HUT63178A - Process for producing bombesin antagonist polypeptides - Google Patents

Description

A találmány polipeptid vegyületekre vonatkozik, melyek bombezinnel vagy bőmbezin-szerű peptidekkel szemben antagonista tulajdonságokkal rendelkeznek, és betegségek, különösen humán kissejtes tüdőrák, Zollinger-Ellison szindróma vagy hasnyálmirigy-rák kezeléséhez használhatók. A találmány tárgyát képezik ennélfogva a polipeptidek, eljárások ezek előállításához, a vegyületeket tartalmazó gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk a gyógyászatban.

A bombezin egy tetradekapeptid, melyet eredetileg béka bőréből izoláltak. A vegyület képlete a következő:

Glp-Gln-Arg-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Nl^

Gasztrin felszabadító peptidnek egy, a sertésbélből izolált 27 aminosav-peptidet nevezünk. Az utolsó tíz aminosav a gasztrint felszabadító peptid terminális szénatomjánál megfelel - egy aminosav módosulással (3) - a bombezin utolsó tíz aminosávjának, azaz

H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NI^

Ismeretes a szakirodalomból (J.H. Walsh and J.R. Reeve, Peptides 6^, (3), 63-68, (1985)), hogy humán kissejtes tüdőrák (SCLC=small-cell lung cancer) sejtek bombezint és bombezin-szerű peptideket, pl. gasztrint felszabadító peptidet választanak ki. A kutatások során abból indultak ki (P.J. Woll and E.Rozengurt, PNAS 85, 1859-1863, (1988)), hogy gasztrint fel szabadító faktor antagonistákat kötnek bombezin receptorokhoz állatokban, következésképpen előnyös volna alkalmazásuk az SCLC kezeléséhez és/vagy olyan klinikai tünetek szabályozásához, melyek együtt járnak ezzel a betegséggel. A bombezin analógjai azt mutatták, hogy meggátolják a gasztrint felszabadító peptid kötődését egy SCLC sejthez, és SCLC sejtek növekedését in-vitro és in-vivő (S. Mahmoud és tsai, Cancer Research, 5J_, 1798-1802 (1991).

Különféle bombezin antagonistákról jelentek meg tájékoztatásuk, például (Leu^-§ (CH^-NH)-Leu^ ) bombezin és (Ala⁹-§(CH₂~NH)-Val^θΐβυ¹⁴) bombezin (Coy et al, J.Biol Chem., 1988, 263, 5056) és

4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-OMe,

4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-NHMe, 4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-MeLeu-OMe,

3- pir icLil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-MeLeu, OMe,

4- piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(Z)-Meleu-OMe,

3- indolil-Co-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-OMe,

4- piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-MeLeu-NHMe, 4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(Z)-Leu-NHMe, 4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(COCI^Ph)-Leu-NHMe és 4-piridil-CO-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-Lys(COCH₂CH₂Ph)-Leu-NHMe.

(Európai Szabadalmi bejelentés (EPA) No. 345990A).

Az alábbiakban szereplő (I) képletben és a leírás teljes szövegében az aminosav-maradékokat standard rövidítéseiknek megfelelően jelöljük (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331; European Journal of Biochemistry, 1984, 138, 9-37).

Kétségek elkerülése végett a következőket adjuk közre: az aminosav szimbólumok az L-konfigurációt jelentik, kivéve, ha a szimbólum előtt D vagy DL megjelenésével mást tüntetünk fel és kötőjellel elválasztjuk. Az (R) és (S) a molekuláris konfiguráció standard ismertetői.

A következő rövidítéseket alkalmazzuk:

§ - psi(CH₂NH)

Ada - 1-adamantán-karboxilsav

CPenc - amino-ciklopentán-karboxilsav

Mox - metoxinin

Des NH₂Pro

Des NH₂Tyr

ThiAla

D-tBuGly

- 1-ciklopentán-karboxilsav

- (4'-hidroxi)-3-fenil-propionsav

- 3-(2-tienil)-alanin

- D-tercier-butil-glicin (tercier-D-leucin

Ha az Ada,CPenc,Mox,des NH₂Pro,des NH₂Tyr csoportok polipeptid láncban találhatók, akkor karbonil formában vannak.

Felismertük, hogy a polipeptideknek egy további csoportja jelentős hatású bombezin-antagonista aktivitással rendelkezik.

A találmány szerinti vegyületek meggátolják a gasztrint felszabadító peptidek működését emlősök sejtjeiben és így jól alkalmazhatók a klinikai tünetek leküzdéséhez azoknál a betegségeknél, melyek a gasztrint felszabadító peptid fokozott elválasztását okozzák (pl. SCLC esetén).

Találmányunk tárgya az (I) általános képletű polipeptid, azaz:

XX¹TrpX²X³X⁴X⁵X⁶X⁷NH₂ a képletben X jelentése X⁸Arg(vagy D-Arg)X⁹K^ csoport és o

X jelentése des NH₂Pro,TyrPro,des NH₂TyrPro, Ada, Pro, D-Pro vagy törölve;

g

X jelentése Gly, Alá, D-Ala vagy törölve;

X jelentése Asn, Phe, D-Phe, vagy Phe vagy D-Phe, egy vagy több halogénatommal helyettesítve;

vagy X jelentése A-(CH₂)_n~CO-csoport, melyben A jelentése

1-3 gyűrűt tartalmazó csoport, ahol legalább égy gyűrű aromás, és valamennyi gyűrűrendszer adott esetben helyettesített; és az alkiléncsoport amino-, hidroxi-, adott esetben halogénatommal helyettesített 1-4 szénatomos alkoxi- és 1-4 szénatomos alkilcsoport közül egy-négy szubsztituenssel adott esetben helyettesítve van, n értéke 0-4, vagy X jelentése A-(CH₂)_n-CO-csoport, melyben A jelentése adott esetben helyettesített, 1-3 gyűrűt tartalmazó aromás maradék, és az alkilcsoport amino-, adott esetben halogénatommal helyettesített 1-4 szénatomos alkoxi- és 1-4 szénatomos alkilcsoport közül egy-négy szubsztituenssel adott esetben helyettesítve van, n értéke 1-4, g

vagy X jelentése ciklopentil-karbonilcsoport, mely X Arg

10 (vagy D-Arg)X X -csoporttal van helyettesítve, a fentiekben már meghatározott értelmezéssel;

X jelentese His, ThiAla vagy törölve;

X jelentése Alá, D-Ala, CPenc, D-tBuGly vagy Pro;

X jelentése Val vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített Val;

X⁴ jelentése Gly, Alá, D-Ala, sxarkozin·., Pro, D-Pro vagy D-Phe;

X^ jelentése His vagy ThiAla;

X⁶ jelentése DPro§, Pro§, 2-pirrolidinil-3-hidroxipropionil vagy D-Pro;

X jelentése Nle,Leu,Phe,Val,Mox, D-Phe vagy Phe, vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített ' naftilAla vagy naftil D-Ala vagy valamely /hidrofób, szubsztituált aromás aminosav vagy aralkil-amin, vagy törölve van.

Megfelelő A-szubsztituens a fenil-, naftil- fenotiazinil vagy indolil-csoport, előnyösen fenil- vagy naftil-csoport.

Az Ar aromás gyűrű megfelelő szubsztitufRglsei lehetnek: halogénatom, hidroxi-, fenil-, 1-4 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport, adott esetben halogénatommal helyettesítve, n értéke előnyösen 2.

X célszerűen egy des NH₂ részben végződik.

o 9

X célszerűen des NH₂Tyr vagy NH₂Pro. X célszerűen

0

Gly vagy D-Ala. X célszerűen D-Phe. X célszerűen des NH₂Phe, desNH₂Tyr, des NH₂TyrPro (vagy D-Pro), Arg (vagy D-Arg).

X előnyösen. His vagy ThiAla;

X előnyösen Alá, Pro;

o

X előnyösen Val vagy hexafluor-valin;

X⁴ előnyösen D-Ala, D-Phe;

Χ^ előnyösen His, ThiAla;

Χθ előnyösen D-Pro§, Pro§, Pro, D-Pro;

X előnyösen Nle vagy Phe, Leu, metoxinin, 2-naftil-2-alanin.

Találmányunk szempontjából előnyben részesülnek az aláb bi polipeptidek:

N-((R)-2-(6-metoxi-2-naftil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((S)-2-(6-metoxi-2-naftil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((S)-3-fenil-butiril)-HisTrpAlaValEHAlaHÍsD-Pro§Nle-NH2

N- ( (R) -3-fenil-butir.il) -HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N- ((3-fenil) propionil) -HisTrpAlaValD-Ala(3-(2-Thi) -Alá) D-Pro§Nle-NH₂

Ν-((S)-3,3,3-trifluor-2-metoxi-2-fenil-propionil)-HisTrpAlaValDPro§Nle-NH₂

N—((R)-3,3,3-trifluor-2-metoxi-2-fenil-propionil)-HisTrpAlaValDPro§Nle-NH₂

N-3-(((4'-hidroxi)fenil)propionil)-ProD-ArgGlyD-PheHisTrpAla

ValGly-HisD-Pro§Nle-NH₂

N— ( ((4'hidroxi)-3-fenil)propionil)-ProD-ArgHisTrpAlaValD-Ala

HisD-Pro§Leu-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§mox-NH₂

N—((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-TrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Leu-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpProValDProHisD-Pro§Leu-NH₂

N-3-(((3'-trifluor-metil)fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Leu-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-3-(2-Thi)-Alá)TrpAlaValD-AlaHisDPro§Leu-NH₂

