JP2003517294A - 超高活性ブタ成長ホルモン放出ホルモン類似体 - Google Patents
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Abstract
Description
優先権を主張する。
大きなレベルでの動物における成長ホルモンの産生の刺激;および成長ホルモン
放出ホルモン類似体の投与を用いる成長の増強に関する。さらに、本発明は、筋
肉に特異的なプロモーターによって調節される前記成長ホルモン放出ホルモン類
似体をコードするヌクレオチド配列を、特に遺伝子治療技術を使用して筋肉組織
に適用することに関する。
に依存した遺伝子から構成されている。GH経路の遺伝子には下記が含まれる:
(1)GHおよびインスリン様成長因子−I(IGF−I)などのリガンド;(
2)pit1の代弁者(prophet)またはprop1およびpit1など
の転写因子;(3)アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、それぞれ成長ホ
ルモン放出ホルモン(GHRH)およびソマトスタチンなど;ならびに(4)G
HRH受容体(GHRH−R)およびGH受容体(GH−R)などの受容体。こ
れらの遺伝子は、視床下部、下垂体、肝臓および骨を含む種々の器官および組織
で発現している。GH経路の効果的で調節された発現は、炭水化物代謝、タンパ
ク質代謝および脂肪代謝の恒常性だけでなく、最適な縦方向の成長に必須である
。GH合成および下垂体前葉からのGH分泌は、GHRHにより刺激され、ソマ
トスタチンにより阻害される。これらはともに視床下部ホルモンである。ヒトお
よび他の脊椎動物における体細胞成長を制御することにおけるGHの中心的な役
割、ならびに下垂体からのGHの分泌を調節する生理学的に関連した経路はよく
知られている。GHは、第一に肝臓において、そして他の標的器官においてIG
F−Iの産生を増大させる。IGF−IおよびGHは、今度はGHRHおよびG
Hの放出を阻害するように視床下部および下垂体に対してフィードバックする。
GHは、末梢組織に対して直接的および間接的な両方の作用を有し、その間接的
な作用は主にIGF−Iによって媒介されている。
われ、そしてGH治療またはGHRH治療に応答する小児および成人の両方に存
在する。すべての場合において、GHRH−GH−IGF−Iの軸は基本的であ
るが、様々な考えられる理由で、最適な感受性または応答性で必ずしも機能して
いない。
GH欠乏性の低身長と同様に、GH軸での種々の場所における遺伝子的欠陥によ
り生じている(Parks他、1995)。非GH欠乏症は種々の病因を有する
:(1)遺伝病、ターナー症候群(Jacobs他、1990;Skuse他、
1999)、低軟骨形成症(Tanaka他、1998;KeyおよびGros
s、1996)、そしてクローン病(Savage他、1999);ならびに(
2)子宮内の発育遅延(AlbaneseおよびStanhope、1997;
Azcona他、1998)、ならびに(3)慢性的な腎機能不全(Sohmi
ya他、1998;BenfieldおよびKohaut、1997)。GH軸
が影響を受けていない患者(すなわち、正常なホルモン、遺伝子および受容体を
有する患者)は発育遅延の全症例の50%以上を占めている。これらの症例では
、GHRH治療またはGH治療が効果的であることが示されている(Gesun
dheitおよびAlexander、1995)。
骨格筋量を喪失させる。GHRH−GH−IGF−I軸は、老化により、そして
中高年において劇的な変化を受け(D’Costa他、1993)、GH産生速
度およびGH半減期を低下させ、GHおよびGHRHの刺激に対するIGF−I
の応答を低下させ、これにより骨格筋量の喪失(筋肉欠乏症(sarcopen
ia))、骨粗鬆症をもたらし、そして脂肪の増大および非脂肪体量の減少をも
たらす(Bartke、1998)。以前の研究により、著しい数の正常な中高
年者において、GHおよび様々なIGFの血清中のレベルが、その10代(13
歳〜19歳)のレベルの70%〜80%の差で著しく低下していることが示され
ている(Corpas他、1993;Iranmanesh他、1991)。筋
肉欠乏症の発症はGH治療により相殺され得ることが明らかにされている。しか
し、これは、そのコストおよび頻繁な副作用のために中高年者においては依然と
して議論されている治療である。
ツールになり得る。GH置換療法が発育不全の患者で広く使用され、満足できる
成長が得られ、そして処置されている小児には好ましい心理学的作用を有し得る
(RosenbaumおよびSaigal、1996;Erling、1999
)が、この治療には、実施できないほどの頻繁なGH投与が必要であること(M
onti他、1997;Heptulla他、1997)および望ましくない二
次的な作用(Blethen他、1996;Watkins、1996;Sha
let他、1997;Allen他、1997)を含むいくつかの欠点がある。
類ガン腫で認められるように)成熟ペプチドまたは短縮型分子として分泌されて
いるが、多くの場合に生物学的に活性であり、そして末端肥大症を生じさせさえ
し得ることが十分に確立されている(Esch他、1982;Thorner他
、1984)。GH欠乏の小児または成人への組換えGHRHの投与は、IGF
−Iレベルを増強し、GHRH用量に比例してGH分泌を増大させ、さらにまた
GHRHのボーラス用量に対する応答を生じさせる(BercuおよびWalk
er、1997)。従って、GHRHの投与は、正常値よりも少ないGHレベル
およびIGF−Iレベルを増大させるより生理学的な代替法を表している(Co
rpas他、1993)。
H分泌を伴い、正常な周期的なGH分泌を刺激するが、生体内のGHRHの短い
半減期は、頻繁な(1日に1回〜3回の)静脈内投与、皮下投与、または(30
0倍の高用量を必要とする)鼻内投与を必要とする。従って、長期間の処置とし
て、GHRH投与は実用的ではない。しかし、頭蓋外に分泌されたGHRHは、
プロセシングされたタンパク質種(Try1−40またはTry1−Leu44
)として、またはそれよりも短い短縮型分子としてさえも、生物学的に活性であ
る(Thorner他、1984)。重要なことに、血中供給における低レベル
のGHRH(100pg/ml)は、GHの分泌を刺激し(Corpas他、1
993)、そしてGHRHを遺伝子治療的発現に対する優れた候補物にする。プ
ラスミドDNAによる直接的な遺伝子移入は、現在、多くの開発された遺伝子治
療法の基礎であり、従ってウイルス遺伝子または脂質粒子を必要としない(Mu
ramatsu他、1998;AiharaおよびMiyazaki、1998
)。骨格筋は、筋肉繊維は長寿命であり、免疫応答性宿主において数ヶ月または
数年にわたって発現する環状DNAプラスミドによって形質導入され得るので好
ましい標的組織である(Davis他、1993;Tripathy他、199
6)。以前の報告は、ヒトGHRHのcDNAが、マウスにおける注射可能な筋
原性の発現ベクターによって筋肉に送達され得ること、そしてこの場合、この発
現ベクターにより、GHの分泌が2週間の期間にわたって適度なレベルに一時的
に刺激されたことを明らかにした(Draghia−Akli他、1997)。
他、1984)および農場動物の両方において有する。血漿中で60分間のイン
キュベーションを行った後では、95%のGHRH(1−44)NH2 が分解さ
れており、一方、それよりも短い(1−40)OH形態のホルモンのインキュベ
ーションは、類似した条件のもとでは、60分間のインキュベーションの後でペ
プチドの77%の分解を示しただけであった(Frohman他、1989)。
(1−40)OH種のより短いGHRHをコードするcDNAを遺伝子治療ベク
ターに組み込むことにより、血清中における半減期が長くなり、効力が増大した
分子をもたらすことができ、そしてプラスミドが注射された動物においてより大
きなGH放出がもたらされる。さらに、プロテアーゼ感受性アミノ酸のアミノ酸
置換による変異導入はhGHRH分子の血清半減期を長くすることができる。そ
の上、GHRHの生物学的活性の増強が、特異的受容体に対するその結合親和性
を増大させ得る超高活性な類似体を使用することによって達成される。
投与することに関する特許(米国特許第5,847,066号;同第5,846
,936号;同第5,792,747号;同第5,776,901号;同第5,
696,089号;同第5,486,505号;同第5,137,872号;同
第5,084,442号;同第5,036,045号;同第5,023,322
号;同第4,839,344号;同第4,410,512号;再発行特許第33
,699号)、あるいはGHRHの合成ペプチドフラグメントまたは天然に存在
するペプチドフラグメントを投与することに関する特許(米国特許第4,833
,166号;同第4,228,158号;同第4,228,156号;同第4,
226,857号;同第4,224,316号;同第4,223,021号;同
第4,223,020号;同第4,223,019号)が発行されている。下記
の変異を含むGHRH類似体が報告されている(米国特許第5,846,936
号):1位のTyrをHisへ;2位のAlaをVal、Leuまたはその他へ
;8位のAsnをGln、SerまたはThrへ;15位のGlyをAlaまた
はLeuへ;27位のMetをNleまたはLeuへ;そして28位のSerを
Asnへの変異。本発明の類似体は、活性に必要である、米国特許第5,846
,936号に報告されているアミノ酸置換のすべてを含まない。
織に送達される遺伝子治療に関しており、そして明細書に述べられた1つの実施
例は成長ホルモン放出ホルモンであるが、2つの重要な差により、このシステム
は本発明と区別される。第1に、本発明は、野生型と異なる成長ホルモン放出ホ
ルモンの類似体に関しており、この類似体は、GH分泌促進剤としてのその機能
を改善する著しい改変、すなわち、治療をもたらす能力を長くする低下したプロ
テアーゼ感受性および増大した安定性、ならびに治療をもたらす能力を増強する
増大した生物学的活性を有する。さらに、本発明の1つの局面において、本発明
は、骨格のα−アクチンに由来する近位の血清応答エレメント(SRE)、多数
のMEF−2部位、MEF−1部位およびTEF−1結合部位を含むSPc5−
12(Li他、1999)と名付けられた特徴的な合成プロモーターを用いてお
り、天然の筋原性プロモーターの転写能を大きく越えている。そのような合成プ
ロモーターのすばらしさは、例えば、筋原性プロモーターおよびその使用に関す
る発行された特許(例えば、米国特許第5,374,544号)、あるいは核酸
配列の筋原性発現に対するシステムに関する発行された特許(例えば、米国特許
第5,298,422号)を上回る著しい改善である。
類似体の適用を教示する。実施例に例示されているように、前記類似体は、先行
