JP2016537026A - 活性なtertを産生するための新しい方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)適当なタグでタグ付けされたTERTタンパク質をコードするヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を用意する工程、
b)酵母細胞によって組換えTERTタンパク質が細胞内で産生されるように、特定の条件で前記細胞を増殖させる工程、
c)特定の条件で前記酵母細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程、
d)適当な親和性精製手順によりTERTタンパク質を精製する工程、
を含む。
a)ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのN末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグ(cMBP)、および
・テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)タンパク質
を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
b)工程a)の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
c)必要であれば、前記抽出物のpHを6.0〜7.5の範囲内のpHに調整する工程と、
d)アミロース結合固体担体により融合タンパク質cMBP−TERTを精製する工程と、
を含む、可溶かつ活性なテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)タンパク質の産生方法に関する。
・出芽酵母のTERT(UniProt:Q06163)、
・分裂酵母のTERT(UniProt:O13339)、
・クルイベロミセス・ラクチスのTERT(ジェンバンク:CAH01870.1)、
・ピキア・パストリスのTERT(UniProt:F2QT80)、
・テトラヒメナ・サーモフィラのTERT(UniProt:O77448)、
・トラフグのTERT(UniProt:Q4KTA7)、
・メダカのTERT(NCBI:NP_001098286.1)、
・ハツカネズミのTERT(UniProt:O70372)、
・ドブネズミ(学名:Rattus Norvegicus)のTERT(UniProt:Q673L6)、
・ゼブラフィッシュのTERT(UniProt:A2THE9)、
・ハイイロオオカミ(学名:Canis lupus)のTERT(UniProt:Q6A548)、
・あるいは、当該技術分野において記載されているあらゆるTERTタンパク質、例えば、NCBIウェブサイト:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=telomerase+reverse+transcriptase上のタンパク質、
・ENSEMBLゲノムサーバ:www.ensembl.org/Multi/Search/Results?q=TERT;facet_feature_type=Gene上のタンパク質、
・またはUniprot:http://www.uniprot.org/uniprot/?query=tert&sort=scoreによって参照されるタンパク質、
からなる群から選択してもよい。
a)ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのN末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグ(cMBP)、および
・ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)タンパク質
を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
b)工程a)の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
c)必要であれば、前記抽出物のpHを6.0〜7.5の範囲内のpHに調整する工程と、
d)アミロース結合固体担体により融合タンパク質cMBP−hTERTを精製する工程と、
を含む、可溶かつ活性なヒトのテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)タンパク質の産生方法に関する。
本発明の方法により、MBPでタグ付けされたhTERTまたはTERT酵素を産生することができる。興味深いことに、MBPは先天免疫に関与することが知られているため、本発明の方法により得られるMBPでタグ付けされたhTERTまたはTERT酵素をワクチン組成物などに使用することができる。この場合、MBPタグの切断は不要であり、本発明の方法は先行技術の精製方法よりもはるかに実施が容易である。
・酵母RNAに結合させることができ、
・MBPタグに融合させることができ、
・どんな変性剤または界面活性剤も含まない産生プロセスで得られた、
という特有の特徴を含む。
本発明のTERTタンパク質をいくつかの用途で使用することができる。
別の態様では、本発明のTERTタンパク質は、患者における抗TERT免疫応答を誘導するために使用(すなわち、ワクチンとして作用)することができる。ワクチン接種を受けると、個体または動物は、高レベルのテロメラーゼを発現している細胞(例えば悪性細胞)に対する免疫応答の増加を誘発する。
