MX2014009880A - Macrociclos peptidomimeticos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan en la presente macrociclos peptidomiméticos y métodos para usar tales macrociclos para el tratamiento de enfermedad.

Description

MACROCICLOS PEPTIDOMIMÉ ICOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION La proteína del factor de transcripción humano p53 induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en respuesta al daño del ADN y tensión celular, y por ello juega un papel crítico al proteger células de transformación maligna. La MDM2 de ubiquitina ligasa E3 (también conocida como HDM2) regula negativamente la función p53 a través de una interacción de enlace directa que neutraliza la actividad de transactivación p53, conduce a la exportación del núcleo de la proteína p53, y dirige a p53 para degradación por medio de la trayectoria de ubiquitilación-proteasomal . La pérdida de actividad p53, ya sea por eliminación, mutación, o sobreexpresión MDM2, es el defecto más común en los cánceres humanos. Los tumores que expresan p53 de tipo natural son vulnerables a agentes farmacológicos que estabilizan o incrementan la concentración de p53 activo. En este contexto, la inhibición de las actividades de MDM2 ha surgido con un enfoque validado para restaurar la actividad p53 y volver a sensibilizar las células de cáncer para apoptosis in vitro e in vivo. El MDMX (MDM4) se ha identificado más recientemente como un regulador negativo similar de p53, y los estudios han revelado homología estructural importante entre las interfaces de enlace p53 de MDM2 y MDMX. Las interacciones de proteina-proteína p53-MDM2 y p53- D X están mediadas por el mismo dominio de transactivación alfa-helicoidal de 15 residuos de p53, que se insertan en las grietas hidrofóbicas en la superficie de MDM2 y MDMX. Tres residuos dentro de esta dominio de p53 (F19, W23, y L26) son esenciales para enlazar a MDM2 y MDMX.

Sigue habiendo una necesidad considerable para compuestos capaces de enlazar a y modular la actividad de p53, MDM2 y/o MDMX. Se proporcionan en la presente macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que modulan una actividad de p53. También se proporcionan en la presente macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que inhiben las interacciones entre proteínas p53, MDM2 y/o MDMX. Además, se proporcionan en la presente macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que pueden usarse para tratar enfermedades incluyendo pero no limitadas a cáncer y otras enfermedades hiperproliferativas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente péptidos establemente reticulados relacionados con una porción de p53 humano ("macrociclos peptidomiméticos p53") . Estos péptidos reticulados contienen al menos dos aminoácidos modificados que juntos forman una reticulación intramolecular que puede ayudar a estabilizar la estructura secundaria alfa-helicoidal de una porción de p53 que se piensa que es importante para el enlace de p53 a MDM2 y para enlace de p53 a MDMX. En consecuencia, un polipéptido reticulado descrito en la presente puede tener actividad biológica mejorada con relación a un polipéptido correspondiente que no está reticulado. Los macrociclos peptidomiméticos p53 se piensa que interfieren con el enlace de p53 a MDM2 y/o de p53 a MDMX, por ello libera el p53 funcional e inhibe su destrucción. Los macrociclos peptidomiméticos p53 descritos en la presente pueden usarse terapéuticamente, por ejemplo para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel indeseablemente bajo o una actividad baja de p53, y/o para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel indeseablemente alto de actividad de MDM2 o MDMX. Los macrociclos peptidomiméticos p53 también pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier trastorno asociado con la regulación interrumpida de la trayectoria transcripcional p53, llevando a condiciones de supervivencia celular en exceso y proliferación tal como cáncer y autoinmunidad, además de las condiciones de detención del ciclo celular inapropiado y apoptosis tales como neurodegeneración e inmunodeficiencas . En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos p53 enlazan a MDM2 (por ejemplo, No. de Acceso al GenBank®: 228952; GI.228952) y/o MDMX (también referido como MD 4; No. de Acceso al GenBank®: 88702791; GI.88702791) .

En un aspecto, se proporciona en la presente un macrociclo peptidomimético que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 60%, 80%, 90%, o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le. Alternativamente, una secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético es elegida del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 4. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético no es un péptido como se muestra en la Tabla 2a o 2b. En otros casos, el macrociclo peptidomimético no comprende una estructura como se muestra en la Tabla 2a o 2b. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos elegida de la Tabla 1. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos elegida de la Tabla la. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos elegida de la Tabla Ib. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos elegida de la Tabla le.

Alternativamente, una secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético se elige como arriba, y además en donde el macrociclo no incluye un tioéter o un triazol. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende una hélice, tal como una a-hélice. En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende un aminoácido a,a-disustituido . Un macrociclo peptidomimético puede comprender una reticulación que liga las a-posiciones de al menos dos aminoácidos. Al menos uno de los dos aminoácidos puede ser un aminoácido a, -disustituido .

En algunas modalidades, se proporciona macrociclo peptidomimético de la fórmula: Fórmula I en donde: cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido; B es un aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-SO2-] , Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-; Li y L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2/ -SR6, -SOR6, -S02R6 -C02R6 una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente enteros desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; u es un entero desde 1-10, por ejemplo 1-5, 1-3 o 1-2; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10, por ejemplo la suma de x+y+z es 2, 3, o 6; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades, w>2 y cada uno de los primeros dos aminoácidos representado por E comprende una cadena lateral no cargada o una cadena lateral negativamente cargada .

Algunas modalidades, el primer aminoácido de terminal C y/o el segundo aminoácido de terminal C representado por E comprende una cadena lateral hidrofóbica. Por ejemplo, el primer aminoácido de terminal C y/o el segundo aminoácido de terminal C representado por E comprende una cadena lateral hidrofóbica, por ejemplo una cadena lateral hidrofóbica grande .

En algunas modalidades, w está entre 3 y 1000. Por ejemplo, el tercer aminoácido representado por E comprende una cadena lateral hidrofóbica grande.

En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético como se reivindica excluye la secuencia de: Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2, (SEQ ID NO: ID NO:l) Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2, (SEQ ID NO:ID NO:2) Ac-$r8SQQTFS$L RLLAibQN-NH2, (SEQ ID NO: ID NO: 3) Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2, (SEQ ID NO: ID NO: 4) Ac-QS$r5QTFStNLW$LLAibQN-NH2 , (SEQ ID NO: ID NO : 5 ) o Ac-QSQQ$r8 FSNLWR$LAibQN-NH2 , (SEQ ID NO:ID NO:6).

En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético como se reivindica excluye la secuencia de: Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2, (SEQ ID NO:ID NO:7).

Los macrociclos peptidomiméticos también se proporcionan de la fórmula: en donde: cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xa 6, Xaa7, aas, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2 (SEQ ID NO: ID NO: 8) , donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forman una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; ¦ cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2 ~SR6, -SOR6, -S02R6< -C02 6/ una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R¾ es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula: en donde: cada uno de Xaa3 Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5- r6- rp7-Ala8-Gln9-Leuio Cbaio-Xii-Alai2, (SEQ ID NO: ID NO: 9) donde cada X es un aminoácido; cada D es independientemente un aminoácido; cada E es independientemente un aminoácido, por ejemplo un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D- alanina) , Aib (ácido -aminoisobutírico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2/ -SR6, -SOR6, -S02R6 -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula: en donde: cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2, (SEQ ID NO: ID NO: 9) donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forman una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-, en donde L comprende al menos un enlace doble en la configuración E; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n/ cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6/ -N(R6)2 _SR6, -S0R6, -S02R6^ -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000; w es un entero desde 3-1000; n es un entero desde 1-5; y Xaa7 es triptofano protegido con Boc.

En algunas modalidades de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente, [D]v es -Leui- hr2- En otras modalidades de la fórmulas descritas en la presente, cada E diferente del tercer aminoácido representado por E es un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido -aminoisobutirico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) .

En algunas modalidades, w es un entero desde 3-10, por ejemplo 3-6, 3-8, 6-8, o 6-10. En algunas modalidades, w es 3. En otras modalidades, w es 6. En algunas modalidades, v es un entero desde 1-10, por ejemplo 2-5. En algunas modalidades, v es 2.

En algunas modalidades, los péptidos descritos en la presente enlazan un sitio enlazado definido al menos en parte por las cadenas laterales de aminoácidos DMX de L17, V46, M50, Y96 (formando el borde de la bolsa) y L99. Sin atarse por la teoría, el enlace a tal sitio enlazado mejora una o más propiedades tales como afinidad de enlace, inducción de apoptosis, eficacia anti-tumor in vitro o in vivo, o relación reducida de afinidades enlazadas a MD X contra DM2.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene afinidad de enlace mejorada a MDM2 o MDMX con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene una relación reducida de afinidades enlazadas a MDMX contra MDM2 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. Todavía en otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene eficacia anti-tumor in vitro mejorada contra líneas celulares de tumor positivas p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético muestra inducción de apoptosis in vitro mejorada en líneas celulares de tumor positivas p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético de la reivindicación 1, en donde el macrociclo peptidomimético tiene una relación de eficacia anti-tumor in vitro mejorada para líneas celulares de tumor mutante o p53 positivo contra p53 negativo con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, l o 2. En algunos casos la relación de eficacia mejorada in vitro, es 1-29, 30-49, o =50. Todavía en otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene eficacia anti-tumor in vivo mejorada contra tumores positivos p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, l o 2. En algunos casos la relación de eficacia mejorada in vivo es -29, =30-49, o =50. Aún en otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene inducción de apoptosis in vivo mejorada en tumores positivos p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene permeabilidad celular mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene solubilidad mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2.

En algunas modalidades, Xaas es Glu o un análogo de aminoácido del mismo. En algunas modalidades, Xaa5 es Glu o un análogo de aminoácido del mismo y en donde el macrociclo peptidomimético tiene una propiedad mejorada, tal como afinidad de enlace mejorada, solubilidad mejorada, eficacia celular mejorada, permeabilidad celular mejorada, eficacia anti-tumor in vivo o in vitro mejorada, o inducción de apoptosis mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene afinidad de enlace mejorada a MDM2 o MDMX con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaa5 es Ala. En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una relación reducida de afinidades enlazadas a MDMX contra MDM2 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene solubilidad mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaa5 es Ala, o el macrociclo peptidomimético tiene eficacia celular mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaa5 es Ala.

En algunas modalidades, Xaas es Glu o un análogo de aminoácido del mismo y en donde el macrociclo peptidomimético tiene actividad biológica mejorada, tal como afinidad de enlace mejorada, solubilidad mejorada, eficacia celular mejorada, helicidad mejorada, permeabilidad celular mejorada, eficacia anti-tumor in vivo o in vitro mejorada, o inducción de apoptosis mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaa5 es Ala.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una linea celular p53+/+ que es al menos 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 70 veces, o 100 veces mayor que su afinidad de enlace contra una linea celular p53-/-. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una línea celular p53+/+ que es entre 1 y 29 veces, entre 30 y 49 veces, o =50 veces mayor que su afinidad de enlace contra una línea celular p53-/-. La actividad puede medirse, por ejemplo, como un valor IC50. Por ejemplo, la línea celular p53+/+ es SJSA-1, RKO, HCT-116, o CF-7 y la línea celular p53-/- es RKO-E6 o SW-480. En algunas modalidades, el péptido tiene un IC50 contra la línea celular p53+/+ de menos de 1 µ?.

En algunas modalidades, Xaa5 es Glu o un análogo de aminoácido del mismo y el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una línea celular p53+/+ que es al menos 10 veces mayor que su afinidad de enlace contra una línea celular p53-/-.