N-((deamino-Pro)-D-ArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValGlyHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValGlyHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((deamino-Pro)-D-ArgD-AlaD-PheHisTípAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

TyrProD-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGlyHisD-Pro§Nle-NH₂

D-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGlyHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-ProPhe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§(3-(2-naftil)D-Ala)-NH₂

Ν-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-PheHisDPro§Phe-NH₂

D-PheHisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-D-ProArgGlyD-PheHisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-3(3-(2-Thi)-Alá)-TrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaVal-(szarkozin)-HisD-Pro§Phe-nh₂

N-3-(((4'-hidroxi)fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-(((2',6'-diklór)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N( ( (3 ' , 4 '-diklór)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(((4'-hidroxi)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(1-naftoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((3,7-dihidroxi)-2-naftoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(((3, 4-dihidroxi)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(2-(3-piridil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-(2-(2-tienil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-(((3-fluor)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(((4-hidroxi-3-metoxi)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH₂

N-(((R)-(-)-2-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

-ΊΟΝ- (((S)-(+)-2-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N-(((transz)-2-fenil)-ciklopropanoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-(3-(10-feno-tiaz inil)propionil-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-metil-3-fenil)butiril)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N—(((2'-trifluor-metil)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N—(((3 '-trifluor-metil)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-(((4'-trifluor-metil)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N—(((2',3'-difluor)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N- ( ((2',4'-difluor)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-(((2',6’-difluor)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-(((2-amino)-2-fenil)acetil)-HisTrpALaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N—(1-naftoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N-(((3',4',5'-trimetoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValDAlaHisDPro§Phe-NH₂

N- ((6'-metoxi)-2-(2-naftoil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N—(((3'-trifluor-metil)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValDAlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N-(((S)-3-fenil)butiril)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

- 11 Ν-(((4/-metoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh₂

N-((((S)-2-hidroxi)-2-fenil)acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisPro§Phe-NH₂

N-((2-metil-2-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§-Phe-NH₂

N-(3-(1-naftil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂

N-(((R)-3-fenil)butiril)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂ N-((9-fluorenoil)1-karbonil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂ N-(((2'-metoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh₂

N-(((2',5'-dimetoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Tyr-NH₂

N-(((2',3'-dimetoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHis(3-(2-pirrolidinil3-hidroxi)propionil)-Phe-NH₂ ((Izokinolil-karbonil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂ N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAla§ValDAlaHisDPro§Phe-NH₂

Találmányunk körébe tartoznak még az (I) általános képletű polipeptidek gyógyászati szempontból elfogadható sói vagy gyógyhatású készítményei (pro-drogs). Alkalmas, gyógyászati szempontból elfogadható sók a sav*---addiciós sók, ha a polipeptid eléggé bázikus, pl. egy vagy több bázikus maradékot, mint hisztidint tartalmaz.

A találmány szerinti, gyógyászati szempontból elfogadha tó savaddiciós sót elő,lehet állítani valamely szervetlen savval, ilyen savak például:

hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, kénsav vagy foszforsav; vagy valamely szerves savval, például a következőkkel:

ecetsav, citromsav, maleinsav, fumár sav, törő borkősav vagy trifluor-ecetsav.

Találmányunk további jellegzetessége, hogy az előnyben részesülő vegyületek bármelyikét, egyet vagy többet gyógyásza ti szempontból elfogadható savaddiciós együtt is lehet alkalmazni.

A találmány szerinti polipeptideket a peptidkémiában jól ismert bármelyik eljárással elő lehet állítani, mely analóg vegyületek szintéziséhez alkalmazható. Így például valamely, a találmány szerinti polipeptidet a következő közleményekben nyilvánosságra hozott analóg eljárások szerint lehet előállítani: Stewart és Joung Solid Phase Peptide Synthesis (publikálva a Pierce Chemical Company részéről, Illinois, 1984), Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verleg, Berlin, 1984), Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1984) és The Synthesis of a Tetrapeptide (J. Am. Chem. Soc., 83 2149 (1963)) .

A találmány szerinti polipeptid előállításához előnyben részesülő eljárások például:

a/ valamely védett polipeptidből egy vagy több szokásos peptid-védőcsoport eltávolítása, melynek révén valamely (I) általános képletű polipeptidet kapunk;

b/ amid-kötés létrehozása két peptidegység kapcsolásával, az egyik egy karboxilcsoportot vagy ennek reaktív származékát, a másik egy aminocsöpörtót tartalmaz, ily módon egy védett vagy nem védett polipeptidet állítunk elő, melynek az (I) általános képletben jelzett szekvenciája van, majd - szükség esetén - a védőcsoportot az (a) eljárást alkalmazva eltávolítjuk .

Az (a) eljárásnál a kiindulási anyagban annyi védőcsoport lehet, amennyi a védelmet igénylő gyökök száma, például azokból a csoportokból néhány vagy valamennyi, melyek mint szabad hidroxicsoportok vagy bázikus aminocsöpörtök (akár primer, akár szekunder aminocsöpörtök) vannak jelen a termékben. A védőcsoportot vagy csoportokat a peptidkémiával kapcsolatban fentebb említett standard kézikönyvekben leírtak közül lehet választani. Ezekben a könyvekben a védőcsoportok eltávolítására vonatkozó különféle módszerek leírása is megtalálható.

Az (a) eljárásnál egy bázikus aminocsoporthoz (akár az N-terminusnál vagy egy aminosav-oldalláncban) megfelelő védőcsoport lehet például valamely aril-metoxi-karbonilcsoport, melyet el lehet távolítani hidrogénezéssel, katalizátor,például

- 14 palládium-szén jelenlétében, vagy szervetlen savval történő kezeléssel, például vízmentes hidrogén-fluoriddal vagy hidrogén-bromiddal.

Az (a) eljárásnál a bázikus aminocsoportfkülönösen alkalmas védőcsoport egy alkoxi-karbonilcsoport, például egy Boc-csoport, melyet valamely szerves savval, például trifluor-ecetsavval, vagy szervetlen savval, például vízmentes hidrogén-kloriddal vagy hidrogén-bromiddal lehet eltávolítani; ugyancsak alkalmas például egy 9-fluorenil-metoxi-karbonilcsoport, melyet valamely szerves bázissal, például piperidinnel lehet eltávolítani .

Az (a) eljárásnál a hisztidin oldalláncában lévő bázikus aminocsoport különösen alkalmas védőcsoportja például egy aril-szulfőnilesöpört,mint például tozilcsoport, melyet hidroxil -aminnal történő kezeléssel, például valamely N-hidroxi-triazollal, különösen 1-hidroxi-benzo-triazollal, benzil-oxi-metilvagy t-butil-oxi-metil-triazollal lehet eltávolítani.

Az (a) eljárásnál egy hidroxiesoporthoz megfelelő védőcsoport lehet például egy aril-metilcsoport, mint például a benzilcsoport, melyet valamely szervetlen savval, például vízmentes hidrogénf^Jluoriddal vagy pedig hidrogénezéssel

- katalizátor, például palládium-szén jelenlétében - lehet eltávolítani; a védőcsoport továbbá egy észterező csoport is lehet, például acetil- vagy benzoilcsoport, melyet valamely bázissal, például nátrium-hidroxiddal történő hidrolízissel lehet eltávolítani.

Az (a) eljárásnál egy karboxicsoporthoz megfelelő védőcsoport lehet például egy észterező csoport, mint például valamely aril-metilcsoport, így a benzilcsoport, melyet valamely szervetlen savval, például vízmentes hidrogén-fluoriddal, vagy pedig hidrogénezéssel - katalizátor, például palládium-szén jelenlétében - lehet eltávolítani; a védőcsoport továbbá egy alkilcsoport is lehet, közelebbről 1-6 szénatomos alkilcsoport, például egy tercier-butilcsoport, melyet valamely szerves savval, például trifluor-ecetsavval történő kezeléssel lehet eltávolítani.

Az (a) eljárásnál a terminális szénatomon lévő karboxicsoport megfelelő védelmét például észter kialakításával lehet elérni, például olyan észterrel, mely a terminális szénatomon lévő aminosav és egy gyanta, például térhálósított, hidroxi-metilezett sztirol-divinilbenzol gyanta kapcsolásával jön létre; a megfelelő védelmet továbbá olyan amid kialakításával is el lehet érni, mely a terminális szénatomon lévő aminosav és egy gyanta, például térhálósított metilbenzhidril-amin-sztirol-divinil-benzol kapcsolásával jön létre .

A (b) eljárásnál a standard peptid-kapcsolási reakciók bármelyikét lehet alkalmazni, például azokat, amelyeket a pép tidkémiával kapcsolatban a fentebb említett kézikönyvekben leírtak .

A (b) eljárásra vonatkozóan megjegyzendő, hogy valamely peptid egység csupán egy védett vagy nem védett aminosavat tartalmazhat.

A (b) eljárásnál megfelelő kapcsolási reakció például egy oldószer-fázisú kapcsolási reakció, mint pl. valamely aktív észterkapcsolás, azidkapcsolás vagy N,N'-diciklohexil-karbodiImidet, 1-hidroxi-benzo-triazolt és BOP(benzo-triazol-1-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluoro-foszfátot magában foglaló kapcsolást.

