PL167322B1 - Sposób wytwarzania zwiazków polipeptydowych PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób w ytw arzania zw iazków polipeptydow ych o wzorze (I) XX1T rpX2 X 3 X4 X 5 X 6 X 7 N H 2 (I) w którym X oznacza grupe X8A rg(lub D -A rg)X 9X10, X 8 oznacza desN H 2Pro, T yrP ro, desN H 2- T yrP ro, A da, P ro, D -P ro lub nie wystepuje, X 9 oznacza G ly, A la, D -A la lub nie wystepuje, X 10 oznacza A sn, Phe, D -Phe albo Phe lub D -Phe podstaw ione jednym lub wiecej atom am i chlorow ca, albo X oznacza grupe A -(C H 2)n-CO-, w której A oznacza grupe zaw ierajaca 1-3 pierscieni, z których co najm niej jeden jest pierscieniem arom atycznym , kazdy z ukladów pierscieniow ych moze byc ew entualnie podstaw iony, a grupa alkilenow a jest ew entualnie podsta- w iona 1-4 grupam i w ybranym i z grupy am inow ej, hydroksylow ej, C 1-4alkoksylowej i C 1-4alkilow ej, ew entualnie podstaw ionej chlorow cem , n jest rów ne 0-4, albo X oznacza grupe cyklopentylokarbonylow a podstaw iona grupa X 8A rg(lub D -A rg)X9X 10, zdefiniow ana powyzej, X 1 oznacza His, T hiA la lub nie wystepuje, X 2 oznacza A la, D -A la, C Penc, D -tB uG ly lub P ro, X 3 oznacza V al lub Val podstaw ione jednym lub wiecej atom am i chlorow ca, C4 oznacza G ly, A la, D -A la, Sarkozyne, P ro, D -Pro lub D -Phe, X 5 oznacza H is lub ThiA la, X8 oznacza D -P ro ? , P ro ? , 2-pirolidynylo-3-hydroksypropionyl lub D -P ro, X 7 oznacza N le, Leu, Phe, Val, M ox, D -Phe lub Phe albo D -Phe podstaw ione jednym lub wiecej atom am i chlorow ca, albo naftyloA la, naftyloD -A la, hydrofobow y, podstaw iony am inokw as arom atyczny, aralkiloam ine albo jest wykreslone, albo jego farm aceutycznie dopuszczalnej soli, zna- mienny tym , ze kondensuje sie am inokw asy i/lu b pochodne am inokw asów w zadana sekwencje i/lu b fragm enty peptydu, zaw ierajace te am inokw asy lub ich pochodne w zadanej sekw encji do uzyskania zadanego peptydu, dla laczenia peptydow ego aktyw uje sie albo koncow a grupe kw asu karboksylow ego lub koncow a grupe am inow a, a pozostale grupy chroni sie, p o czym z otrzym anego peptydu ew entualnie usuw a sie grupy ochronne i/lu b otrzym any peptyd przeprow adza sie w jego farm aceutycznie dopuszczalna sól. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związków polipeptydowych, posiadających właściwości antagonistyczne wobec bombezyny lub peptydów typu bombezyny, użytecznych w

167 322 3 leczeniu chorób, w szczególności drobnokomórkowego raka płuca, zespołu Zollinger-Ellison lub raka trzustki.

Bombezynajest tetradekapeptydem wyizolowanym ze skóry żaby. Ma ona wzór Glp-Gln-ArgGly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.

Peptyd uwalniający gastrynę jest peptydem o 27 aminokwasach, wyizolowanym z jelita świńskiego. Dziesięć ostatnich C-terminalnych aminokwasów peptydu uwalniającego gastrynę odpowiada, ze zmianą jednego aminokwasu (3), dziesięciu ostatnim aminokwasom bombenzyny, a mianowicie: H-Gly-Asn-His-T rp-Ala- Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.

Wiadomo (J. H. Walsh i J. R. Reeve, Peptides 6, (3), 63-68, (1985)), że bombezyny i peptydy typu bombezyny, takie jak peptyd uwalniający gastrynę są wydzielane u ludzi przez komórki drobnokomórkowego raka płuca (SCLC). Założono (P. J. Woli i E. Rozengurt, PNAS 85, 18591863, (1988)), że antagoniści czynnika uwalniającego gastrynę będą łączyć się konkurencyjnie z receptorami bombezyny u zwierząt i w związku z tym będą miały zastosowanie w leczeniu SCLC i/lub kontrolowaniu klinicznych symptomów związanych z tą chorobą i spowodowanych przez nadmierne wydzielanie tego hormonu peptydowego. Stwierdzono, że analogi bombezyny hamują wiązanie się peptydu uwalniającego gastrynę w linię komórek SCLC i hamują wzrost komórek SCLC in vitro i in vivo (S. Mahmoud i wsp., Cancer Research, 51, 1798-1802 (1991)).

Opisano szereg antagonistów bombezyny, np. [Leu¹³- ^(CH 2-NH)lLeu¹⁴]bombezynę i [Ala⁹^(CH2-NH)-Val¹0Leu¹⁴]bombezynę (Coy i współpracownicy, J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056) oraz 4-Pirydyl-CO-His-Trp-AIa-Val-D-Ala-His-Leu-OMe,4-Pirydyl-CO-His-Trp-Ala-Val-D-AlaHis-Leu-NHMe,4-Pirydyl-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-MeLeu-OMe, 3-Pirydyl-CO-His-TrpAla-Val-D-Ala-His-MeLeu-OMe, 4-Pirydyl-CO-His-Trp-Ala-Val-D-AlaLys(Z)-MeLeu-OMe, 3Indolil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-OMe, 4-Pirydyl-CO-HisTrp-Ala-Val-D-Ala-His-MeLeu-NHMe, 4-Pirydyl-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(Z)-LeuNHMe, 4-Pirydyl-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(COCH2Ph)-Leu-NHMe i 4-Pirydyl-CO-HisTrp-Ala-Val-D-Ala-Lys(COCH2CH2Ph)-Leu-NHMe.

(Zgłoszenie patentu europejskiego nr 345990A).

W podanym poniżej i w dalszej części opisu, wzorze (I) reszty aminokwasów oznaczono standardowymi skrótami (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331; European Journal of Biochemistry, 1984, 138, 9-37).

W celu uniknięcia wątpliwości zaznacza się, że: symbole aminokwasów oznaczają konfigurację L, jeśli inaczej nie zaznaczono przez D lub DL przed symbolem i oddzielono łącznikiem. (R) i (S) są standardowymi oznaczeniami konfiguracji cząsteczkowej.

Zastosowano następujące skróty:

Ψ = (CH2NH)

Ada = kwas 1-adamantanokarboksylowy CPenc = kwas aminocyklopentanokarboksylowy Mox = metoksynina

DesNH2Pro = kwas 1-cyklop en tanokarboksylowy DesNKkTyr = kwas (4'-hydroksy)-3-fenylopropionowy ThiAla = 3-(2-tienylo)~aIanina

D-tBuGly = D-III-rzęd.-butylo-glicyna (III-rzęd.D-Leucyna).

Gdy grupy Ada, CPenc, Mox, des NH 2 Pro, des NH2 Tyr znajdują się w łańcuchu polipeptydu, to są one w postaci karbonylowej.

Obecnie odkryto nową grupę polipeptydów, wykazujących silną aktywność antagonistyczną wobec bombezyny.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku hamują wytwarzanie peptydu uwalniającego gastrynę w komórkach ssaków i są użyteczne w zwalczaniu klinicznych objawów chorób, które powodują powstawanie nadmiernego wydzielania peptydu uwalniającego gastrynę (np. SCLC).

Sposobem według wynalazku wytwarza się polipeptyd o wzorze (I):

XX1TrpX2x³x4x⁵X⁶X^ZNH2 (D w którym X oznacza grupę X⁸Arg (lub D-Arg)X9X1°, X⁸ oznacza desNH2Pro, TyrPro, desNH2TyrPro, Ada, Pro, D-Pro lub nie występuje, X9 oznacza Gly, Ala, D-Ala lub nie występuje, X^w

167 322 oznacza Asn, Phe, D-Phe albo Phe lub D-Phe podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, albo X oznacza grupę A-(CH2)n-CO-, w której A oznacza grupę zawierającą 1-3 pierścieni, z których co najmniej jeden jest pierścieniem aromatycznym, każdy z układów pierścieniowych może być ewentualnie podstawiony a grupa alkilenowa jest ewentualnie podstawiona 1-4 grupami wybranymi z grupy aminowej, hydroksylowej, C1-4alkoksylowej i C1-4alkilowej, ewentualnie podstawionej chlorowcem, n jest równe 0-4, albo X oznacza grupę A-(CH2)n-CO-, w której A oznacza ewentualnie podstawioną resztę aromatyczną zawierającą 1-3 pierścieni, a grupa alkilenowa jest ewentualnie podstawiona 1-4 grupami wybranymi z grupy aminowej, C-i-^alkoksylowej i C1-4alkilowej ewentualnie podstawionej chlorowcem, n jest równe 1-4, albo X oznacza grupę cyklopentylokarbonylową podstawioną grupą X⁸ Arg (lub D-Arg)X⁹X^w, zdefiniowaną powyżej, χ1 oznacza His, Thi Ala lub nie występuje, X² oznacza Ala, D-Ala, CPenc, D-tBuGly lub Pro, X3 oznacza Val lub Val podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, X4 oznacza Gly, Ala, D-Ala, Sarkozynę, Pro, D-Pro lub D-Phe, X⁵ oznacza His lub ThiAla, X^e oznacza D-Pro ψ, Pro ψ,

2-pirolidynylo-3-hydroksypropionyl lub D-Pro, X⁷ oznacza Nle, Leu, Phe, Val, Mox, D-Phe lub Phe albo D-Phe podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, albo naftyloAla, naftyloDAla, hydrofobowy, podstawiony aminokwas aromatyczny, aralkiloaminę albo nie występuje.

Dogodnie A oznacza fenyl, naftyl, fenotiazynyl lub indolil. Korzystnie A oznacza fenyl lub naftyl.