Adicionalmente, se proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer pulmonar, cáncer de mama, o glioma.

También se proporciona un método para modular la actividad de p53 o MDM2 o MDMX en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético, o un método para antagonizar la interacción entre p53 y proteínas MDM2 y/o MDMX en un sujeto que comprende ' administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético.

Se proporciona en la presente un método para preparar una composición que comprende un macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) : Fórmula (I) , que comprende una secuencia de aminoácidos que es alrededor de 60% hasta alrededor de 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le, el método comprende tratar un compuesto de la Fórmula (II) Formula (II) , con un catalizador para resultar en el compuesto de la Fórmula I en donde en los compuestos de la Fórmula e (I) y (II) cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido; cada B es independientemente un aminoácido, [- NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-] , o [-NH-L3-] ; cada Ri y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halógeno; o al menos uno de Ri y R2 forman una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada R3 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada 1/ es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; cada Li, L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4'-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 y R4' es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es independientemente 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R6/ -C02R6^ una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R7 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; cada Re es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; cada v y w son independientemente enteros desde 1-1000; u es un entero desde 1-10; cada x, y, y z son independientemente enteros desde 0- 10; cada n es independientemente un entero desde 1-5; cada o es independientemente un entero desde 1 hasta 15; cada p es independientemente un entero desde 1 hasta 15; "(E)" indica un enlace doble trans; y uno o más de los aminoácidos A, C y/o B cuando B es un aminoácido, presente en los compuestos de la Fórmula e (I) y (II), tiene una cadena lateral que porta un grupo protector.

En algunas modalidades, el grupo protector es un grupo protector de átomo de nitrógeno.

En algunas modalidades, el grupo protector es un grupo Boc .

En algunas modalidades, la cadena lateral del aminoácido que porta el grupo protector que comprende un indol protegido .

En algunas modalidades, el aminoácido que porta el grupo protector en su cadena lateral es triptofano (W) que se protege por el grupo protector en su indol nitrógeno. Por ejemplo, el grupo protector es un grupo Boc.

En algunas modalidades, después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en cantidades iguales o superiores que un compuesto correspondiente que es un isómero Z. Por ejemplo, después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en una cantidad 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces superior que el compuesto correspondiente que es un isómero Z.

En algunas modalidades, el catalizador es un catalizador de rutenio.

En algunas modalidades, el método comprende además la etapa de tratar los compuestos de la Fórmula (I) con un agente reductor o un agente oxidante.

En algunas modalidades, el compuesto de la Fórmula (II) se une a un soporte sólido. En otras modalidades, el compuesto de la Fórmula (II) no se une a un soporte sólido.

En algunas modalidades, el método comprende además remover los grupos protectores de los compuestos de la Fórmula (I) .

En algunas modalidades, la metatésis de cierre de anillo se conduce a una temperatura en el intervalo desde alrededor de 20°C hasta alrededor de 80°C.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) tiene la Fórmula: en donde: cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaag, Xaag, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3- 4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, (SEQ ID NO: 8) donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forman una ligadura que forma macrociclo 1/ conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li~L2-, en donde L comprende al menos un enlace doble en la configuración E; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-]„, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2f -SR6, -S0R6 -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; RQ es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000; w es un entero desde 3-1000; n es un entero desde 1-5; y Xaa7 es triptofano protegido con Boc.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) comprende una a-hélice.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las características novedosas de la invención se establecen con particularidad en las reivindicaciones anexas. Un entendimiento mejor de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá como referencia para la siguiente descripción detallada que establece modalidades ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y las figuras acompañantes de las cuales: La Figura 1 muestra una estructura de macrociclo peptidomimético 46 (Tabla 2b) , un macrociclo peptidomimético p53, compuesto con MDMX (Número de acceso SwissPro primario Q7ZUW7; Entrada MDM4_DANRE) .

La Figura 2 muestra estructuras superpuestas de macrociclos peptidomiméticos p53 142 (Tabla 2b) y SP43 enlazado a MD X (Número de acceso SwissPro primario Q7ZUW7; Entrada MDM4_DANRE) .

La Figura 3 muestra el efecto de SP154, un macrociclo peptidomimético, un crecimiento de tumor en un modelo de xenoinjerto MCF-7 de ratón.

La Figura 4 muestra el efecto de SP249, un macrociclo peptidomimético, un crecimiento de tumor en un modelo de xenoinjerto MCF-7 de ratón.

La Figura 5 muestra el efecto de SP315, un macrociclo peptidomimético, un crecimiento de tumor en un modelo de xenoinjerto MCF-7 de ratón.

La Figura 6 muestra el efecto de SP252, una mutación de punto de SP154, un crecimiento de tumor en un modelo de xenoinjerto MCF-7 de ratón.

La Figura 7 muestra una gráfica de solubilidad para macrociclos peptidomiméticos con extensiones de terminal C variadas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en la presente, el término "macrociclo" se refiere a una molécula que tiene una estructura química incluyendo un anillo o ciclo formado por al menos 9 átomos covalentemente enlazados.

Como se usa en la presente, el término "macrociclo peptidomimético" o "polipéptido reticulado" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos unidos por una pluralidad de enlaces de péptido y al menos una ligadura que forma el macrociclo que forma un macrociclo entre un primer residuo de aminoácido que se presenta naturalmente o que no se presenta naturalmente (o análogo) y un segundo residuo de aminoácido que se presenta naturalmente o que no se presenta naturalmente (o análogo) dentro de la misma molécula. El macrociclo peptidomimético incluye modalidades donde la ligadura que forma el macrociclo conecta el carbono del primer residuo de aminoácido (o análogo) para el carbono del segundo residuo de aminoácido (o análogo) . Los macrociclos peptidomiméticos opcionalmente incluyen uno o más enlaces no de péptido entre uno o más residuos de aminoácidos y/o residuos análogos de aminoácido, y opcionalmente incluyen uno o más residuos de aminoácidos que no se presentan naturalmente o residuos análogos de aminoácido además de cualquiera que forma el macrociclo. Un "polipéptido no reticulado correspondiente" cuando se refiere en el contexto de un macrociclo peptidomimético se entiende que se refiere a un polipéptido de la misma longitud como el macrociclo y que comprende los aminoácidos naturales equivalentes de la secuencia de tipo natural correspondiente al macrociclo.

Como se usa en la presente, el término "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una estructura secundaria definida en la solución por un macrociclo peptidomimético como se mide por dicroismo circular, R N u otra medición biofísica, o resistencia a degradación proteolítica in vitro o in vivo. Los ejemplos no limitantes de estructuras secundarias contemplados en la presente son a-hélices, hélices 3io, ß-vueltas, y ß-láminas plisadas.

Como se usa en la presente, el término "estabilidad helicoidal" se refiere al mantenimiento de estructura helicoidal a por un macrociclo peptidomimético como se mide por dicroismo circular o RMN. Por ejemplo, en algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético exhibe al menos un incremento de 1.25, 1.5, 1.75 o 2 veces en a-helicidad como se determina por dicroismo circular comparado con un macrociclo no reticulado correspondiente.

El término "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, tanto los isómeros D como L de los aminoácidos que se presentan naturalmente, así como aminoácidos que no se presentan naturalmente preparados por síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. El término aminoácido, como se usa en la presente, incluye, sin limitación, -aminoácidos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, y análogos de aminoácido.

El término "a-aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo enlazado a un carbono que se designa el a-carbono.

El término "ß-aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo en una configuración ß.

El término "aminoácido que se presenta naturalmente" se refiere a cualquiera de uno de los veinte aminoácidos comúnmente encontrados en péptidos sintetizados en la naturaleza, y conocidos por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, y V.

La siguiente Tabla muestra un resumen de las propiedades de los aminoácidos naturales: "Aminoácidos hidrofóbicos" incluye aminoácidos hidrofóbicos pequeños y aminoácidos hidrofóbicos grandes. "Aminoácido hidrofóbico pequeño" son glicina, alanina, prolina, y análogos del mismo. "Aminoácidos hidrofóbicos grandes" son valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, metionina, triptofano, y análogos del mismo. "Aminoácidos polares" son serina, treonina, asparagina, glutamina, cisterna, tirosina, y análogos del mismo. "Aminoácidos cargados" son lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, y análogos del mismo.

El término "análogo de aminoácido" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar a un aminoácido y el cual puede sustituirse por un aminoácido en la formación de un macrociclo peptidomimético . Los análogos de aminoácido incluyen, sin limitación, ß-aminoácidos y aminoácidos donde el grupo amino o carboxi se sustituye por un grupo similarmente reactivo (por ejemplo, sustitución de la amina primaria con una amina secundaria o terciaria, o sustitución del grupo carboxi con un éster) .

El término "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los veinte aminoácidos comúnmente encontrados en péptidos sintetizados en la naturaleza, y conocidos por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, y V. Los aminoácidos no naturales o análogos de aminoácido incluyen, sin limitación, estructuras de acuerdo con las siguientes: 20 20 ?? Los análogos de aminoácido incluyen ß-análogos de aminoácido. Los ejemplos de ß-análogos de aminoácido incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: ß-análogos de aminoácido cíclicos; ß - alanina; (R) - ß - fenilalanina; ácido (R) - 1, 2, 3, -tetrahidro- isoquinolina - 3 - acético; ácido (R) -3-amino-4- ( 1 - naftil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2, 4-diclorofenil) butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2-clorofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( 2-cianofenil ) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2-fluorofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2 - furil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2 -metilfenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2 - naftil)-butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2 - tienil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (2 - trifluorometilfenil ) -butírico; ácido (R)- 3-amino-4- (3, 4-diclorofenil) butírico; ácido (R) -3-amino-4-(3,4 - difluorofenil) butírico; ácido (R) -3-amino-4- (3 benzotienil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (3 - clorofenil)-butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( 3 - cianofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (3 - fluorofenil ) -butírico; ácido (R) -3-amino-4-(3 - metilfenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (3 -piridil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (3 - tienil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( 3 - trifluorometilfenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (4 - bromofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (4 - clorofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( 4 cianofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( - fluorofenil ) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- ( 4 - iodofenil ) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (4 - metilfenil ) -butírico; ácido ( R) -3-amino-4- (4 - nitrofenil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (4 - piridil) -butírico; ácido (R) -3-amino-4- (4 - trifluorometilfenil ) -butírico; ácido (R) -3-amino - 4 - pentafluoro fenilbutírico; ácido (R) -3-amino - 5 - hexenoico; ácido (R)-3-amino - 5 - hexinoico; ácido (R) -3-amino-5-fenilpentanoico; ácido (R) -3-amino - 6 - fenil - 5 - hexenoico; ácido (S) -1, 2, 3, 4-tetrahidro- isoquinolina - 3 - acético; ácido (S)-3-amino-4-(l - naftil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2, 4-diclorofenil) butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2-clorofenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- ( 2-cianofenil ) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2-fluorofenil) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- (2 - furil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2 - metilfenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2 - naftil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2 - tienil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (2 -trifluorometilfenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3, 4-diclorofenil) butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3, 4 difluorofenil) butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 benzotienil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 - clorofenil)-butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 - cianofenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 - fluorofenil) -butírico; ácido (S)-3-amino-4-(3 - metilfenil) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- ( 3 -piridil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 - tienil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (3 - trifluorometilfenil) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- ( - bromofenil ) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (4 - clorofenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (4 cianofenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (4 - fluorofenil)-butírico; ácido (S) -3-amino-4- (4 - yodofenil ) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- ( 4 - metilfenil ) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- (4 - nitrofenil) -butírico; ácido (S) -3-amino-4- (4 - piridil) -butírico; ácido ( S ) -3-amino-4- ( 4 - trifluorometilfenil ) -butírico; ácido (S)-3-amino - 4 - pentafluoro fenilbutírico; ácido (S)-3-amino - 5 - hexenoico; ácido (S)-3-amino - 5 - hexinoico; ácido (S) -3-amino-5-fenilpentanoico; ácido (S)-3-amino - 6 - fenil - 5 - hexenoico; ácido 1,2,5,6 tetrahidropiridin-3-carboxílico; ácido 1,2,5,6 tetrahidropiridin- 4-carboxílico; ácido 3 - amino - 3 - (2 -clorofenil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 - (2 - tienil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 - (3 - bromofenil) propiónico; ácido 3 - amino - 3 - (4 clorofenil) propiónico; ácido 3 - amino - 3 - (4 - metoxifenil) propiónico; ácido 3 - amino - 4,4,4 - trifluoro - butírico; ácido 3 - aminoadípico; D- ß - fenilalanina; ß - leucina; L -ß - homoalanina; éster de ? - bencilo del ácido L - ß -homoaspártico; éster de d - bencilo del ácido L - ß -homoglutámico; L - ß - homoisoleucina; L - ß - homoleucina; L - ß - homometionina; L - ß - homofenilalanina; L - ß -homoprolina; L - ß - homotriptofano; L - ß - homovalina; L -?? - benciloxicarbonil- ß - homolisina; ?? -L^-homoarginina; O -bencil-L-ß - homohidroxiprolina; O -bencil-L-ß homoserina; O -bencil-L-ß - homotreonina; O -bencil-L-ß -homotirosina; ? - tritil-L-ß - homoasparagina; (R) - ß -fenilalanina; éster de ? - t - butilo del ácido L - ß -homoaspártico; éster de d - t - butilo del ácido L - ß -homoglutámico; L - ?? - ß - homolisina; ?d - tritil-L-ß -homoglutamina; ?? - 2 , 2 , 4 , 6, 7-pentametil - dihidrobenzofuran - 5 - sulfonyl -L^-homoarginina; O -t-butil-L-ß homohidroxi - prolina; O -t-butil-L-ß - homoserina; O -t-butil-L-ß - homotreonina; O -t-butil-L-ß - homotirosina; ácido 2- aminociclopentan carboxílico; y ácido 2- aminociclohexan carboxílico.