A (b) eljárásban a - karboxilcsoportot tartalmazó - peptid egység megfelelő reaktív származéka például egy acil-halogenid, pl. valamely acil-klorid, mely a sav és egy szervetlen savklorid, pl. tionii-klorid reakciójával jön létre; valamely kevert anhidrid,fpl. a sav és egy halogén-formiát reakciójával keletkezik, pl. izobutil-klór-formiát; vagy valamely acil-azid,/például a sav és egy azid, mint difenil-foszforil-azid reakciójával jön létre.

peptid

különösen megfelelő reaktív származéka például a sav és valamely karbodiimid, pl. N,N'-diciklohexil-karbodiimid vagy N,N'- 17 -diciklohexil-karbodiimid vagy N,N'-diizopropil-karbodiimid reakcióterméke, vagy az említett származék a sav, valamely N-hidroxi-triazol, pl. 1-hidroxi-benzo-triazol és valamely karbo-diimid, például N,N'-diciklohexil-karbodiimid vagy N,N'-diizopropil-karbodiimid reakcióterméke.

A (b) eljárásnál előnyben részesített módszer például az, hogy szilárd-fázisú szintézist alkalmazunk, ahol az aminosavat, melyből a találmány szerinti polipeptid terminális szénatomján lévő aminosav lesz, az alfa-aminocsoportnál védjük és - szükség esetén - az oldalláncban, és észter- vagy amidkötéssel egy szilárd alaphoz kapcsoljuk, mely például valamely gyanta lehet, pl. hidroxi-metilezett vagy valamely metil-benzhidrilamin-sztirol-divinil-benzol térhálósított gyanta, majd az alfa-aminocsoport védőcsoportját eltávolítjuk.

Az aminosavat, melyet a terminális szénatomon lévő aminosavhoz kell kapcsolni, az alfa-aminocsoporton védjük és, szükség esetén/ az, oldalláncban, és a terminális szénatomon lévő aminosavhoz kapcsoljuk, mely a szilárd alaphoz rögzítve marad.

Az alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítását célzó lépésről-lépésre haladó folyamatot és a következő aminosavhoz történő kapcsolást ismételve a szilárd alaphoz kötött, védett vagy nem védett polipeptidet kapunk.

A védett vagy nem védett polipeptidet a szilárd hidroxi-metilezett gyanta-alaptól el lehet választani például hidrolízissel, pl. savas hidrolízissel, pl. szerves savval, mint tri18 fluor-ecetsawal, vagy szervetlen savval, pl. vízmentes hidrogén-fluoriddal vagy hidrogén-bromiddal; vagy a polipeptidet el lehet választani például alkoholízissel, pl. metanolízissel, valamely bázis, pl. szerves bázis, mint diizopropil-etil-amin jelenlétében, majd utána, szükség esetén, a védőcsoportokat az (a) eljárás alkalmazásával eltávolítjuk.

Amennyiben metil-benzhidril-amin gyantát alkalmazunk, a védett vagy nem védett polipeptidet a szilárd alaptól el lehet választani például valamely szervetlen savval, pl. hidrogénf-luoriddal való kezeléssel, majd utána, szükség esetén, a védőcsoportokat az (a) eljárás alkalmazásával eltávolítjuk.

A (b) eljárásnál további előnyben részesített módszer például, hogy szilárd-fázisú szintézist alkalmazunk, ahol egy aminosavat, mely a találmány szerinti polipeptidet képező aminosavak láncában kapcsoló elemmé válik, az alfa-aminocsoportnál és, ha szükséges, az oldalláncban védjük és, amint fentebb leírtuk, egy szilárd alaphoz, például egy gyantához rögzítjük, majd utána az alfa-aminocsöpörtón lévő védőcsoportot eltávolítjuk. A szilárd alaphoz rögzített aminosavhoz kapcsolandó aminosavat az alfa-aminocsoportnál és, ha szükséges, az oldalláncban védjük, majd a szilárd alaphoz rögzített aminosavhoz kapcsoljuk. Az. alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítását célzó, lépésről-lépésre haladó folyamatot és a következő aminosavhoz történő kapcsolást ismételve a szilárd alaphoz kötött védett vagy nem védett polipeptidet kapunk.

A védett vagy nem védett polipeptidet a szilárd alaptól el lehet választani, például a fentiekben leírt módszerek valamelyikével, majd utána egy további peptid-egységet lehet kapcsolni^, amihez a (b) eljárásnál leírt oldószer-fázisú kapcsolási reakciót lehet alkalmazni, végül, ha szükséges, a védőcsoportokat az. (a) eljárás alkalmazásával eltávolítjuk.

A találmány szerinti polipeptideknek bowibezin-antagonista hatásuk van, amit azzal lehet demonstrálni, hogy képesek meggátolni Swiss 3T3 egér kötőszöveti sejtjeinek

Bombesin C-vel stimulált mitogenezisét, ahogyan ezt a / H/-timidin felvétel révén meg lehet határozni.

A találmány tárgyához tartoznak még olyan gyógyászati kompozíciók, melyek valamely (I) általános képletű polipeptidet vagy ennek gyógyászati szempontból elfogadható sóját tartalmazzák, gyógyászati szempontból elfogadható hígító- vagy hordozóanyaggal együtt.

A kompozíció különféle felhasználásra alkalmas formában lehet, így orális alkalmazáshoz, pl. tabletta, kapszula, vizes vagy olajos oldat, szuszpenzió vagy emulzió; nazális alkalmazáshoz pl. orron keresztül felszívható gyógyszer, orr-spray vagy orrcseppek; hüvelyi vagy rektális alkalmazáshoz, pl. végbélkúp; belélegzéssel történő alkalmazáshoz, pl. finoman eloszlatott por vagy folyékony aeroszol; szublingvális vagy száj20 bán történő alkalmazáshoz, pl. tabletta vagy kapszula; vagy parenterális alkalmazáshoz (beleértve intravénás, szubkután, intramuszkuláris, intravaszkuláris vagy infúziós felhasználást) pl. steril vizes vagy olajos oldat vagy szuszpenzió.

A fenti kompozíciókat általában szokásos módon lehet előállítani, szokásos kötőanyagok felhasználása mellett. Mindamellett, orális beadásra szolgáló kompozíció esetén célszerű lehet védőbevonatot alkalmazni, hogy megvédje az aktív polipeptid hatóanyagot a gyomorban lévő enzimek hatásától.

A találmány szerinti kompozíció a találmány szerinti polipeptid mellett még egy vagy több tumorellenes anyagot is tartalmazhat, ilyenek például: mitozisos inhibitorok, például vinblasztin; alkilezőszerek, például cisz-platin, karboplatin és ciklofoszfamid; antimetabolitok, például 5-fluor-uracil, citozin-arabinozid és hidroxikarbamid; beépülő antibiotikumok, például adriamicin és bleomicin; enzimek, például aszparagináz, topoizomeráz. inhibitorok, például etopozid és biológiai reagálás-módiiikálók, például interferon.

Találmányunk körében előnyös kompozíció például az, amely adagolási egységek, pl. tabletták vagy kapszulák formájában orális beadásra alkalmas, és valamennyi egység 2,5-500 mg, előnyösen 10-100 mg polipeptidet tartalmaz, vagy amelyik parenterális beadásra szolgál és 0,5-100, előnyösen

1-10 mg/ml polipeptidet tartalmaz az oldatban.

A parenterális kompozíció előnyösen egy izotonikus sóoldatban vagy izotonikus dextrózban készült oldat, melyet szükség esetén 5-9 pH értékre pufferőiünk. Másik lehetőségként a parenterális kompozícióból lassan felszabaduló formát lehet kialakítani, ez esetben a polipeptid mennyisége adagolási egységenként általában nagyobb, mint amennyi a konvenciális injektálható formához szükséges. Előnyös például a folyamatosan felszabaduló forma, például olyan típus, melyet az US 4767628 és US 5004602 sz. szabadalmi dokumentumokban ismertettZek. Valamely megfelelő, lassan felszabaduló parenterális forma 10-100 mg polipeptidet tartalmaz adagolási egységenként. Előnyben részesül még az olyan, lassan felszabaduló formájú mikrokapszulázott polipeptid, melyhez, biológiailag leépülő, biokompatibilis kopolimer került felhasználásra.

Ezeket a készítményeket célszerűen intravénásán lehet beadni, de szubkután, intrejmuszkuláris vagy intradermális injekció is alkalmazható.

A polipeptidek olyan gyógyászati szerek, melyek speciális gyógyszerészeti formákat igényelnek ahhoz, hogy a betegek hatásosan, biztonságosan és kényelmesen tudják használni. Minthogy még a kis méretű oligopeptidek is - mint a tirotropin-felszabadító hormon (THR) nagyon alacsony orális aktivitással rendelkeznek, és a nagyobb molekulákat a gyomor- és bélrendszer terű22 létén az endopeptidázok inaktiválják, hosszú ideig tartó kezelésnél a napi injekciózáshoz vagy beadáshoz kis méretű, hordozható infúziós pumpára van szükség. Másfelől, számos lehetséges megoldás adódik a beteg számára, egyrészt a saját maga által történő gyógyszeres kezelésre (pl. nazális alkalmazás, végbélkúpok), vagy pedig szabályozottan felszabaduló készítmények, mint injektálható mikrokapszula szuszpenziók és beültetett szerek alkalmazására.

Azoknál a gyógyszereknél, melyek alkalmasak bőrön át történő beadásra, valamely (I) általános képletű vegyület vizes oldatát, adott esetben vizes pufferoldatát lehet előállítani és a készítményt passzív diffúzió vagy elektromosan elősegített bevitel, például iontoforézis útján lehet alkalmazni (1. például Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)).

A találmány szerinti kompozíciót a szokásos módon lehet alkalmazni, úgy, hogy egy napi orális dózis 0,1 mg/kg - 50 mg/kg, előnyösen 0,1 mg/kg - 25 mg/kg között legyen, és egy napi parenterális dózis mennyisége 20 mikrogramm/kg - 10 mg/kg, előnyösen 100 mikrogramm - 10 mg/kg.