技術の類似体における8位でのGln、SerまたはThrへの置換がないにも
かかわらず、成長ホルモンの放出を増大させることに成功している。さらに、本
発明は、筋肉繊維は長寿命であり、環状DNAプラスミドによって形質導入され
得るために好ましく選択された骨格筋組織に、合成された筋原性プロモーターに
よりその発現が調節される前記類似体を導入するための遺伝子治療技術を提供す
る。これは、GHRHタンパク質の頻繁な投与を必要とすることが長期間の処置
としての使用についてGHRHタンパク質を不可能にしている現在の技術を上回
る改善である。
放出ホルモンである。
随した成長ホルモン関連欠乏症を処置する方法;(2)遺伝病に付随した成長ホ
ルモン関連欠乏症を処置する方法;(3)動物における成長成績を改善する方法
;(4)成長不全疾患を有する動物を処置する方法;(5)食用動物の効率を増
大させる方法;および(6)火傷、外傷、AIDSその他の消耗疾患に関連する
消耗性症状を動物において処置する方法;(7)正常な成長に付随するレベルよ
りも大きなレベルで動物における成長ホルモンの産生を刺激する方法;および(
8)動物における成長を増強する方法。これらの方法はすべて、機能的な発現に
適した間隔で順次作動的に連結されたプロモーター;配列番号1をコードするヌ
クレオチド配列;および3’非翻訳領域を含むプラスミドベクターを動物に導入
する工程を含む。
、hGH3’非翻訳領域が3’非翻訳領域に存在する。
、リポソームまたはカチオン性脂質からなる群より選択される。さらなる具体的
な実施形態において、前記ベクターは筋原性細胞または筋肉組織に導入される。
さらなる具体的な実施形態において、前記動物は、ヒト、愛玩動物、使役動物ま
たは食用動物である。
における成長ホルモンの放出を刺激するための医薬組成物である。
出ホルモンをコードするヌクレオチド配列である。
が含まれる。この方法は、機能的な発現のために作動的に連結されたプロモータ
ー;配列番号1をコードするヌクレオチド配列;および3’非翻訳領域からなる
ベクターの治療上有効量を動物に導入する工程を含む。具体的な実施形態におい
て、プロモーターは、合成筋原性プロモーターである。別の具体的な実施形態に
おいて、3’非翻訳領域はhGH3’非翻訳領域である。別の具体的な実施形態
において、動物は、ヒト、愛玩動物、食用動物および使役動物からなる群より選
択される。さらなる具体的な実施形態において、ベクターは筋原性細胞に導入さ
れる。さらなる具体的な実施形態において、ベクターは前記動物の筋肉組織に導
入される。別の具体的な実施形態において、そのような導入により、成長ホルモ
ン経路に付随した成長ホルモン関連欠乏性疾患が処置される。さらなる具体的な
実施形態において、欠乏性疾患は、前記動物における遺伝物質の変化の結果であ
る。さらなる実施形態において、そのような導入により、前記動物における成長
成績の改善が得られる。別の実施形態において、そのような導入は、食品に使用
される前記動物の効率を増大させる。さらなる実施形態において、そのような導
入により、火傷、外傷、AIDSその他の消耗疾患に付随する消耗性症状が動物
において処置される。別の具体的な実施形態において、そのような導入により、
前記動物の成長の増強がもたらされる。別の具体的な実施形態において、ベクタ
ーは一回投与で前記動物に導入される。さらなる具体的な実施形態において、ベ
クターは、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよびカチオン性脂質か
らなる群から選択される。
長ホルモン関連欠乏症を処置する方法が含まれる。この方法は、機能的な発現の
ために作動的に連結された合成筋原性プロモーター;配列番号1をコードするヌ
クレオチド配列;およびhGHの3’非翻訳領域からなるベクターの治療上有効
量を動物に導入する工程を含む。
で動物における成長ホルモンの産生を刺激する方法が含まれる。この方法は、機
能的な発現のために作動的に連結された合成筋原性プロモーター;配列番号1を
コードするヌクレオチド配列;およびhGHの3’非翻訳領域を含むベクターの
有効量を前記動物に導入することを含む。
明細書を理解することによって、そしてその一部を形成する添付された図面を参
照することによって明らかであり、そして最終的にはより容易に理解される。す
なわち、本発明の現時点で好ましい実施形態の何らかの例が開示目的で示されて
いる。
な置換および変更を施しうることは、当業者には容易に理解されるだろう。
ましい態様として、この用語は、より具体的には、ヒト、愛玩動物(イヌ、ネコ
、ウマ)、使役動物(ウマ、ウシ)および食用動物(食品を生産する動物(ニワ
トリ、ウシ、魚)またはそれ自体が食品である動物(カエル、ニワトリ、魚、カ
ニ、ロブスター、エビ、イガイ、ホタテガイ、ヤギ、イノシシ、ウシ、ヒツジ、
ブタ、ダチョウ、エミュー、ウナギ)および当技術分野で周知の他の動物を含む
)を指す。
が減少し、筋力が低下する疾患であって、患者は骨の脱灰(不随意、機序不明)
を起こしている場合があり、複合的なウイルス/細菌感染症を起こしている場合
があり、または一部の基本的代謝の調節が解除されている場合があると定義され
る。このような疾患の一例としてAIDS、結核、癌などが挙げられる。
ンドポイントを使ってモニターすることができる効果を宿主にもたらすのに必要
な組成物の量と定義される。
(当該動物の体重増加量)と定義される。
健康状態、病状または疾患と定義される。この不全は成長ホルモン経路(GHR
H−GH−IGF−I軸など)に直接影響を及ぼす異常、成長ホルモン経路に間
接的に影響を及ぼす異常、または成長ホルモン経路には全く影響を及ぼさない異
常の結果でありうる。
であり、化学的メッセンジャーとして働いて標的細胞に対するその作用を発揮す
ると定義される。
ンの放出を促進または刺激するホルモンと定義される。
型のアミノ酸配列(合成右旋性アミノ酸または環状アミノ酸を含まないもの)中
に、GHRH分子には天然には存在しないアミノ酸突然変異を含有するが、それ
でもなお成長ホルモンの合成および分泌を増進する機能を保っているタンパク質
と定義される。
与を受容哺乳動物が耐容しうる化合物を指す。
成および分泌を増進する天然または合成分子を指す(例えばGHRHはGHの分
泌促進物質である)。
って、その量が生理的に有意である場合を指す。薬剤は、その存在が受容動物の
生理機能に人為的変化をもたらす場合に、生理的に有意であるという。例えば、
成長不全の処置にあっては、成長を増加させる組成物は治療上有効であり、消耗
性疾患にあっては、減損率を低下させるかまたは成長を増加させる組成物は治療
上有効であろう。配列番号1をコードするヌクレオチド配列の発現を治療上有効
レベルにするために、十分なベクター量が利用されることは、当業者にはわかる
だろう。
症状に好都合な影響を及ぼす行為または動物の成長に好都合な影響を及ぼす行為
と定義される。1または複数の症状の治療はこの用語に包含されるものの、「処
置」という用語が必ずしも治療を示さないことは、当業者にはわかるだろう。
達する任意の媒体を指す。プラスミド、ウイルスベクター、リポソームまたはカ
チオン性脂質などが、その例である。
される。
ン類似体およびそれをコードする全てのヌクレオチド配列である。
欠乏症の処置方法、(2)遺伝病に付随する成長ホルモン関連欠乏症の処置方法
、(3)動物の成長成績を向上させる方法、(4)成長不全疾患を持つ動物の処
置方法、(5)食用動物の効率を増大させる方法、(6)火傷、外傷、AIDS
その他の消耗性疾患に伴う動物の消耗症状を処置する方法、(7)動物における
成長ホルモンの産生を正常な成長に付随するレベルより高いレベルに刺激する方
法、および(8)動物の成長を増進する方法がある。これらの方法はいずれも、
機能的発現に適した間隔で順次作動的に連結されたプロモーター、配列番号1を
コードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領域を含有するプラスミドベクタ
ーを動物に導入する工程を含む。具体的一態様として、これらの方法は成長の増
加、改善または増進をもたらすか、または成長ホルモンの産生の増加をもたらす
。
ーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領域を含有
する治療上有効量のベクターを動物に導入する工程を含む、動物において成長ホ
ルモン経路に付随する成長ホルモン関連欠乏症の処置方法がある。成長ホルモン
経路におけるこのような欠乏症は成長ホルモン経路に直接的または間接的な影響
を及ぼしうること、また、影響を受ける段階はGHRH作用またはGHRH機能
の上流または下流に存在しうることは、当業者にはわかる。GHRH作用または
GHRH機能より下流の段階が影響を受ける具体的一態様では、影響を受けたこ
の段階が、もともとは遺伝子治療の形で投与された本発明GHRH類似体の上昇
したレベルによって克服される。
たプロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領
域を含有する治療上有効量のベクターを動物に導入する工程を含む、遺伝病に付
随する成長ホルモン関連欠乏症の処置方法がある。本欠乏症は遺伝病によって直
接的または間接的に起こり、他の表現型が存在する場合もある。遺伝病の例には
、クロイツフェルト・ヤコブ病、コーエン症候群、アミノプテリン−メトトレキ
セート症候群、カブキ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、ラッセル・シ
ルバー症候群、ミラー・ディッカー症候群、ランゲルハンス細胞性組織球症、ロ
バーツ症候群、および18q−症候群などがあるが、これらに限らない。
モーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領域を含
有する治療上有効量のベクターを動物に導入する工程を含む、成長不全疾患を持
つ動物の処置方法がある。成長不全疾患は遺伝的欠陥によるものであってもよい
し、成長ホルモン経路における欠乏症によるものであってもよい。
れたプロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳
領域を含有する有効量のベクターを当該動物に導入する工程を含む、動物の成長
成績を改善させる方法がある。本明細書で使用する「成長成績」という用語は、
動物の成長状態または成長状況と定義される。成長成績は、当該動物の又は当該
動物の親の遺伝病、成長関連欠乏症、または成長に影響を及ぼす薬剤へのばく露
の結果でありうる。具体的一態様として、動物の成長成績を向上させる方法は、
当該動物の成長を増加させる方法を含む。
たプロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領
域を含有する有効量のベクターを当該動物に導入することからなる、動物におけ
る成長ホルモンの産生を正常な成長に付随するレベルより高いレベルに刺激する
方法がある。正常な成長に付随するレベルより高いレベルには、成長関連欠乏症