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de alanina, valina, glicina o leucina. Los ejemplos de análogos de aminoácido de alanina, valina, glicina, y leucina incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: a - metoxiglicina; a -alil- L - alanina; ácido a - aminoisobutirico; a - metil -leucina; ß - (1 - naftil) - D - alanina; ß - (1 - naftil)-L-alanina; -(2-naftil) - D - alanina; ß- (2-naftil) -L-alanina; ß- (2-piridil) - D - alanina; ß- (2-piridil) -L-alanina; ß-(2-tienil) D - alanina; ß- (2-tienil) -L-alanina; ß - (3 -benzotienil) - D - alanina; ß - (3 - benzotienil) -L-alanina; ß - (3 - piridil) - D - alanina; ß - (3 - piridil) -L-alanina; ß - (4 - piridil) - D - alanina; ß - (4 - piridil) -L-alanina; ß - cloro - L - alanina; ß - ciano - L - alanina; ß -ciclohexil- D - alanina; ß - ciclohexil- L - alanina; ß -ciclopenten - 1 -il- alanina; ß - ciclopentil- alanina; sal de ß - ciclopropil- 'L - Ala - OH · diciclohexilamonio; ß -t-butil- D - alanina; ß -t-butil- L - alanina; ácido ? -aminobutirico; ácido L - , ß - diaminopropiónico; 2,4 dinitro - fenilglicina; 2,5 - dihidro - D - fenilglicina; ácido 2 - amino - 4,4,4 - trifluorobutirico; 2 - fluoro -fenilglicina; ácido 3 - amino - 4,4,4 - trifluoro - butírico; 3 - fluoro - valina; 4,4,4 - trifluoro - valina; sal de 4,5 -deshidro- L - leu - OH · diciclohexilamonio; 4 - fluoro - D - fenilglicina; 4 - fluoro - L - fenilglicina; 4 - hidroxi - D fenilglicina; 5,5,5 - trifluoro - leucina; ácido 6 aminohexanoico; ciclopentil- D - Gly OH · sal de diciclohexilamonio; ciclopentil- Gly - OH · sal de diciclohexilamonio; ácido D - a,ß - diaminopropiónico; ácido D - a - aminobutírico; D - - t - butilglicina; D - (2 -tienil) glicina; D - (3 - tienil) glicina; ácido D - 2 aminocaproico; D - 2 - indanilglicina; sal de D alilglicina^diciclohexilamonio; D - ciclohexilglicina; D -norvalina; D - fenilglicina; ácido ß - aminobutírico; ácido ß aminoisobutírico; (2 - bromofenil) glicina; (2 metoxifenil) glicina; (2 - metilfenil) glicina; (2 tiazoil) glicina; (2 - tienil) glicina; ácido 2 - amino - 3 -(dimetilamino) - propiónico; ácido L - , ß diaminopropiónico; ácido L - o¡ - aminobutírico; L - OÍ - t -butilglicina; L - (3 - tienil ) glicina; ácido L - 2 - amino -3 - (dimetilamino) - propiónico; sal de diciclohexil- amonio de ácido L - 2 - aminocaproico; L - 2 - indanylglicina; sal de L - alilglicina»diciclohexil amonio; L ciclohexilglicina; L - fenilglicina; L - propargilglicina; L - norvalina; N - a - aminometil - L - alanina; ácido D - ,? - diaminobutírico; ácido L - a,? - diaminobutírico; ß ciclopropil- L - alanina; ácido (N - ß - (2,4 dinitrofenil) ) -L-OÍ, ß - diaminopropiónico; ácido (N - ß-1-(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 - iliden)etil) - D - a,ß - diaminopropiónico; ácido (N - ß-1-(4,4 - dimetil - 2,6 -dioxociclohex - 1 - iliden) etil) -L-a, ß - diaminopropiónico; ácido (N - ß - 4 - metiltritil) -L- , ß - diaminopropiónico; ácido (N - ß - aliloxicarbonil) -L- , ß - diaminopropiónico; ácido (N - ?-1-(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 -iliden) etil) - D - ,? - diaminobutirico; ácido (N - ?-1-(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 - iliden) etil) -L- , ? -diaminobutirico; ácido (N - ? - 4 - metiltritil) - D - ,? -diaminobutirico; ácido (N - ? - 4 - metiltritil) -L-a,? -diaminobutirico; ácido (N - ? - aliloxicarbonil) -L- ,? -diaminobutirico; ácido D - ,? - diaminobutirico; 4,5 deshidro- L - leucina; ciclopentil- D - Gly - OH; ciclopentil- Gly - OH; D - alilglicina; D homociclohexilalanina; L - 1 - pirenilalanina; ácido L - 2 -aminocaproico; L - alilglicina; L - homociclohexilalanina; y N - (2 - hidroxi - 4-metoxi-Bzl) - Gly - OH.

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de arginina o lisina. Los ejemplos de análogos de aminoácido de arginina y lisina incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: citruliina; ácido L - 2 - amino - 3 - guanidinopropiónico; ácido L - 2 - amino - 3 - ureidopropiónico; L - citrulina; Lys(Me)2 ~ OH; Lys(N3) - OH; ?d - benciloxicarbonil- L -ornitina; ?? - nitro - D - arginina; ?? - nitro - L - arginina; - metil - ornitina; ácido 2,6 diaminoheptandioico; L - ornitina; (?d-1-(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxo - ciclohex - 1 - iliden)etil) - D - ornitina; (?d-1-(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxo - ciclohex - 1 - iliden)etil) -L - ornitina; (?d - 4 - metiltritil) - D - ornitina; (?d - 4 - metiltritil) - L - ornitina; D - ornitina; L - ornitina; Arg (Me) (Pbf ) - OH; Arg(Me)2 - OH (asimétrico); Arg(Me)2 - OH (simétrico); Lys(ivDde) - OH; Lys(Me)2 - OH · HC1; cloruro de Lys(Me3) - OH; ?? - nitro - D - arginina; y ?? - nitro - L -arginina .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de ácidos aspártico o glutámico. Los ejemplos de análogos de aminoácido de ácidos aspártico y glutámico incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: ácido a-metil-D - aspártico; ácido OÍ-metil-glutámico; ácido - metil-L-aspártico; ácido ? metilene - glutámico; (N - ? - etil) - L - glutamina; ácido [ - OÍ — (4 - aminobenzoil) ] -L-glutámico ; ácido 2,6 diaminopimélico; ácido L - - aminosubérico; ácido D - 2 -aminoadipico; ácido D - - aminosubérico; ácido o¡ aminopimélico; ácido iminodiacético; ácido L - 2 -aminoadipico; ácido treo - ß-metil-aspártico; éster de ?,? -di - t - butilo del ácido ? - carboxi - D - glutámico; éster de y, Y - di - t - butilo del ácido ? - carboxi-L-glutámico; Glu(OAll) - OH; L - Asu(OtBu) - OH; y ácido piroglutámico .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de cisteina y metionina. Los ejemplos de análogos de aminoácido de cisteina y metionina incluyen, pero no se limitan a, Cys (farnesil) - OH, Cys ( farnesil) - OMe, a - metil metionina, Cys (2 - hidroxietil) - OH, Cys (3 - aminopropil) -OH, ácido 2 - amino-4- (etiltio) butírico, butionina, butioninsulfoximina, etionina, clorur de metionina metilsulfonio, selenometionina, pacido cisteico, [2 - (4 -piridil) etil] - DL - penicilamina, [2 - (4 - piridil) etil] -L - cisteina, 4 - metoxibencil- D - penicilamina, 4 metoxibencil-L - penicilamina, 4 - metilbencil-D penicilamina, 4 - metilbencil-L - penicilamin, bencil-D-cisteína, bencil- L - cisteina, bencil- DL - homocisteína, carbamoil L cisteina, carboxietil - L - cisteina, carboximetil - L - cisteina, difenilmetil - L - cisteina, etil - L - cisteina, metil - L - cisteina, t-butil - D -cisteina, tritil - L- homocisteína, tritil - D -penicilamina, cistationina, homocistina, L-homocistina, (2-aminoetil) - L - cisteina, seleno - L cistina, cistationina, Cys(StBu) - OH, y acetamidometil - D -penicilamina .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de fenilalanina y tirosina. Los ejemplos de análogos de aminoácido de fenilalanina y tirosina incluyen ß - metil - fenilalanina, ß - hidroxifenilalanina, a-metil-3-metoxi-DL -fenilalanina, -metil-D - fenilalanina, -metil-L fenilalanina, ácido 1,2,3,4 - tetrahidroisoquinolina -3-carboxilico, 2,4 - dicloro - fenilalanina, 2 (trifluorometil) - D -fenilalanina, 2 - (trifluorometil ) - L fenilalanina, 2-bromo-D-fenilalanina, 2 - bromo L -fenilalanina, 2 - cloro - D - fenilalanina, 2 - cloro - L -fenilalanina, 2 - ciano - D - fenilalanina, 2 - ciano - L -fenilalanina, 2 - fluoro - D - fenilalanina, 2 - fluoro - L -fenilalanina, 2-metil-D - fenilalanina, 2-metil-L -fenilalanina, 2 - nitro - D - fenilalanina, 2 - nitro - L -fenilalanina, 2; 4; 5 - trihidroxi - fenilalanina, 3,4,5 trifluoro D fenilalanina, 3,4,5 - trifluoro L fenilalanina, 3,4 - dicloro - D - fenilalanina, 3,4 - dicloro - L - fenilalanina, 3,4 - difluoro - D - fenilalanina, 3,4 -difluoro - L - fenilalanina, 3,4 - dihidroxi L fenilalanina, 3,4 - dimetoxi - L - fenilalanina, 3,5,3' triyodo- L - tironina, 3,5 - diyodo- D - tirosina, 3,5 -diyodo- L - tirosina, 3,5 - diyodo- L - tironina, 3 (trifluorometil) - D - fenilalanina, 3 - (trifluorometil) - L - fenilalanina, 3 - amino - L - tirosina, 3 - bromo - D -fenilalanina, 3 - bromo - L - fenilalanina, 3 - cloro - D -fenilalanina, 3 - cloro - L - fenilalanina, 3 - cloro - L -tirosina, 3 - ciano - D - fenilalanina, ; 3 - ciano - L - fenilalanina, 3 - fluoro - D - fenilalanina, 3 - fluoro - L -fenilalanina, 3 - fluoro - tirosina, 3-yodo-D - fenilalanina, 3 - yodo - L - fenilalanina, 3 - yodo - L - tirosina, 3-metoxi-L - tirosina, 3-metil-D - fenilalanina, 3-metil-L -fenilalanina, 3 - nitro - D - fenilalanina, 3 - nitro - L -fenilalanina, 3 - nitro - L - tirosina, 4 - (trifluorometil) - D - fenilalanina, 4 - (trifluorometil) - L - fenilalanina, 4 - amino - D - fenilalanina, 4 - amino - L - fenilalanina, 4 - benzoil - D - fenilalanina, 4 -benzoil-L - fenilalanina, 4 - bis (2 - cloroetil) amino - L - fenilalanina, 4 - bromo - D -fenilalanina, 4 - bromo - L - fenilalanina, 4 - cloro - D -fenilalanina, 4 - cloro - L - fenilalanina, 4 - ciano - D -fenilalanina, 4 - ciano - L - fenilalanina, 4 - fluoro - D -fenilalanina, 4 - fluoro - L - fenilalanina, 4-yodo-D -fenilalanina, 4 - yodo - L - fenilalanina, homofenilalanina, tiroxina, 3,3 - difenilalanina, tironina, etil-tirosina, y metil-tirosina .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de prolina.