Találmányunk további jellegzetessége az a módszer, melylyel bombezin-antagonista hatást lehet előidézni melegvérűeknél, így az embernél, ha ilyen kezelésre szükség van, és amelynél az említett melegvérűeknek az (I) általános képlet körébe tartozó polipeptidet vagy ennek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóját adják be. A találmány tárgyához tartozik az említett polipeptid vagy sójának alkalmazása olyan új gyógyszer előállításához, melyet bombezin vagy bőmhezin-szerű peptidek által közvetített betegség vagy orvosi beavatkozásra szoruló állapot kezeléséhez alkalmaznak.

A találmányunk szerinti vegyületek meggátolják a gasztrint felszabadító peptidek kötődését a sejtekben. A találmány szerinti vegyületek ráksejtek növekedését is gátolják.

A találmány szerinti vegyületek rosszindulatú betegségek kezelésénél hasznosak, például rosszindulatú betegségnél a tüdő ben, így a kissejtes tüdőráknál, rosszindulatú betegségnél az agyalapi mirigyben, mellékvesében, pankreászban vagy a bőrben. A találmány szerinti polipeptid különösen hasznos exokrin pancreasz-adenokarcinoma tüneti enyhítésére és/vagy kezelésére. A találmány szerinti polipeptid olyan állapotok kezelésénél is hasznos, melyek bombezin vagy bombezin-szerű peptidek (mint gasztrin-felszabadító faktor) túltermelésével vannak összefüggésben, ilyen például a gasztrin túltermelése a bélben.

A gasztrintermelés az állatokban a növekedési hormon és a prolactin felszabadulásának elfojtásához vezetett. A találmány szerinti polipeptidek ennélfogva felhasználhatók a növekedési hormon hozzáférhetőségének elősegítéséhez embernél és állatoknál, ha ilyen kezelésre szükség van. A szóban lévő polipeptidek olyan állapotok kezeléséhez is használhatók, melynél a gyomorsav-elválasztás működésének normális fiziológiai szabá24 lyoz.ása eredménytelen volt.

Találmányunk tárgyának további szempontjai a következők:

a/ a találmány szerinti polipeptidek alkalmazása a gyógyászatban ;

b/ gyógyszerészeti formák, melyek a találmány szerinti polipeptideket, legalább egy gyógyszerészeti hordozót vagy kötőanyagot és, szükség esetén, egy vagy több egyéb komponenseket tartalmaznak;

c/ a találmány szerinti polipeptidek alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer előállításához;

d/ valamely, a találmány szerinti polipeptid alkalmazása a következő betegségek kezeléséhez szükséges gyógyszer előállításához :

(I) Bélsipoly (II) II típusú diabetes, I típusú diabetes (III) Zollinger-Ellison szindróma (IV) Hasnyálmirigy-sziget karcinóma (V) Acromegalia (VI) Pszoriázis, pl. krónikus folt-pszoriázis (VII) Műtét utáni vékonybél sipoly (VIII) Dumping-szindróma » · ·

(IX) Rosszindulatú inszulinoma (X) Hypophysis-növekedési-hormon sejtadenoma (XI) Thyrotropin-kiválasztó hypophysis adenoma (XII) Kissejtes tüdőrák e/ módszer valamely emlősben (pl. emberben) sejtek növekedésének meggátlására, melyek érzékenyek a gasztrin-felszabaditó peptidek (GRP) növekedést elősegítő aktivitására, mely szerint az említett emlősnek a találmány tárgyát képező polipeptidből a növekedést gátló mennyiséget kell beadni.

A következő példák a találmány szerinti polipeptidek előállításának és biológiai tulajdonságainak illusztrálását szolgálják:

Anyagok

A leírás egészében a következő rövidítéseket alkalmazzuk:

BOC - tercier butil-oxi-karbonil

TLC - vékonyréteg kromatográfia

NMR - mágneses magrezonancia

MS - tömegspektrometria

GRP - gasztrin-felszabadító peptid

A következő termékeket az Advanced Chemtech, Inc.,

P.O. Box 1403, Louisville, KY 40201 U.S.A. cégtől szereztük be:

p-metil-benzhidril-amln gyanta.HC1 (helyettesítési értékek

0,56 - 0,94 meq/g), trifluor-ecetsav, N-Boc-D-alanin, N-Boc-L-alanin, N-Boc-N-tozil-arginin, N-Boc-glicin, N-Boc-L-leucin, N-Boc-L-leucinol, N-Boc-L-norleucin, N-Boc-D-fenil-alanin, N-Boc-L-fenil-alanin, N-Boc-D-prolin, N-Boc-L-prolin, N-Boc-D-prolinol, N-Boc-szarkozin, N-Boc-L-triptofán és N-Boc-L-valin.

N-Boc~L-im-CBZ.-L-hisztidin, N-Boc- -tienil-L-alanin, és

3-(2-naftil)-D-alanin beszerzési forrása: Bachem, Inc., 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505, U.S.A.

L-metoxinin (O-metil-L-homoszerin) a Biohellas S.A., 10. Parnithos Street, 154 52 P. Phsychiko, Athens-Greece terméke.

Leucin-metil-észter-hidroklorid, (+)-6-metoxi-ot-metil-2-naftalin-ecetsav és (S) -6-metoxi-<.£-metil-2-naf talí.n-ecetsav a Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, U.S.A. termékei.

Di-terc-butil-dikarbonát, 4-fluor-fenil-alanin, 3-(4-hidroxi-fenil)-propionsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter, továbbá (R)és (S)-3-fenil-butirilsav a Fluka Chemical Corp., 980 South Street, Ronkonkoma, NY 11779, U.S.A. termékei.

A következő termékeket az Aldrich Chemical Co., Inc., 1001 West Saint Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233, U.S.A. cégtől szereztük be: 3-fenil-propionsav(hidrocinnamilsav), (R) és (S)-3,3,3-trifluor-2-metoxi-2-fenil-propionsav, diciklohexil-amin,

-ciklopentánkarbonsav, 4-metil-morfolin, 1-metil-imidazol, nátrium-ciano-bórhidrid és diizopropil-etil-amin.

Szilárdfázisú peptid szintézishez diklór-metánt (CH₂C1₂), Ν,Ν-dimetil-formamidot (DMF) és N-metil-pirrolidont használtunk oldószerként, ezek a Baxter Healthcare Corp., Burdick és Jackson Division, Muskegon, MI 49442, U.S.A. cég termékei.

A BOP kapcsoló reagens, benztriazol~1-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluor-foszfát a Richelieu Biotechnologies, Inc., 5726 Laurier Blvd., St-Hyacinthe, QC., J25 3V8 Canada cég terméke.

Hidrogén-fluoridőt a Matheson Gas Products, P.O. Box 85, 932 Paterson Piánk Road, East Rutherford, NJ 07073, U.S.A. cégtől szereztünk be.

A találmány szerinti peptidek előállítása

I. lépés. Boc-aminosavak előállítása

Azokra az aminosavakra, melyeknél az aminocsoporton nincs védőcsoport (L-metoxinin, 4-fluor-fenil-alanin), az alábbiak szerint vittünk fel védőcsoportot. Egy ekvivalensnyi aminosavat 5%-os vizes Na-^CO^/I , 4-dioxánban oldtunk és O°C-ra hűtöttünk. Két ekvivalens di-terc-butil-dikarbonátot, 1,4-di- 28 oxános közegben cseppenként a hideg aminosav keverékhez adtunk.

Ez után a keveréket 25°C-ra hagytuk felmelegedni és 12 óra hosszat kevertük. A reakció teljes befejeződése után, amint ezt TLC útján ellenőriztük, a dioxánt elpárologtattuk. A vizes keveréket 1N HCl-lel savanyítottuk pH2-ig, amikor is kristályok keletkeztek, többnyire 60% hozammal. A szilárd anyagot leszűrtük, majd TLC, NMR és MS segítségével megállapítottuk, hogy a termék elég tiszta ahhoz, hogy további tisztítás nélkül folytassuk az eljárást. Azokban az extrém esetekben, mint az L-metoxininnél, amelynél a termék, melyet a savas, vizes oldatból csepegtettünk, folyadék volt, a terméket etilacetáttal távol ítottuk el a vizes oldatból. Ez után a szerves anyagokat vízmentes nátrium-szulfáttal szárítottuk és az etil-acetátot elpárologtattuk. A folyékony maradékot kis mennyiségű etil-acetátban feloldtuk. A keverékhez egy ekvivalens diciklohextil-amint adtunk, majd nagy feleslegben dietil-éterrel hígítottuk. Hűtés közben a Boc-amino-sav-diciklohexil-amin kikristályosodott. A szilárd anyagot szűrtük (20-30% hozam), meghatároztuk (TLC, NMR, MS), és további tisztítás nélkül alkalmaztuk.

II. lépés. Boc-D-prolinal előállítása

A következő folyamat annak a reakciónak a változata, melyet Mancuso és társa dolgozott ki (J. Org. Chem. 43, 2481 (1978)).