を持つ動物の基礎的な固有の成長、または成長関連欠乏症を持たない個体を含む
集団中の他の類似する動物に類似する成長レベルを持つ動物の基礎的な固有の成
長が含まれる。
ロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻訳領域を
含有する有効量のベクターを当該動物に導入することからなる、動物の成長を増
進する方法がある。成長を増進する動物は成長不全であっても成長不全でなくて
もよい。
されたプロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列および3’非翻
訳領域を含有するベクターがある。配列番号1をコードするために様々なヌクレ
オチド配列を使用できることは、当業者には理解される。使用される特定の配列
は、改変される特定の配列および特定の用途に合わせて当業者が決定した実験条
件によって部分的に決まる。本明細書に示すように、当業者は、部位特異的突然
変異導入法によって天然配列または種特異的配列とプロテアーゼ耐性などのため
の所望のアミノ酸置換とを含有するように配列を変化させる目的で、GHRH
cDNA配列を使用することができる。ここに記載する例は、部位特異的突然変
異導入法などの方法でヌクレオチド配列を変化させることによって所望の配列を
取得する方法に向けられる。したがって、例えば配列番号8またはGenBan
kから得られる類似の配列(下記参照)を鋳型として利用し、その鋳型に部位特
異的突然変異導入法または他の既知の方法で改変を施すことによって配列番号1
をコードするヌクレオチド配列を取得する方法は、当業者にはわかる。各コドン
にゆらぎ(第3)位置があるために複数のヌクレオチド配列によってコードされ
る配列番号1のアミノ酸配列は、配列を入手するためのGenBankへの接続
、本明細書に記載の部位特異的突然変異導入法、および一般的な生化学または分
子生物学の教科書(例えばBiochemistry,第3版,L.Stray
er,W.H.Freeman and Co.,ニューヨーク(1988)な
ど)であればどれにでも掲載されているような遺伝コードのコドン表があれば、
当業者には容易に作成することができるだろう。
翻訳領域にはhGH 3’非翻訳領域である。本発明の具体的一態様では、骨格
筋α−アクチン由来の近位血清応答配列(SRE)、複数のMEF−2部位、M
EF−1部位およびTEF−1結合部位を含有し、天然の筋原性プロモーターの
転写能力を大きく上回るSPc5−12(Liら,1999)(配列番号6)と
呼ばれる合成プロモーターが使用される。本発明のこの態様では、例えばトラン
ス作用因子結合部位やエンハンサーなどといった他の配列も使用してよい。これ
に代わる一態様では天然筋原性プロモーターを使用するが、このようなプロモー
ター配列を、例えば米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)Ge
nBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/Genbank/GenbankSearch.html)またはNC
BI PubMedサイト(http://www.ncbi.nlm.nih
.gov/PubMed/)などといったデータベースから入手する方法は、当
業者には知られている。また、これらのワールドワイドウェブサイトを利用して
、本発明に関係する配列または適切な文献を入手できることも、当業者には知ら
れている。
核酸ベクター中で利用する。
を使って動物中の成長ホルモンを増加させる方法がある。実施例に記述するよう
に、ヒトGHRH cDNA(配列番号8)を部位特異的突然変異導入用の鋳型
として使用して、天然ブタ配列とプロテアーゼ耐性などを目的とする所望のアミ
ノ酸置換とを両方とも含有するように配列を変化させる。このように、これらの
実施例は、部位特異的突然変異導入法などの方法によってヌクレオチド配列を改
変して所望の配列を得る方法を教示している。したがって例えば配列番号8また
はGenBank(上記参照)から得られる類似の配列を鋳型として利用し、そ
の鋳型に部位特異的突然変異導入法または他の既知の方法で改変を施すことによ
って、配列番号1をコードするヌクレオチド配列を取得する方法は、当業者であ
ればわかる。各コドンにゆらぎ(第3)位置があるために複数のヌクレオチド配
列によってコードされる配列番号1のアミノ酸配列は、配列を入手するためのG
enBankへの接続、本明細書に記載の部位特異的突然変異導入法、および一
般的な生化学または分子生物学の教科書(例えばBiochemistry,第
3版,L.Stryer,W.H.Freeman and Co.,ニューヨ
ーク(1988)など)であればどれにでも掲載されているような遺伝コードの
コドン表があれば、当業者には容易に作成することができるだろう。
ムまたはカチオン性脂質からなる群より選択される。さらなる具体的態様として
、前記ベクターは筋原細胞または筋組織に導入される。さらなる具体的一態様と
して、前記動物はヒト、愛玩動物、使役動物または食用動物である。
なる、動物における成長ホルモンの放出を刺激するための医薬組成物である。
出ホルモンをコードするヌクレオチド配列である。
的態様の他に、動物またはその細胞に核酸をトランスフェクトするための当技術
分野既知の送達系も使用できる。例えば他の非ウイルスまたはウイルス法も使用
できる。非ウイルス型のDNAまたはRNAを標的化する系は4つの成分、すな
わち1)対象となるDNAまたはRNA、2)細胞表面レセプターまたは抗原を
認識し、それに結合する部分、3)DNA結合部分、および4)細胞表面から細
胞質への複合体の輸送を可能にする溶解部分を必要とすることが、当業者には知
られている。また、リポソームおよびカチオン性脂質を使って、治療用遺伝子の
組み合わせを送達することにより、同じ効果を達成することもできる。考えられ
るウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペス
ウイルスおよびウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが挙
げられる。また、エピソームベクターを使用することもできる。当技術分野では
他のDNAベクターおよび輸送系も知られている。
クシニアウイルスに由来する発現ベクターを使って、標的とする器官、組織また
は細胞集団にヌクレオチド配列を送達できることが、当業者には知られている。
成長ホルモン放出ホルモン類似体をコードする遺伝子を発現させる組換えベクタ
ーを構築するには、当業者に周知の方法を使用することができる。一過性発現は
非複製ベクターの場合で1ヶ月またはそれ以上持続することができ、ベクター系
の一部に適当な複製配列がある場合はさらに長く持続しうる。
の細胞中で前記核酸配列を複製させることができる担体核酸分子を指すために使
用される。核酸配列は「外来性」であることができる。「外来性」であるとは、
当該核酸配列は当該ベクターが導入される細胞にとって外来であること、または
当該配列は当該細胞中の配列に相同であるが、当該配列が通常は見出されないよ
うな当該宿主細胞核酸内の位置に存在することを意味する。ベクターにはプラス
ミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイ
ルス)、人工染色体(例えばYAC)が含まれる。当業者であれば、Mania
tisら,1988およびAusubelら,1994(共に参照によって本明
細書に組み込まれる)に記載の標準的な組換え技術によってベクターを構築する
ことは十分に可能である。
とも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。具体的一態様では、
前記核酸配列がGHRHの一部または全部をコードする。ある場合には、次にR
NA分子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。また別の場
合には、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生産などにおいては、これ
らの配列は翻訳されない。発現ベクターは様々な「制御配列」を含有しうる。「
制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の転
写と、場合によって翻訳とに必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する
制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列
を含有してもよく、それらを以下に説明する。
の開始および転写の速度が制御される。プロモーターは、例えばRNAポリメラ
ーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および調節分子が結合できる遺伝
子配列を含みうる。「作動的に配置された」「作動的に連結された」「制御下に
」および「転写制御下に」という表現は、プロモーターが、ある核酸配列に対し
て、その配列の転写開始および/または発現を制御できるように、正しい機能的
位置および/または向きにあることを意味する。プロモーターは「エンハンサー
」と共に使用してもよいし、「エンハンサー」と共に使用しなくてもよい。「エ
ンハンサー」とは核酸配列の転写活性に関係するシス作用性調節配列を指す。
非コード配列を単離することによって得られるもののように、遺伝子または配列
にもともと付随しているものであってよい。そのようなプロモーターは「内因性
」と言うことができる。同様に、エンハンサーも、核酸配列にもともと付随して
いて当該配列の下流または上流に位置するものであってよい。もう一つの選択肢
として、コード核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーターの
制御下に置くことにより、一定の利点が得られるだろう。組換えプロモーターま
たは異種プロモーターとは、ある核酸配列にそれ本来の環境では通常付随してい
ないプロモーターを指す。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーという用
語も、ある核酸配列にそれ本来の環境では通常付随していないエンハンサーを指
す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモータ
ーまたはエンハンサー、他の原核細胞、ウイルスまたは真核細胞から単離された
プロモーターまたはエンハンサー、「天然に存在」しない(すなわち様々な転写
調節領域の様々な配列、および/または発現を変化させる突然変異を含有する)
プロモーターまたはエンハンサーがある。プロモーターおよびエンハンサーの核
酸配列を合成的に作成する他に、組換えクローニングおよび/または核酸増幅技
術(PCRTMなど)を本明細書に開示する組成物と共に使用することによって、