Odpowiednimi podstawnikami pierścienia aromatycznego Ar są grupy hydroksylowa, fenylowa, chlorowiec, Cr-4alkilowa lub C1- 4alkoksylowa, ewentualnie podstawiona chlorowcem.

Korzystnie n jest równe 2.

Dogodnie X jest zakończone fragmentem desNH2.

Dogodnie X⁸ oznacza desNH2TyrPro lub des NH2Pro, X⁹ oznacza Gly lub D-Ala a X^w oznacza D-Phe. Korzystnie X oznacza desNH2Phe, desNH2Tyr, desNH 2TyrPro (lub D-Pro), Arg (lub D-Arg).

Korzystnie X1 oznacza His lub ThiAla; Korzystnie X2 oznacza Ala, Pro; Korzystnie X3 oznacza Val lub heksafluorowalinę; Korzystnie X4 oznacza D-Ala, D-Phe; Korzystnie X5 oznacza His, ThiAla; Korzystnie X^e oznacza D-Proψ, Proψ, Pro, D-Pro; Korzystnie X? oznacza Nle lub Phe, Leu, Metoksyninę, 2-Naftylo-2-Alaninę.

Korzystne polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku obejmują:

N-((R)--^^(^--^e^tol^:^^--^--^^2^i'tt^lo)f^rr^j^ii^i^;^ll^)-lfisT^Tr^^y^'l^V^£^Il^‘^-^-l^]^^H^i^]^-P^o0Nle-NH2

N-(YS}-2--6-Metoksy2-Naftylo)Propionylo))HisTrpAiaValD-AlaHisD-Pro<£Nle-NH2

N-((s)-3-Fenylobutyrylo)·HisT:rrAlaVaiD-A'iaHisD-ProψNle-NHN-((R)-3-Fenylobutrylo)~HisTrpAlaValD-AlaHisD-Proψ Nle-NHN-((3-FeRylo)Propionyio)-HisTrpAlaValD-Ala(3-(2-Thi)-Ala)D-Pn^Nle-NH2

N-((S)-3,3,3-Trifilloro-2-Metoksy-2-Fenylo-Propionylo)-HisTrpAlaValD-ProψNle-NH2

N-((R)-3_;.3_;3-Tl'iSfuoro-2-Metoksy-2-Fenylo-Propionyk))-HίsTrpAlaValD-ProψNle-NH2

N-3-(((4'-Hydroksy)Fenylo)Propiony'lo)-ProD-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGlyHisDPro <^Nle-NH2

N-(((4'-Hydro ksy)--^--^^i^;^Il^))^ir^]^i<^i^^ll^)--^i^o D-A rgHisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro ψLeuNH2

N-((3-Fenylo)Propionylo'>-HisT:rpAlaValD-AlaHisD-Proψmox-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-Pro^/Phe-NH2

N-((3^^e:^;do).P.ri^j^i^<^!nyil^)-T]^-pAI^V^^lD-AI:^:His^-Pro0Leu-NH2

N-((3-^!^t^:^;^lo)]^)^(^]^!^(^:^^l^o}^j^i^:5Tir^l^:^oV^]^l^-^]^:^oHii^^-Pro0Leu-NH^2

N-3-(((3''-Triftuoromet'yl^θ)Peίnyl^o)Prr)pίonyl^o)-HisTΓp Al^aVaID-AlaHisD-ProψLeu-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)~(3-(2-'Thi}-Ala)TrpAlaVaID-AlaHisD-ProψLeu-NH2

N-(deamino-Pro)-D-ArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValGlyHisD-ProψNle-NH2

N~((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValGlyFiisD-Pro<^Nle-NH2

N-(deamino-PrO)-D-ArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValD-AiaHisD-Pro0Nle-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro ψNle-NH2TyrProD-ArgGlyDPheHisTrpAlaValGlyHisD-Pro ψNle-NH 2 D-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGlyHisD-Pro ψΝΗNH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD~AlaHisD-ProPhe-NFϊί2

167 322

N-((3-Fenylo)Propionvlo)-HisTrpAlaValD~AlaHisD-Pro0(3-(2-Naftylo)-D-Ala)-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-PheHisD-Pro^Phe-NH2D-PheHisTrpAlaValDAlaHisD-Pro^Phe-NHk

N-((3-Feny!o)PropionyIo)-D-ProArgGlyD-PheHisTrpAlaValD-AlaHisD-PiO<^Phe-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-(3-(2-Thi)-Ala)-TrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaVal-(Sarkozyna)-HisD-Pro^Phe-NH2

N-3-(((4'-Hydroksy)Fenyio)Propionv’o}-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-(((2',6'-Dichloro)-2.-Fenylo)Acetylo)-HisTrpAlaVa][D-AlaHisD-Proi^Nle-NH2

N-(((3',4'-Dichloro)-2-Fenylo)Acetylo}-HisT;irpAlaValD-AlaHisD-Pro^Nle-NH2

N-(((4'-Hydroksy)-2-Fenylo)Acetylo>HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Nle-NH2

N-(1-Naftoilo>HisTrpAlaValD-AIaHisD-Pro^Nle-NH2

N-((3,7-Dihydroksy)-2-Naftoilo)-HisTirpAlaValD-AlaHisD-Pro0Nle-NH2

N-(((3,‘4-Dihydroksy)-2-Fenyło)Acetylo)-HisTrpAiaValD-AlaHisD-ProψNIe-NH2

N-(2-(3-Pirydylo)Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Nle-NH2

N-(2-(2-Tienylo)Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHίsD-ProψNIe-NH2

N-(((3^^1uoro^3-Fenylio)P^opiony^o)^^Hi^T^]3Al^V;^i:^-^.^l^aHi^^D-Pro0Nle-NH2

N-(((4-hydroksy-3-metoksy--2-Fenylo)Acetylo)-HisTrpAIaValD-AIaHisD-ProψNle-NH2

N-(((R)-(-)-2-Fenylo)Propionylo(pHisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-(((s)-( + )-2-Fenylo)Propionylo^-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2

N-(((Trans--2Fenylo)-CyklopΓopanoilo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-pΓoψPhe-NH2

N-(3-(1O-Fenotiazynylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2

N-((3-Metylo-3-Fenylo)Butyrylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2'-TrifluorometyIo--2-Fenylo)Acetylo)-HisTrpAIaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((3'-Trifluorometylo>2-Fenylo)Acetylo>HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro 0Phe-NH2

N-(((4'-·Trifluorometylo)-2-Feny!o)Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2',3'-Difluoro)-2-Fenylo-Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2',4'-Difluoro)-2-Fenylo)Acetylo)-HisTrpAlaVal·D-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2',6'-DifIuoro--2-FenyIo-Acetylo)-HisTrpAlaVaID-AIaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2-Amino)-2-Fenylo)Acetylo)-HisTrpAIaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(1-Naftoilo--HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((3' ,4' ,5'-Trimetoksy)-3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHis]D-ProψPhe-NH2

N-((6'-Metoksyy2-(2-Naftoiio)Propionyio)-HisTrpAlaViaD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-(((3'-Trifluorometylo)-3-Fenylo)Propionylo}-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((S)-3-Fenylo)Butyrylo>HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((4'-Metoksy)-3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((S}-2-HydΓoksy}-2-Fenylo)Acetylo))HisTrpAjlaV<αD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisPro^Phe-NH2

N-((2-Metylo-2-Fenyo)Propionylo)-HisTirpAlaViaD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-(3-(1-Naftylo)Propionylo--HisTrpAlaValD-AlaHisD-PΓoψPhe-NH2

N-(((E)-3-Fenylo)Butyrylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-PΓoψPhe-NH2

N-((9-Fluoroenoilo)-1-karbonylo--HisTrpAlaValD-AlaHisD-PΓoψPhe-NH2

N-(((2'-Metoksy)-3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-(((2',5'-Dimetoksy)-3-Feny[o)Propionylo}-HisTirpAlaV<aD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Proi^Tyr-NH2

N-(((2',3'-Dimetoksy)-3-Fenylo)PΓop!C'nylo)-HisTrpAlaVa^D-AlaHisD-ProψPhe-NH2

N-((3-Fenylo-PropionyIo--HisTrpAlaValD-AIaHis(3-(2-Pirolidynylo-3-Hydroksy-Propionylo^Phe-NH2 (Izochinolilokarbonylo)-HisTrpAleValD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2

N-((3-Fenylo)PropionyloFHisTrpAlaVaiD-AlaHisD-PiOi^Phe-NH2·

Sposobem według wynalazku wytwarza się również farmaceutycznie dopuszczalne sole lub pro-leki polipeptydów o wzorze (I)· Odpowiednimi farmaceutycznie dopuszczalnymi solami są sole addycyjne z kwasami, gdy polipeptyd jest wystarczająco zasadowy, np· zawiera jedną lub więcej reszt zasadowych, takich jak histydyna·

Dogodną farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem według wynalazku można wytwarzać z kwasem nieorganicznym, np· kwasem chlorowodorowym, bromowodorowym, siar6

167 322 kowym lub fosforowym albo z kwasem organicznym, np. kwasem octowym, cytrynowym, maleinowym, fumarowym, bursztynowym, winowym lub trifluorooctowym.

Polipetydy można wytworzyć sposobami dobrze znanymi w dziedzinie chemii peptydów, które można dostosować do syntezy analogicznych związków. Tak więc, np. polipeptyd można otrzymać za pomocą postępowania analogicznego do ujawnionego w „Solid Phase Peptide Synthesis“, Stewart i Young (opublikowanego przez Pierce Chemical Company, Illinois, 1984), „Principles of Peptide Synthesis“ (opublikowanego przez Springer-Verlas, Berlin 1984), „Practice of Peptide Synthesis“ (opublokowanego przez Springer-Verlag, Berlin, 1984) oraz „The Synthesis of a Tetrapeptide (J. Am. Chem. Soc., 83 2149 (1963)).