Egy 500 ml-es háromnyakú palackban oxalil-klorid metilén-kloridban készült 2,0 M oldatából (50 mmól, Aldrich) 25 ml-t ml száraz Cl^C^-ben, -60°C-on, ^-atmoszférában feloldtunk. Dimetil-szulfoxidot (10 ml, 140 mmól, Aldrich) 25 ml száraz Cl^C^-ben feloldtunk és egy kiegészítő tölcsérrel cseppenként a -60°C hőmérsékletű oldathoz adagoltuk. Utána a keveréket percig kevertük. Boc-D-prolinolt (10 g, 50 mmól, Advanced Chemtech) 60 ml száraz Cl^C^-ben oldtunk és -60°C-ra hűtöttük egy gömblombikban, ^-atmoszférában. A két lehűtött lombik tartalmának kombinálhatósága érdekében az ^-vonalat szorosan szereltük fel, hogy mindkét lombikot hozzáilleszthessük. Az oxalil-klorid/DMSO keveréket fokozatosan adagoltuk az alkoholos oldathoz duplahegyű tűn keresztül, ^-túlnyomásos átvitellel. Az N£ áramlási értékének manuális szabályozása mellett a lombikok tartalmát átvittük egyikből a másikba, igen lassan, de nem cseppenként. A folyamat befejezése után a keveréket 10 percig kevertük. Végül 20 ml trietil-amint (140 mmól, Kodak) adtunk lassan hozzá, -60°C hőmérsékleten. Ez után a keveréket szobahőmérsékletre hűtöttük.

A keveréket 50 ml vízzel mostuk. Ezt a vizes réteget háromszor extraháltuk 70 ml CH₂Cl₂-vel. A szerves réteget egymás után mostuk 50-50 ml 5%-os NaHCO-j-mal, 1N hidrogén-kloriddal és vízzel. A vizes mosóanyagot 50 ml CH₂Cl₂-vel extraháltuk, majd a többi szerves anyaggal egyesítettük. A szerves anyagok nátrium-szulfáttal való szárítása után az oldószert elpárologtattuk. A maradékot 3 óra hosszat vákuum szivattyún szárítottuk.

* ·· » • · · · · « · · · · • · ··· ♦·· ·

- 30 Az NMR szerint a Boc-D-prolinolra jellemző -OH csúcs (ö 4,5 ppm) tovább már nem volt látható. Meredek szinglet mutatta ó’9 / 4 ppm-nél a Boc-D-prolinol aldehid-protonjának jelenlétét. TLC olyan termék-keveréket jelzett, mely nem tartalmaz lényeges mellékterméket, úgyhogy ez további tisztítás nélkül használható volt.

III. lépés. Boc-DPro§(CH^NH)X-MBHA gyanta előállítása i/ p-metil-benzhidril-amin gyanta.HC1 (p-MBHA) terméket alkalmaztunk. A gyanta helyettesítési értéke 0,90-0,97 meq/g.

Tíz gramm p-MBHA gyantát (9,0-9,7 mmól) egy kézi peptid rázópalackba (Milligen) helyeztünk. A gyantát kétszer (3 és 5 percig) mostuk 10% Ν,Ν-diizopropil-etil-aminnal (DIEA, Aldrich) C^C^-ben, rázás közben. Utána a gyantát vel öblítettük. A gyantán lévő HC1 semlegesítését Kaiser ninhidrin-teszt jelezte, amit nagyon mély kék színként figyeltünk meg.

A továbbiakban a gyantát Boc-norleucinnel (Bachem, Torrance, CA), benztriazol-l-il-oxi-trisz(dimetil-amino)foszfonium-hexafluorfoszfáttal (BOP, Richelieu Biotechnologies of Canada) és 4-metil-morfolinnal (Aldrich) kezeltük, mindegyiket két ekvivalens mennyiségben és valamennyit 50 ml Ν,Ν-dimetil-formamidban (DMF) oldva. Ezt a keveréket 1 óra hosszat ráztuk, majd C^C^-vel öblítettük.

* ·«· « · Λ · l • ♦ · · · • · ·· · ··· ·

- 31 A kapcsolást Kaiser-teszttel (színtelen.) igazoltuk, összehasonlítva az előbbi Kaiser-eredménnyel (kék).

A norleucin Boc-csoportjárói úgy távolítottuk el a védőcsoportot, hogy a gyantát CH₂Cl₂-ben, 50% trifluor-ecetsav (TFA, Advanced Chemtech) jelenlétében kétszer, 5 és 20 percig ráztuk. A gyanta CH₂Cl₂-vel történő öblítése után a fölöslegben lévő TFA-t 10% DIEA/CH₂C1₂ oldattal semlegesítettük 3 és 5 percig tartó rázással. Utána kétszer Ct^C^-vel öblítettünk, majd a gyantát ismét kvalitatív tesztelésnek vetettük alá ninhidrinnel (nagyon mély kék).

A gyantát ez után 50 ml, 2% jégecetet tartalmazó DMFben 2 ekvivalens Boc-D-prolinállal 2 óra hosszat ráztuk.

A két óra elteltével három ekvivalens nátrium-ciano-bórhidridet adtunk hozzá lassan és fokozatosan. Utána CH-^C^-vel öblítettünk, a kapcsolást ninhidrinnel ellenőriztük (színtelen). Ezzel a gyanta standard szilárdfázisú peptidszintézishez készen állt.

Alternatív eljárás Boc-D-Pro§(CH^-NH)X-MBHA gyanta előállítására ii/ A következő eljárásokat bármelyik D-Pro§(CH₂-NH)X-MBHA gyanta előállításához lehet alkalmazni, melynél X jelentése bármilyen, primer aminocsoporttal rendelkező aminosav.

« ···«

A. Boc-D-Pro§ (CI^-NH) X-OH-t állíthatunk elő a következőkben ismertetett eljárásokkal: Martinez és tsa, J.Med. Chem., 28, 1874 (1985), vagy D. Tourwe és tsa, a Peptides-ben, 1988: Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, Ed. Jung, Bayer; Walter de Gruyter, p. 562-4.

B. A cím szerinti gyantát úgy állíthatjuk elő, hogy Boc-D-Pro§(CH2~NH)-OH-t kapcsolunk MBHA gyantához oly módon, hogy BOP-vel és 4-metil-morfolinnal (vagy 1metil-imidazollal) rázzuk N-metil-pirrolidinben 2 óra hosszat.

Intermedierek előállítása

Eljárás etil-3-(1-terc-butoxi-karbonil)-2-pirrolidinil)3-hidroxi-propionát előállítására

Frissen aktivált cinkport (0,79 g, 12 mmól, Aldrich) és benzolt (50 ml) egy 250 ml-es kétnyakú gömblombikba helyeztünk N₂-atmoszférában. A lombikot egy Dean-Stark készülékhez kötöttük és 25 ml benzolt desztiláltunk a gyűjtőbe. Visszafolyatás alkalmazásával Boc-D-profinál oldatot (1,90 g, 9,5 mmól) és etil-bróm-acetátot (2,0 g, 12 mmól, Aldrich) adagoltunk cseppenként. Az oldat felének becsöpögtetése után egy jódkristályt adtunk a keV ·*· ·

- 33 verékhez a reakció iniciálására. Az addició befejezése után a keveréknél három óra hosszat visszafolyatást alkalmaztunk, lehűtöttük és 0,5 n HCl-dal óvatosan mostuk. A vizes oldatot éterrel extraháltuk (25 ml) és az egyesített szerves oldatot fokozatosan vízzel (30 ml) mostuk és NaHCO^-mal (30 ml) telítettük, majd vízmentes Na₂SO₄-tal szárítottuk és vákuumban koncentráltuk. A kapott sárga olajat szilikagélen kromatografáltuk (hexán/etil-acetáttal), melynek során színtelen olajat különítettünk el (1,12 g, 41%).

Tömegspektrum analízis eredményei: 288 (m+1, 20%), 232 (m-tBu+1, 40%), és 188(m-C0₂Bu+1, 100%). ¹H-NMR (CDC1₃): & 4,15 (brm, 3H); 3,92(m, 1H); 3,48(m, 1H); 3,26(m, 1H); 2,40(m, 2H);

1,65-2,00(br m, 4H); 1,45(s, 9H) ; 1,25(t, 3H) .

Eljárás 3-(1-(terc-butoxj-karbonil)-2-pirrolidinil-3hidroxi-propionsav előállítására

Etil-3-(1-terc-butoxi-karbonil)-2-pirrolidinil)-3-hidroxi-propionát (3,06 g, 10,6 mmól) és NaOH (0,80 g, 20 mmól) H₂O:THF:metanolban (3:3:1, 35 ml) készült elegyét 25°C-on két óra hosszat kevertük. A keveréket óvatosan (30°C) vákuumban koncentráltuk. A vizes oldatot 1,0 Ν' HCl-dal ρΗ-5-re savanyítottuk és etil-acetáttal extraháltuk. A szerves fázist MgSO₄~tal szárítottuk, szűrtük és vákuumban koncentráltuk. A maradékot hexán/etil-acetátból átkristályosítottuk és 1,19g (47%) színtelen, szilárd anyagot kaptunk (A), (o.p.

< ·

- 34 122-4°C). Az anyaoldatot viszkózus, halványsárga olajjá koncentráltuk (B) .

Tömegspektrum-analízis eredményei: 260(m+1 , 60%); 204(m-tBu+1, 100%), 160(m-100+1, 70%). ^]H NMR (DMSO):£4,09(m, 1H) ;

3,57(br s, 1H); 3,31(m, 1H); 3,15(m, 1H) ; 2,10-2,40(m, 2H) ;

1,60-2,00(m, 4H): 1,38(s, 9H). Elementár-analízis: elméleti, 55,58% C, 8,16% H, 5,40% N; talált: 55,39% C, 8,23% H, 5,37% N. HPLC: egy nagyobb csúcs a NOVA PÁK C^g-nál 50% metanol /H₂O/0,1% trietil-amin (A = 93:7 arány, B = 1:2 arány, megfigyelve elnyújtott HPLC-n.

Az elemzések azt mutatták, hogy a két termék a hidroxi-pozíciónál egymástól eltérő sztereoizomer. Mindkét sztereoizomer különleges peptidekben került alkalmazásra; a kettő közül az aktívabb az N-((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-Ala His(3-(2-pirrolidinil-3-hidroxi)propionil)-Phe-NH₂.