配列を作成することもできる(参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第
4,683,202号および米国特許第5,928,906号を参照されたい)
。さらに、例えばミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内での転写およ
び/または発現を指示する制御配列も同様に使用できると考えられる。
グメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび/またはエンハンサーを
使用することが重要だろう。分子生物学分野の当業者には、プロモーター、エン
ハンサーおよび細胞タイプの組み合わせを使用してタンパク質を発現させる方法
が一般に知られている。例えば参照によって本明細書に組み込まれるSambr
ookら(1989)を参照されたい。使用するプロモーターは構成的、組織特
異的、誘導性であってよく、そして/または、例えば組換えタンパク質および/
またはペプチドの大量生産に有利なものなど、適当な条件下で導入DNAセグメ
ントの高レベル発現を指示するのに役立つプロモーターであることができる。プ
ロモーターは異種プロモーターでも内因性プロモーターでもよい。具体的一態様
では、プロモーターは、Liら(1999)に記載されているような合成筋原性
プロモーターである。
けるための測定法は、当業者にはよく知られている。そのような領域の例には、
ヒトLIMK2遺伝子(Nomotoら,1999)、ソマトスタチンレセプタ
ー2遺伝子(Krausら,1998)、ネズミ精巣上体レチノイン酸結合遺伝
子(Lareyreら,1999)、ヒトCD4(Zhao−Emonetら,
1998)、マウスα2(XI)コラーゲン(Tsumakiら,1998)、
D1Aドーパミンレセプター遺伝子(Leeら,1997)、インスリン様成長
因子II(Wuら,1997)、ヒト血小板内皮細胞接着分子−I(Almen
droら,1996)がある。
れらのシグナルにはATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コ
ドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与える必要があるかもしれない。これを決
定し、必要なシグナルを与えることは、当業者なら容易にできるだろう。インサ
ート全体が確実に翻訳されるためには、開始コドンが所望のコード配列の読み枠
に対して「インフレーム」でなければならないことは、よく知られている。外来
の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然であっても合成であってもよい。適
切な転写エンハンサー配列を組み込むことによって、発現の効率は増大させても
よい。
、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作成する。IRES配列は5
’メチル化キャップ依存的翻訳というリボゾームスキャンモデルを迂回して、内
部部位から翻訳を開始することができる(PelletierおよびSonen
berg,1988)。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー(ポリオ
ウイルスおよび脳心筋炎ウイルス)に由来するIRES配列(Pelletie
rおよびSonenberg,1988)と、哺乳類メッセージに由来するIR
ES(MacejakおよびSarnow,1991)の記載がある。IRES
配列は異種オープンリーディングフレームに結合させることができる。それぞれ
がIRESによって分離されている複数のオープンリーディングフレームを一緒
に転写し、ポリシストロン性メッセージを作ることができる。IRES配列のお
かげで、各オープンリーディングフレームはリボソームと接触して効率のよい翻
訳を行うことができる。単一のプロモーター/エンハンサーを使って単一のメッ
セージを転写することにより、複数の遺伝子を効率よく発現させることができる
(参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,925,565号および
第5,935,819号を参照されたい)。
クローニング部位は複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、それらの制限酵
素部位はいずれも、標準的な組換え技術によってベクターを消化するために使用
することができる。(参照によって本明細書に組み込まれるCarbonell
iら,1999、Levensonら,1998、およびCocea,1997
を参照されたい)。「制限酵素消化」とは、核酸分子中の特定の位置でしか機能
しない酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販
されている。このような酵素の使用法は当業者には広く理解されている。多くの
場合、ベクターは、外来配列を当該ベクターに連結することが可能になるように
、MCS内を切断する制限酵素を使って直線化または断片化される。「連結(ラ
イゲーション)」とは、互いに隣接していても隣接していなくてもよい2つの核
酸断片間にリン酸ジエステル結合を形成させる過程を指す。制限酵素および連結
反応に関係する技術は組換え技術分野の当業者にはよく知られている。
めにRNAスプライシングを受ける。真核ゲノム配列を含有するベクターは、転
写物がタンパク質発現に適したプロセシングを確実に受けるように、スプライス
供与部位および/またはスプライス受容部位を必要とするかもしれない。(参照
によって本明細書に組み込まれるChandlerら,1997を参照されたい
)。
、ポリアデニル化シグナルが組み入れられるだろう。ポリアデニル化シグナルの
性質は本発明の実施の成功にとっては決定的な問題ではないと考えられ、そして
/または任意の配列を使用することができる。好ましい態様としては、SV40
ポリアデニル化シグナルおよび/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナ
ルが挙げられ、これらは便利でありかつ/または様々な標的細胞でよく機能する
ことが知られている。転写終結部位も発現カセットの配列として考えられる。こ
れらの配列はメッセージレベルを増大させ、かつ/または当該カセットから他の
配列への読み過ごしを最小限に抑える役割を果たすことができる。
点(しばしば「ori」と呼ばれる)を含有しうる。複製起点は複製の開始位置
となる特別な核酸配列である。また、宿主細胞が酵母である場合は、自律複製配
列(ARS)を使用してもよい。
クターにマーカーを組み入れることによってインビトロまたはインビボで細胞を
同定することができる。そのようなマーカーは確認可能な変化を細胞に付与して
、当該発現ベクターを含有する細胞の同定を容易にする。一般的に、選択可能マ
ーカーは、選択を可能にする性質を付与するものである。陽性選択マーカーはそ
のマーカーの存在によってその選択が可能になるマーカーであり、一方、陰性選
択マーカーはそのマーカーの存在によってその選択が妨げられるマーカーである
。陽性選択マーカーの例は薬剤耐性マーカーである。
助けになり、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DH
FR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子な
どは有用な選択マーカーである。条件の設定に基づいて形質転換体の識別を可能
にする表現型を付与するマーカーの他に、例えば比色分析に基礎を置くGFPな
どのスクリーニング可能マーカーなど、他のタイプのマーカーも考えられる。も
う一つの選択肢として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)または
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)などのスクリーニ
ング可能酵素も利用できる。免疫学的マーカーを、場合によってはFACS分析
と共に使用する方法も、当業者には知られている。どのマーカーを使用するかは
、遺伝子産物をコードする核酸と同時にそのマーカーを発現させることができる
限り、重要ではないと考えられる。選択可能およびスクリーニング可能マーカー
の他の例は、当業者にはよく知られている。
物」の各用語は交換可能で使用され得る。これらの用語はすべて、任意の後世代
およびすべての後世代であるそれらの子孫をも含む。すべての子孫は、意図的な
変異または意図的でない変異のために同一でなくてもよいことが理解される。異
種の核酸配列を発現させることに関して、「宿主細胞」は原核生物性細胞または
真核生物性細胞を示し、これらには、ベクターを複製することができ、かつ/ま
たはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現させることができる任意の
形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターの受容物として使用する
ことができ、そしてベクターの受容物として使用されている。宿主細胞は、「ト
ランスフェクション」または「形質転換」され得る。これは、外因性核酸が宿主
細胞に移入または導入されるプロセスをいう。形質転換細胞には、初代の被験体
細胞およびその子孫が含まれる。
された核酸配列の一部またはすべての発現であるかどうかに依存して、原核生物
または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物を宿主細胞とし
ての使用に利用することができ、それらは、生存培養物および遺伝物質の保管所
として使用されている機関であるAmerican Type Culture
Collection(ATCC)から入手することができる(www.at
cc.org)。適切な宿主は、ベクター構造および所望する結果に基づいて当
業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドを、多くのベク
ターを複製するために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクターの複
製および/または発現を行うための宿主細胞として使用される細菌細胞には、D
H5a、JM109およびKC8、ならびに多数の市販の細菌宿主(SURER
コンピテント細胞およびSOLOPACKaゴールド細胞(STRATAGEN
ER 、La Jolla)など)が含まれる。あるいは、大腸菌LE392など
の細菌細胞をファージウイルスの宿主細胞として使用することができる。
HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saosお
よびPC12が含まれる。様々な細胞タイプおよび生物に由来する多くの宿主細