Sposób wytwarzania polipeptydu według' wynalazku polega na tym, że kondensuje się aminokwasy i/lub pochodne aminokwasów w żądaną sekwencję i/lub fragmenty peptydu, zawierające te aminokwasy lub ich pochodne w żądanej sekwencji do uzyskania żądanego peptydu, dla łączenia peptydowego aktywuje się albo końcową grupę kwasu karboksylowego lub końcową grupę aminową, a pozostałe grupy chroni się, po czym z otrzymanego peptydu ewentualnie usuwa się grupy ochronne i/lub otrzymywany peptyd przeprowadza się w jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

W sposobie według wynalazku tworzy się wiązanie amidowe przez sprzęganie dwóch jednostek peptydowych, z których jedna zawiera grupę kwasu karboksylowego lub jego reaktywną pochodną, a druga zawiera grupę aminową, w taki sposób że wytwarza się chroniony lub niechroniony polipeptyd o sekwencji wskazanej we wzorze I, po czym, jeśli to konieczne, grupy ochronne usuwa się.

W substancjach wyjściowych może występować tyle grup ochronnych ile jest rodników które mogą wymagać ochrony, np. kilka lub wszystkie z tych grup, które występują w produkcie jako wolne grupy hydroksylowe lub zasadowe grupy aminowe (pierwsze lub drugorzędowe grupy aminowe). Grupa lub grupy ochronne mogą być wybrane z opisanych w standardowych podręcznikach z dziedziny chemii peptydów, wymienionych powyżej. W publikacjach tych są również opisane różne metody usuwania grupy lub grup ochronnych.

Dogodną grupą ochronną dla zasadowej grupy aminowej (przy terminalnym N lub łańcuchu bocznym aminokwasu) jest, np. grupa arylometoksykarbonylowa, którą można usunąć przez uwodornienie nad katalizatorem, np. palladem na węglu drzewnym lub przez traktowanie kwasem nieorganicznym, np. bezwodnym fluorowodorem lub bromowodorem.

Szczególnie dogodną grupą ochronną zasadowej grupy aminowej jest, np. grupa alkoksykarbonylowa, np. grupa Boc, którą można usunąć przez traktowanie kwasem organicznym, np. kwasem trifluorooctowym albo przez traktowanie kwasem nieorganicznym, np. bezwodnym chlorowodorem lub bromowodorem; albo np. grupa 9-fluorofenylometoksykarbonylowa, którą można usunąć przez traktowanie zasadą organiczną, np. piperydyną.

Szczególnie dogodną grupą ochronną zasadowej grupy aminowej w łańcuchu bocznym Histydynyjest, np. grupa arylosulfonylowa, np. grupa tozylowa, którą można usunąć przez traktowanie hydroksyloaminą, np. N-hydroksytriazolem, zwłaszcza 1-hydroksybenzotriazolem, benzyloksymetylem lub t-butyloksymetylem.

Dogodną grupą ochronną grupy hydroksylowej jest, np. grupa arylometylowa, np. grupa benzylowa, którą można usunąć przez traktowanie kwasem nieorganicznym, np. bezwodnym fluorowodorem lub przez uwodornienie nad katalizatorem, np. palladem na węglu drzewnym; albo może to być np. grupa estryfikująca, np. acetylowa lub benzoilowa, którą można usunąć za pomocą hydrolizy zasadowej, np. wodorotlenkiem sodu.

Dogodną grupą ochronną grupy karboksylowej jest, np. grupa estryfikująca, np. grupa arylometylowa, np. benzylowa, którą można usunąć przez traktowanie kwasem nieorganicznym, np. bezwodnym fluorowodorem lub przez uwodornienia nad katalizatorem, np. palladem na węglu drzewnym; albo grupa alkilowa, C1-6alkilowa, np. ΙΙΙ-rz.butylowa, którą można usunąć przez traktowanie kwasem organicznym, np. trifluorooctowym.

Zwłaszcza dogodną ochroną grupy karboksylowej przy terminalnym atomie C uzyskuje się przez utworzenie np. estru, np. estru wytworzonego przez sprzężenie C-terminalnego aminokwasu i żywicy, np. usieciowanej żywicy hydroksymetylowany styren-diwinylobenzen; albo przez utworzenie np. amidu, np. amidu wytworzonego przez sprzężenie C-terminalnego aminokwasu i żywicy, np. usieciowanej żywicy metylobenzhydryloaminostyren-diwinylobenzen.

167 322 7

W sposobie według wynalazku można stosować każdą ze standardowych reakcji sprzęgania, np. opisanych w standardowych podręcznikach chemii peptydów, wymienionych powyżej·

Należy rozumieć, że jednostka peptydowa może zawierać jeden chroniony lub niechroniony aminokwas.

Dogodną reakcją sprzęgania jest, np. reakcja sprzęgania w roztworze, np. sprzęgania aktywnego estru, sprzęganie azydowe lub sprzęganie wywiązujące N,N'-dicykloheksylokarbodiimid,

1-hvdroksybenzotriazol i BOP (heksafluorofosforan benzotriazol-1-ilo-oksy-tris-/dimetyloamino)fosfoniowy.

Odpowiednią reaktywną pochodną jednostki peptydowej, zawierającą grupę kwasu karboksylowego jest, np. halogenek acylu, np. chlorek acylu, wytworzony w reakcji kwasu i chlorku kwasu nieorganicznego, np. chlorku tionylu; mieszany bezwodnik, np. bezwodnik wytworzony w reakcji kwasu i chlorowcomrówczanu, np. chloromrówczanu izobutylu; albo azydek acylu, np. azydek wytworzony w reakcji kwasu i azydku, takiego jak azydek difenylofosforylu.

Zwłaszcza dogodną reaktywną pochodną jednostki peptydowej, zawierającą grupę kwasu karboksylowego jest, np. produkt reakcji kwasu i karbodiimidu, np. N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu lub N,N'-diizopropylokarbodiimidu, albo jest to produkt reakcji kwasu, N-hydroksytriazolu, np. 1-hydroksybenzotriazolu i karbodiimidu, np. N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu lub N,N'-diizopropylokarbodiimidu.

Korzystnie jest np. stosować syntezę w fazie stałej, w której aminokwas, który ma być C-terminalnym aminokwasem polipeptydu według wynalazku, jest chroniony przy grupie aminowej alfa i, jeśli to konieczne, w łańcuchu bocznym i przyłączony do stałego podłoża, np. żywicy, np. usieciowanej żywicy hydroksymetylowany lub metylobenzhydryloamino-styren-diwinylobenzen przez wiązanie, odpowiednio, estrowe lub amidowe, po czym grupę ochronną grupy alfa-aminowej usuwa się. Aminokwas, który ma być przyłączony do C-terminalnego aminokwasu jest chroniony przy grupie alfa-aminowej i, jeśli to konieczne, w łańcuchu bocznym i sprzęgany z C-terminalnym aminokwasem, który pozostaje przyłączony do stałego podłoża. Etapowy proces usuwania grup ochronnych z grupy alfa-aminowej i sprzęganie z następnym aminokwasem powtarza się, do otrzymania chronionego lub niechronionego polipeptydu przyłączonego do stałego podłoża.

Chroniony lub niechroniony polipeptyd może być uwalniany ze stałego podłoża z hydroksymetylowanej żywicy, np. za pomocą hydrolizy, np. hydrolizy kwasowej za pomocą np. kwasu organicznego, np. kwasu trifluorooctowego lub za pomocą, np. kwasu nieorganicznego, np. bezwodnego fluorowodoru lub bromowodoru; albo polipeptyd uwalnia się za pomocą, np. alkoholizy, np. metanolizy, w obecności zasady, np. zasady organicznej, np. diizopropyloetyloaminy, po czym, jeśli to konieczne, grupy ochronne usuwa się.

Gdy stosuje się żywicę metylobenzhydryloaminową, chroniony lub niechroniony polipeptyd można uwalniać ze stałego podłoża, np. przez traktowanie kwasem nieorganicznym, np. fluorowodorem, po czym, jeśli to konieczne, usuwa się grupy ochronne.

Ponadto korzystnie jest, np. stosować syntezę w fazie stałej, w której aminokwas, który ma być łącznikiem z łańcuchem aminokwasów tworzących polipeptyd według wynalazku, jest chroniony przy grupie alfa-aminowej i, jeśli to konieczne, w łańcuchu bocznym i przyłączony do stałego podłoża, np. opisanej wyżej żywicy, po czym usuwa się grupę ochronną grupy alfa-aminonowej. Aminokwas, który ma być przyłączony do aminokwasu sprzężonego ze stałym podłożem jest chroniony przy grupie alfa-aminowej i, jeśli to konieczne w łańcuchu bocznym i przyłączony do aminokwasu, który pozostaje sprzężony ze stałym podłożem. Etapowy proces usuwania grupy ochronnej grupy alfa-aminowej i sprzęgania z następnym aminokwasem powtarza się do otrzymania chronionego lub niechronionego polipeptydu przyłączonego do stałego podłoża.

Chroniony lub niechroniony polipeptyd można uwalniać ze stałego podłoża, np. stosując jedną z wyżej opisanych metod, po czym można przyłączyć następną jednostkę peptydową, stosując reakcję sprzęgania w roztworze, opisaną powyżej, po czym jeśli to konieczne, usuwa się grupy ochronne.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku wykazują działanie antagonistyczne wobec bombezyny, które może być ukazane przez ich zdolność do inhibitowania procesu wywoływania mitozy stymulowanego Bombezyną C w komórkach fibroblastowych myszy Swiss 3T3, co określono przez wychwyt [³H]-tymidyny.

167 322

Ze związków wytworzonych sposobem według wynalazku wytwarza się kompozycję farmaceutyczną, zawierającą polipeptyd o wzorze I lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.

Kompozycje mogą być w postaci do stosowania doustnego, np. tabletka, kapsułka, roztwór wodny lub olejowy, zawiesina lub emulsja; do stosowania donosowego, np. proszki do wąchania, preparat do rozpylania lub krople do nosa; do stosowania dopochwowego lub doodbytniczego, np. czopki; do podawania przez inhalację, np. w postaci subtelnie rozdrobnionego proszku lub ciekłego aerozolu; do stosowania podjęzykowego lub dopoliczkowego, np. tabletka lub kapsułka; do stosowania pozajelitowego (obejmującego podawanie dożylne, podskórne, domięśniowe, donaczyniowe lub infuzje), np. sterylne wodne' lub olejowe roztwory lub zawiesiny.