あるいは、本発明のTERTタンパク質は、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて治療用化合物のスクリーニングのために使用することができる。そのような試験で用いられる本発明のTERTタンパク質は、溶液中に遊離していてもよく、固体担体に固定されていてもよく、細胞表面に支持されていてもよく、あるいは細胞内に位置していてもよい。TERTタンパク質と試験されている薬剤との結合複合体の形成は、EMSA、ゲル濾過またはグリセリン勾配によって検出してもよい。
・試料中で本発明のTERTタンパク質、テロメラーゼRNA(TR)および候補阻害剤を接触させる工程と、
・試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を含む。
a)試料中で本発明のTERTタンパク質および候補阻害剤を接触させる工程と、
b)テロメラーゼRNA(TR)を添加する工程と、
c)試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を上記順序で含む。
a)試料中で本発明のTERTタンパク質およびテロメラーゼRNA(TR)を接触させる工程と、
b)候補阻害剤を添加する工程と、
c)試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を上記順序で含む。
hTERT cDNA(Whitehead Institute of Biomedical ResearchのRobert Weinbergからの贈り物)およびpMAL p-2(New England Biolabs社)を以下のプライマーと共に、MBP(配列番号:9)およびhTERT(配列番号3)のPCR増幅のための鋳型として使用した。
・MBP−F(配列番号19):ATGCAATTCGAAGGTACCAAGCTTGCCACCATGAAAATCGAAGAAGGTAAAC
・MBP−R(配列番号20):p−TCGTTGGATCGTAATCGTTGTTGTTATTGTTATTG
・hTERT−F(配列番号21):p−CCGAAAACTTATATTTTCAGGGTATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCG、および
・hTERT−R(配列番号22):CTTCAAGACCATCCTGGACTGAGTCGAGCCGCGGCGGCCGCATGCAA
このプラスミドをシークエンシングで確認し、次いで20μgをAvrIIで直線化し、精製し、Bio-Rad Gene Pulser(1500V、25μF、200Ω)を用いてピキア・パストリスのX−33株(Invitrogen社)の中に電気穿孔法により導入した。複数の組み込み体を、寒天プレート(硫酸アンモニウムを含む0.2%酵母窒素原基礎培地、1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%デキストロース、1Mのソルビトール、pH7.0、300μg/mlのゼオシン)上で選択し、27℃で2〜3日間インキュベートした。コロニーを再画線し、次いでLBG(それぞれ20g/LのL培地およびグルコース)中で増殖させて、ウエスタンブロット(Epitomics社製のhTERT抗体)でhTERT発現を確認した。200ml(1%酵母抽出物、pH7.0、1%デキストロース、500μg/mlのゼオシン)中、160rpmおよび27℃で確認済みのクローンを増幅させ、次いで2mlの管に分注し、10%グリセリンと共に−80℃で保存した。
アミロースセファロースを用いてcMBP−hTERTタンパク質の精製を行った後、ウエスタンブロットおよびクマシーブリリアントブルー染色を行った(図2A)。レーン2(TEVプロテアーゼによるMBPタグの切断前)とレーン3(TEVプロテアーゼによるMBPタグの切断後)との間でのサイズの変化により、精製済タンパク質はcMBP−hTERTであることを確認した(MBPとhTERTとの間にTEV部位が含められていた)。
僅かな修正を伴うが記載されているとおりに(D'Ambrosio et al., 2012)直接アッセイを行った。テロメラーゼ基質として、40mMのトリス−HCl(pH7.9)、1mMのMgCl2、1mMのジチオスレイトール、2mMのスペルミジン、40μMのdATP、80μMのdTTP、2μMのdGTP、20μCiの[α−32P]−dGTP(3,000Ci/mmol)および33nMの5’ビオチン化プライマーを含有する20μLの反応緩衝液中で、再構成されたテロメラーゼを30℃で45分間インキュベートした。25mMになるまでEDTAを添加して反応を停止させた。ビオチン化プライマーを20μLのストレプトアビジン−アガロースビーズ(GE Healthcare社)に室温で10分間結合させることにより、取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。ビーズを10mMのトリス−HCl(pH8.0)、1mMのEDTA、1MのNaClで2回、10mMのトリス−HCl(pH8.0)、1mMのEDTAで1回洗浄する。プライマーを90%ホルムアミド、10mMのEDTA、0.5mMのビオチン(Sigma社)中、95℃で10分間加熱して溶出させ、15%ポリアクリルアミド−尿素シークエンシングゲル(19:1のアクリルアミド:ビスアクリルアミド比)上で分離させた。ゲルをプラスチックフィルムで覆い、ホスホイメージャースクリーンに露光し、STORM860(Molecular Dynamics社)を用いてスキャンした。
