：03(人IgGl的轻链恒定区)

agaactgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttg

aacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgtta

ctgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggttta

cgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaa

SEQ ID NO：04(人IgGl的重链恒定区)

tctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaag

gactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatctt

ccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagc

catccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccag

aattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatg

tgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaatgttcatactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagac

taagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaa

aggaggtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaa

gagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggat

tctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggat

tctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgc

atgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaa

SEQ ID NO：05(CD20LF1)

aggagtcgtattcaaatcgtcttgtctcaatccccagctattttg

SEQ ID NO：06(CD20LF2)

tctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctct

SEQ ID NO：07(CD20LF3)

tcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcc

SEQ ID NO：08(CD20LF4)

tctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggt

SEQ ID NO：09(CD20LF5)

gttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactct

SEQ ID NO：10(CD20LF6)

cttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttactac

SEQ ID NO：11(CD20LF7)

tgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtacc

SEQ ID NO：12(CD20LF8)

aaattggagattaagagaactgttgctgctccatcc

SEQ ID NO：13(CD20LR1)

caacagttctcttaatctccaatttggtaccaccaccgaaagttg

SEQ ID NO：14(CD20LR2)

gtgggttagaagtccattgctgacagtagtaagtagcagcgtcct

SEQ ID NO：15(CD20LR3)

cggcttcaactctggagatggtaagagagtaggaggtaccggaac

SEQ ID NO：16(CD20LR4)

agaaccagagaatctaactggaacaccggaagccaagttggaag

SEQ ID NO：17(CD20LR5)

tagcgtagatccatggctttggagaggaacctggcttttgctgga

SEQ ID NO：18(CD20LR6)

ccagtgaatgtaagagacagaggaagaggctctacaagtcatgg

SEQ ID NO：19(CD20LR7)

tgaccttctctccaggggaagcagacaaaatagctggggattgag

SEQ ID NO：20(CD20L/up)

aggagtcgtattcaaatcgtc

SEQ ID NO：21(LfusionRTVAAPS/up)

agaactgttgctgctccatcc

SEQ ID NO：22(LfusionRTVAAPS/lp)

ggatggagcagcaacagttc

SEQ ID NO：23(CD20L/lp)

ctggtaccttaacactctcctctgttgaag

SEQ ID NO：24(CD20HFl)

aggagtcgtattcaagtccagttgcaacagcctggtgccgagttg

SEQ ID NO：25(CD20HF2)

gtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgta aggcttctggt

SEQ ID NO：26(CD20HF3)

tacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactcca

SEQ ID NO：27(CD20HF4)

ggtagaggtttggagtggattggtgccatctacccaggtaacggt

SEQ ID NO：28(CD20HF5)

gacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttacc

SEQ ID NO：29(CD20HF6)

gctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttg

SEQ ID NO：30(CD20HF7)

acttctgaagactctgctgtttactactgtgctagatccacctac

SEQ ID NO：31(CD20HF8)

tacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccact

SEQ ID NO：32(CD20HF9)

gtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatcc

SEQ ID NO：33(CD20HR1)

tagtagaagcagcggaaacggtgacagtggtaccagcaccccaaa

SEQ ID NO：34(CD20HR2)

cgttgaagtaccagtctccaccgtagtaggtggatctagcacag

SEQ ID NO：35(CD20HR3)

agtaaacagcagagtcttcagaagtcaaggaagacaattgcatgt

SEQ ID NO：36(CD20HR4)

aggcggtggaagaggacttatcagcggtaagagtagcctttccct

SEQ ID NO：37(CD20HR5)

tgaatttttggttgtaagaagtgtcaccgttacctgggtagatgg

SEQ ID NO：38(CD20HR6)

caccaatccactccaaacctctacctggagtttgcttgacccagt

SEQ ID NO：39(CD20HR7)

gcatgttgtaggaggtgaaagtgtaaccagaagccttacaggaca

SEQ ID NO：40(CD20HR8)

tcttaacagaagcacctggcttgaccaactcggcaccaggctgtt

SEQ ID NO：41(CD20H/up)