Ogólnie powyższe kompozycje można wytwarzać w sposób konwencjonalny, stosując konwencjonalne dodatki. Jednakże, w przypadku kompozycji do podawania doustnego, może być dogodne dla kompozycji dodanie powłoki w celu ochrony polipeptydowego składnika aktywnego przed działaniem enzymów w żołądku.

Kompozycje według wynalazku może również zawierać dodatkowo do peptydu wytworzonego według wynalazku, jedną lub więcej znanych substancji przecinakowych, wybranych z, np. inhibitorów mitozy, np. winblastyny; środków alkilujących, np. cis-platyny, karboplatyny i cyklofosfamidu; antimetabolitów, np. 5-fluorouracylu, arabinozydu cytozyny i hydroksymocznika; antybiotyków włączanych pomiędzy, np. adriamycyny i bleomycyny; enzymów, np. asparaginazy, inhibitorów topoizomerazy, np. etopozydu i ich modyfikatorów biologicznych, np. interferonu.

Korzystną kompozycją jest np. kompozycja do podawania doustnego w postaci dawek jednostkowych, np. tabletek lub kapsułek, zawierających od 2,5 do 500 mg, korzystnie 10 do 100 mgpolipeptydu w każdej dawce jednostkowej lub kompozycja do podawania pozajelitowego, zawierająca od 0,5 do 100 mg polipeptydu na ml, korzystnie 1 do 10 mg polipeptydu na ml roztworu.

Kompozycja pozajelitowa jest korzystnie roztworem w izotonicznej solance lub izotonicznej dekstrozie, zbuforowanej, jeśli to konieczne, do wartości pH 5 do 9. Alternatywnie, kompozycja pozajelitowa może być przeznaczona do powolnego uwalniania i wtedy ilość peptydu na dawkę jednostkową jest na ogół większa niż wymagana dla konwencjonalnego preparatu do wstrzykiwania. Korzystnym preparatem o powolnym uwalnianiu jest np. preparat o stałym uwalnianiu, np. preparat typu opisanego w opisach patentowych USA nr nr 4767628 i 5004602. Korzystny pozajelitowy preparat o powolnym uwalnianiu zawiera od 10 do 100 mg polipeptydu na dawkę jednostkową. Innym korzystnym preparatem o powolnym uwalnianiu jest polipeptyd mikrokapsułkowy, w którym stosuje się biodegradujący się, biokompitybilny kopolimer. Preparaty te korzystnie podaje się dożylnie, z tym że podawanie może również być prowadzone za pomocą iniekcji podskórnych, domięśniowych lub śródskórnych.

Polipeptydy są środkami terapeutycznymi wymagającymi wyspecjalizowanych prepatarów farmaceutycznych do efektywnego bezpiecznego i dogodnego stosowania przez pacjentów. Ponieważ nawet małe oligopeptydy, jak hormon uwalniający tyrotropinę (TRH) wykazują bardzo niską aktywność przy podawaniu doustnym a większe cząsteczki są dezaktywowane przez endopeptydazy w przewodzie żołądkowo-jelitowym, leczenie długotrwałe wymaga codziennego wstrzykiwania lub podawania z małych przenośnych pomp infuzyjnych. Z drugiej strony istnieje wiele potencjalnych wysiłków w celu rozpowszechnienia metod podawania samemu (np. podawanie donosowe, czopki) albo preparatów o kontrolowanym uwalnianiu, takich jak mikrokapsułkowe zawiesiny do wstrzykiwania i implanty.

Leki stosowane do podawania przezskórnego mogą mieć postać ewentualnie buforowanych wodnych roztworów związku o wzorze I i mogą być dostarczone przez pasywną dyfuzję lub przez elektrycznie wspomagany transport, np. jontoforezę (patrz np. Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)).

Kompozycję normalnie podaje się tak, aby dzienna dawka doustna wynosiła od 0,1 mg/kg do 50 mg/kg, a najbardziej korzystnie od 0,1 mg/kg do 25 mg/kg a dzienna dawka pozajelitowa od 20 mikrogramów/kg do 10 mg/kg, bardziej korzystnie 100 mikrogramów do 10 mg/kg.

Wytwarzane sposobem według wynalazku związki wywołują efekt entagonistyczny wobec bombezyny u zwierząt ciepłokrwistych, takich jak człowiek, który wymaga takiego leczenia, który osiąga się przez podawanie temu zwierzęciu efektywnej ilości polipeptydu o wzorze I lub jego

167 322 farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Polipeptyd o wzorze I lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól znajduje zastosowanie do wytwarzania nowego leku do leczenia chorób lub stanów medycznych spowodowanych przez bombezynę lub peptyd typu bombezyny.

Związki wytwarzane według niniejszego wynalazku są użyteczne do hamowania wiązania peptydu uwalniającego gastrynę w komórkach. Związki te hamują również wzrost komórek rakowych.

Polipeptydy wytwarzane według wynalazku są użyteczne w leczeniu chorób złośliwych, np. złośliwych chorób płuc, takich jak drobnokomórkowy rak płuca u ludzi, np. chorób złośliwych przysadki mózgowej, nadnercza, trzustki lub skóry. W szczególności te polipeptydy są użyteczne do usuwania objawów i/lub leczenia zewnątrzwydzielniczego raka trzustki, w leczeniu stanów związanych z nadprodukcją bombezyny lub peptydów typu bombezyny (takich jak czynnik uwalniający gastrynę), np. nadprodukcją gastryny w jelicie. Wytwarzanie gastryny u zwierząt było powiązane z zahamowaniem wydzielania hormonu wzrostu i prolaktyny. Te polipeptydy mogą więc być stosowane do wzmacniania czynności hormonu wzrostu u ludzi lub zwierząt, które potrzebują takiego traktowania. Polipeptydy te można również stosować do leczenia stanów związanych z brakiem normalnej fizjologicznej kontroli regulacji wydzielania kwasu żołądkowego.

Polipeptyd wytwarzany według wynalazku służy do wytwarzania leku do leczenia chorób takich jak:

i/ przetoka jelitowo-skóma ii// cukrzyca typ II, cukrzyca typ 1 iii/ zespół Zollinger-EUisona iv/ rak wysp trzustkowych v/ akromegalia vi/ łuszczyca, np. chroniczna łuszczyca płytkowa vii/ pooperacyjna przetoka jelita cienkiego viii/ zespół poresekcyjny żołądka ix/ złośliwy gruczolak wysepkowatokomórkowy χ/ gruczolak komórki hormonu wzrostu przysadki xi/ gruczolaki przysadki wydzielające tyrotropinę xii/ drobnokomórkowy rak płuca

Następujące przykłady ilustrują sposób wytwarzania polipeptydów według wynalazku i ich właściwości biologiczne.

Dział doświadczalny.

Materiały: Stosuje się następujące skróty: BOC = trzeciorzędowy butyloksyk.arbonyl;TLC = chromatografia cienkowarstwowa; NMR = magnetyczny rezonans jądrowy; MS = spektrometria masowa.

Następujące pozycje otrzymano z Advanced Chemtech, Inc., P. O. Box 1403, Louisville, KY 40201 USA: żywica p-metylobenzhydryloaminowa. HCl (podstawienie w zakresie od 0,560,94meq(g), kwas trifluorooctowy, N-Boc-D-Alanina, N-Boc-L-Alanina, N-Boc-N-TozyloArginina, N-Boc-Glicyna, N-Boc-L-Leucyna, N-Boc-L-Leucynol, N-Boc-L-Norleucyna, N-BocD-Fenyloalanina, N-Boc-L-Fenyloalanina, N-Boc-D-Prolina, N-Boc-L-Prolina, N-Boc-D-Prolinol, N-Boc-Sarkozyna, N-Boc-L-Tryptofan i N-Boc-L-Walina.

N-Boc-L-im-CBZ-L-Histydyna, N-Boc- β-Tienylo-L-Alanina i 3-(2-Naftylo)-D-Alanina zostały nabyte od Bachem, Inc., 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA90505, USA.

L-Metoksyninę (O-Metylo-L-Homoserynę) otrzymano od Biohellas S.A.,10. Parnithos street, 15452 P. Phsychiko, Ateny-Grecja.

Chlorowodorek estru metylowego leucyny, kwas ( + )-6-Metoksy-a-metylo-2-Naftalenooctowy i kwas (s)-6-Metoksy-a-metylo-2-Naftalenooctowy otrzymano od Sigma Chemical Company, P. O. Box 14508, St. Louis, M063178, U.S.A.

Diwęglan Di-tert-butylu, 4-Fluorofenyloalaninę, ester N-hydroksysukcynimidowy kwasu 3(4-Hydroksyfenylo)propionowego oraz kwas (R) i (S)-3-Fenylomasłowy otrzymano od Fluka Chemical Corp., 980 South Street, Ronkonkoma, NY 11779, U.S.A.

Następujące pozycje nabyto od Aldrich Chemical Co., Inc., 1001 West. Saint Paul Avenue, Milwaukee, Wi 53233, U.S.A.: kwas 3-Fenylopropionowy (kwas Hydrocynamonowy), kwas (R) i

167 322 (S)-3,3,3-Trifluoro-2-Metoksy-2-Fenylopropionowy, Dicykloheksyloamina, kwas 1-Cyklopentanokarboksylowy, 4-Metylomorfolina, 1-Metyloimidazol, Cyjanoborowodorek sodu i Diizopropyloetyloamina.

Dichlorometan (CH 2 Cl2), Ν,Ν-Dimetyloformamid (DMF) i N-Metylopirolidon zastosowano jako rozpuszczalniki w syntezie peptydu w fazie stałej i nabyto je od Baxter Healthcare Corp., Burdick and Jackson Division, Muskegon, MI 49442, U. S. A.