Los ejemplos de análogos de aminoácido de prolina incluyen, pero no se limitan a, 3 , 4-deshidro-prolina, 4-fluoro-prolina, cis-4-hidroxi-prolina, ácido tiazolidin-2-carboxilico, y trans-4-fluoro-prolina .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de serina y treonina. Los ejemplos de análogos de aminoácido de serina y treonina incluyen, pero no se limitan a, ácido 3 - amino - 2 - hidroxi - 5 - metilhexanoico, ácido 2 - amino - 3 - hidroxi - 4 - metilpentanoico, ácido 2 - amino - 3 - etoxibutanoico, ácido 2 - amino - 3 - metoxibutanoico, ácido 4 - amino - 3 -hidroxi - 6 - metilheptanoico, ácido 2 - amino - 3 -benciloxipropiónico, ácido 2 - amino - 3 -benciloxipropiónico, ácido 2 - amino - 3 - etoxipropiónico, ácido 4 - amino - 3 - hidroxibutanoico, y a-metilserina .

Los análogos de aminoácido incluyen análogos de triptofano. Los ejemplos de análogos de aminoácido de triptofano incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: a-metil-triptofano; ß - (3 - benzotienil) - D - alanina; ß - (3 benzotienil) -L-alanina; 1-metil-triptofano; 4-metil-triptofano; 5 - benciloxi - triptofano; 5 - bromo-triptofano; 5 - cloro - triptofano; 5 - fluoro - triptofano; 5 - hidroxi - triptofano; 5 - hidroxi-L-triptofano; 5-metoxi-triptofano; 5 - metoxi-L-triptofano; 5-metil-triptofano; 6 - bromo-triptofano; 6 - cloro - D - triptofano; 6 - cloro triptofano; 6 - fluoro - triptofano; 6-metil-triptofano ; 7-benciloxi - triptofano; 7 -bromo-triptofano; 7-metil--triptofano; ácido D - 1, 2, 3, 4-tetrahidro- norharman -3-carboxilico; ácido 6-metoxi-l, 2, 3, 4 - tetrahidronorharman -1-carboxílico; 7-azatriptofano; ácido L - 1, 2, 3, 4-tetrahidro-norharman-3-carboxilico; 5-metoxi-2-metil-triptofano; y 6 - cloro-L-triptofano .

En algunas modalidades, los análogos de aminoácido son racémicas. En algunas modalidades, se usa el isómero D del análogo de aminoácido. En algunas modalidades, se usa el isómero D del análogo de aminoácido. En otras modalidades, el análogo de aminoácido comprende centros quirales que están en la configuración R o S. Todavía en otras modalidades, los grupos amino de un ß-análogo de aminoácido se sustituye con un grupo protector, por ejemplo, tert-butiloxicarbonilo (grupo BOC) , 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) , tosilo, y los similares. Aún en otras modalidades, el grupo funcional de ácido carboxílico de un ß-análogo de aminoácido se protege, por ejemplo, como su derivado éster. En algunas modalidades se usa la sal del análogo de aminoácido.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo natural de un polipéptido sin abolir o sustancialmente alterar su actividad bioquímica o biológica esencial (por ejemplo, activación o enlace del receptor) . Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera de la secuencia de tipo natural del polipéptido, resulta en abolir o sustancialmente abolir la actividad bioquímica o biológica esencial del polipéptido.

Una "sustitución de aminoácido conservada" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, K, R, H) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, D, E) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, G, N, Q, S, T, Y, C) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, A, V, L, I, P, F, M, W) , cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, T, V, I) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, Y, F, W, H) . De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido, por ejemplo, se reemplaza con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son sustituciones con base en las consideraciones isostéricas (por ejemplo norleucina para metionina) u otras propiedades (por ejemplo 2-tienilalanina para fenilalanina, o ß-Cl-triptofano para triptofano) .

El término "grupo tapado" se refiere a la porción química que ocurre en cualquiera . de la terminal carboxi o amino de la cadena de polipéptido del macrociclo peptidomimético del sujeto. El grupo tapado de una terminal carboxi incluye un ácido carboxilico no modificado (esto es -COOH) o un ácido carboxilico con un sustituyente . Por ejemplo, la terminal carboxi puede sustituirse con un grupo amino para proporcionar una carboxamida en la terminal C. Varios sustituyentes incluyen pero no se limitan a aminas primarias y secundarias, incluyendo aminas secundarias pegiladas. Los grupos tapados de amina secundarios representativos para la terminal C incluyen: isopropilamida propilamida sec-butilamida butilamida isobutilamida (-NHPr) (-NHnPr) (-NHsBu) (-NHnBu) (-NHiBu) amilamida ¡soam ¡lamida hexilamida 3,3-dimetilbutilamida (-NHAm) (-NHiAm) (-NHHex) (-NHnBu3,3Me) ciclohexilamida 2-ciclohexiletilamida 2-ciclopentiletilamida (-NHChx) (-NHnEt2Ch) (-NHnEt2Cp) bencilamida fenetilamida 3-fenil-1 -propilamida (-NHBn) (-NHPe) (-NHnPr3Ph) n-diPeg2-amida n-diPeg4-amida (-NHmdPeg2) (-NHmdPeg4) El grupo tapado de una terminal amino incluye una amina no modificada (esto es -NH2) o una amina con un sustituyente .

Por ejemplo, la terminal amino puede sustituirse con un grupo acilo para proporcionar una carboxamida en la terminal N. Varios sustituyentes incluyen pero no se limitan a grupos acilo sustituidos, incluyendo carbonilos Ci-C6, carbonilos C7-C30, y carbamatos pegilados. Los grupos tapados representativos para la terminal N incluyen, pero no se limitan a, 4-FBzl ( 4-fluoro-bencilo) y los siguientes: Adamantilcarbonilo Isonicotinilo 1 -naftilo (Isoac) (Admac) (Napac) vA N ^^J^ ^^J^ H- N,N-D¡metilaminoacetilo Trimetilacetilo Hexanoilo Hep/ (no tapado) (Dmaac) (Tmac) (Hexac) Decanoilo Palmitilo (Decae) (Pam) El término "miembro" como se usa en la presente en conjunto con macrociclos o ligaduras que forman macrociclo se refiere a los átomos que forman o pueden formar el macrociclo, y excluyen sustituyentes o átomos de cadena lateral. Por analogía, ciclodecano, 1 , 2-difluoro-decano y 1, 3-dimetil ciclodecano también son macrociclos de diez miembros considerados como los sustituyentes de hidrógeno o flúor o cadenas laterales de metilo que no participan en la formación del macrociclo.

El símbolo cuando se usa como parte una estructura molecular se refiere a un enlace sencillo o un enlace doble trans o cis.

El término "cadena lateral de aminoácido" se refiere a una porción unida al a-carbono (u otro átomo de estructura) en un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácido para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácido para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoácido para cisterna es tiometilo, la cadena lateral de aminoácido para aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácido para tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. Otras cadenas laterales de aminoácido que no se presentan naturalmente también se incluyen, por ejemplo, aquellas que ocurren en la naturaleza (por ejemplo, un metabolito de aminoácido) o aquellas que se hacen sintéticamente (por ejemplo, un aminoácido ,a disustituido) .

El término "aminoácido a, di-sustituido" se refiere a una molécula o porción que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo enlazado a un carbono (el a-carbono) que se une a dos cadenas laterales de aminoácido naturales o no naturales.

El término "polipéptido" abarca dos o más aminoácidos que se presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida) . Los polipéptidos como se describen en la presente incluyen proteínas de longitud completa (por ejemplo, proteínas completamente procesadas) así como secuencias de aminoácido más cortas (por ejemplo, fragmentos de proteínas que se presentan naturalmente o fragmentos de polipéptido sintético) .

El término "primer aminoácido de terminal C" se refiere al aminoácido que está más próximo a la terminal C. El término "Segundo aminoácido de terminal C" se refiere al aminoácido unido a la terminal N del primer aminoácido de terminal C.