電気泳動移動度シフト解析(EMSA)によりcMBP−hTERT/hTR複合体を分析した。50μCiの[α−32P]−CTPを添加してhTRを合成し、cMBP−hTERTと共に1時間構築した。1×TBE中に1.2%の冷蔵したアガロースゲル上で全長hTRを110Vで2時間泳動させた。ゲルを10%酢酸および10%エタノール中で1時間固定し、乾燥して、ホスホイメージャースクリーンに露光した。STORM860(Molecular Dynamics社)を使用してスキャンを行った。
10μL(1μg)の精製済cMBP−hTERTタンパク質を、それらの専売緩衝液に入れたいくつかの市販の酵素の1μL原液と共に30分間インキュベートした後、試料をTAE緩衝液(トリス、酢酸、EDTA)中にSYBR GREEN II RNA(Invitrogen社)を含有する1%アガロースゲル中で30分間泳動させた。
MBPはN末端ペリプラズム標的シグナルを含有する。本発明者らは、この配列をMBP−hTERTから除去することにより、クマシーブリリアントブルー染色で精製済タンパク質cMBP−hTERTを検出することができるような酵母におけるより良好な発現が可能になることを示した(図2を参照)。
PGAPZベクターを用いてGST−hTERT(155kDa)を細胞内で発現させる(図1Aおよび図1Bを参照)。
本発明者らは、いくつかの他のタグ(His、His−MBP、GST)の使用により効率的な精製が支援されないことを実証した(GSTの実施例、図1Cを参照)。Hisでタグ付けされたhTERTは、精製後にクマシーブリリアントブルー染色によって検出できず、精製済MBP−hTERTで得られたテロメラーゼ活性レベルの2〜5%しか生じなかった。ウエスタンブロットでは、そのN末端においてStrep−タグIIに融合されたhTERTを発現するように形質転換された酵母においてタンパク質発現を検出することができず(2種類の異なる構築物を試験)、従って、このタグはタンパク質の発現または安定性にとって有害であり得る。
AOX1プロモーターに基づく古典的なピキア系では完全なタンパク質を効率的に発現させることができなかった(図1G)。GAPDHプロモーターを用いた場合、hTERTは、リッチ培地(酵母抽出物を含有)のみで効率的に発現されることが分かった。従って、構成的プロモーターまたは場合により、リッチ培地において抑制されない誘導性プロモーターが好ましい。
最近解凍したか4℃で保存した酵母は、より低品質のhTERTタンパク質を産生する。新しい前培養物からの指数関数的に増殖している酵母を用いた場合に最良の結果が得られた。
核/塩基性タンパク質では予期せずに、高塩濃度(NaClまたはKCl)が抽出効率を低下させることが分かった。緩衝液(HEPESまたはトリス、pH7〜8)も抽出を低下させた。
僅かに酸性のpH(6.3〜7.0)においてアミロース樹脂への最良の結合が観察された(図1K)。従って、効率的な精製は、結合および全ての洗浄溶液を6.0〜7.5の範囲内のpHに設定することを要件とする。
本方法を用いて産生されるhTERTタンパク質は、いくつかの内因性酵母RNAと結合されていることが分かった(図4A)。これらの要素をリボヌクレアーゼAによって除去することができた(図4B)。hTERTに対して高い親和性を有するhTRの導入によって置換されるため、それらはhTERTに(恐らくイオン相互作用および/または水素結合を介して)可逆的に結合するものと思われる。従って、リボヌクレアーゼAを用いたこれらのRNAの除去は、hTRによりテロメラーゼ活性を再構成するために必要ではない。しかし、精製プロセス中にリボヌクレアーゼAを添加してこれらの要素を除去した場合、3mg/mlを超えて濃縮すると精製済cMBP−hTERTは凝集する傾向があり、かつ沈殿することが分かった。電気泳動移動度シフト解析によるcMBP−hTERT−hTR複合体の分析により、調製されたタンパク質とリボヌクレアーゼAとの高分子重量の凝集体が形成されることが明らかとなった。実際には、かなりの割合の複合体がウェルの底に残留し、かつこのゲルの中に進入することができなかった(図5、レーン2および3)。さらに、結合された酵母RNAを保存する条件で精製されたhTERTタンパク質は、精製後に4℃で少なくとも48時間安定な触媒活性を示すが、これらのRNAなしに回収されたhTERTは、最初の24時間以内にその活性の大部分を失う。従って、これらの酵母RNAへのその結合を保存する条件でのhTERTの精製により、長期間の高い安定性を有し、かつこれらの要素なしに精製されたhTERTと比較して向上した溶解性を有する組換えタンパク質が得られる。
MBPで精製したhTERTを使用して、8000の構成要素からなる化学ライブラリーを用いて潜在的テロメラーゼ阻害剤を同定した。
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本発明の方法により、cMBPでタグ付けされたhTERTまたはTERT酵素を産生することができる。興味深いことに、MBPは先天免疫に関与することが知られているため、本発明の方法により得られるMBPでタグ付けされたhTERTまたはTERT酵素をワクチン組成物などに使用することができる。この場合、MBPタグの切断は不要であり、本発明の方法は先行技術の精製方法よりもはるかに実施が容易である。
本発明者らは、いくつかの他のタグ(His、His−MBP、GST)の使用により効率的な精製が支援されないことを実証した(GSTの実施例、図1Cを参照)。Hisでタグ付けされたhTERTは、精製後にクマシーブリリアントブルー染色によって検出できず、精製済cMBP−hTERTで得られたテロメラーゼ活性レベルの2〜5%しか生じなかった。ウエスタンブロットでは、そのN末端においてStrep−タグIIに融合されたhTERTを発現するように形質転換された酵母においてタンパク質発現を検出することができず(2種類の異なる構築物を試験)、従って、このタグはタンパク質の発現または安定性にとって有害であり得る。