IV. lépés. Peptidszintézis és tisztítás

A peptideket a szilárdfázisú módszer javított változatával szintetizáltuk az irodalomban leírtak alapján:

R.B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis I. The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc., 83, 2149 (1963), Applied Biosystems Model 430A peptid-szintetizálót alkalmazva.

Pseudopeptidek szintéziséhez a megfelelő gyantát, azaz Boc-D-Pro§(CH₂-NH)Phe-MBH-t töltöttünk a szintetizálóba és egy standard védőcsoport eltávolító (TFA/CE^-C^)-semlegesítő (diizopropil-etil-amin/CH2-C12) programmot alkalmaztunk, mellyel az. Applied Biosystems (8 50 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404 U.S.A.) látott el.

Boc-védett aminosavakat kapcsoltunk a gyantához, melyhez egy módosított programmot használtunk, hogy megfeleljen a BOP kapcsolási folyamatnak, amint ez a szakirodalomban leírva található: Dung Le-Nguyen, Annié Heik és Bertrand Castro, J. Chem. Soc., Perkins Trans. 1, 1915 (1987). A kapcsolási előírás értelmében 1 mmól Boc-csoporton védett aminosavat, 1 mmól BOP-t és 1 mmól 1-metil-imidazolt 7 ml DMF-ben oldtunk. A keveréket 0,5 mmól gyantához adtuk, 1 óra hosszat kevertük és szűrtük. Utána DMF-ben és Cl^-C^-ben többször mostuk.

Miután a peptid a gyantához kötődött, deblokkoltuk és 10% anizolt tartalmazó folyékony hidrogén-fluoriddal hehasítottuk a gyantáról a következő közleményben leírt módszer egyik változata szerint: S. Sakakibara és tsa, Bull. Chem. Soc. Jap., 40, 2164 (1967). Ezt követően a peptidet és a gyantát etil-acetáttal mostuk, majd a gyantából a peptidet vizes, 1%-os ecetsavoldattal kivontuk. A peptid-oldatot liofilizáltuk, hogy megkapjuk a száraz, szilárd peptidet.

A peptideket ellenkező fázisú folyadékkromatográfiával tisztítottuk, Vydac 218TP1022 oszlopot alkalmazva Waters

Delta Drep 3000 Rendszeren, mely Gilson Model 116 ultraibolya detektorral volt felszerelve. A tisztítást úgy hajtottuk végre, hogy az oszlopot 0,1% TFA-t tartalmazó vízzel egyensúlyba hoztuk, és acetonitril lineáris gradiensét alakítottuk ki 1-től 40%-ig, 20 perc alatt, 20 ml/perc áramlási értéknél. A mintákat manuálisan összegyűjtöttük és a tisztaságot egy Spectra-Physics analitikai HPLC rendszeren (beleértve SP8700, SP8440, SP8780 és SP4200) ellenőriztük, Vydac 215TP54 oszlopot alkalmazva. 1,5 ml/perc áramlási értéket hasznosítottunk 0,1% TFA/acetonitril-gradienst alkalmazva 10%-tól 60% ACN-ig, 10 perc alatt.

Szintézis

N— ( (3-fenil) propionil) HisTrpAlaValDAlaHisDPro-psi (CH^NtUPhe-NH^) előállításához

Metil-benzhidril-amin-gyantát (MBHA) (5,0 g, 4,7 mmól, Advanced Chemtech) kétszer mostuk (3 és 5 percig) 10% diizopropil-etil-amint (DIEA, Aldrich) tartalmazó diklór-metánnal (DCM) Milligen Peptid Shaker készülékben. Ez után a gyantát DCM-mel és N,N-dimetil-formamiddal (DMF) mostuk. 2,5 g Boc-Phe-t (9,4 mmól, Chemtech), 4,3 g BOP reagenst (9,4 mmól, RichÉlieü Biotechnologies) és 0,95 ml 4-metil-morfolint (8,6 mmól, Aldrich) tartalmazó oldatot a gyantával egy óra hosszat ráztuk. Utána a gyantát egymást követően metanollal és DCM-mel mostuk, és a kapcsolást Kaiser Ninhidrin kvalitatív teszt útján igazoltuk.

Egy adag Boc-Phe-MBHA-t a védőcsoportok eltávolítása céljából 50% trifluor-ecetsavat (TFA, Chemtech) tartalmazó DCM-mel kezeltük 5 és 20 perces szakaszokban. A gyantát DCM-mel kétszer mostuk. A savat utána 10%-os DI.EA oldattal semlegesítettük 3 és 5 perces rázással, majd DCM-mel és DMF-el mostuk. A H₂N-Phe-MBHA-t 1,2 g Boc-D-prolinált (6,0 mmól, a szintézist az előbbiekben leírtuk) tartalmazó 1% ecetsav/N-metil-pirrolidon oldattal több mint 2 óra hosszat ráztuk. Utána nátrium-ciano-bórhidridet (0,54 g, 8,62 mmól, Aldrich) adagoltunk négy részletben, 2 óra alatt. A gyantát metanollal és DCM-mel mostuk és ninhidrinnel teszteltük. Ugyanazt a gyantát másik módon is elő lehet állítani, amint azt a fentiekben az alternatív eljárásnál már ismertettük.

A következő aminosavakat: Boc-P-Ala, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-His (Z.)-t és 3-fenil-propionsavat adagoltunk a szekvenciához Applied Biosystems Automated Peptide Synthesizer (Model 430A) alkalmazásával, ugyanolyan folyamat szerint eljárva, mint amilyent a kapcsolásnál, védőcsoport-eltávolításnál és semlegesítésnél leírtunk, beleértve Boc-Phe-t (felhasználva 0,5 mmól gyantát, 1-1 mmól aminosavat, BOP-t és 4-metil-morfolint). Valamennyi aminosavkapcsolást, melyeket a 430A modellel hajtottunk végre, a kapcsolások befejezése után a készülékből vett gyantamintákon folytatott Kaiser-tesztekkel ellenőriztünk.

A peptidet (kb. 1,0 g) lehasítottuk a gyantáról oly módon, hogy a peptid-gyantát hidrogén-fluoriddal (kb. 10 ml) kezeltük 0°C-on, 1 óra hosszat. A peptidet etil-acetáttal kicsaptuk és szűrtük az MBHA gyantával. A peptidet ez után a gyantából kivontuk 1 %-os vizes ecetsavat alkalmazva és az extraktum fagyasztva-szárításával elkülönítettük.

100 g peptidet Vydac C-18 preparatív oszlopon tisztítottunk (Chemtech) 0,1% TFA/H2O:0,1% TFA/acetonitril gradienst alkalmazva. Az összegyűjtött frakciókat egy analitikai Vydac C-18 oszlopon (Chemtech) ellenőriztük, és azokat a mintákat, melyek tiszta pepiidnek mutatkoznak, egyesítettük és fagyasztva szárítottuk. Megközelítően 15 mg peptidet különítettünk el. FAB-tömegspektrum (MH -1081,7) és aminosav-analízis /Ala(2,19), His(1,68), Val(1,12)/ alkalmazásával történt jellemzés után 12,2 mg maradt (12 hozam HPLC alapján).

Analitikai módszerek

A tisztaságot analitikai HPLC-vel ellenőriztük Spectra-Physics analitikai HPLC rendszert alkalmazva, beleértve SP8700-t, SP8440-t, SP8780-t és SP4200-t. Vydac 218TP54 oszlopot használtunk 1,5 ml/perc áramlási értékkel, 10,1% TFA/acetonitril gradiensnél.

Valamennyi peptid pontos összetételét aminosav analízissel és (FAB) tömegspektroszkópiával állapítottuk meg.

Az aminosav analízist a következő módon vittük végbe; kb. 1-10 nanomól peptidet savval kimosott Pyrex tesztcsőbe helyeztünk. A peptidet csökkentett N₂ atmoszférában 1% fenolt tartalmazó 6 N HCL-dal redukáltuk 1 óra hosszat 150°C-on. Utána a peptidet 2:2:1 arányú etanol:víz:trietil-amin keverékével szárítottuk és 7:1:1:1 arányú etanol:víz:trietil-amin:fenil-izotiocianát oldattal derivatizáltuk. A derivatizált aminosavat ellenkező-fázisú kromatográfiával analizáltuk.

FAB (Fást Atom Bombardment) tömegspektrumokat kaptunk EBQQ geometriájú VG 70SQ tömegspektrométeren, az adatgyűjtéshez VG 11-250J adatrendszert alkalmazva. A tömegspektrométer hét kilovolt gyorsuló potenciálon működött. A kísérletben használt FAB-ágyú Ion Tech FAB11N volt, mely hét kilovolt potenciálnál és egy milliamperes áramnál működött. Bombázó gázként xenont használtunk 1x10 millibar kiinduló nyomásnál. A kiválasztott mintát a FAB—MS analízis előtt glicerinben oldtuk fel.

Biológiai eredmények

A peptideket annak alapján értékeltük, hogy milyen aktivitással gátolják a GRP kötődést Swiss 3T3 sejtekhez. Az antagonista aktivitást a nyugalmi állapotban lévő 3T3 ROZ sejtek mitogén stimulálásának meggátlása útján mértük. A 3T3 ROZ sejteket a következő forrásból kaptuk: Enrique Rozengurt,

Imperial Cancer Research Fund, P.O. Box 123, Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, England. A sejteket tizennyolc óra hosszat 10 mg/ml BN-nel inkubáltuk önmagában egy antago3 nista jelenlétében. A sejteket utána 2 óra hosszat H-timi3 dinnel kezeltük és mostuk, majd a bevitt H-t megszámláltuk.