Aggagtcgtattcaagtccag

SEQ ID NO：42(HchainASTKGPs/up)

gcttctactaagggaccatcc

SEQ ID NO：43(HchainASTKGPs/lp)

ggatggtcccttagtagaagc

SEQ ID NO：44(HFckpnl/lp)

ctggtattacttacctggggacaaagac

SEQ ID NO：45(具有 EcoRI的Kar2信号序列)

gaattcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccat

ttgctaaacctgttagagct

SEQ ID NO：46(P.BiPss/UPl-EcoRI)

aattcgaaacgatgctgtctttgaagccatcttggcttactttggctgctttgatgtacgctatgctttt

SEQ ID NO：47(P.BiPss/LP1)

ccaaagtaagccaagatggcttcaaagacagcatcgtttcg

SEQ ID NO：48(P.BiPss/UP2)

ggttgttgttccatttgctaagccagttagagct

SEQ ID NO：49(P.BiPss/LP2)

agctctaactggcttagcaaatggaacaacaaccaaaagcatagcgtacatcaaagcag

SEQ ID NO：50(GenBank#AF013576)

gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagatcctctcaatctttgga

aaactctaacggtaacactttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaaca

gattttctggtgttccagatagattttctggttctggttctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttg

ggtgtttacttctgtttgcaagttactcatgttccatacacttttggtggtggtactactttggaaattaagagaactgttgctgctc

catctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtactgcttctgttgtttgtcttcttaacaacttctacccaaga

gaagctaaggttcagtggaa ggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaacaagattctaaggat

tctacttactctttgtcttctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaag

gtttgtcttctccagttactaagtcctttaacagaggtgaatgttag

SEQ ID NO：51(GenBank#AF013577)

gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgttactggttactctattact

actaactacaactggaactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttct

gaatacaccccatctttgaagaacagagtttctattactagagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactc

cagaagatactgctacttactactgtgctagattggattactggggtcaaggtacttctgttactgtttcttctgcttctactaagg

gtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtactgctgctttgggttgtttggttaaggattactttccag

aaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaatcttctggtttgtactcttt

gtcttctgttgttactgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttg

ataagagagttgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatca

gttttcttgttcccaccaaaaccaaaggatacccttatgatttctagaactcctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatg

aagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgagtggtgttgaagttcataatgctaagacaaagccaagagaagaacaata

caactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaatacaagtgtaaggtctcca

acaaagctcttccagctccaattgagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgcc

accatccagagatgaactgactaagaaccaagtctctctgacttgtctggttaaaggtttctatccatctgatattgctgttgaat

gggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctggattctgatggttccttcttcctttactctaag

cttactgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactca

gaagtctctttccctgtctccaggtaaataa

SEQ ID NO：52 mh285L-1cggaattc-

gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtga

tgaagcttctatttcttgtag

SEQ ID NO：53 mh285L-2

agaaccagttcaagaaagtgttaccgttagagttttccaaagattgagaggatctacaagaaatagaagcttcat

SEQ ID NO：54 mh285L-3

actttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagattt

SEQ ID NO：55 mh285L-4

caaagtgaaatcagtaccagaaccagaaccagaaaatctatctggaacaccagaaaatctgttagaaactctgta

SEQ ID NO：S6 mh285L-5

tctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttac

SEQ ID NO：57 mh285L～6

caacagttctcttaatttccaaagtagtaccaccaccaaaagtgtatggaacatgagtaacttgcaaacagaagtaa

SEQ ID NO：58 mh285L-7

tggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggta

SEQ ID NO：59 mh285L-8

tgaaccttagcttctcttgggtagaagttgttaagaagacaaacaacagaagcagtaccagacttcaattgttcat

SEQ ID NO：60 mh285L-9

cccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaa

SEQ ID NO：61 mh285L-10

ccttagacaaagtcaaagtagaagacaaagagtaagtagaatccttagaatcttgttcagtaacagattcttgaga

SEQ ID NO：62 mh285L-11

ctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtc

SEQ ID NO：63 mh285L-12

ggggtaccctaacattcacctctgttaaaggacttagtaactggagaagacaaaccttgatgagtaac

SEQ ID NO：64 mh285H-1

cggaattc-gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctg

SEQ ID NO：65 mh285H-2

ggaaattgtctaatccagttccagttgtagttagtagtaatagagtaaccagtaacagaacaagtcaaagacaaag

SEQ ID NO：66 mh285H-3

aactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatac

SEQ ID NO：67 mh285H-4

attggttcatagaagtatctctagtaatagaaactctgttcttcaaagatggggtgtattcagaagtaccatcgta

SEQ ID NO：68 mh285H-5

gagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgc

SEQ ID NO：69 mh285H-6

agtagaagcagaagaaacagtaacagaagtaccttgaccccagtaatccaatctagcacagtagtaagtagcagta

SEQ ID NO：70 mh285H-7

ctgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggta

SEQ ID NO：71 mh285H-8

gaaacagtaactggttctggaaagtaatccttaaccaaacaacccaaagcagcagtccaccagaagtagactta

SEQ ID NO：72 mh285H-9

tccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaa

SEQ ID NO：73 mh285H-10

ccaaagaagaagatggaacagtaacaacagaagacaaagagtacaaaccagaagattgcaaaacagctggaaaagt

SEQ ID NO：74 mh285H-11

ctgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttga

SEQ ID NO：75 mh285H-12

tgtatgagttttatcacaagattttggttcaactctcttatcaaccttagtgttagatgg

SEQ ID NO：76 Fc-1

5’gctgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacagttgtccaccatgtccagctcctgaacttcttgggtggaccatcagtttt3’

SEQ ID NO：77 Fc-2

5’atgtgacttcaggagttctagaaatcataagggtatcctttggttttggtgggaacaagaaaactgatggtccacccaga

3’

SEQ ID NO：78 Fc-3

5’ctagaacccctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgat3’

SEQ ID NO：79 Fc-4

5’taagtagagttgtattgttcttctcttggctttgtcttagcattatgaacttcaacaccatcaacgtaccagttgaactt3’

SEQ ID NO：80 Fc-5

5’agaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaataca3’

SEQ ID NO：81 Fc-6

5’agctttggaaatggttttctcaattggagctggaagagctttgttggagaccttacacttgtattccttaccattcagcc3’

SEQ ID NO：82 Fc-7

5’gagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactga

c3’

SEQ ID NO：83 Fc-8

5’cagcaatatcagatggatagaaacctttaaccagacaagtcagagagacttggttcttagtcagttcatctctggatggt

3’

SEQ IDNO：84 Fc-9

5’tctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctg3’

SEQ ID NO：85 Fc-10

5’tgccatctggacttatcaacagtaagcttagagtaaaggaagaaggaaccatcagaatccagaacaggaggagtagtct

t3’

SEQIDNO：86 Fc-11

5’tgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactc3’

SEQ ID NO：87 Fc-12

5’ttatttacctggagacagggaaagagacttctgagtgtaatggttatgcaaag3’

SEQ ID NO：88 Fc/LP5

5’ggggtaccttatttacctggagacagggaaagagacttct3’

SEQ ID NO：89(人血清白蛋白，HSA)

atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagt

gaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt

gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattg

tgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgc

tgtgcaaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgaga

ccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagac

atccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaag

ctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgcca

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SEQ ID NO：90(凝血酶位点)

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Claims (24)

1.包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

2.权利要求1的组合物，其中50摩尔百分比以上的所述多个N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

3.权利要求1的组合物，其中75摩尔百分比以上的所述多个N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

4.权利要求1的组合物，其中90摩尔百分比以上的所述多个N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

5.权利要求1的组合物，其中所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖以比所述多个N-聚糖中其次最占优势的N-聚糖结构多约5摩尔百分比-约50摩尔百分比的水平存在。

6.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白表现出与FcγRIIb受体的结合亲和力减少。

7.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白表现出与FcγRIII受体的结合亲和力增加。

8.权利要求7的组合物，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIa受体。

9.权利要求7的组合物，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIb受体。

10.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性增加。

11.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白基本不含岩藻糖。

12.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白缺乏岩藻糖。

13.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白与选自下组的抗原结合：生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α和TNF-β。

14.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自下组的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区。

15.一种药物组合物，包含权利要求1-14任一项的组合物，和药学可接受载体。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白基本不含岩藻糖。

17.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白缺乏岩藻糖。

18.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白包括与选自下组的抗原结合的抗体：生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α和TNF-β。

19.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自下组的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区。

20.含有权利要求1的组合物的试剂盒。

21.含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞经过工程化或经过选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，由此产生包含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

22.权利要求21的宿主细胞，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。

23.在真核宿主中生产包含多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白包含至少一个与其连接的N-聚糖，其中所述组合物由此包含多个N-聚糖，所述N-聚糖中占优势的N-聚糖基本由GlcNAcMan₅GlcNAc₂组成。

24.权利要求23的方法，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。

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