El término "reactivo de macrociclización" o "reactivo que forma el macrociclo" como se usa en la presente se refiere a cualquier reactivo que puede usarse para preparar un macrociclo peptidomimético al mediar la reacción entre dos grupos reactivos. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, una azida y alquino, en cuyo caso los reactivos de macrocilización incluyen, sin limitación, reactivos Cu tal como reactivos que proporcionan una especie de Cu(I) reactivo, tal como CuBr, Cul o CuOTf, asi como sales Cu (II) tal como Cu(C02CH3)2, CuS04, y CuCl2 que pueden convertirse in situ para un reactivo Cu(I) activo por la adición de un agente reductor tal como ácido ascórbico o ascorbato de sodio. Los reactivos de macrociclización pueden adicionalmente incluir, por ejemplo, reactivos Ru conocidos en la técnica tal como Cp*RuCl (PPh3) 2, [Cp*RuCl]4 u otro reactivos Ru que pueden proporcionar una especie Ru(II) reactiva. En otros casos, los grupos reactivos son olefinas terminales. En tales modalidades, los reactivos de macrociclización o reactivos que forman macrociclo son catalizadores de metatésis incluyendo, pero no limitados a, catalizadores de complejo de carbeno de metal de transición posterior, estabilizada tal como catalizadores de carbeno de metal de transición del Grupo VIII. Por ejemplo, tales catalizadores son centro de metal Ru y Os que tienen un estado de oxidación +2, un conteo de electrón de 16 y penta-coordinado. En otros ejemplos, los catalizadores tienen centros W o Mo. Varios catalizadores se describen en Grubbs et al., "Ring Closing etathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, Patente de E.U.A. No. 5,811,515; Patente de E.U.A. No. 7,932,397; Solicitud de E.U.A. No. 2011/0065915; Solicitud de E.U.A. No. 2011/0245477; Yu et al., "Synthesis of Macrocyclic Natural Products by Catalyst-Controlled Stereoselective Ring-Closing Metathesis," Nature 2011, 479, 88; and Peryshkov et al., "Z-Selective Olefin Metathesis Reactions Promoted by Tungsten Oxo Alquilidene Complexes, " J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754. Aún en otros casos, los grupos reactivos son grupos tiol. En tales modalidades, el reactivo de macrociclización es, por ejemplo, una ligadura funcionalizada con dos grupos de tiol-reactivo tal como grupos de halógeno.

El término "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo o un radical de los mismos.

El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, Ci-Cio indica que el grupo tiene desde 1 hasta 10 (inclusive) átomos de carbono en este. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquilo" es una cadena (recta o ramificada) que tiene 1 hasta 20 (inclusive) átomos de carbono en este.

El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente ( esto es, -R- ) .

El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o cadena ramificada que tiene uno o más enlaces dobles carbono-carbono. La porción alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene desde 2 hasta 10 (inclusive) átomos de carbono en este. El término "alquenilo inferior" se refiere a una cadena alquenilo C2-C6. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquenilo" es una cadena (recta o ramificada) que tiene 2 hasta 20 (inclusive) átomos de carbono en este.

El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o cadena ramificada que tiene uno o más enlaces triples carbono-carbono. La porción de alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-Ci0 indica que el grupo tiene desde 2 hasta 10 (inclusive) átomos de carbono en este. El término "alquinilo inferior" se refiere a una cadena alquinilo C2-C6. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquinilo" es una cadena (recta o ramificada) que tiene 2 hasta 20 (inclusive) átomos de carbono en este.

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático bicíclico de 10 carbonos o monocíclico de 6 carbonos en donde 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo se sustituyen por un sustituyente . Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y los similares. El término "arilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con arilo.

"Arilalquilo" se refiere a un grupo arilo, como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado con un grupo alquilo C1-C5, como se define arriba. Los ejemplos representativos de un grupo arilalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-metilfenilo, 3-metilfenilo, 4-metilfenilo, 2-etilfenilo, 3-etilfenilo, 4-etilfenilo, 2-propilfenilo, 3-propilfenilo, 4-propilfenilo, 2-butilfenilo, 3-butilfenilo, 4-butilfenilo, 2-pentilfenilo, 3-pentilfenilo, 4-pentilfenilo, 2-isopropilfenilo, 3-isopropilfenilo, 4-isopropilfenilo, 2-isobutilfenilo, 3-isobutilfenilo, 4-isobutilfenilo, 2-sec-butilfenilo, 3-sec-butilfenilo, 4-sec-butilfenilo, 2-t-butilfenilo, 3-t-butilfenil y 4-t-butilfenilo .

"Arilamido" se refiere a un grupo arilo, como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado con uno o más grupos -C(0)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo arilamido incluyen 2-C (O) NH2-fenilo, 3-C (O) NH2-fenilo, 4-C (O) NH2-fenilo, 2-C(0)NH2-piridilo, 3-C (0) NH2-piridilo, y 4-C (0) NH2-piridilo .

"Alquilheterociclo" se refiere a un grupo alquilo C1-C5 , como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un heterociclo. Los ejemplos representativos de un grupo alquilheterociclo incluyen, pero no se limitan a, -CH2CH2-morfolina, -CH2CH2-piperidina, -CH2CH2CH2-morfolina, y CH2CH2CH2-imidazol .

"Alquilamido" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo -C(0)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo alquilamido incluyen, pero no se limitan a, -CH2-C (O) NH2, -CH2CH2-C (O) NH2, -CH2CH2CH2C (O) NH2, -CH2CH2CH2CH2C (O) NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2C (O) NH2, -CH2CH (C (0)NH2)CH3, -CH2CH (C (O) NH2) CH2CH3, -CH (C (O) NH2) CH2CH3, -C (CH3) 2CH2C (O) NH2, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH3, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH3-CH3, y -CH2-CH2-NH-C (O) -CH=CH2.

"Alcanol" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo hidroxilo. Los ejemplos representativos de un grupo alcanol incluyen, pero no se limitan a, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2 CH2CH2OH, -CH2CH (OH) CH3, CH2CH (OH) CH2CH3, -CH(OH)CH3 y -C (CH3) 2CH2OH .

"Alquilcarboxi" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se define arriba, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo --COOH. Los ejemplos representativos de un grupo alquilcarboxi incluyen, pero no se limitan a, -CH2COOH, -CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2COOH, - CH2CH2CH2CH2COOH , -CH2CH (COOH) CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2COOH , CH2CH(COOH) CH2CH3, -CH (COOH) CH2CH3 y -C (CH3) 2CH2COOH.

El término "cicloalquilo" como se emplea en la presente incluye grupos hidrocarburo cíclicos saturados y parcialmente no saturados que tienen 3 hasta 12 carbonos, preferiblemente 3 hasta 8 carbonos, y más preferiblemente 3 hasta 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente está opcionalmente sustituido. Algunos grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, y ciclooctilo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros, o tricíclico de 11-14 miembros aromático que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico, o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, los heteroátomos seleccionados de O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6, o 1-9 heteroátomos de 0, N, o S si es monocíclico, bicíclico, o tricíclico, respectivamente) , en donde 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo se sustituyen por un sustituyente . Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, benzimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo, y los similares.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo monociclico de 5-8 miembros, biciclico de 8-12 miembros, o triciclico de 11-14 miembros no aromático que tiene 1-3 heteroátomos si es monociclico, 1-6 heteroátomos si es biciclico, o 1-9 heteroátomos si es triciclico, los heteroátomos seleccionados de 0, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6, o 1-9 heteroátomos de 0, N, o S si es monociclico, biciclico, o triciclico, respectivamente) , en donde 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo se sustituyen por un sustituyente . Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo, y los similares.

El término "sustituyente" se refiere a un grupo que reemplaza un segundo átomo o grupo tal como un átomo de hidrógeno en cualquier molécula, compuesto o porción. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, grupos halo, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alcoxicarbonilo, amido, carboxi, alcansulfonilo, alquilcarbonilo, y ciano.

En algunas modalidades, los compuestos descritos en la presente contienen uno o más centros asimétricos y de esta manera ocurren como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros sencillos, diastereómeros individuales y mezclas diastereoméricas . Todas las formas isoméricas de estos compuestos se incluyen a menos que se proporcionen expresamente de otra manera. En algunas modalidades, los compuestos descritos en la presente también se representan en formas tautoméricas múltiples, en tales casos, los compuestos incluyen todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente (por ejemplo, si la alquilación de un sistema de anillo resulta en alquilación en múltiples sitios, la invención incluye todos los productos de reacción) . Todas las formas isoméricas de tales compuestos se incluyen a menos que se proporcionen expresamente de otra manera. Todas las formas de cristal de los compuestos descritos en la presente se incluyen a menos que se proporcionen expresamente de otra manera.

Como se usa en la presente, los términos "incrementar" y "disminuir" significa, respectivamente, provocar un incremento o disminución estadísticamente de forma importante (esto es, p < 0.1) de al menos 5%.

Como se usa en la presente, la recitación de un intervalo numérico para una variable se pretende para expresar que la variable es igual a cualquiera de los valores dentro de tal intervalo. De esta manera, para una variable que es inherentemente discreta, la variable es igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. Similarmente, para una variable que es inherentemente continua, la variable es igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. Como un ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe como que tiene valores entre 0 y 2 toma los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreto, y toma los valores 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, o cualquiera de otros valores reales = 0 y = 2 si la variable es inherentemente continua.

Como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente de otra manera, la palabra "o" se usa en el sentido inclusivo de "y/o" y sin el sentido exclusivo de "cualquier/o" .

El término "en promedio" representa el valor medio derivado de realizar al menos tres replicados independientes para cada punto de datos.

El término "actividad biológica" abarca propiedades funcionales y estructurales de un macrociclo. La actividad biológica es, por ejemplo, estabilidad estructural, alfa-helicidad, afinidad para un objetivo, resistencia para la degradación proteolitica, penetrabilidad celular, estabilidad intracelular, estabilidad in vivo, o cualquier combinación de los mismos.

El término "afinidad de enlace" se refiere a la fuerza de una interacción de enlace, por ejemplo entre un macrociclo peptidomimético y un objetivo. La afinidad de enlace puede expresarse, por ejemplo, como una constante de disociación de equilibrio ("KD"), que se expresa en unidades que son una medición de la concentración (por ejemplo M, mM, µ , nM etc) . Numéricamente, la afinidad de enlace y valores KD varían inversamente, de manera que una afinidad de enlace inferior corresponde a un valor KD superior, mientras que una afinidad de enlace superior corresponde a un valor KD inferior. Donde se deseable la afinidad de enlace alta, la afinidad de enlace "mejorada" se refiere a afinidad de enlace superior y por lo tanto valores KD inferiores.

El término "eficacia in vitro" se refiere a la extensión a la cual un compuesto de prueba, tal como un macrociclo peptidomimético, produce un resultado benéfico en un ensayo o sistema de prueba in vitro. La eficacia in vitro puede medirse, por ejemplo, como un valor "IC50" o "EC50", que representa la concentración del compuesto de prueba que produce 50% del efecto máximo en el sistema de prueba.

El término "relación de eficacias in vitro" o "relación de eficacia in vitro" se refiere a la relación de valores IC50 o EC50 de un primer ensayo (en numerador) contra un segundo ensayo (el denominador) . Consecuentemente, una relación de eficacia in vitro mejorada para el Ensayo 1 contra el Ensayo 2 se refiere a un valor inferior para la relación expresada como IC50 (Ensayo 1 ) /IC50 (Ensayo 2) o alternativamente como EC5o(Ensayo 1) /EC50 (Ensayo 2). Este concepto también puede caracterizarse como "selectividad mejorada" en el Ensayo 1 contra el Ensayo 2, que puede ser debido a ya sea a una disminución en el valor IC50 o EC50 para el Objetivo 1 o un incremento en el valor para el valor IC50 o EC50 para el Objetivo 2.

Los detalles de una o más modalidades particulares de la invención se establecen en las figuras acompañantes y la descripción de abajo. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán aparentes de la descripción y figuras, y de las reivindicaciones.

Macrociclos peptidomiméticos En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula (I) : Fórmula I en donde : cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido (incluyendo aminoácidos naturales o no naturales, y análogos de aminoácido) y la terminal D y E independientemente opcionalmente incluye un grupo tapado; B es un aminoácido (incluyendo aminoácidos naturales o no naturales, y análogos de aminoácido) , [-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-] , o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; L es una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -SO2 6 -C02R6 una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Ra es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente enteros desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; u es un entero desde 1-10, por ejemplo 1-5, 1-3 o 1-2; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10, por ejemplo la suma de x+y+z es 2, 3, o 6; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades, v y w son enteros entre 1-30. En algunas modalidades, w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3 o 6. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3. En otras modalidades, la suma de x+y+z es 6.