A bombezin hatásának történt kitétel maximális reagálást eredményezett. Az antagonisták erejét azzal mértük, hogy ezt a maximális reagálást az alapvonalig visszaszorítva gátolták. Az értékeket titrálási görbékből határoztuk meg. Analógokat és rendelkezésre álló értékeket az I.táblázat sorol fel.

I. táblázat

Szerkezet	IC5O(M)	(MH+(FAB)- MS	AAA
N-((R)-2-(6-metoxi-2-naftil) Propionil) -HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Nle-NH2	3x1010	1128	Ala(1,85), His(1,79), Val(1,00)
N-((S)-2-(6-metoxi-2-naftil) propionil)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Nle-NH2	1,77χ1θ8	1128	Alá(1,97), His(1,81), Val(1,00)
N-((S)-3-fenil-butíril)-HisTrp AlaValO-AlaHisD-Pro§Nle-NH2	4,7χ1θ8	1061,6	Ala(1,92) , His(1,71), Val(1,00)

Ν- ((R) -3-fenil-butiril)-HisTrp

AlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrp AlaValD-Ala(3-(2-tienil) -Alá)

D-Pro§Nle-NH₂

N-((S)-3,3,3—trifluor-2-metoxi-

2-fenil-propionil)-HisTrpAla ValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-((R)-3,3,3-trifluor-2-metoxi2-fenil-propionil)-HisTrpAla ValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

N-(( (4/-hidroxi)-3-fenil) propionil)-ProD-ArgGlyD-PheHis TrpAlaValGlyHisD-Pro§NleHSIH₂

N- (((4' -hidroxi) -3-fenil) propionil)-ProD-ArgGlyD-PhéHis TrpAlaValGlyHisPro§Nle-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrp

AlaValD-AlaHisp-Pro§metoxininnh₂

7,54x108	1061,6	Ala(1,77), His(1,65), Val(1,00)
2,35x107	1063,5	N/A
még nem	1132	Ala(2,40),
tesztelt		His(1,15), Val(1,00)
még nem	1131,3	Ala(1,90),
tesztelt		His(1,19), Val(1,00)
1 ,99x10~8		Ala(1,00), Arg(1,05), Gly(2,15), Hís(1,73), Phe(1,02), Pro(1,10),
		Val(0,95)
7,95x10~8	1508,2	Ala(0,96), Arg(1,07), Gly(2,08), His(1,78), Phe(1,03), Pro(1,17), Val(0,91)
3x43x10’8	1049,4	Ala(2,09), His(1,84), Val(1,07)

N-((3-fenil)propionil) -HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH2	8,30x10~12	1081,7	Ala(2,19), His(1,68), Val(1,12)
N-((3-fenil)propionil)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro§Leu-NH2	2,72x1o8	922,0	Ala(2,02), His(0,75), Val(1,00)
N- ((3-fenil)propionil) -HisTrp ProValD-ProHisD-Pro§Leu-NH2	6,92x10_7	1099,9	His(1,73), Pro(2,06), Val(1,00)
N-(((3'-trifluor-metil)-3-fenil propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHis D-Pro§Leu-NH2	2,70x10-9	1116,0	Ala(1,92), His(1,57) , Val(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-(3-(2tienil) -Ala-TrpAlaValD-AlaHis D-Pro§Leu-NH2	4,70x1o9	1064,0	Ala(1,96), His(0,75), Val(1,00)
N- ((1-cíklopentil)-karboxil)-D- ArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValGly HisD-Pro§Nle-NH2	1 ,75x10~8	1371,6	Ala(1,93), Arg(1,04), Gly(1,03), His(1,91), Phe(1,04), Val(1,04)
N-((3-fenil)propionil) -HisTrp AlaValGlyHisDPro§Nle-NH2	2,00x10_7	1034,1	Ala(0,99), Gly(1,11),

His(1,94),

Val(0,96)

- 43 Ν- ((1 -ciklopentil) karboxil) -DArgD-AlaD-PheHisTrpAlaValDPro§Nle-NH2

N-((3-fenil)propionil)-HisTrp

AlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH₂

TyrProD-ArgGlyD-PheHisTrpAla

ValGlyHisD-Pro§Nle-NH2

D-ArgGlyD-PheHisTrpAlaValGly

HisD-PXO§Nle-NH₂

1,73x10_8 1386,7	Ala(2,90), Arg(1,07), His(1,93), Phe(1,05), Val(1,05)
3,10x10~9 1048,2	Ala(2,02), His(1,90), Val(1,08)
8,54x1o8 1522,2	Álad,03), Arg(0,97), Gly(2,07), His(2,03), Phe(1,00), Pro(0,93), Tyr(0,87), Val(1,11)
2,00x10_7 1262,5	Ala(0,97),

Arg(1,05),

Gly(1,96),

His(1,94), Phe(1,04), Val(1,04)

N-((3-fenil)propionil)-HisTrp

AlaValD-AláHis(4-fluorPhe)-NH₂

N-((3-fenil)propionil)-HisTrp

AlaValD-AlaHisD-ProPhe-NH2

7,87x10 8	1017,0	Alá (1,87), His(0,86), Val(1,00)
3,65x108	1096	Ala(2,13),

His(2,31),

Phe(1,11),

Pro(1,24),

Val(1,00)

Ν-((3-fenil)propionil)-HisTrp	2,65x10	1132,4	Ala(1,96),
AlaValD-AlaHisDPro§(3-(2naftil)-D-Ala)-NH2	-8		His(1,42), Val(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-HisTrp AlaVaW-PheHisD-Pro§Phe-NH2	4,32x10	1157,4	Ala(1,15) His(1,76), Phe(0,99), Val(1,00)
D-PheHisTrpAlaValD-AlaHisD- Pro§Phe-NH2	-10 <5,47x10 U	1093,2	Álad,98), Phe(0,92), Val(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-D-Pro ArgGlyD-PheHisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Phe-NH2	-10 <3,90x10 u	1540	Álad,83), Arg(1,02) , Gly(0,94), His(1,54), Phe(0,85), Pro(0,94), Vald,00)
N-((3-fenil)propionil)-3-(2tienil)-Alá)-TrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Phe-NH2	3,65x10‘8		Ala(1,92), His(0,59), Val(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-HisTrp AlaVal-szarkozin)-HisD-Pro§ Phe-NH2	-10 <5,55x10 lu		Alá(1,02), His(2,06), Val(1,00)
N-(((4'-hidroxi)-3-fenil) propionil)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro§Phe-NH2	-10 < 5,47x10 .	1098	Alá(2,04), His(1,96), Val(1,00)

- 45 λ.

Ν-(((2',6-diklór)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Nle-NH2	9,07x10-7	1103	Ala(1,85), His(1,83), Val(1,00)
N(((3',4'-diklór) -2-fenil) < acetil) -HisTrpAlalfölD-AlaHisDPro§Nle-NH2	-10 5,44x10	1103,5	Ala(2,06), His(1,79), Val(1,00)
N- (( (4' -hidroxi) -2-fenil) acetil) -HisTrpAlaVálD-Ala HisD-Pro§Nle-NH2	1,91x10-9	1050,1	N/A
N—(1-naftoil)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro§Nle~NH2	-10 9,35x10	1069,9	N/A
N-((3,7-dihidroxi)-2-naftoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§NleNH2	2,36x10-8	1101,6	Ala(1,34), His(2,05), Val(1,00)
N-(((2,3-dihidroxi)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH2	1,22x10-7	1065,5	Ala(2,23), His(1,90), Val(1,00)
N-(2-(3-piridil)acetil)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH2	3,87x10-7	1034,6	Alá(2,26), His(2,00), Val(1,00)
N-(2-(2-tienil)acetil)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH2	2,98x108	1040	Ala(2,15), His(1,63), Val(1,00)
N-(((3-fluor)-3-fenil)propionil)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Nle-NH2	3,00x109	1066	Ala(2,14), His(1,66), Val(1,00)

Ν- (((3,4-dihidroxi) -2-fenil) acetil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Nle-NH2	4,63x108	1079 Ala(2,13), His(1,43), Val(1,00)
N-( ((R)-(-)-2-fenil)propicnil)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh2	-10 9,25x10 υ	1081,2 Ala(2,07), His(1,51), Val(1,00)
N-(((S)-(+)-2-fenil)propionil)- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh2	2,77x10’9	1081,1 Ala(2,05), His(1,44), Val(1,00)
N- (((transz) -2-fenil) -ciklopropanoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	1 ,46x10_9	1093,1 Ala(1,99), His(1,44), Val(1,00)
N- (3- (10-fenotiazinil) propionil- HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh2	2,66x10'8	1202,1 Ala(2,25), His(1,58), Val(1,00)
N- ((3-metil-3-fenil)butiril) - HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phenh2	1,44x10_8	1109,5 Alá(2,07), IIis(1,63), Val(1,00)
N- (((2'-trifluor-metil) -2-fenil) acetil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	3,50x107	1135,4 Ala(2,10), His(1,63) , Val(1,00)
N-(((3'-trifluor-metil)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	8,81x1 θ'8	1135,4 Alá(2,10), His(1,60), Val(1,00)
N-(((4'-trifluor-metil)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	1,41 x10_7	1135,5 Ala(2,24), His(1,68), Val(1,00)