胞を利用することができ、これらは当業者には知られている。同様に、ウイルス
ベクターを、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞のいずれかとともに使用
することができ、特に、ベクターの複製または発現を許容し得る宿主細胞ととも
に使用することができる。
および/または発現を可能にする制御配列を用いることができる。当業者はさら
に、上記に記載された宿主細胞のすべてをインキュベーションし、それらを維持
し、かつベクターの複製を可能にする条件を理解している。ベクターの大規模製
造、ならびにベクターによってコードされる核酸の製造およびその同系ポリペプ
チド、タンパク質またはペプチドの製造を可能にする技術および条件もまた理解
されており、そして知られている。
数多く存在する。原核生物型システムおよび/または真核生物型システムを、核
酸配列またはその同系ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを製造するため
に本発明による使用に用いることができる。多くのそのようなシステムが広範囲
に市販されている。
ンパク質発現をもたらし得る。そのようなシステムは、米国特許第5,871,
986号および同第4,879,236号(これらはともに参考として本明細書
中に組み込まれる)などに記載されており、例えば、INVITROGENR か
ら得られるMAXBACR 2.0およびCLONTECHR から得られるBAC
PACKTMBACULOVIRUS発現システムの名称で購入することができる
。
ONTROLa誘導性哺乳動物発現システム(これは、合成エクジソンにより誘
導可能な受容体を含む)またはそのpET発現システム(大腸菌発現システム)
が含まれる。誘導可能な発現システムの別の例をINVITROGENR から入
手することができる。これは、全長のCMVプロモーターを使用する誘導可能な
哺乳動物発現システムであるT−REXTM(テトラサイクリン調節発現)システ
ムを有する。INVITROGENR はまた、Pichia methanol
ica発現システムと呼ばれる酵母発現システムを提供する。これは、メチロト
ローフ酵母Pichia methanolicaにおける組換えタンパク質の
高レベル製造を目的としている。当業者は、核酸配列あるいはその同系ポリペプ
チド、タンパク質またはペプチドを産生させるために発現構築物などのベクター
をいかにして発現させるかを理解している。
る。変異は、変化が生物の量または構造において生じるプロセスである。変異は
、1つの遺伝子のヌクレオチド配列、遺伝子群または染色体全体の変化を伴い得
る。一遺伝子における変化は、DNA配列内の一ヌクレオチド塩基の除去、付加
または置換を伴う点変異の結果であり得るか、あるいは非常に多くのヌクレオチ
ドの挿入または欠失を伴う変化の結果であり得る。
レメント(トランスポゾン)の動きなどの事象の結果として自然に生じ得る。変
異はまた、化学的変異原または物理的変異原にさらされた後に誘導される。その
ような変異誘導因子には、イオン化放射線、紫外線、ならびに(一般にはいくつ
かの代謝的な生物変換の後で)核酸と直接的または間接的のいずれかでそのすべ
てが相互作用し得るアルキル化剤および多環状芳香族炭化水素などの多様な化学
物質が含まれる。そのような環境的因子によって誘導されたDNA損傷は、影響
を受けたDNAが複製または修復されるときに塩基配列の変化をもたらし、従っ
て変異をもたらし得る。変異はまた、特定の標的化方法を使用することによって
部位特異的に生じさせることができる。
解明して操作するための強力な手段である(Wells、1996;Brais
ted他、1996)。そのような技術により、様々な配列変化体が、選択され
たDNA内に1つまたは2つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによっ
て調製され、調べられる。
する非改変ヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列が使用され
る。このようにして、プライマー配列に、欠失接合をまたぐ両側で安定な二重鎖
を形成するのに十分なサイズおよび複雑性がもたらされる。約17ヌクレオチド
〜25ヌクレオチドの長さを有するプライマーが好ましく、配列の接合部両側の
約5ヌクレオチド〜10ヌクレオチドが変化させられる。
テリオファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発において有用なベクター
には、M13ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージベクターは
市販されており、その使用は一般に当業者には十分に知られている。二本鎖プラ
スミドもまた、目的とする遺伝子をファージからプラスミドに移す工程を省略す
る部位特異的変異誘発において日常的に用いられている。
をその配列内に含む一本鎖ベクターが最初に得られるか、またはそのような二本
鎖ベクターの2つの鎖が融解される。所望する変異型配列を有し、合成的に調製
されたオリゴヌクレオチドプライマーが、その後、ハイブリダイゼーション条件
が選択されたときのミスマッチの程度を考慮に入れて一本酸DNA調製物とアニ
ーリングさせられる。ハイブリダイゼーション産物は、変異含有鎖の合成を完全
にするために、大腸菌ポリメラーゼI(クレノウフラグメント)などのDNA重
合酵素に供される。従って、ヘテロ二重鎖が形成される。この場合、一方の鎖が
元の非変異型配列をコードし、第2鎖が所望の変異を有する。その後、このヘテ
ロ二重鎖ベクターを使用して、大腸菌細胞などの適切な宿主細胞が形質転換され
、そして変異型配列編成を有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
19個のすべてのアミノ酸置換体が調べられる飽和変異誘発によって最もよく得
ることができる。この方法の欠点は、多残基の飽和変異誘発に関係する技術が不
十分であるということである(Warren他、1996;Brown他、19
96;Zeng他、1996;BurtonおよびBarbas、1994;Y
elton他、1995;Jackson他、1995;Short他、199
5;Wong他、1996;Hilton他、1996)。数百個(場合によっ
ては数千個さえも)の部位特異的な変異体を調べなければならない。しかし、改
善された技術により、変異体の作製および迅速なスクリーニングがはるかにより
直接的になっている。例えば、「ウォークスルー」変異誘発の記載について米国
特許第5,798,208号および同第5,830,650号を参照のこと。
284,760号;同第5,354,670号;同第5,366,878号;同
第5,389,514号;同第5,635,377号;および同第5,789,
166号に開示されている。
1992)を使用して導入され得る。変異誘発速度は、様々な希釈度の様々な鋳
型を含む多数のチューブでPCRを行うことによって増大させることができる。
の危険性を最小限にしながら、多数の残基がアミノ酸のアラニンで個々に置換さ
れ、その結果、側鎖の相互作用を失った作用が測定され得るアラニン走査変異誘
発である(Cunningham他、1989)。
の技術が開発されている(Blackburn他、1991;米国特許第5,2
21,605号および同第5,238,808号)。少量の物質を用いて機能的
アッセイを行うことができることは、抗体の飽和変異誘発に対する非常に効率的
なインビトロ方法論を開発するために役立ち得る。本発明者らは、タンパク質変
異体の高処理能作製のためにPCR変異誘発を共役インビトロ転写/翻訳と組み
合わせることによってクローニング工程を回避した。この場合、PCR産物が、
変異型単鎖抗体のインビトロ転写/翻訳に対する鋳型として直接使用される。1
9個のすべてのアミノ酸置換体がこの方法で非常に効率的に作製および分析され
得るので、目的とする多数の残基における飽和変異誘発、すなわち、インビトロ
走査飽和変異誘発(Burks他、1997)として記載され得るプロセスを行
うことが現在可能である。
速な方法を提供する。これには、(i)リガンド結合特異性を調節する残基の同
定;(ii)特定の位置で活性を保持するそのようなアミノ酸および特定の位置
で活性を破壊するそのようなアミノ酸を同定することに基づくリガンド結合のよ
り良好な理解;(iii)活性部位またはタンパク質サブドメインの全体的な柔
軟性の評価;(iv)増大した結合をもたらすアミノ酸置換体の同定が含まれる
。
クレオチド配列、または配列番号1をコードするヌクレオチド配列を有するベク
ター)は、作用成分と動物体内における薬剤の作用部位との接触をもたらす任意
の手段によって様々な成長不全状態に影響を及ぼすために処方され、そして投与
され得る。本発明の組成物は、本明細書中に記載されたアミノ酸配列類似体であ
る本発明の化合物をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターとして定義
される。前記組成物は、前記化合物の治療上有効量を生じさせるために十分な量
で投与される。当業者は、十分なベクター量が、配列番号1をコードするヌクレ
オチド配列の発現を治療上効果的なレベルにするために用いられることを承知し
ている。当業者は、用語「投与(される)」および用語「導入(される)」が交
換可能で使用され得ることを認識している。
で調合薬と一緒に使用するために利用可能な任意の従来の手段で投与され得る。
治療有効成分は単独で投与され得るが、一般には、選ばれた投与経路および標準
的な製薬的慣行に基づいて選択される医薬担体とともに投与され得る。そのよう
な医薬組成物は、ヒトおよび動物の両方の臨床医学において治療目的または診断
目的のために使用することができる。例えば、そのような医薬組成物は、下垂体
機能低下小人症などの成長に関連した異常、および成長ホルモン産生の異常に起
因する糖尿病を処置することにおいて有用である。さらに、医薬組成物はまた、
成長を刺激するために、または食肉生産のために生じる動物の飼料効率を高める
ために、または乳汁生産を高めるために、そして卵生産を刺激するために使用す
ることができる。
あるが、特定の作用成分の薬理学的特徴ならびにその投与様式および投与経路;
動物のタイプ;被投与体の年齢;被投与体の性別;被投与体の健康状態;被投与
体の体重;症状の性質および程度;同時に行われている処置の種類;処置頻度;
ならびに所望する効果などの知られている様々な要因に依存して変化する。投与
される本発明のベクターの適切な投薬量は、処置されている個々の対象体および
その状態に依存して若干変化する。当業者は、正常な成長に関連する成長ホルモ
ンの知られている循環レベルおよびベクターの成長ホルモン放出活性に基づいて
適切な投薬量を決定することができる。この分野では十分に知られているように
、成長に関連する異常の処置は、成長ホルモン産生の不十分さの程度に依存して