Reagent sprzęgający BOP, heksafluorofosforan Benzotriazol-1-iloksy-tris-(dimetyloamino)fosfoniowy otrzymano od Richelieu Biotechnologjes, Inc., 5726 Laurier Blvd., st-Hyacinthe, Q. C., J 2S 3V8 Canada.

Kwas fluorowodorowy nabyto od Matheson Gas Products, P. O. Boc 85,932 Paterson Plank Road, East Rutherford, nJ 07073, U. S. A.

Wytwarzanie peptydów według wynalazku.

Etap I. Wytwarzanie Boc-aminokwasów.

Aminokwasy, które otrzymano bez zabezpieczającej grupy tert-butyloksykarbonylowej przy grupie aminowej (L-Metoksynina, 4-Fluorofenyloalanina) zabezpieczono w opisany poniżej sposób. Jeden równoważnik aminokwasu rozpuszcza się w 5% wodnym Na2CO3'1,4-dioksan i oziębia do 0°C. Następnie do zimnej mieszaniny aminokwasu wkrapla się dwa równoważniki diwęglanu di-tert-butylu w 1,4-dioksanie. Po zakończeniu dodawania mieszaninę odstawia się do ogrzania do 25°C i miesza w ciągu 12 godzin. Po zakończeniu reakcji, co sprawdza się za pomocą TLC, odparowuje się dioksan. Wodną mieszaninę zakwasza się 1N HCl do pH = 2, przy czym tworzą się kryształy, w większości przypadków z wydajnością 60%. Ciało stałe odsącza się i charakteryzuje za pomocą TLC, NMR i MS. Jest wystarczająco czyste aby stosować dalej bez oczyszczania. W przypadkach takich jak L-metoksynina, gdy produkt wypadający z kwaśnego wodnego roztworu jest ciekły, usuwa się go z kwaśnego wodnego roztworu octanem etylu. Warstwy organiczne suszy się bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje octan etylu. Ciekłą pozostałość rozpuszcza się w małej ilości octanu etylu. Do mieszaniny dodaje się jeden równoważnik dicykloheksyloaminy, po czym rozcieńcza dużym nadmiarem eteru dietylowego. Po oziębieniu wykrystalizowuje się dicykloheksyloaminowa Boc-aminokwasu. Ciało stałe odsącza się (wydajność 20-30%), charakteryzuje (TLC, NMR, MS) i dalej stosuje bez oczyszczania.

Etap II. Wytwarzanie Boc-D-prolinalu.

Następująca procedura jest odmianą reakcji przeprowadzonej przez Mancuso i wsp. w J. Org. Chem. 43, 2481 (1978).

W trójszyjnej 500 ml kolbie rozpuszcza się 25 ml 2,0 M roztworu chlorku oksalilu w chlorku metylenu (50 mmoli, roztwór otrzymany od Aldricha) w 60 ml suchego CH 2Cl2 w -60°C, w atmosferze N 2. Dimetylosulfotlenek (10 ml, 140 mmoli, Aldrich) rozpuszcza się w 25 ml suchego CH 2Cl2 i wkrapla za pomocą wkraplacza do roztworu w -60°C. Otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 15 minut po zakończeniu dodawania. Boc-D-prolinol (10 g, 50 mmoli, Advanced Chemtech) rozpuszcza się w 60 ml suchego CH2 Cl2 i oziębia do -60°C w 500 ml okrągłodennej kolbie, w atmosferze N2. W celu ułatwienia połączenia zawartości obydwu zimnych kolb linię N2 ustawia się seryjnie, aby dostosować obydwie kolby. Mieszaninę chlorek oksalilu/DMSO dodaje się stopniowo do alkoholowego roztworu pod ciśnieniem N2 przez igłę z podwójną końcówką. Przez ręczne kontrolowanie szybkości przepływu N2 zawartość przenosi się z jednej kolby do drugiej, bardzo wolno, ale nie kroplami. Po zakończeniu dodawania mieszaninę miesza się w ciągu 20 minut. Na końcu dodaje się powoli, ciągle w -60°C, 20 ml trietyloaminy (140 mmoli, Kodak). Następnie mieszaninę odstawia się do ogrzania do temperatury pokojowej. Mieszaninę przemywa się 50 ml wody. Warstwę wodną ekstrahuje się trzykrotnie 70 ml CH 2 Cl2. Warstwy organiczne kolejno przemywa się porcjami po 50 ml 5% NaHCO3, 1N HCl i wody. Wodne przemywki ekstrahuje się 50 ml CH2O2, które łączy się z pozostałymi warstwami organicznymi. Warstwę organiczną suszy się bezwodnym siarczanem sodu, rozpuszczalnik odpędza się za pomocą obrotowego odparowania. Pozostałość suszy się za pomocą pompy próżniowej w ciągu 3 godzin.

Stwierdza się za pomocą NMR, że pik charakterystyczny dla -OH Boc-D-prolinolu (δ 4,5 ppm) nie jest widoczny. Ostry singlet przy δ 9,4 ppm wskazuje na obecność protonu aldehydowego Boc-D-prolinialu. TLC wskazuje na mieszaninę produktu nie zawierającą zasadniczych produktów ubocznych, co pozwala na stosowanie produktu bez dalszego oczyszczania.

167 322

Etap III. Wytwarzanie żywicy Boc-DPro (CH₂NH)X-MBHA.

i/ Zastosowano żywicę p-metylobenzhydryloaminową. HCl (p-MBHA) (Advanced Chemtech). Podstawienie żywicy w zakresie 0,90-0,97 meq/g.

g żywicy p-MBHA (9,0-9,7 mmoli) umieszcza się w ręcznym mieszalniku peptydów (Milligen). Żywicę przemywa się dwukrotnie (3 i 5 minut) 10% N,N-diizopropyloetyloaminą (DiEA, Aldrich) w CH 2 Cl₂, wstrząsając. Następnie żywicę dwukrotnie płucze się w CH 2 Cl₂. Zobojętnienie HCl na żywicy wykazuje test ninhydrynowy Kaisera, obserwowany jako bardzo ciemny niebieski kolor.

Następnie żywicę traktuje się dwoma równoważnikami każdego z Boc-norleucyny (Bachem, Torrance, CA), heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksy-tris(dimetyloamino)fosfoniowego (BOP, Richelien Biotechnologies of Canada) i 4-metylomorfoliny (Aldrich), wszystkie rozpuszczone w 50 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF). Otrzymaną mieszaninę wytrząsa się w ciągu 1 godz. i płucze dwukrotnie w CH2O2. Sprzęganie sprawdza się testem Kaisera (bezbarwny), w porównaniu z poprzednim wynikiem testu Kaisera (niebieski).

Usuwanie grupy zabezpieczającej z grupy Boc norleucyny prowadzi się przez wytrząsanie żywicy w obecności 50% kwasu trifluorooctowego (TFA, Advanced Chemtech) w CH 2O2 dwukrotnie, w ciągu 5 i 20 minut. Po wypłukaniu żywicy w CH2O2, nadmiar TFA zobojętnia się 10% roztworem DIEA/CH2O2 w ciągu 3 i 5 minut, wstrząsając. Po dwukrotnym wypłukaniu w CH2Cl2, żywicę ponownie testuje się jakościowo za pomocą ninhydryny (kolor bardzo ciemny niebieski).

Następnie żywicę wytrząsa się w ciągu 2 godzin z 2 równoważnikami Boc-D-prolinalu w 50 ml 2% lodowatego kwasu octowego w DMF. Po upływie 2 godz. powoli i stopniowo dodaje się trzy równoważniki cyjanoborowodorku sodu (Aldrich). Po wypłukaniu dwukrotnie w CH 2Cl2, sprawdza się sprzęganie ninhydryną (bezbarwny). Żywica jest teraz gotowa do przeprowadzenia standardowej syntezy peptydu w fazie stałej.

Alternatywne wytwarzanie żywicy: Boc-D-Pro(CH2NH)X-MBHA.

ii/ Następujące procedury mogą być zastosowane do wytwarzania każdej żywicy DPro(CH ₂NH)X-MBHA, gdzie X = każdy aminokwas z pierwszorzędową grupą aminową.

A. Boc-D-Pro(CH2NH)X-OH można zsyntezować sposobami opisanymi przez Martineza i wsp. w J. Med. Chem., 28,1874 (1985) albo D. Tourwe'a i wsp. w Peptides 1988: Proceedings of the 20th European Peptide Symposium., Ed. Jung, Bayer; Walter de Gruyter, str. 562-4.

B. Żywicę można otrzymać przez sprzęganie Boc-D-Pro(CH2NH)X-OH do żywicy MBHA, przez wytrząsanie z BOP i 4-metylomorfoliną (lub 1-metyloimidazolem) w N-metylopirolidonie w ciągu 2 godz.

Wytwarzanie związków pośrednich.

Wytwarzanie 3-(1-tert-butoksykarbonylo)-2-pirolidynylo)-3--hydroksypropiomanu etylu.

Świeżo aktywowany proszek cynkowy (0,79 g, 12 mmoli, Aldrich) i 50 ml benzenu umieszcza się w 250 ml dwuszyjnej kolbie okrągłodennej w atmosferze N 2. Kolbę przyłącza się do aparatu Dean/Starka i oddestylowuje się 25 ml benzenu do łapacza. Wkrapla się w warunkach refluksu roztwór Boc-D-prolinalu (1,90 g, 9,5 mmoli) i bromooctanu etylu (2,0 g, 12 mmoli, Aldrich). W celu zainicjowania reakcji, po dodaniu połowy wkraplanego roztworu, dodaje się kryształjodu. Po zakończeniu dodawania mieszaninę utrzymuje się w stanie refluksu w ciągu 3 godz., oziębia i ostrożnie przemywa 0,5 n HCl. Roztwór wodny ekstrahuje się 25 ml eteru i połączone roztwory organiczne przemywa się kolejno 30 ml wody i 30 ml nasyconego NaHCOa, po czym suszy bezwodnym Na₂SO4 i zatęża pod próżnią. Żółty olej poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym (heksan/octan etylu), otrzymując bezbarwny olej (1,12 g, 41%).