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos también se proporcionan de la fórmula: individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5- yr6- rp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2/ (SEQ ID NO: 8) donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2^ -SR6, -SOR6, -S02R6^ -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20 o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades, v y w son enteros entre 1-30.

En algunas modalidades, w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3 o 6. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3. En otras modalidades, la suma de x+y+z es 6.

En algunas modalidades de cualquiera de la fórmulas descritas en la presente, al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, (SEQ ID NO:8). En otras modalidades, al menos cuatro de Xaa3, Xaas, a6, Xaa7, Xaa8, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leu10-Xii-Seri2, (SEQ ID NO:8). En otras modalidades, al menos cinco de Xaa3, Xaas, Xaa¾, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Ser12, (SEQ ID NO: 8). En otras modalidades, al menos seis de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leui0-Xii-Seri2, (SEQ ID NO: 8). En otras modalidades, al menos siete de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, (SEQ ID NO: 8.

En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula: en donde: cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2, (SEQ ID NO: 9) donde cada X es un aminoácido; cada D es independientemente un aminoácido; cada E es independientemente un aminoácido, por ejemplo un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido a-aminoisobutírico) , Sar (N-metil glicina), y Ser (serina); Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -ORÉ, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R6, -C02 6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Re es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquílo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5.

En algunas modalidades de la Fórmula de arriba, al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbai0-Xii-Alai2 ( SEQ ID NO: 9). En otras modalidades de la Fórmula de arriba , al menos cuatro de Xaa3, Xaas, a6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cba10-Xii-Alai2 ( SEQ ID NO: 9). En otras modalidades de la Fórmula de arriba , al menos cinco de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7 Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbai0-Xii-Alai2 (SEQ ID NO: 9). En otras modalidades de la Fórmula de arriba , al menos seis de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2 (SEQ ID NO: 9). En otras modalidades de la Fórmula de arriba , al menos siete de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2. (SEQ ID NO: 9).

En algunas modalidades, w es un entero desde 3-10, por ejemplo 3-6, 3-8, 6-8, o 6-10. En algunas modalidades, w es 3. En otras modalidades, w es 6. En algunas modalidades, v es un entero desde 1-10, por ejemplo 2-5. En algunas modalidades, v es 2.

En una modalidad de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente, Li y L2, ya sea solo o en combinación, no forman un triazol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de Ri y R2 es alquilo, sustituido o no sustituido con halo-. En otro ejemplo, ambos Ri y R2 son independientemente alquilo, sustituido o no sustituido con halo-. En algunas modalidades, al menos uno de Ri y R2 es metilo. En otras modalidades, Ri y R2 son metilo.

En algunas modalidades, x+y+z es al menos 3. En otras modalidades, x+y+z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3 o 6. En algunas modalidades, la suma de x+y+z es 3. En otras modalidades, la suma de x+y+z es 6. Cada ocurrencia de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor macrociclo es independientemente seleccionado. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca modalidades donde los aminoácidos no son idénticas, por ejemplo Gln-Asp-Ala asi como modalidades donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo Gln-Gln-Gln. Esto aplica para cualquier valor de x, y, o z en los intervalos indicados. Similarmente, cuando u es mayor que 1, cada compuesto puede abarcar macrociclos peptidomiméticos que son los mismos o diferentes. Por ejemplo, un compuesto puede comprender macrociclos peptidomiméticos que comprenden diferentes longitudes de ligadura o composiciones químicas.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende una estructura secundaria que es una a-hélice y Rs es -H, permitiendo el enlace de hidrógeno intrahelicoidal . En algunas modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es un aminoácido a, a-disustituido . En un ejemplo, B es un aminoácido a, a-disustituido . Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutirico . En otras modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es En otras modalidades, la longitud de la ligadura que forma el macrociclo L se mide de un primer Ca hasta un Segundo Ca es seleccionado para estabilizar una estructura de péptido secundario deseado, tal como una a-hélice formada por residuos del macrociclo peptidomimético incluyendo, pero no necesariamente limitados a, aquellos entre el primer Ca hasta un Segundo Ca.

En una modalidad, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es: en donde cada Ri y R2 es independientemente-H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-.

En modalidades relacionadas, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es: en donde cada Ri' y R2' es independientemente un aminoácido .

En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas mostradas a continuación: aminoácido natural o no nat:uurraall yy es [D]v, [E]w como se define arriba, y n es un entero entre 0 y 20, 50, 100, 200, 300, 400 o 500. En algunas modalidades, n es 0. En otras modalidades, n es menor que 50.

Las modalidades ejemplares de la ligadura que forma el macrociclo L se muestran a continuación. donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH donde X, Y = -CH2 m, n, o, p = 0-10 m, n, o, p = 0-10 donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o = 0-10 R = H, alquilo, otro sustituyente En otras modalidades, D y/o E en el compuesto de la Fórmula I se modifican además con objeto de facilitar la absorción celular. En algunas modalidades, la lipidación o PEGilación de un macrociclo peptidomimético facilita la absorción celular, incrementa la biodisponibilidad, incrementa la circulación sanguínea, altera los farmacocinéticos , disminuye la inmunogenicidad y/o disminuye la frecuencia necesaria de administración.

En otras modalidades, al menos uno de [D] y [E] en el compuesto de la Fórmula I representa una porción que comprende una ligadura que forma el macrociclo adicional de manera que el macrociclo peptidomimético comprende al menos dos ligadura que forman el macrociclo. En una modalidad especifica, un macrociclo peptidomimético comprende dos ligaduras que forman el macrociclo. En una modalidad, u es 2.

En algunas modalidades, cualquiera de las ligaduras que forman el macrociclo descritas en la presente pueden usarse en cualquier combinación con cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le y también con cualquiera de los sustituyentes R indicados en la presente .

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende al menos una porción de a-hélice. Por ejemplo, A, B y/o C en el compuesto de la Fórmula I incluyen una o más a-hélices. Como una material general, las a-hélices incluyen entre 3 y 4 residuos de aminoácidos por vuelta. En algunas modalidades, la a-hélice del macrociclo peptidomimético incluye 1 hasta 5 vueltas y, por lo tanto, 3 hasta 20 residuos de aminoácido. En modalidades especificas, la a-hélice incluye 1 vuelta, 2 vueltas, 3 vueltas, 4 vueltas, o 5 vueltas. En algunas modalidades, la ligadura que forma el macrociclo estabiliza una porción a-hélice incluida dentro del macrociclo peptidomimético. De esta manera, en algunas modalidades, la longitud de la ligadura que forma el macrociclo L de una primera Co¡ hasta una segunda Ca se selecciona para incrementar la estabilidad de una a-hélice. En algunas modalidades, la ligadura que forma el macrociclo gira desde 1 vuelta hasta 5 vueltas de la a-hélice. En algunas modalidades, la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta, 2 vueltas, 3 vueltas, 4 vueltas, o 5 vueltas de la a-hélice. En algunas modalidades, la longitud de la ligadura que forma el macrociclo es aproximadamente 5 Á hasta 9 Á por vuelta de la a-héüce, o aproximadamente 6 Á hasta 8 Á por vuelta de la a-hélice. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de una a-hélice, la longitud es igual hasta aproximadamente 5 enlaces carbono-carbono hasta 13 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 7 enlaces carbono-carbono hasta 11 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 9 enlaces carbono-carbono. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 2 vueltas de una a-hélice, la longitud es igual hasta aproximadamente 8 enlaces carbono-carbono hasta 16 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 10 enlaces carbono-carbono hasta 14 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 12 enlaces carbono-carbono. Donde la ligadura que forma el macrociclo que abarca aproximadamente 3 vueltas de una a-hélice, la longitud es. igual hasta aproximadamente 14 enlaces carbono-carbono hasta 22 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 16 enlaces carbono-carbono hasta 20 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 18 enlaces carbono-carbono. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 4 vueltas de una a-hélice, la longitud es igual hasta aproximadamente 20 enlaces carbono-carbono hasta 28 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 22 enlaces carbono-carbono hasta 26 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 24 enlaces carbono-carbono. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 5 vueltas de una a-hélice, la longitud es igual hasta aproximadamente 26 enlaces carbono-carbono hasta 34 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 28 enlaces carbono-carbono hasta 32 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 30 enlaces carbono-carbono. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de una a-hélice, la ligadura contiene aproximadamente 4 átomos hasta 12 átomos, aproximadamente 6 átomos hasta 10 átomos, o aproximadamente 8 átomos. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 2 vueltas de la a-hélice, la ligadura contiene aproximadamente 7 átomos hasta 15 átomos, aproximadamente 9 átomos hasta 13 átomos, o aproximadamente 11 átomos. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 3 vueltas de la a-hélice, la ligadura contiene aproximadamente 13 átomos hasta 21 átomos, aproximadamente 15 átomos hasta 19 átomos, o aproximadamente 17 átomos. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 4 vueltas de la a-hélice, la ligadura contiene aproximadamente 19 átomos hasta 27 átomos, aproximadamente 21 átomos hasta 25 átomos, o aproximadamente 23 átomos. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 5 vueltas de la a-hélice, la ligadura contiene aproximadamente 25 átomos hasta 33 átomos, aproximadamente 27 átomos hasta 31 átomos, o aproximadamente 29 átomos. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de la a-hélice, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 17 miembros hasta 25 miembros, aproximadamente 19 miembros hasta 23 miembros, o aproximadamente 21 miembros. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 2 vueltas de la a-hélice, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene . aproximadamente 29 miembros hasta 37 miembros, aproximadamente 31 miembros hasta 35 miembros, o aproximadamente 33 miembros. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 3 vueltas de la a-hélice, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 44 miembros hasta 52 miembros, aproximadamente 46 miembros hasta 50 miembros, o aproximadamente 48 miembros. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 4 vueltas de la a-hélice, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 59 miembros hasta 67 miembros, aproximadamente 61 miembros hasta 65 miembros, o aproximadamente 63 miembros. Donde la ligadura que forma el macrociclo gira aproximadamente 5 vueltas de la a-hélice, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 74 miembros hasta 82 miembros, aproximadamente 76 miembros hasta 80 miembros, o aproximadamente 78 miembros.

En otras modalidades, se proporcionan macrociclos peptidomiméticos de la Fórmula (IV) o (IVa) : (IV) (IVa) en donde: cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y la terminal D y E independientemente opcionalmente incluyen un grupo tapado; B es un aminoácido natural o no natural, análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] , o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; L es una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquíleno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2 -SR6, -S0R6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; v y w son independientemente enteros desde 1-1000; u es un entero desde 1-10; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10; y n es un entero desde 1-5.

En un ejemplo, Li y L2, ya sea solos o en combinación, no forman un triazol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de Ri y R2 es alquilo, sustituido o no sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto Ri como R2 son independientemente alquilo, sustituido o no sustituido con halo-. En algunas modalidades, al menos uno de Ri y R2 es metilo. En otras modalidades, Ri y R2 son metilo.