個体毎に投薬量を変化させることを必要とする。家畜における成長活性を刺激す
るための用いられる投薬量は、ヒトにおける下垂体性小人症などの成長ホルモン
欠乏症の症例における正常な成長を回復させるために用いられる投薬量よりも(
体重1kgあたり)著しく大きい。
方法が本発明によって提供される。この方法は、正常な成長に付随するレベルに
まで成長ホルモンの産生を刺激するために十分な量の本発明の類似体を投与する
ことを含む。成長ホルモンの正常なレベルは個体間でかなり変化し、そして任意
の特定の個体についても、循環している成長ホルモンのレベルは1日の中でかな
り変化している。
するために十分な量の本発明のGHRH類似体を投与することによって動物の成
長速度を増大させる方法もまた提供される。
形態、液体形態または気体形態にある調剤に、それらのそれぞれの投与経路につ
いてこの分野で知られている方法で配合することができる。この分野で知られて
いる手段を、組成物が標的器官に達するまで組成物の放出および吸収を妨げるた
めに、あるいは組成物の徐放性を確保するために利用することができる。本発明
の組成物を無効にしない医薬的に許容されうる形態を用いられなければならない
。医薬的な投薬形態において、組成物は単独で使用され得るか、または他の医薬
的に活性な化合物との組合せだけでなく、他の医薬的に活性な化合物との適切な
会合状態で使用され得る。
よって動物体内の様々な部位に送達することができる(例えば、Rosenfe
ld他(1991);Rosenfeld他(1991a);Jaffe他、1
992を参照のこと)。当業者は、2つ以上の経路を投与のために使用すること
ができるが、特定の経路が別の経路よりも即時的かつ効果的な反応をもたらし得
ることを認識している。局所的送達または全身的送達は、処方物の体腔内への適
用または点滴注入、エアロゾルの吸入または吹送を含む投与によって、あるいは
非経口的な導入(これには筋肉内投与、静脈内投与、腹腔投与、皮下投与、皮内
投与ならびに局所投与が含まれる)によって達成され得る。
ことを認識している。例には下記が含まれる:(1)物理的な手段を利用する方
法、例えば、エレクトロポレーション(電気)、遺伝子銃(物理的な力)または
大量の液体を塗布すること(圧力)など;ならびに(2)前記ベクターが、リポ
ソームまたは輸送体分子などの別の実体物に複合体化される方法。
、上記の投与経路を使用して、または当業者に知られている、特定の適用に適切
な代わりの経路を使用して、好ましくは組成物の一部として本発明のベクターを
投与することを含む。ベクターの宿主細胞への本発明による効果的な遺伝子移入
は、治療効果(例えば、処置されている特定の疾患に関連する何らかの症状の緩
和)に関してモニターされ得るか、あるいはさらには、移入された遺伝子の証拠
または宿主内における遺伝子の発現によって(例えば、配列決定と結合したポリ
メラーゼ連鎖反応、宿主細胞内の核酸を検出するノーザンハイブリダイゼーショ
ンもしくはサザンハイブリダイゼーション、または転写アッセイ、あるいは免疫
ブロット分析、抗体媒介検出、mRNAもしくはタンパク質の半減期研究、また
は移入された核酸によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドを検出
する特定化されたアッセイ、またはそのような移入によるレベルまたは機能に影
響を与えるタンパク質もしくはポリペプチドを検出する特定化されたアッセイを
使用して)モニターされ得る。
適用に適するさらなる方法が当業者には明かである。さらに、組成物の有効量は
、所望する効果を発揮することが知られている化合物との類似性によってさらに
近似され得る。
投与されるかどうかに依存して、または薬理動態学、薬物の性質および代謝にお
ける個人間の差に依存して変化し得る。同様に、量は、利用される特定の細胞株
に依存して、(例えば、細胞表面に存在するベクター受容体の数、または遺伝子
移入のために用いられた特定のベクターがその細胞株で複製する能力に基づいて
)インビトロ適用では変化し得る。さらに、細胞あたり加えられるベクターの量
は、ベクター内に挿入されている治療遺伝子の長さおよび安定性によって、同様
にまた配列の性質によっても変化すると考えられ、そして特に、経験的に決定し
なければならないパラメーターであり、本発明の方法に固有的でない要因(例え
ば、合成に関連するコスト)により変化し得る。当業者は、特定の状況の要求に
従って何らかの必要な調節を容易に行うことができる。
図するものではない。
約12分という比較的短い半減期をもっている。GHRHの生物学的半減期を延
長し、および/またはGH分泌促進物質活性を向上させるGHRH類似体を用い
ることによって、GH分泌の促進が実現される。部位特異的突然変異誘発法によ
ってGHRH変異体を作出した。Gly15をAla15で置換して、α−ヘリ
ックス立体配座と両親媒性構造を増加させ、トリプシン様酵素による切断を減少
させた(Suら、1991)。Ala15を置換したGHRH類似体は、GHR
Hレセプターに対して4〜5倍高い親和性を示す(Campbellら、199
1)。Metの酸化による生物活性の減少を抑えるため、遊離のCOOH−末端
をもつ分子(Kubiakら、1989)を利用した、僅かではあるがより安定
性の高い形態になるよう、Leu27およびAsn28によるMet27および
Ser28の置換を行なった。このようにして、GHRH−15/27/28と
名付けた3アミノ酸置換変異体を作製した。ジペプチジルペプチダーゼIVは、
主要な血清GHRH分解酵素である(Walterら、1980; Marti
nら、1993)。GHRH−15/27/28を用い、Ile2をAla2(
GHRH−TI)またはVal2(GHRH−TV)で置き換えるか、あるいは
、Tyr1およびAla2をHis1およびVal2(GHRH−HV(図1A
);H1V2A15L27N28)に変換することにより、より不十分なジペプ
チダーゼ基質を作出した。
クチン、複数のMEF−2部位、複数のMEF−1部位、およびTEF−1結合
部位に由来する近位血清応答配列を含む、新規の合成筋肉プロモーターであるS
Pc5−12によって最大量の骨格筋特異的遺伝子発現を誘発することができる
プラスミドベクターを設計した(Liら、1999)。pGHRHの228塩基
対の断片で、31アミノ酸のシグナルペプチド、およびブタGHRH(Tyr1
−Gly40)の全長成熟ペプチドおよび/またはGHRH変異体をコードし、
その後ろにhGH cDNAの3' 非翻訳領域が続いている断片を、当技術分野
において周知されている方法により、筋原性GHRH発現ベクターの中に組み込
んだ。プラスミドpSPc5−12は、土台であるpSK−GHRH(Drag
hia−Akliら、1997)のSacI/BamHI部位に、SPc5−1
2合成プロモーターの360塩基対からなるSacI/BamHI断片(Liら
、1999)を含んでいる。
te II in vitro Mutagenesis System)(ウ
ィスコンシン州マディソンのプロメガ社(Promega)というキットを用い
たヒトGHRH cDNA(配列番号:8)の部位特異的変異誘発によって、野
生型および変異型のブタGHRH cDNAが得られた。ヒトGHRH cDN
AをBamHI−HindIII断片として、pALTERプロメガベクターの
対応部位にサブクロニーングし、製造業者の指示に従って変異誘発を行なった。
ブタの野生型cDNAは、ヒトのcDNAから、配列番号2のプライマー:5'
−AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGC
ATAATGACTGCAG−3' を用いて、ヒトの34番目と38番目のアミ
ノ酸を変更することによって得られた。ブタHV変異は、配列番号3のプライマ
ー:5' −ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCA
TCTTCACCAAC−3' を用いて作出した。ブタ15Ala変異は、配列
番号4のプライマー:5' −CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTC
CGCC−3' を用いて作出した。ブタ27Leu28Asn変異は、配列番号
5のプライマー:5' −CTGCTCCCAGGACATCCTGAACAGG
CAGCAGGGAGAG−3' を用いて作出した。変異誘発後、適正さを確認
するために得られたクローンの配列を決定した後、当業者にとって周知の方法に
より、本実施例で説明したpSK−GHRHのBamHI/HindIII部位
にサブクロニーングした。
s)(配列番号:9;GenBank受入番号NM_010285)、ウシ(B
os tauras)(配列番号:10;GenBank受入番号AF1686
86または配列番号:11;GenBank受入番号BTU29611)、ウマ
(Equus caballus)(配列番号:12; GenBank受入番
号AF097587)、ラット(Rattus norvegicus)(配列
番号:13;GenBank受入番号RNU10156)に由来する配列など、
他のGHRH配列を利用できることが知られている。
なったところ、同じようにうまく行った。しかしながら、図はすべて、ブタの下
垂体前葉培養で得られたデータを示している。ニワトリの初代筋原細胞培養は、
以下のようにして得られた。ニワトリの胚組織を取り出し、皮膚と軟骨から切り
離して、機械的に分離させた。細胞懸濁液をチーズクロスとレンズペーパーに通
してから、100mmプラスチック製培養皿当たり1×108 から2×108 の
密度で播いた。懸濁液中に残っている細胞集団を、コラーゲンコートした100
mmプラスチック製培養皿当たり2×106 から3×106 の密度に播いて、5
%CO2 環境中37℃でインキュベートした。そして、形質転換を行なう前24
時間、細胞を100mmプレート当たり1.5×106 の密度で、10%熱非働
化ウマ血清(HIHS)、5%ニワトリ胚抽出物(CEE)(ニューヨーク州グ
ランドアイランドのギブコBRL(Gibco BRL)、およびゲンタマイシ
ンを添加した最少必須培地(MEM)の中でインキュベートした。さらに詳しく
は、Draghia−Akliら、1997およびBergsmaら、1986
を参照されたい。ブタの下垂体前葉培養は、本質的に既述された通りにして得ら
れた(Tannerら、1990)。簡単に言うと、下垂体組織を酵素条件下で
分離させ、プラスチック製の皿に播き、十分な時間を置いて接着させた。そして
、細胞をリンスし、実験前にインキュベーション用培地に入れた。詳細について
は、Tannerら(1990)を参照されたい。
4mgのプラスミドにより細胞を形質転換した。形質転換後、培地を2%HIH
Sおよび2%CEEを含むMEMに変えて細胞を分化させた。分化させてから7
2時間後に培地と細胞を回収した。形質転換の効率は、対照用プレートのβ−ガ
ラクトシダーゼ組織化学法によって10%であると推定された。回収の一日前に