Spektralna analiza masowa daje wynik przy 288 (m+1, 20%), 232 (m-tBu+1, 40%) i 188 (m-CO2Bu+ 1, 100%). 1H-NMR (CDCI3): δ 4,15 (br m, 3H), 3,92 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,26 (m, 1H), 2,40 (m, 2H), 1,65-2,00 (br m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,25 (t, 3H).

Wytwarzanie kwasu 3-(l-(tert-bi2toksykarbcnylo)--2-piroiidynylo)-3-hydroksypropionowego.

Mieszaninę 3-(1-(tert-butoksykarbonylo)-2-pirolidynylo)-3-hydroksypropionianu etylu (3,06 g, 10,6 mmoli) i NaOH (0,80 g, 20 mmoli) w H2O:THF:metanol (3:3:1, 35 ml) miesza się w 25°C w ciągu 2 godz. Mieszaninę zatęża się delikatnie (30°C) pod próżnią. Roztwór wodny

167 322 zakwasza się 1,0 N HCl do pH = 5 i ekstrahuje octanem etylu. Przemywki organiczne suszy się MgSCO, sączy i zatęża pod próżnią. Pozostałość rekrystalizuje się z mieszaniny heksan/octan etylu, otrzymując 1,19 g (47%) bezbarwnego ciała stałego (A, tt = 12,2-124°C). Ciecz macierzystą zatęża się do lepkiego, bladożółtego oleju (B).

Spektralna analiza masowa: 260 (m + 1,60%), 204 (m-tBu + 1,100%), 160 (m-100 + 1,70%). 1H NMR (DMSO): 6 4,09 (m, 1H), 3,57 (br s, 1H), 3,31 (m, 1H), 3,15 (m, 1H), 2,10-2,40 (m, 2H), 1,60-2,00 (m, 4H), 1,38 (s, 9h). Analiza elementarna: teoretycznie 55,58% C, 8,16% H, 5,40% N; znaleziono 55,39% C, 8,23% H, 5,37% N. HPLC: jeden główny pik przy NoVa PAK C18-50% metanol(H2O)0,1% TFA(0,1% trietyloamina (A = 93:7, B= 1:2 na rozwiniętym HPLC). Stwierdzono, że dwa produkty są różnymi stereoizomerami w pozycji grupy hydroksylowej. Obydwa stereoizomery zastosowano do indywidualnych peptydów; bardziej aktywnym jest N-((3-fenylo)propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHis(3-(2-pirc)lidynylo-3-hydroksy)propionylo)-Phe-NH2.

Etap IV. Synteza peptydu i oczyszczanie.

Peptydy syntezuje się stosując udoskonalaną, wersję metody w fazie stałej, opisanej przez R. B. Merrifielda „Solid Phase Peptide Synthesis I. The Synthesis of a Tetrapeptide“, J. Am. Chem. Soc., 83, 2149 (1963), stosując syntesyzer peptydowy Applied Biosystems Model 430A.

W celu syntezy „pseudopeptydów do syntesyzera ładuje się odpowiednią żywicę, np. Boc-DPro (CH2NH) Phe-MBH i stosuje się standardowe usuwanie grupy ochronnej (TFA/CH2O2) -zobojętnianie (diizopropyloetyloamina/C^Ck), jak opisano w Applied Biosystems (850 Lincolu Centre Drive, Foster City, CA94404 U.S.A.).

Boc-chronione aminokwasy sprzęga się z żywicą, stosując zmodyfikowany program procedury sprzęgania BOP, opisanej przez Dung Le-Nguyen, Annie Heik, Bertrand Castro, J. Chem. Soc., Perkins Trans 1,1915 (1987). Sprzęganie wymaga rozpuszczenia 1 mmola Boc-chronionego aminokwasu, 1 mmola BOP i 1 ml 1M 1-metyloimidazolu w 7 ml DMF. Mieszaninę dodaje się do 0,5 mmola żywicy, miesza w ciągu 1 godz. i sączy. Następnie przeprowadza się serię przemywań za pomocą DMF i CH 2O2.

Po osadzeniu peptydu na żywicy, odblokowuje się go i odszczepia od żywicy za pomocą ciekłego HF, zawierającego 10% anizolu, zgodnie z odmianą metody opisanej przez S. Sakakibara i wsp. w Buli. Chem. Soc. Jap., 40, 2161 (1967). Następnie peptyd i żywicę przemywa się octanem etylu i ekstrahuje peptyd z żywicy 1% wodnym roztworem kwasu octowego. Następnie roztwór peptydowy liofilizuje się w celu uzyskania suchego stałego peptydu.

Następnie peptydy oczyszcza się za pomocą ciekłej chromatografii z odwróconymi fazami, stosując kolumnę Vydac 218TP1022 z układem Waters Delta Prep 3000, wyposażony w detektor ultrafioletu. Gilson Model 116. Oczyszczenie osiąga się przez równoważenie kolumny 0,1%TFA w wodzie i rozwijanie gradientem liniowym acetonitrylu 1-40% w ciągu 20 minut przy szybkości przepływu 20 ml/min. Próbki zbiera się ręcznie i sprawdza ich czystość w układzie analitycznym HPLC Spectra-Physics (SP8700, SP8440, SP8780 i SP4200), stosując kolumnę Vydac 218TP54. Stosuje się szybkość przepływu 1,5 ml/min. i gradient 0,1% TFA/acetonitryl z 10-60% ACN w ciągu 10 minut.

Synteza N-((3-fenylo)propionylo)HisTrpAlaValD-AlaHisDPro-(CH2NH)Phe-NH2.

Żywicę metylobenzhydryloaminową (MBHA) (5,0 g, 4,7 mmoli, Advanced Chemtech) przemywa się dwukrotnie (3 i 5 minut) 10% diizopropyloetyloaminą (DIEA, Aldrich) w dichlorometanie (DCM) we wstrząsarce peptydowej Milligen. Następnie żywicę przemywa się DCM i N,Ndimetyloformamidem (DMF). Żywicę wytrząsa się w ciągu 1 godz. z roztworem zawierającym 2,5 g Boc-Phe (9,4 mmoli, Chemtech), 4,3 g BOP (9,4 mmoli, Richelieu Biotechnologies) i 0,95 ml

4-metylomorfoliny (8,6 mmoli, Aldrich). Następnie żywicę przemywa się kolejno metanolem i DCM, i sprawdza się sprzęganie jakościowym testem ninhydrynowym Kaisera.

Z części Boc-Phe-MBHA (3,06 g, 2,8 mmoli) usuwa się grupy ochronne przez traktowanie 50% kwasem trifluorooctowym (tFa, Chemtech) w DCM w ciągu 5 i 20 minut. Żywicę przemywa się dwukrotnie DCM, po czym zobojętnia kwas przez wytrząsanie w ciągu 3 i 5 minut z 10% DIEA, i przemywa DCM i DMF. H2N-Phe-MBHA wytrząsa się z 1% roztworem kwas octowy / Nmetylopirolidon, zawierającym 1,2 g Boc-D-prolinalu (6,0 mmoli, synteza opisana powyżej) w ciągu 2 godz. Następnie w ciągu 2 godz. dodaje się w czterech porcjach 0,54 g cyjanoborowodorku sodu (8,62 mmoli, Aldrich), średnio co 20 minut. Żywicę przemywa się metanolem i DCM, i testuje

167 322 13 ninhydryną. Tę samą żywicę można również wytworzyć alternatywnym sposobem opisanym powyżej.

Do sekwencji dodaje się kolejno aminokwasy (Boc-His(Z), Boc-P-Ala, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-His(Z) i kwas 3-fenylopropionowy) za pomocą Applied Biosystems Automated Peptide Synthesizer (Model 430A) stosując procedurę opisaną dla sprzęgania, deprotekcji i zobojętniania Boc-Phe (stosując 0,5 mmola żywicy i 1 mmol każdego aminokwasu, BOP i 4-metylomorfolinę). Sprzęganie wszystkich aminokwasów przeprowadzone w modelu 430A sprawdza się jakościowym testem Kaisera na próbkach żywicy pobieranych po zakończeniu każdego etapu sprzęgania.

Peptyd (około 1,0 g) odszczepia się od żywicy MBHA przez traktowanie układu peptyd-żywica fluorowodorem (około 10 ml) w 0°C, w ciągu 1 godz. Peptyd wytrąca się i sączy z żywicą MBHA octanem etylu. Następnie peptyd ekstrahuje się stosując 1% wodny kwas octowy i oddziela po liofilizacji tego ekstraktu.

Część peptydu (100 mg) oczyszcza się na kolumnie preparatywnej Vydac C-18 (Chemtech), stosując gradient 0,1% TFA(H2O:0,1% TFA) acetonitryl. Zebrane frakcje sprawdza się na kolumnie analitycznej Vydac C-18 (Chemtech), próbki zawierające czysty peptyd łączy się i liofilizuje. Wyodrębnia się około 15 mg peptydu. Po scharakteryzowaniu widma masowego FAB (MH+ = 1081,7) i analizie aminokwasów [Ala (2,19), His (1,68), Val (1,12)], pozostaje 12,2 mg (12% wydajności w oparciu o HPLC).

Metody analityczne.

Czystość sprawdza się przez analityczną HPLC, stosując układ analityczny HPLC SpectraPhysics, obejmujący SP8700, SP8440, SP8780 i SP4200. Stosuje się kolumnę Vydac 218TP54 z szybkością przepływu 1,5 ml/min. gradientu 0,1% TFA/acetonitryl.

Prawidłowy skład każdego peptydu stwierdzono analizą aminokwasów i spektroskopią masową (FAB). Analizę aminokwasów prowadzono w następujący sposób. Około 1-10 nanomoli peptydu umieszcza się w rurze do badań Pyrex przemywanej kwasem. Peptyd hydrolizuje się pod obniżonym ciśnieniem N2 za pomocą 6N HCl i 1% fenolu w ciągu 1 godz. w 150°C. Następnie peptyd suszy się mieszaniną 2:2:1 etanol:woda:trietyloamina i derywatyzuje roztworem 7:1:1:1 etanol:woda:trietyloamina:fenyloizotiocyjanian. Derywatyzowane aminokwasy analizuje się za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami.