En algunas modalidades, x+y+z es. al menos 1. En otras modalidades, x+y+z es al menos 2. En otras modalidades, x+y+z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Cada ocurrencia de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor macrociclo se selecciona independientemente. Por ejemplo, una secuencia representado por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca modalidades donde los aminoácidos no son idénticas, por ejemplo Gln-Asp-Ala asi como modalidades donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo Gln-Gln-Gln. Esto aplica para cualquier valor de x, y, o z en los intervalos indicados .

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende una estructura secundaria que es una a-hélice y Rs es -H, permitiendo el enlace de hidrógeno intrahelicoidal . En algunas modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es un aminoácido a, a-disustituido . En un ejemplo, B es un aminoácido , -disustituido. Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutirico . En otras modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es En otras modalidades, la longitud de la ligadura que forma el macrociclo L se mide de una primera Ca hasta una segunda Ca se selecciona para estabilizar una estructura de péptido secundario deseado, tal como una a-hélice formada por residuos del macrociclo peptidomimético incluyendo, pero no necesariamente limitados a, aquellos entre la primera Ca hasta una segunda Ca.

Las modalidades ejemplares de la ligadura que forma el macrociclo -Li-L2- se muestran a continuación. donde X, Y = -CH2 donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o, p = 0-10 donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH donde X, Y = -CH2-, O, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o = 0-10 R = H, alquilo, otro sustituyente A menos que se establezca de otra manera, cualquiera de los compuestos (incluyendo macrociclos peptidomiméticos , precursores macrociclo, y otras composiciones) también se entiende que abarcan compuestos que difieren únicamente en presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las estructuras describe excepto para el reemplazo de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por carbono enriquecido por 13C o 1 C están dentro del alcance de esta invención .

En algunas modalidades, los compuestos descritos en la presente pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden radioetiquetarse con isótopos radioactivos, tal como por ejemplo tritio (3H) , yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C) . En otras modalidades, uno o más átomos de carbono se reemplaza con un átomo de silicio. Todas las variaciones isotópicas de los compuestos descritos en la presente, si son radioactivos o no, se contemplan en la presente.

Preparación de macrociclos peptidomiméticos Los macrociclos peptidomiméticos pueden prepararse por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cualquiera de los residuos indicados por o "$r8" en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le puede sustituirse con un residuo capaz de formar una reticulación con un segundo residuo en la misma molécula o un precursor de tal residuo.

Varios métodos para efectuar la formación de macrociclos peptidomiméticos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la preparación de macrociclos peptidomiméticos de la Fórmula I se describe en Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); alensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); Patente de E.U.A. No. 7,192,713 y Solicitud de PCT WO 2008/121767. Los aminoácidos o¡, -disustituidos y precursores aminoácidos descritos en las referencias citadas pueden emplearse en síntesis de los polipéptidos precursores de macrociclo peptidomimético . Por ejemplo, el "aminoácido S5-olefina" es (S) -a- (2' -pentenil) alanina y el "aminoácido R8 olefina" es (R) -a- (2' -octenil) alanina. Después de la incorporación de tales aminoácidos en polipéptidos precursores, las olefinas terminales se hacen reaccionar con un catalizador de metatésis, llevando a la formación del macrociclo peptidomimético. En varias modalidades, los siguientes aminoácidos pueden emplearse en la síntesis del macrociclo peptidomimético: En otras modalidades, los macrociclos peptidomiméticos son de la Fórmula^ IV o IVa. Los métodos para la preparación de tales macrociclos se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 7,202,332.

Los métodos adicionales para formar macrociclos peptidomiméticos que son previstos como adecuados incluyen aquellos descritos por Mustapa, M. Firouz ohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193-8198; Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, páginas 1403-1406; Patente de E.U.A. No. 5,364,851; Patente de E.U.A. No. 5,446,128; Patente de E.U.A. No. 5,824,483; Patente de E.U.A. No. 6,713,280; y Patente de E.U.A. No. 7,202,332. En tales modalidades, los precursores de aminoácido se usan que contienen un sustituyente adicional R- en la posición alfa. Tales aminoácidos se incorporan en el precursor macrociclo en las posiciones deseadas, que pueden estar en las posiciones donde el reticulador se sustituye o, alternativamente, en otro lugar en la secuencia del precursor macrociclo. La ciclización del precursor luego se efectúa de acuerdo con el método indicado.

Ensayos Las propiedades de macrociclos peptidomiméticos se colocan en ensayo, por ejemplo, al usar los métodos descritos abajo. En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético tiene propiedades biológicas mejoradas con relación a un polipéptido correspondiente que carece de los sustituyentes descritos en la presente.

Ensayo para determinar la a-helicidad En solución, la estructura secundaria de polipéptidos con dominios a-helicoidales alcanzará un equilibrio dinámico entre las estructuras de espiral aleatorio y estructuras a-helicoidales, a menudo se expresan como un "porcentaje de helicidad". De esta manera, por ejemplo, dominios alfa-helicoidales son predominantemente espirales aleatorios en la solución, con contenido a-helicoidal usualmente bajo 25%. Los macrociclos peptidomiméticos con ligaduras optimizadas, por otro lado, posee, por ejemplo, una alfa-helicidad que es al menos dos veces mayor que aquella de un polipéptido sin reticulado correspondiente. En algunas modalidades, los macrociclos poseerán una alfa-helicidad de mayor que 50%. Para colocar en ensayo la helicidad de macrociclos peptidomiméticos, los compuestos se disuelven en una solución acuosa (por ejemplo solución de fosfato de potasio 50 mM en pH 7, o H20 destilado, a concentraciones de 25-50 µ?) . Los espectros de dicroismo circulares (CD) se obtienen en un espectropolarimetro (por ejemplo, Jasco J-710) usando parámetros de medición estándares (por ejemplo temperatura, 20°C; longitud de onda, 190-260 nm; resolución en etapa, 0.5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 seg; ancho de banda, 1 nm; longitud de trayectoria, 0.1 cm) . El contenido a-helicoidal de cada péptido se calcula al dividir la elipticidad del residuo medio (por ejemplo [$>] 222obs) por el valor reportado para un decapéptido helicoidal modelo (Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130:208) ) .

Ensayo para determinar la temperatura de fusión (Tm) .

Un macrociclo peptidomimético que comprende una estructura secundaria tal como una a-hélice exhibe, por ejemplo, una temperatura de fusión superior que un polipéptido no reticulado correspondiente. Típicamente los macrociclos peptidomiméticos exhiben Tm de > 60°C representando una estructura altamente estable en soluciones acuosas. Para colocar en ensayo el efecto de la formación de macrociclo en la temperatura de fusión, los macrociclos peptidomiméticos o péptidos no modificados se disuelven en H20 destilada (por ejemplo en una concentración final de 50 µ?) y el Tm se determina al medir el cambio en elipticidad sobre un intervalo de temperatura (por ejemplo 4 hasta 95 °C) sobre un espectropolarímetro (por ejemplo, Jasco J-710) usando parámetros estándares (por ejemplo longitud de onda 222nm; resolución en etapa, 0.5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 seg; ancho de banda, 1 nm; tasa de incremento de temperatura: l°C/min; longitud de trayectoria, 0.1 cm) .

Ensayo de Resistencia a la proteasa.

El enlace de amida de la estructura de péptido es susceptible a hidrólisis por proteasas, por ello representa compuestos peptídicos vulnerables para degradación rápida in vivo. La formación de hélice de péptido, sin embargo, típicamente entierra la estructura de amida y por lo tanto puede proteger esto de desdoblamiento proteolítico . Los macrociclos pept idomiméticos pueden someterse a proteólisis de tripsina in vitro para evaluar cualquier cambio en tasa de degradación comparada con un polipéptido no reticulado correspondiente. Por ejemplo, el macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente se incuban con tripsina agarosa y las reacciones se apagan en varios puntos de tiempo por centrifugación e inyección HPLC posterior para cuantificar el sustrato residual por absorción ultravioleta en 280 nm. Brevemente, el macrociclo peptidomimético y precursor pept idomimético (5 mcg) se incuban con tripsina agarosa (Pierce) (S/E -125) durante 0, 10, 20, 90, y 180 minutos. Las reacciones se apagan por centrifugación en la mesa en velocidad alta; el sustrato restante en el sobrenadante aislado se cuantifica por detección de pico basado en HPLC en 280 nm. La reacción proteolítica exhibe cinéticos de primer orden y la constante de tasa, k, se determina de un gráfica de ln[S] contra el tiempo ( k=-lXpendiente ) .

Ensayo de estabilidad ex vivo.

Los macrociclos peptidomiméticos con ligaduras optimizadas poseen, por ejemplo, una vida media ex vivo que es al menos dos veces mayor que aquella de un polipéptido no reticulado correspondiente, y posee una vida media ex vivo de 12 horas o más. Para los estudios de estabilidad de suero ex vivo, puede usarse una variedad de ensayos. Por ejemplo, un macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente (2 mcg) se incuban con ratón fresco, rata y/o suero humano (2 mL) a 37°C durante 0, 1, 2, 4, 8, y 24 horas. Para determinar el nivel de compuesto intacto, el siguiente procedimiento puede usarse: Las muestras se extraen al transferir 100 µ? de suero a tubos centrífugos de 2 mi seguido por la adición de 10 µL de ácido fórmico al 50% y acetonitrilo 500µ? y centrifugación en 14,000 RPM durante 10 min a 4 ± 2°C. Los sobrenadantes luego se transfieren a tubos de 2 mi frescos y evaporan en Turbovap bajo N2 < 0.703 kg/cm2 (10 psi) , 37°C. Las muestras se reconstituyen en 100 L de 50:50 acetonitrilo : agua y envían a análisis LC-MS/MS.

Ensayos de enlace in vitro.

Para evaluar el enlace y afinidad de macrociclos peptidomiméticos y precursores peptidomiméticos a proteínas aceptadoras, se usa un ensayo de polarización de fluorescencia (FPA), por ejemplo. La técnica FPA mide la movilidad y orientación molecular usando el trazador fluorescente y de luz polarizada. Cuando se alborotan con trazador fluorescente, de luz polarizada (por ejemplo, FITC) unidos a moléculas con pesos moleculares aparentes altos (por ejemplo péptidos etiquetados FITC enlazados a una proteina grande) emiten niveles superiores de fluorescencia polarizada debido a sus tasas inferiores de rotación como se compara con los trazadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo péptidos etiquetados FITC que están libre en solución) .

Por ejemplo, los macrociclos peptidomiméticos fluoresceinados (25 nM) se incuban con la proteina aceptadora (25- ??????) en solución amortiguadora de enlace (NaCl 140mM, Tris-HCL 50 mM, pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se mide la actividad de enlace, por ejemplo, por polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo Perkin-Elmer LS50B) . Los valores Kd pueden determinarse por análisis de regresión no lineal usando, por ejemplo, software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . Un macrociclo peptidomimético muestra, en algunas modalidades, Kd similar o inferior que un polipéptido no reticulado correspondiente.

Ensayos de desplazamiento in vitro para caracterizar los antagonistas de interacciones de péptido-proteina .

Para evaluar el enlace y afinidad de los compuestos que antagonizan la interacción entre un péptido y una proteina aceptadora, se usa un ensayo de polarización de fluorescencia (FPA) utilizando un macrociclo peptidomimético fluoresceinado derivado de una secuencia precursora peptidomiméticoa, por ejemplo. La técnica FPA mide la movilidad y orientación molecular usando trazador fluorescente y de luz polarizada. Cuando se alborotan con trazadores fluorescentes, de luz polarizada (por ejemplo, FITC) unidos a moléculas con pesos moleculares aparentes altos (por ejemplo péptidos etiquetados FITC enlazados a una proteina grande) emiten niveles superiores de fluorescencia polarizada debido a sus tasas inferiores de rotación como se compara con trazadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo péptidos etiquetados FITC que están libre en solución) . Un compuesto que antagoniza la interacción entre el macrociclo peptidomimético fluoresceinado y una proteina aceptadora se detectará en un experimento FPA de enlace competitivo.