Ν-(((2',3'-difluor)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	3,61x10_7	1103,4	Alá(2,16), His(1,63), Val(1,00)
N-(((2 *,4'-difluor)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	1,80x10-7	1103,2	Ala(2,16), His(1,62), Val(1,00)
N-(((2',6'-difluor)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	5,71 x10-7	1103,2	Ala(2,11), His(1,69), Val(1,00)
N-(((2-amino)-2-fenil)acetil)- HisTrpAla^fa.lD-AlaHisD-Pro§Phenh2	7,30x10~9	1082,2	N/A
N-(1-naftoil)-HisTrpAlaValD- AlaHisD-Pro§Phe-NH2	1,81x10-12	1103,9	Ala(2,06), His(2,12), Val(1,00)
N-(((3',4',5'-trimetoxi)-3fenil)propionil)-HisTrpAlaValBAlaHisD-Pro§Phe-NH2	1,11x10~11	1171,8	Ala(1,86) , His(1,71), Val(1,0Q)
N-((6'-metoxi)-2-(2-naftoil) propionil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	3,44x10~11	1161,8	Álad ,87), His(1,87), Val(1,00)
N-(((3' —trifluor-metil)-3-fenil) propionil) -HisTrpAla^felD-AlaHisDPro§Phe-NH2	3,47x10-11	1149,8	Ala(2,17), His(1,50), Val(1,00)
N-(((S)-3-fenil)butiril)-HisTrp AlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH2	5,47x10~11	1095,9	Álad,83), His(1,82), Val(1,00)

Ν- (((4' -rnetoxi) -3-fenil) propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDProgPhe-N^	5,40x10~^2	1111,9	Ala(1,84), His(1,76), Val(1,00)
N-((((S)-2-hidroxi)-2-fenil) acetil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	5,53x10~9	1083,8	Álad,92), His(1,64), Vhl(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-HisTrp AlaValD-AlaHisProgPhe-N^	9,25x10~9	1081,5	Ala(1,80), His (1,75), Val(1,00)
N-((2-metil-2-fenil)propionil)- HisTrpAla\falD-AlaHisD-Pro§Phenh2	1,46x10~11	1095	Ala(2,00), His (1,55), Val(1,00)
N-(3-(1-naftil)propionil)-His TrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH2	1,77x10~8	1131	Alá(2,22) His(1,44) Val(1,00)
N-(((R)-3-fenil)butiril)-His TrpAlaValD-AlaHísD-Pro§Phe-NH2	9,12x10~9	1095	Alá(2,68), His(1,38), Val(1,00)
N-((9-fluorenil)1-karbonil)- HisTrapALaValDAlaHisD-Pro§ Phe-N^	8,66x10~9	1158	Ala(2,71), His(1,08), Val(1,00)
N-(((2'-rnetoxi)-3-fenil) propionil)-HisTrpAlaValD-Ala HisD-Pro§Phe-NH2	9,00x10~9	1111	Ala(2,07), His(1,35), Val(1,00)
N-(((2',5'-dimetoxi)-3-fenil) propionil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	8,76x10~9	1141,7	Alá(2,23), His(1,67), Val(1,00)

Ν-((3-fenil)propionil)-HisTrpAla Vaip-AlaHisD-Pro§Tyr-NH2	1,82x1ο8	1097,7	N/A
N- (((2',3'-dimetcxi)-3-fenil) propionil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH2	3,50x1θ9	1141,7	Alá(2,25), His(1,66), Val(1,00)
N- ((3-fenil) propionil) -HisTrpAla ValD-AlaHis(3-(2-pirrolidinil-3hidroxi)propionil)-Phe-NH2	1,76χ1θ”8	1139,6	N/A
((Izokinolil-karbonil)-His-Trp AlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH2	3,44x109	1104,5	Ala(1,82), His(1,32), Val(1,00)
N-((3-fenil)propionil)-HisTrp Ala§ValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH2	7,50x108	1067,1	Alá(1,00), His(3,17)

• · · · ·

Claims (11)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. (I) általános képletű polipeptid

   XX¹TrpX²X³X⁴X⁵X⁶X⁷NH₂ azzal jellemezve, hogy a képletben

   X jelentése X^Arg(vagy D-Arg)X^X^ csoport,

   O és X jelentése des NH₂Pro,TyrPro,des NH₂TyrPro, Ada, Pro,

   D-Pro vagy törölve;

   jelentése Gly, Alá, SAla vagy törölve;

   X jelentése Asn, Phe, D-Phe vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített Phe vagy áphe;

   vagy X jelentése A-(CH„) -CO-csoport, melyben A jelentése 1-3 gyűrűt tartalmazó csoport, melyek közül legalább egy gyűrű aromás, valamennyi gyűrűrendszer adott esetben helyettesített, és az alkiléncsoport adott esetben aminocsöpört, hidroxicsoport, adott esetben halogénatommal helyettesített 1-4 szénatomos alkoxi- és 1-4 szénatomos alkilcsoport szubsztituensek közül 1-4 csoporttal helyettesített;

   n értéke 0-4,

   8 9 1 0 vagy X jelentése X Arg(vagy D-Arg)X X csoporttal helyettesített ciklopentil-karbonilcsoport, a fentiekben meghatározott értelmezésekkel;

   X jelentése His, ThiAla vagy törölve;

   X jelentése Alá, D-Ala, CPenc, D-tBuGly vagy Pro;

   • · · · · • · *

   - 51 3

   X jelentése Val vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített Val;

   X⁴ jelentése Gly, Alá, D-Ala, szarkozin, Pro, D-Pro vagy

   D-Phe;

   c

   X jelentése His vagy ThiAla;

   Χ^ jelentése D-Pro§, Pro§, 2-pirrolidinil-3-hidroxipropionil vagy D-Pro;

   X jelentése Nle,Leu,Phe,Val,Mox, D-Phe, Phe, vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített D-Phe vagy naftilAla vagy naftil D-Ala vagy hidrofób, helyettesített aromás aminosav, vagy aralkilamin, vagy törölve .
2. 2. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sói azzal jellemezve ,'hogy

   X jelentése A-((CH₂)_n-CO-csoport, melyben A jelentése fenil-, naftil-, fenotiazinilvagy indolilcsoport, melyek adott esetben hidroxicsoport, fenilcsoport, halogénatom, adott esetben halogénatommal helyettesített 1-4 szénatomos alkoxi- és 1-4 szénatomos alkilcsoport szubsztituensek közül 1-4 szubsztituenssel vannak helyettesítve;

   n értéke 2; és

   X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ jelentése megegyezik az 1. igénypontban megadott értelmezésekkel.

   • · · « ·· · · · • · · · » ·· ·«· ·*· ·
3. 3. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sói azzal jellemezve, hogy X jelentése des Nf^Phe, des Nf^Tyr, des NH₂TyrPro (vagy D-Pro) Arg (vagy D-Arg), és

   X¹ jelentése His vagy ThiAla;

   X jelentése Alá, Pro;

   X jelentése Val vagy hexafluor-valin;

   X⁴ jelentése D-Ala, D-Phe;

   Χ^ jelentése His, ThiAla;

   Χ^ jelentése D-Pro§, Pro§, Pro, D-Pro;

   X jelentése Nle vagy Phe, Leu, metoxinin, 2-naftil-2alanin.
4. 4. Az 1-3. igénypontok szerinti (I) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sói azzal jellemezve, hogy a vegyület:

   N((3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH_{2 t}

   N- ( (. (4 ' -hidroxi) -3-fenil) propionil) -HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂,

   N-(1-naftoil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§Phe-NH₂,

   N-(((4'-metoxi)-3-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisDPro§Phe-NH₂,

   N-((2-metil-2-fenil)propionil)-HisTrpAlaValD-AlaHisD-Pro§ Phe-NH₂.

   ,·Μ Μ • ♦ ·· ·· ·· · · · • · * · · «,· ·*· ··· ·
5. 5. Az 1-4. igénypontok szerinti /1) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójának alkalmazása gyógyászati hatóanyagként.
6. 6. Az 1-4. igénypontok szerinti (I) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójának alkalmazása olyan gyógyszer előállításához, mely alkalmas olyan sejtek növekedésének meggátlására, melyek érzékenyek a GRP növekedést elősegítő aktivitására.
7. 7. Az 1-4. igénypontok szerinti (I) általános képletű polipeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójának alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer előállításához.
8. 8. Gyógyászati készítmény azzal jellemezve, hogy az

   1-4. igénypontok valamelyike szerinti (I) általános képletű polipeptidet vagy annak gyógyászati szempontból elfogadható sóját, gyógyászati szempontból elfogadható hordozót és adott esetben egy vagy több egyéb, gyógyászati aktív hatóanyagot tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a készítmény tabletta vagy kapszula formájában van.
10. 10. Eljárás az 1-4. igénypontok szerinti (I) általános képletű polipeptid előállítására azzal jellemezve, hogy aminosavakat és/vagy aminosav-származékokat a kívánt peptidet • * · ···· » · ·· ·· ·· · · * • · · · ·, ·♦ ♦ *· *9f t, í

    ¹ - 54 w adó szekvenciává és/vagy fragmentumokká kondenzáljuk, az említett aminosavak a kívánt peptidet adó szekvenciában karboxil-végcsoportot vagy amino-végcsoportot tartalmaznak, melyeket a peptid-kötéshez aktiválunk, a megmaradó csoportokra védőcsoportokat viszünk fel, és a kapott peptidről a védőcsoportot adott esetben eltávolítjuk és/vagy a peptidet gyógyászati szempontból elfogadható sójává alakítjuk.
11. 11. Eljárás gasztrin-felszabadító peptidek kötésének meggátlására olyan sejtekben, melyek az említett kötésre képesek, azzal jellemezve, hogy az említett sejteket az 1., 2., 3. vagy 4. igénypontok szerinti, megfelelő mennyiségű vegyület gátló hatásának tesszük ki.