Widmo masowe FAB (szybkie bombardowanie atomowe) uzyskuje się na spektrometrze masowym o geometrii EBQQ, stosując do zbierania danych układ danych VG 11-250J. Spektrometr masowy pracuje przy potencjale przyspieszającym siedmiu kilowoltów i rozdzielczości 1000 (10% minimum definicji). Zastosowano w doświadczeniach działo FAB Ion Tech FAB 11N pracujące przy potencjale 7 kilowoltów i prądzie 1 miliampera. Jako gaz bombardujący zastosowano ksenon przy ciśnieniu 1X 10“⁵ milibarów. Próbki przed analizą FAB-MS rozpuszczano w glicerynie.

Wyniki biologiczne.

Oceniano aktywność hamowania wiązania GRP do komórek Swiss 3T3 peptydów. Działanie antagonistyczne mierzono hamowaniem stymulacji mitogenicznej spoczynkowych komórek 3TS ROZ. Komórki 3T3 ROZ otrzymano od Enrique Rozengurt, Imperial Cancer Research Found, P. O. Box 123, Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, England. Komórki inkubowano w ciągu 18 godz. za pomocą 10 ng/ml BN albo samego albo w obecności antagonisty. Następnie komórki znakowano pulsacyjnie w ciągu 2 godz. ³H-tymidyną i przemywano. Następnie obliczano wprowadzone ³H. Poddanie działaniu bombezyną widać ze zwiększenia cykli na minutę, w porównaniu z medium kontrolnym aż do odpowiedzi maksymalnej. Potencjał antagonistów mierzono przez hamowanie tej maksymalnej odpowiedzi w dół do poziomu linii zerowej. Wartości ICso określano z krzywych miareczkowania. Analogi i uzyskane wartości IC50 zestawiono w tabeli.

167 322

Tabela

Struktura	IC5(M)	MH+(FAB)-MS	Analiza aminokwasów
1	2	3	4
N-((R)2-(WMetoksy-2-Naftylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Rro^Nle-NHa	3X10’°	1128	Ala(1,85), His(1,79), Val(1,00)
N-((S)-2-(<6-Metoksy-2-Naftylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro0Nle-NH2	1,77 X!0-’	1128	Ala(1,97), His(1,81), Val(1,00)
AlaValD-AlaHisD-Pro0Nle-NH2	4,71 X 10-8	1061,6	Ala(1,92), His(1,71), Val(1,00)
N-((R)-i3Fenylobutyrylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro^Nle-NH2	7,54 X10-8	1061,6	Ala(1,77), His(1,65), Val(1,00)
N-{(3-Fenylo(PΓopionylo--HisTrp AlaValD-Ala)3-{2-Tienylo)-Ala) D-Pro0Nle-NH2	2,35 X10-7	1063,5
N-((S)-3,3,3-Trifluoro-2-Metoksy2-Fenylo-Propionylo)-HisTrpAla ValD-AlaHisD-Pro0Nle-NK2	nie badany	1132	Ala(2,40), His(1,15), Val(1,00)
N-((R)-3,3,3-Trifluoro-2-Metoksy- 2-Fenylo-Propionylo)-HisTrpAla ValD-AlaHisD-Pro0Nle-NH2	nie badany	1131,3	Ala(1,90), His(1,19), Val(1,00)
N-(((4'-Hydroksy)-3-Fenylo) Propionylo)-ProD-ArgGlyD-PheHis TrpAlaValGlyHisD-Pro0Nle-NH2	1,»X Μ-*		Ala(1,00), Arg(1,05), Gly(2,15), His(1,73), Phe(1,02), Pro(1,10), Val(0,95)
N-K^-Hydroksy^-Fenylo) Propionylo)-ProD-ArgGlyD-PheHis TrpAJaValGlyHisPro0Nle-NH2	7,96 X10-8	1508,2	Ala(0,96), Arg(1,07), Gly(2,08) His(1,78), Phe(1,03), Pro(1,17), Val(0,91)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro0Metoksynina- nh2	3,43 X 10-8	1049,4	Ala(2,09), His(1,84), Val(1,07)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro^Phe-NH2	8,30X1012	1081,7	Ala(2,19), His(1,68), Val(1,12)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp Ala.ValD-AlaHisD-Pro0Leu-NH2	2,72 X10-8	922,0	Ala(2,02), His(0,75), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp ProValD-ProHisD-Pro0Leu-NH2	6,92 X10“7	1099,9	His(1,73), Pro(2,06), Val(1,00)
N-(((3'-Trifluorometylo)-3-Fenylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro0Leu-NH2	2,70X10-9	1116,0	Ala(1,92), His(1,57), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionyk>)-3-(2- Tienylo>-Ala-TrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Leu-NH2	4,70 X10-9	1064,0	Ala(1,96), His(0,75), Val(1,00)
N-(( 1-CykJ.opentylo)karboksylo)-D- ArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValGly HisD-Pro^Nle-NH2	1,75 X10-8	1371,6	Ala(1,93), Arg(1,04), Gly (1,03) His(1,91), Phe(1,04), Val(1,04)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisT rp AlaValGlyHisD-Pro0Nle-NH2	2,00 X10-7	1034,1	Ala(0,99), Gly(1,11), His(1,94) Val(0,96)
N-((1-Cyklopentylo)karboksylo)-DArgD-AlaD-PheHisT rpAlaValDPro0Nle-NH2	1,73 X108	1386,7	Ala(2,90), Arg(1,07), His(1,93) Phe(1,05), Val(1,05)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp AlaVa!D-AlaHisD-Pro0Nle-NH2	3,10 X10-9	1048,2	Ala(2,02), His(1,90), Val(1,08)
TyrProD-ArgGlyD-PheHisTrpAla ValGlyHisD-Pro0Nle-NH2	8,54 X10-8	1522,2	Ala(1,03), Arg(0,97), Gly(2,07), His(2,03), Phe(1,00), Pro(0,93), Tyr(0,87, Val(1,11)
D-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGly HisD-Pro^Nle-NH2	2,00 X10-7	1262,5	Ala(0,97), Arg(1,05), Gly(1,96), His(1,94), Phe(1,04),Val(1,04)
N-((3-Fenylo)PΓopionylo>·HisTrp- AlaValD-AlaHis(4-FluoroPhe)-NH2	7,87 X10-8	1017,0	Ala(1,87), His(0,86), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionyio)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-ProPhe-NH2	3,65 X10-8	1096	Ala(2,13), His(2,31), Phe(1,11), Pro(1,24), Val(1,00)
Nl((3-Fenylo(PΓopionylo>-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro0)3-(2- Naftylo)-D-Ala)-NH2	2,65 X10-8	1132,4	Ala(1,96), His(1,42), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp AlaValD-PheHisD-Pro0Phe-NH2	4,32 X«0'a	1157,4	Ala(1,15), His(1,76), Phe(0,99), Val(1,00)

167 322

1	2	3	4
D-PheHisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Phe-NH2	<5,47 X ΙΟ'™	1093,2	Ala(1,98), Phe(0,92), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Piopionylo}-D-Pro ArgGlyD-PheHisTipAlaValD-Ala HisD-Pro0Phe-NH2	<3,90 X 10'10	1540	Ala(1,83), Arg(1,02), Gly(0,94), Hls(1,54), Phe(0,85), Pro(0,94), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-3-{2- Tienylo)-Ala)-TrpAlaValD-Ala HisD-Pro0Phe-NH2	3,65 X 10-8		Ala(1,92), His(0,59), Val(1,C0)
N-^-FenykoPropionylol-HisTrp- AlaVal-Sarcożia)-HisD-Pro<^Phe- NH2	<5,55 X 1O'10		Ala(1,02), His(2,06), Val(1,00)
N-(((4'-Hydroksy)-3-Fenylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro^Phe-NH'	<5,47 X 10'10	1098	Ala(2,04), His(1,96), Val(1,00)
N-(((2'-6'-Dichloro)-2-Fenylo) Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Nle-NH'	9,07 X10’7	1103	Ala(1,85), His(1,83), Val(1,00)
N(((3',4'-Dichloro)-2-Fenylo) Acetylo-)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro0Nle-NH'	<5,44 X IO!	1103,5	Ala(2,06), His(1,79), Val(1,00)
N-(((4'-Hydroksy)-2-Fenylo)- Acetylo)-HisTrpAlaValD-Ala HisDPro^Nle-NH'	1,91 X 10-9	1050,1
N-(1-Naftoilo)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro^Nle-NH'	9,35 X ΙΟΊ	1069,9
N-((3,7-Dihydroksy)-2-Naftoilo)- HisTrpAlaValD-AlaHis-D-Pro0Nle- -NH2	2,36X10-8	1101,6	Ala(1,34), His(2,05), Val(1,00)
N-(((2,3-Dihydroksy)-2-Fenylo) Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD~ Pro^Nle-NH'	1,22 X107	1065,5	Ala(2,23), His(l,9O),Val(1,00)
N-(2-{3-Pirydylo)Acetylo)-HisT rp AlaValD-AlaHisD-Pro(^Nle-NH2	3,87 X 10'7	1034,6	Ala(2,26), His(2,00), Val(1,00)
N-(2-(2-Tienylo)Acetylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro0Nle-NH2	2,98X10*8	1040	Ala(2,15), His^1,63), Val(1,00)
N-(((3-Fluoro)-3-Fenylo)Propio- nylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Nle-NH'	3,00 X10-β	1066	Ala(2,14), His(1,66), Val(1,00)
N-(((3,4-Dihydroksy)-2-Fenylo)- Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHi3D- Pro^Nle-NH'	4,63X10-®	1079	Ala(2,13) His(1,43), Val(1,00)
N-{((R)---))2-Fenylo)PΓopionylo)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro0Phe- ΝΗ2	9,25 X 10~o	1081,2	Ala(2,07), His(1,51), Val(1,00)
N-(((S)-( + )-2-Fenylo(Ptopionylo)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-PTo0Pbe- NH2	2,77 X U)-*	1081,1	Ala(2,05), His(1,44), Val(1,0O)
N-(((Trans)-2-Fenylo)-Cyklopro- panoilo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Phe-NH'	1,46 X 10-9	1093,1	Ala(1,99), His(1,44), Val(1,00)
N-(3-(110Fenotiazynylo)Pro- pionylo-HisTrpAlaValD-A!aHisD- Pto^Phe-NH'	2,66X10-8	1202,1	Ala(2,25), His(1,58), Val(1,00)
N-{(3-Metylo-3-Fenylo(Butyrylo)- HisTrpSlayalD-AlaHisD-Pro^Phe- NH2	1,44X10-8	1109,5	Ala(2,07), His(1,63), Val(1,0O)
N-(((2'-Trifluorometylo)-2- Fenylo(Acetylo)-HisTrpAlaValD- AlaHisO-Pro^Phe-NH'	3,50 X KU	1135,4	Ala(2,10), His(1,63), Val(1,00)
N-{((3'-Trifluorometylo)-2- Fenylo(Acetylo)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro^Phe-NH'	8,81X10-*	1135,4	Ala(2,10), His(1,60), Val(1,00)
N-(((4'-Trifluorometylo)-2- Fenylo(Acetylo)-HisTrpAlaValD- AlaHisO-Pro^Phe-NH'	1,41 X 1107	1135,5	Ala(2,24), His(1,68), Val(1,00)
N-(((2'-3'-Difluoro)-2-Fen.ylo) Acetylo)-HisTrpSlaValD-AlaHisD- Pro^Phe-NH'	3,61 X10’7	1103,4	Ala(2,16), His{1,63), Val(1,00)
N-(((2',4'-Difluoro)-2-Fenylo) Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-	1,80 X107	1103,2	Ala(2,16), His(1,62), Vai(1,O0)