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中で2回洗浄し、培地をMEM、0.1%ウシ
血清アルブミンに変えた。ならし培地に0.25倍容の1%トリフルオロ酢酸と
1mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを加えて処理し、−80℃で凍結
させ、凍結乾燥させ、C−18 Sep−カラムで精製し(カリフォルニア州ベ
ルモントにあるペニンシュララボラトリーズ社(Peninsula Labo
ratories)、再凍結乾燥してから、放射免疫測定法に使用するか、初代
ブタ下垂体前葉培養用に条件を整えた培地に再懸濁した。
細胞から精製したGHRH部分を、ブタ下垂体前葉培養細胞における成長ホルモ
ン分泌を調べるために測定した。図1Bに示すように、24時間後に培地を回収
し、ブタ特異的GH放射免疫測定法によって定量したところ、改変したGHRH
分子種(GH15/27/28; GHRH−TI; GHRH−TV)は、G
H分泌において、野生型pGHRHよりも約20%から50%という小幅な増加
が見られた。4種類の変異体のうちGHRH−HV一種類だけが、GH分泌促進
物質活性を実質的に上昇させ、pGH量は、200ng/mlという基準値から
1600ng/mlまで上昇した(図1B)。
合成によって、化学合成したHV−GHRHを調製した。ブタ血漿を融解して遠
心分離し、37℃に置いて平衡化させた。GHRH変異体を血漿サンプルに溶解
して、最終濃度100μg/mlとした。GHRH変異体を加えた直後、ならび
に15、30、60、120および240分後、1mlの血漿を取り出して、1
mlの1M TFAで酸性にした。酸性化血漿をC18アフィニティーSEP−
Pakカラムで精製し、凍結乾燥してから、ウォルターズ600マルチシステム
送達システム、ウォルターズ717型インテリジェントサンプルプロセッサー、
およびウォルターズ分光測定装置490(マサチューセッツ州ミルフォードにあ
るミリポア社、ウォルターズアソシエイツ社(Walters Associa
tes, Millipore Corp.)を用いたHPLCで分析した。2
14nmで検出を行なった。これらの時点で分解されたペプチドの割合を統合ピ
ーク測定法によって測定した。
の中で、GHRHペプチドをインキュベートすることによって調べ、その後、固
相抽出およびHPLC解析を行なった。図1Cに示すように、野生型GHRH(
1−44)NH2 の95%は、血漿中でインキュベートしてから60分以内に分
解した。これに対して、ブタ血漿中でのGHRH−HVをインキュベートしたと
ころ、インキュベートして4時間から6時間の間、少なくとも75%のポリペプ
チドが、酵素切断から保護されたことが示された。したがって、同一条件下で、
野生型GHRHは完全に分解されるが、GHRH−HVの主要部分は元のままで
あり、このことは、血清プロテアーゼに対するGHRH−HVの安定性がかなり
増加したこと示している(図1C)。
ランドレース種、ハンプシャー種、およびデュロック種)5頭からなる群を3つ
用いた。動物は一個体ずつ収容して、無制限に水を与え、体重の6%を食餌量と
した(24%タンパク質のブタ用飼料、テキサス州ブライアンにある生産者協同
組合連合)。動物の体重を1日おきに午前8時30分に測ってから飼料を与えた
。動物は、NIHの指針、USDAおよび動物保護法の指針に従って飼育した。
びpSPc5−12bgalのエンドトキシンを含まないプラスミド(カリフォ
ルニア州チャットワースにあるキアゲン社(Qiagen Inc.)標品をP
BS(pH7.4)で1mg/mlに希釈した。動物をいずれかの処理に同数振
り分けた。ブタは、イソフルラン(誘導には2〜6%濃度、維持には1〜3%)
で麻酔した。外科処理によって頸部カテーテルを埋め込み、注射後3、7、14
、21、28、45および65日目に動物から血液を取り出した。麻酔しながら
、ブタの半腱様筋の中に直接、10mgのプラスミドを注射した。注射してから
2分後に、注射された筋肉を、1組のカリパスの間におき、200V/cmで6
0ミリ秒間4回パルスという最適条件を用いてエレクトロポレーションした(A
iharaら、1998)。注射後65日目に動物を殺して、内臓と注射した筋
肉を集め、重量を量ってから、液体窒素で凍結し、−80℃で保存した。死体の
重さを量り、中性子活性化法によって解析した。背中の脂肪を測定した。
すなわちGHとIGF−1の血清レベルを上昇させる 最適化されたプロテアーゼ耐性pSP−HV−GHRHベクターが、長期間に
わたってGHRHを発現させ、GHおよびIGF−1の分泌量を刺激することが
できるかを判定した。pSP−HV−GHRH、ならびに、野生型対照である野
生型構築物pSP−wt−GHRH、および偽薬対照である、合成筋原性プロモ
ーター大腸菌β−ガラクトシダーゼ発現ベクターpSP−bgalのマップの概
要を図2Aに示す。3週齢の去勢した雄ブタを麻酔してから、頸部静脈カテーテ
ルを挿入し、動物に不快感を与えることなく血液サンプルを採集できるようにし
た。プラスミド発現ベクターDNA(pGHRH−HV、pSP−GHRH、ま
たはpSP−bgalのDNAを10mg)を半腱様筋の中に直接注射してから
、エレクトロポレーションした(実施例7参照)。
ララボラトリーズ社(Peninsula Laboratories))によ
ってブタGHRHを測定した。測定法の感度はチューブ当たり1pgである。特
異的な二重抗体法であるRIA(ペンシルバニア州立大学)によって血漿中のブ
タGHを測定した。この測定法の感度はチューブ当たり4ngである。異種であ
るヒトのアッセイ法(テキサス州ウェブスターにあるダイアグノスティックシス
テムラブ社(Diagnositc System Lab.))によってブタ
IGF−1を測定した。マイクロソフトエクセル(Microsoft Exc
el)統計解析用パッケージを用いてデータを解析した。図中に示した値は、平
均値±平均値の標準誤差である。具体的なp値は、スチューデントのt検定を用
いた比較によって得た。p<0.05を統計的有意性のレベルとした。半腱様筋
肉にpSP−GHRH−HVを注射したブタでは、注射後7日目にGHRHレベ
ルが上昇し(図2B)、14日目には対照のレベルよりも150%高くなった(
652.4±77pg/ml対419.6±13pg/ml)。pSP−GHR
H−HV発現活性は、60日後までに偽薬注射対照値よりも約2〜3倍高いレベ
ルになってプラトーに達した。pSP−GHRH−HVを注射したブタによって
分泌された血清GHRHの絶対量で、0日目から60日目の間の体重増加に対す
る補正を行なったもの(血液の容量は、全体重の8%を占める)は、偽薬を注射
した対照の値よりは3倍高かった(1426.49±10.47ng対266.
84±25.45ng)(図2C)。野生型のpSP−GHRHを注射された動
物は、半腱様筋内に注射されたが、注射後45日目からほんの少しだけGHRH
レベルの増加を示した。しかし、注射後60日目までに、生物学的作用を誘引す
るには十分なレベルである2倍の増加(779.36ng)を示した。
。最初の注射から7日および14日後に24時間にわたって15分おきに採取し
た血液サンプルについて、pGHレベルを測定し、このレベルをpGHの内容量
の全変化について外挿した。pGHRH−HVを注射したブタ(図2D)は、注
射後7日目(デルタ変動HV=+1.52、wt=−0.73に対して対照=−
3.2ng/ml)、および14日目(デルタ変動HV=+1.09、wt=−
4.42に対して対照=−6.88ng/ml)に明らかにGH内容量の増加を
示した。
。血清におけるブタIGF−1のレベルは、pSP−GHRH−HVを注射した
ブタでは、注射後約3日目から上昇し始めた(図2E)。21日目には、これら
の動物では、平均して約3倍の血清IGF−1レベルの増加があり、これは60
日間にわたって維持された(p<0.03)。相対的に、野生型pSP−GHR
H発現ベクターを注射したブタでは、図2Eに示すように、循環IGF−1レベ
ルは40%増加しただけであった(p=0.39)。
分泌されるブタGHは、去勢された若い雄ブタにおいて、65日間にわたって成
長を促進する。注射後30日目と65日目にインビボで(デンシトメトリー、K
40)、または死後(器官、死骸、体脂肪、直接解剖した後に中性子活性化チャ
ンバーに入れる)に、身体の組成を測定した。図3Aに示すとおり、野生型pS
P−GHRHを注射した動物は、偽薬対照よりも平均して21.5%重かった(
37.125kg対29.375kg)が、pSP−GHRH−HVを注射した
ブタは37.8%重かった(41.775kg;p=0.014)。飼料効率も
、GHRH構築物を注射されたブタでは、対照と比較して20%向上していた(
pSP−HV−GHRHでは、1kg毎体重を増加させるのに1日当たり0.2
67kgの飼料、pSP−wt−GHRHでは0.274kg、これに対し、p
SP−bgalを注射したブタでは0.334kg)(図3B)。デンシトメト
リー、K40カリウムチャンバー、および中性子活性化チャンバーによる身体組
成の研究によって、GHRHを注射した動物では全ての身体組成が比例して増加
し、臓器の巨大化、体脂肪の相対割合、およびそれに関連する病理の兆候は見ら
れないことが明らかになった。偽薬を注射された対照用ブタ、およびpSP−G
HRH−HVを注射したブタの45日後の写真を図3Cに示す。
清内の尿素量の減少を明らかに示しており、pSP−GHRHおよびpSP−G
HRH−HVでそれぞれ(対照では9±0.9mg/dl、注射したブタでは8
.3±1mg/dlおよび6.875±0.5mg/dl)(p= 0.006
)であり、これは、アミノ酸の異化作用が低下したことを示している。血清のグ
ルコースレベルは、対照とプラスミドGHRH注射ブタとの間で同じ位であった
(対照用ブタで99.2±4.8mg/dl、pSP−GHRH−HVを注射し
たブタでは104.8±6.9mg/dl、また、野生型pSP−GHRHを注
射した動物では97.5±8mg/dl(P= 0.263))。この他の代謝
における変化は見られなかった。
2匹の子ブタからなる群に生後10日目にpSP−HV−GHRH(3mg、1
mg、100μg)を注射した。図4に示すように、100マイクログラムのプ
ラスミドを注射された群が最も優れた成長曲線を示し、50日齢以後、対照との
差が統計的に有意になった。3mgを注射された群の一匹は抗体を発生させ、成
長パターンが有意に低下した。
からなる群に注射した。IGF−1値は、注射後10日目に上昇し始め、注射後
35日目には、100マイクログラムのプラスミドを注射されたブタは、対照よ
りも平均して10.62倍高いIGF−1値を示した。1mg注射されたブタは
、対照よりも平均7.94倍高く、3mgを注射されたブタでは、対照値の平均
して1.16倍であった。
り低量にして注射する。具体的な実施態様では、約100マイクログラム(0.