cMBPで精製したhTERTを使用して、8000の構成要素からなる化学ライブラリーを用いて潜在的テロメラーゼ阻害剤を同定した。
Claims (27)
- a)ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのN末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質(cMBP)、および
・テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)タンパク質
を含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
b)工程a)の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
c)必要であれば、前記抽出物のpHを6.0〜7.5の範囲内のpHに調整する工程と、
d)アミロース結合固体担体により前記融合タンパク質cMBP−TERTを精製する工程と、
を含む、活性かつ可溶なテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)タンパク質の産生方法。 - 前記酵母細胞の細胞内pHが5.8未満の値に到達する前に工程b)を行う、請求項1に記載の方法。
- 前記酵母細胞はピキア・パストリス細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記構成的プロモーターは好ましくは配列番号10のGAPDHプロモーターである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マルトース結合タンパク質タグは配列番号8のポリペプチドを有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列は、前記マルトース結合タンパク質タグをコードする配列と前記TERTタンパク質をコードする配列との間に、プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)は、水性溶液、好ましくは塩および界面活性剤非含有水への前記酵母細胞の溶解を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性溶液はどんなプロテアーゼ阻害剤も含有していない、請求項7に記載の方法。
- 前記固体担体はアミロース結合アガロースビーズからなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体担体を6.0〜7.5の範囲内のpHを有する洗浄緩衝液で洗浄する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記精製済画分中にプロテアーゼを添加することにより、前記cMBPタグを前記TERTタンパク質から切断する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターは組み込みベクターである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって得られた前記TERTタンパク質を含有する組成物。
- TERTは前記cMBPに連結されている、請求項13に記載の組成物。
- TERTは酵母RNAに結合されている、請求項13または14に記載の組成物。
- どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項13、14または15のいずれか1項に記載の組成物。
- 薬として使用される請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 実験的生体外アッセイのための請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 細胞老化または不妊症を治療するために使用される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって得られた前記TERTタンパク質を含有する医薬組成物。
- TERTは前記cMBPに連結されている、請求項19に記載の医薬組成物。
- TERTは酵母RNAに結合されている、請求項19または20に記載の医薬組成物。
- どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項19〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 対象において抗TERT免疫応答を誘導させるために使用される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって得られた前記TERTタンパク質を含有するワクチン組成物。
- TERTは前記cMBPに連結されている、請求項23に記載のワクチン組成物。
- TERTは酵母RNAに結合されている、請求項23または24に記載のワクチン組成物。
- どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項23〜25のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって得られた前記TERTタンパクを用いて効率的なテロメラーゼ阻害剤を生体外で同定する方法。
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