167 322

1	2	3	4
Pro0Phe-NH2
N-(((2',6'-Difluoro)-2-Fenylo) Acetylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro0Phe-NH2	5,71 X10'7	1103,2	Ala(2,11), His(1,69), Val(1,00)
N-{((2-Amino)-2-Fenylo)Acetylo)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro^Phe- NH2	7,30XK)-e	1082,2
N-(1-Niftoilo)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro^Phe-NH2	1,81 X 10-12	1103,9	Ala(2,06), His(2,12), Val(1,00)
N-(((3',4',5'-Trimetoksy)-3- Fenylo(Propionylo)-HisTrpAla- ValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2	1,11 X 10-ii	1171,8	Ala(1,86), His(1,71), Val(1,00)
N-((6'-Metoksy)-2-{2-Naftoilo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro0Phe-NH2	3,44 X 10-ii	1161,8	Ala(1,87), His(1,87), Val(1,00)
N-(((3'-Trifluorometylo}-3- Fenylo)Propionylo)-HisTrpAlaValD- AIaHisD-Pro^Phe-NH2	3,47X10'11	1149,8	Ala(2,17), His(1,50), Val(1,00)
N-(((S)--^Fenylo)Butyrylo)-His TrpAlaValD-AlaHhD-Prp^Pha-NH2	5,47X10-”	1095,9	Ala(1,83), His(1,82), Val(1,00)
N-(((4'-Metoksy)-3-Fenylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro0Phe-NH2	5,40 X10-12	1111,9	Ala(1,84), His(1,76), Val(1,00)
N-((((S)-2-Hydroksy)-2-Fenylo) Acetylo)-HisTrpAJaValD-AlaHisD- Pro0Phe-NH2	5,43 XH0-'	1083,8	Ala(1,92), His(1,64), Val(1,00)
N-{(3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisPro^Phe-NH2	9,25 X10-9	1081,5	Ala(1,80), His(1,75), Val(1,00)
N-((2-Metylo-2-Fenylo)Propionylo)HisT rpAlaValD-AlaHisD-Pro0PheNH2	1,46 X10’	1095	Ala(2,0O), His(1,55), Val(1,00)
N-(3-(1-Naftylo)Propionylo)-His TrpAlaValD-AlaHisD-Prp^Phe-NH2	177X10-’	1131	AIa(2,22), His(1,44), Val(1,00)
N-{((R)-3-Fenylo)ButyryIo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2	9,12X10	1095	Ala(2,68), His(1,38), Val(1,00)
N-((9-Fluoroenoilo)1-karbonylo}- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro0Phe- NH2	8,66 X 10·	1158	Ala(2,71), His(1,08), Val(1,00)
N-(((2'-Metoksy)-3-Fenylo) Propionylo)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-ProtfPhe-NH2	9,00X10-·	1111	Ala(2,07), His(1,35), Val(1,00)
N-(((2',5'-Dimetoksy)-3-Fenylo) Propionylo}-HisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro^Phe-NH2	8,76X10-*	1141,7	Ala(2,23), His(1,67), Val(1,00)
N-{(3-Fenylo)Propionylo)-HisTrpAla ValD-AlaHisD-Pro#Tyr-NH2	1,82X10-*	1097,7
N-(((2',3'-Dimetoksy)-3-Fenylo) Propionylo)-HisT rpAlaValD-AlaHisDPro0Phe-NH2	3,50X10-’·	1141,7	Ala(2,25), His(1,66), Val(1,00)
N-((3-Fenylo/Propionylo)-HisTrpAla ValD-AlaHis)3-(2-Pirolidynylo- 3Hydroksy)PTopionylo)-Phe-NH2	1,76X10-8	1139,6
(Izochinolili-Karbonylo)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2	3,44X10·	1104,5	Ala(1,82), His(1,32), Val(1,00)
N-((3-Fenylo)Propionylo)-HisTrp Ala0ValD-AlaHisD-Pro0Phe-NH2	7,50X10-·	1067,1	Ala(1,00), His(3,17)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania związków polipeptydowych o wzorze (I)

   XX ¹TrpX ² X ³X ⁴X® X ^eX ⁷NH ₂ (I) w którym X oznacza grupę X^eArg(lub D-Arg)X⁹X, X⁸ oznacza desNH2Pro, TyrPro, desNH2TyrPro, Ada, Pro, D-Pro lub nie występuje, X⁹ oznacza Gly, Ala, D-Ala lub nie występuje, X¹⁰ oznacza Asn, Phe, D-Phe albo Phe lub D-Phe podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, albo X oznacza grupę A-(CH2)_n-CO-, w której A oznacza grupę zawierającą 1-3 pierścieni, z których co najmniej jeden jest pierścieniem aromatycznym, każdy z układów pierścieniowych może być ewentualnie podstawiony, a grupa alkilenowa jest ewentualnie podstawiona 1-4 grupami wybranymi z grupy aminowej, hydroksylowej, C-talkoksylowej i C1 ^alkilowej, ewentualnie podstawionej chlorowcem, n jest równe 0-4, albo X oznacza grupę cyklopentylokarbonylową podstawioną grupą X⁸Arg(lub D-Arg)X9x^w, zdefiniowaną powyżej, X^f oznacza His, ThiAla lub nie występuje, X² oznacza Ala, D-Ala, CPenc, D-tBuGly lub Pro, X³ oznacza Val lub Val podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, C4 oznacza Gly, Ala, D-Ala, Sarkozynę, Pro, D-Pro lub D-Phe, X⁵ oznacza His lub ThiAla, X⁶ oznacza D-Pro ψ, Pro ψ, 2-pirolidynylo-3hydroksypropionyl lub D-Pro, X⁷ oznacza Nle, Leu, Phe, Val, Mox, D-Phe lub Phe albo D-Phe podstawione jednym lub więcej atomami chlorowca, albo naftyloAla, naftyloD-Ala, hydrofobowy, podstawiony aminokwas aromatyczny, aralkiloaminę albo jest wykreślone, albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, znamienny tym, że kondensuje się aminokwasy i/lub pochodne aminokwasów w żądaną sekwencję i/lub fragmenty peptydu, zawierające te aminokwasy lub ich pochodne w żądanej sekwencji do uzyskania żądanego peptydu, dla łączenia peptydowego aktywuje się albo końcową grupę kwasu karboksylowego lub końcową grupę aminową, a pozostałe grupy chroni się, po czym z otrzymanego peptydu ewentualnie usuwa się grupy ochronne i/lub otrzymany peptyd przeprowadza się w jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe, w których X oznacza grupę A-(CH₂)n-CO-, w której A oznacza fenyl, naftyl, fenotiazynyl lub indolil, ewentualnie podstawiony przez podstawniki wybrane z grupy hydroksylowej, fenylowej, chlorowca, Ci-4alkilowej lub

   X5, X^s, X mają znaczenie podane w zastrz.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe, w których X oznacza desNH2Phe, desNH2Tyr, desNH2TyrPro (lub D-Pro) Arg (lub D-Arg),

   X1 oznacza His lub ThiAla,

   X2 oznacza Ala, Pro,

   X3 oznacza Val lub heksafluorowalinę,

   X4 oznacza D-Ala, D-Phe,

   X5 oznacza His,ThiAla,

   X^e oznacza D-Pro ψ, Pro ψ, Pro, D-Pro,

   X oznacza Nle lub Phe, Leu, metoksyninę, 2-naftylo-2-alaninę.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania N((3-fenylo)propionylo)-HisTrpAlaValD-AlaHis DProψ Phe-NH₂ lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, sprzęga się żywicę metylobenzhydryloaminową z aminokwasami w kolejności sekwencji: N-Boc-fenyloalanina, Boc-D-prolinal, Hoc-His(Z), Boc-D-alanina, Boc-walina, Boc-alanina, Boctryptofan, Boc-His(Z) i kwas 3-fenylopropionowy.

   ej lub C1-4alkoksylowej, ewentualnie podstawionej przez chlorowiec, n = 2, X\ X2, x3, χ4, ; , X mają znaczenie podane w zastrz. 1.