1ミリグラム)のプラスミドを用いる。別の具体的な実施態様では、約200−
300マイクログラムを注射する。
子ブタからなる群に出生したときから開始して2mgのpSP−HV−GHRH
を注射した。図6に示すように、出生してから14日後に注射した群が、すべて
の時点で、対照と比較して統計学的に有意な差をもつ、もっとも良好な成長曲線
を示した。21日目に注射された群の一匹の動物が抗体を発生させて、成長パタ
ーンを有意に低下させた。あまりに早く(すなわち、約10〜14日齢未満で)
処理を行なうと、インシュリン耐性が生じる可能性がある。具体的な実施態様に
おいて、この治療法は、天然のGHおよびIGF−1レベルが最も低いとき(生
後約10〜14日目)が最も効果的であり、GHRHレベルが通常高いときには
逆効果になる可能性がある。
目で、対照よりも平均8ポンド重い)。注射をするのに好適な投与量は、2〜5
ml容量中100マイクログラムのプラスミドである(注射後40日目で、対照
よりも平均して6ポンド重い(p<0.02)。雌ブタ1(経時)および雌ブタ
3(用量曲線)の子孫では、ホルモンおよび生化学的な定数(IGF−1、IF
G−BP3、インシュリン、尿素、グルコース、全タンパク質、クレアチニンな
ど)は正常であり、体重の増加に相関しており、有害な副作用がない。以前行な
った実験から身体組成を調べたところ、HV−GHRHは、あらゆる身体区分の
均一な増加(対照と同じような身体組成であるが大きい)を決定づけ、wt−G
HRHは、除脂肪体重の増加と脂肪の減少を決定づけることが明らかになった。
おける当業者のレベルを示すものである。すべての特許および刊行物は、それぞ
れ個々の刊行物が具体的かつ個別的に参照により取り込まれたことを示した場合
と同じ程度まで、本明細書において参照により取り込まれる。
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dney Int.Suppl. 53:S126-7;S126-S127 。
、ならびに本明細書に内在するものを得るために、本発明が十分適応されること
を容易に認識する。本明細書に記載された成長ホルモン、成長ホルモン放出ホル
モン、類似体、プラスミド、ベクター、医薬組成物、処置、方法、手段および技
術は、好ましい態様の代表例を表し、例示を意図するものであり、本配列の範疇
を制限するものとして意図されたものではない。そこでの変更およびその他の使
用は、当業者に見出されるものであり、本発明の精神内に包含されるかまたは係
属中の請求の範囲により規定されるものである。
定性を増大させることを明らかにしている図。図1Aは、ブタの野生型(1−4
0)OHアミノ酸配列とその類似体HV−GHRHとの比較の図。図1Bは、ブ
タの初代下垂体培養におけるブタGH放出に対する種々のGHRH種の作用を示
している図。図1Cは、4時間〜6時間のインキュベーションを行っているとき
のHV−GHRHおよび野生型ブタGHRHについて生じる安定性の変化を明ら
かにしている図。
した後の2ヶ月間にわたるGHRH、GHおよびIGF−Iの血清レベルの増大
を明らかにしている図。図2Aは、SPc5−12合成プロモーターおよびGH
の3’UTRを含む構築物を示している図。変異型タンパク質のモデルとして、
HV−GHRH構築物が使用され、これは、陽性対照としてのブタ野生型と比較
され、そして陰性対照としてのβ−ガラクトシダーゼ構築物と比較されたことを
示す。図2Bは、pSP−GHRH注射ブタ対プラセボ注射対照ブタにおける血
清GHRHの相対的なレベルを例示している図。図2Cは、体重/血液容量増大
について補正された、対照ブタに対するpSP−GHRH注射ブタにおける血清
GHRHの絶対値を明らかにしている図。図2Dは、pSP−HV−GHRH注
射ブタにおけるGHレベルの変動を示している図。図2Eは、pSP−GHRH
構築物を直接筋肉内に注射した後の血漿IGF−Iレベルを示している図。
明らかにしている図。図3Aは、pSP−GHRHまたはpSP−GHRH−H
Vが2ヶ月間にわたって注射されたブタにおける平均体重の変化を示している図
。図3Bは、対照に対するpSP−GHRH注射ブタにおける飼料効率の状態を
示している図。図3Cは、pSP−HV−GHRH注射ブタおよびプラセボ注射
対照ブタの注射後45日目の比較である図。
した効果を明らかにしている図。
P−GHRH−HVを注射した効果を示している図。
を例示している図。
Claims (21)
- 【請求項1】 組成物としての配列番号1のアミノ酸配列を有する成長ホル
モン放出ホルモン。 - 【請求項2】 医薬的に許容されうる担体中に請求項1に記載の成長ホルモ
ン放出ホルモンを含有する、動物における成長ホルモンの放出を刺激するための
医薬組成物。 - 【請求項3】 組成物としての配列番号1のアミノ酸配列を有する成長ホル
モン放出ホルモンをコードするヌクレオチド配列。 - 【請求項4】 プロモーター、配列番号1をコードするヌクレオチド配列、
および機能的発現のために作動可能に連結されている3’非翻訳領域を含有する
ベクター。 - 【請求項5】 前記プロモーターが合成筋原性プロモーターである請求項4
に記載のベクター。 - 【請求項6】 前記3’非翻訳領域がhGH3’非翻訳領域である請求項4
に記載のベクター。 - 【請求項7】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を動物に導入する
工程を含む、動物において成長ホルモンを増加させる方法。 - 【請求項8】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を動物に導入する
工程を含む、動物において成長ホルモン経路に付随する成長ホルモン関連欠乏疾
患を処置する方法。 - 【請求項9】 前記欠乏疾患が前記動物において遺伝物質の変化の結果であ
る請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を導入する工程
を含む、動物において成長成績を改善する方法。 - 【請求項11】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を導入する工程
を含む、動物の効率を増大させる方法。 - 【請求項12】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を導入する工程
を含む、動物において消耗性症状(ここで、前記消耗性症状は、火傷、外傷、A
IDSその他の消耗性疾患に付随するものである)を処置する方法。 - 【請求項13】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を導入する工程
を含む、動物において成長を増進させる方法。 - 【請求項14】 請求項4に記載のベクターの治療上有効量を導入する工程
を含む、成長ホルモン経路に付随する成長ホルモン関連欠乏疾患を処置する方法
。 - 【請求項15】 前記動物がヒト、愛玩動物、家畜、および使役動物からな
る群より選ばれる請求項7、8、9、10、11、12、13、または14に記
載の方法。 - 【請求項16】 前記ベクターが筋原性細胞に導入される請求項7、8、9
、10、11、12、13、または14に記載の方法。 - 【請求項17】 前記ベクターが前記動物の筋肉組織に導入される請求項7
、8、9、10、11、12、13、または14に記載の方法。 - 【請求項18】 前記ベクターが1回の投与で前記動物に導入される請求項
7、8、9、10、11、12、13、または14に記載の方法。 - 【請求項19】 前記ベクターがプラスミド、ウイルスベクター、リポソー
ム、およびカチオン性脂質からなる群より選ばれる請求項4に記載のベクター。 - 【請求項20】 動物に治療上有効量のベクターを導入する工程を含み、 前記ベクターは、合成筋原性プロモーター; 配列番号1をコードするヌクレオチド配列;および 機能的発現のために作動可能に連結されているhGHの3’非翻訳領域 を含有する、 動物において成長ホルモン経路に付随する成長ホルモン関連欠乏症を処置する方
法。 - 【請求項21】 動物において正常な成長に付随するレベルよりも大きなレ
ベルで成長ホルモンの産生を刺激する方法であって、前記方法は、前記動物に治
療上有効量のベクターを導入する工程を含み、前記ベクターは、合成筋原性プロ
モーター;配列番号1をコードするヌクレオチド配列;および機能的発現のため
に作動可能に連結されているhGHの3’非翻訳領域を含有する、方法。
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