Por ejemplo, los compuestos antagonistas supuestos (1 nM hasta 1 mM) y un macrociclo peptidomimético fluoresceinado (25 nM) se incuban con la proteina aceptadora (50 nM) en solución amortiguadora de enlace (NaCl 140mM, Tris-HCL 50 mM, pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se mide la actividad de enlace antagonista, por ejemplo, por polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo Perkin-Elmer LS50B) . Los valores Kd pueden determinarse por análisis de regresión no lineal usando, por ejemplo, software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) .

Cualquier clase de molécula, tal como moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligonucleótidos o proteínas puede examinarse como antagonistas supuestos en este ensayo.

Ensayo para enlace de la proteína-ligando por espectrometría de masa de selección de afinidad Para evaluar el enlace y afinidad de los compuestos de prueba para proteínas, se usa un ensayo de espectrometría de masa de selección de afinidad, por ejemplo.

Los experimentos de enlace de proteína-ligando se conducen de acuerdo con el siguiente procedimiento representativo resumido por un experimento de control de sistema amplio usando macrociclo peptidomimético 1 µ? más hMDM2 5 µ?. Una alícuota de DMSO 1 µ de una solución madre 40 µ? de macrociclo peptidomimético se disuelve en 19 µL de PBS (solución amortiguadora salina de fosfato: 50 mM, pH 7.5 solución amortiguadora de fosfato que contiene NaCl 150 mM) . La solución resultante se mezcla por pipeteo repetido y clarificado por centrifugación en 10 OOOg durante 10 min. A una alícuota de 4 µ?, del sobrenadante resultante se agrega 4 µ] de hMDM2 10 µ? en PBS. Cada 8.0 µ? de muestra experimental de esta manera contiene 40 pmol (1.5 µg) de proteína en concentración 5.0 µ? en PBS más macrociclo peptidomimético 1 µ? y DMSO al 2.5%. Las muestras en duplicado de esta manera preparadas para cada punto de concentración se incuban durante 60 min a temperatura ambiente, y luego se enfriaron a 4°C antes del análisis de cromatografía-LC-MS por exclusión de tamaño de inyecciones 5.0 µL. Las muestras que contienen una proteína objetivo, complejos de proteína-ligando, y compuestos sin enlace se inyectan en una columna SEC, donde los complejos se separan del componente sin enlace por una etapa SEC rápida. El eluido de columna SEC se monitorea usando detectores UV para confirmar que la fracción de la proteína eluida temprana, que se eluye en el volumen vacío de la columna SEC, está bien resuelto de los componentes sin enlace que se mantienen en la columna. Después de que el pico que contiene los complejos de proteina y proteina-ligando se eluye del detector UV primario, ingresa un rizo de muestra donde se extirpa de la corriente de flujo de la etapa SEC y transfiere directamente al LC-MS por medio de un mecanismo de válvula. El ion (M + 3H)3+ del macrociclo peptidomimético se observa por ESI-MS en el m/z esperado, confirmando la detección del complejo de proteina-ligando .

Ensayo para experimentos de titulación Kd de proteina-ligando .

Para evaluar el enlace y afinidad de los compuestos de prueba para las proteínas, se realiza un experimento de titulación Kd de proteina-ligando, por ejemplo. Los experimentos de titulaciones ¾ de proteína-ligando se conducen como sigue: alícuotas DMSO 2 ]il¡ de una solución madre diluida en serie de macrociclo peptidomimético de titulación (5, 2.5, 0.098 mM) se preparan luego se disuelven en 38 µ]1 de PBS . Las soluciones resultantes se mezclan por pipeteo repetido y clarifican por centrifugación en 10 OOOg durante 10 min. Para alícuotas 4.0 \iL de los sobrenadantes resultantes se agrega 4.0 L de hMDM2 10 µ? en PBS. Cada muestra experimental 8.0 L de esta manera contiene 40 pmol (1.5 g) de proteína en concentración 5.0 µ en PBS, concentraciones variadas (125, 62.5, 0.24 µ?) del péptido de titulación, y DMSO al 2.5%. Las muestras en duplicado de esta manera preparadas para cada punto de concentración se incuban a temperatura ambiente durante 30 min, luego se enfrian hasta 4°C antes del análisis SEC-LC-MS de las inyecciones 2.0 µ?,. El ion (M + H) 1+, (M + 2H)2+, (M + 3H)3+, y/o (M + Na)1+ se observa por ESI-MS; se cuantifican cromatogramas de iones extraídos, luego se ajusta a ecuaciones para derivar la afinidad de enlace Ká como se describe en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs . Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N . ; Chuang, C. C; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; también en "ALIS; An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization de protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hófner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors) : Methods and Principies in Medicinal Chemistry.

Ensayo para Experimentos de Enlace Competitivos por selección de afinidad-espectrometría de masa Para determinar la capacidad de los compuestos de prueba para enlazar competitivamente a las proteínas, se realiza un ensayo de espectrometría de masa de selección de afinidad, por ejemplo. Una mezcla de ligandos en 40 µ? por componente se prepara al combinar alícuotas 2 µL de soluciones madre 400 µ? de cada uno de los tres compuestos con 14 µ?, de DIVISO. Luego, alícuotas 1 µL de esto 40 µ? por mezcla de componente se combinan con alícuotas DMSO 1 µL de una solución madre diluida en serie de macrociclo peptidomimético de titulación (10, 5, 2.5, 0.078 m ) . Estas muestras 2 uL se disuelven en 38 µ? de PBS. Las soluciones resultantes se mezclaron por pipeteo repetido y clarificaron por centrifugación en 10 OOOg durante 10 min. Para alícuotas 4.0 µL de los sobrenadantes resultantes se agrega 4.0 µL de proteína hMDM2 10 µ en PBS. Cada muestra experimental 8.0 µL de esta manera contiene 40 pmol (1.5 ug) de proteína en concentración 5.0 µ? en PBS más ligando 0.5 µ?, DMSO al 2.5%, y concentraciones variadas (125, 62.5, 0.98 µ?) del macrociclo peptidomimético de titulación. Las muestras en duplicado de esta manera se preparan para cada punto de concentración se incuba a temperatura ambiente durante 60 min, luego enfría hasta 4°C antes del análisis SEC-LC-MS de las inyecciones 2.0 µ??. Los detalles adicionales en estos y otros métodos se proporcionan en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affínities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N. ; Chuang, C. C; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; también en "ALIS; An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterízation de protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hófner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors) : Methods and Principies in Medicinal Chemistry.

Ensayos de enlace en células de intacto.

Es posible medir el enlace de los péptidos o macrociclos peptidomiméticos a sus aceptadores naturales en células intactas por experimentos de inmunoprecipitación . Por ejemplo, las células intactas se incuban con compuestos fluoresceinado (etiquetado FITC) durante 4 hrs en ausencia de suero, seguido por reemplazo de suero e incubación adicional que tiene intervalos desde 4-18 hrs. Las células luego se peletizaron e incubaron en solución amortiguadora de lisis (Tris 50mM [pH 7.6], NaCl 150 mM, CHAPS al 1% y cóctel de inhibidor de proteasa) durante 10 minutos a 4°C. Los extractos se centrifugan en 14,000 rpm durante 15 minutos y los sobrenadantes se recolectan e incuban con anticuerpo anti-FITC de cabra 10 µ? durante 2 hrs, girando a 4°C seguido por incubación de 2 hrs adicional a 4°C con proteina A/G Sefarosa (50 µ? de mezcla espesa de perla al 50%) . Después de la centrifugación rápida, los peletizados se lavan en solución amortiguadora de lisis que contiene concentración de sal incrementada (por ejemplo, 150, 300, 500 mM) . Las perlas luego se vuelven a equilibrar en NaCl 150 mM antes de la adición de la solución amortiguadora de muestra que contienen SDS y ebullición. Después de la centrifugación, los sobrenadantes opcionalmente están sometidos a electroforesis usando geles Bis-Tris de gradiente al 4%-12% seguido por transferencia en membranas de Immobilon-P. Después del bloqueo, las manchas opcionalmente se incuban con un anticuerpo que detecta FITC y también con uno o más anticuerpos que detectan proteínas que enlazan al macrociclo peptidomimético .

Ensayos de penetrabilidad celular.

Un macrociclo peptidomimético es, por ejemplo, más penetrable a la célula comparado con un macrociclo no reticulado correspondiente. Los macrociclos peptidomiméticos con ligaduras optimizadas poseen, por ejemplo, penetrabilidad celular que es al menos dos veces mayor que un macrociclo no reticulado correspondiente, y a menudo 20% o más del macrociclo peptidomimético aplicado se observará para tener penetrada la célula después de 4 horas. Para medir la penetrabilidad celular de los macrociclos peptidomiméticos y macrociclo no reticulado correspondiente, las células intactas se incuban con macrociclos peptidomiméticos fluorescentemente etiquetados (por ejemplo fluoresceinado) o macrociclo no reticulado correspondiente (10 µ?) durante 4 hrs en medios libres de suero a 37 °C, lavan dos veces con medios e incuban con tripsina (0.25%) durante 10 min a 37°C. Las células se lavan de Nuevo y se vuelven a suspender en PBS. Se analiza la fluorescencia celular, por ejemplo, al usar ya sea un citómetro de flujo FACSCalibur o lector KineticScan ® HCS de Cellomics.

Ensayos de eficacia celular.

Se determina la eficacia de ciertos macrociclos peptidomiméticos, por ejemplo, en ensayos de exterminación basados en célula usando una variedad de lineas celulares tumorigénicas y no tumorigénicas y células primarias derivadas de poblaciones celulares de ratón y humano. Se monitorea la viabilidad celular, por ejemplo, durante 24-96 hrs de incubación con macrociclos peptidomiméticos (0.5 hasta 50 µ ) para identificar aquellos que se exterminan en EC50<10 µ?. Diversos ensayos estándares que miden la viabilidad celular están comercialmente disponibles y opcionalmente se usan para evaluar la eficacia de los macrociclos peptidomiméticos . Además, los ensayos que miden la activación de caspasa y Anexina V se usan opcionalmente para evaluar si los macrociclos peptidomiméticos exterminan células al activar la maquinaria apoptótica. Por ejemplo, el ensayo Titer-glo celular se usa el cual determina la viabilidad celular como una función de concentración ATP intracelular .

Ensayo de estabilidad in Vivo.

Para investigar la estabilidad in vivo de los macrociclos peptidomiméticos, los compuestos, por ejemplo, se administran a ratones y/o ratas por rutas IV, IP, PO o inhalación en concentraciones en el intervalo desde 0.1 hasta 50 mg/kg y especímenes de sangre retiradas en 0', 5', 15', 30' , 1 hr, 4 hrs, 8 hrs y 24 horas después de la inyección. Los niveles de compuesto intacto en 25 yL de suero fresco luego se miden por LC-MS/MS como arriba.

Eficacia in vivo en modelos animal.

Para determinar la actividad anti-oncogénica de macrociclos peptidomiméticos in vivo, los compuestos, por ejemplo, se dan solos (rutas IP, IV, PO, por inhalación o nasal) o en combinación con dosis sub-óptimas de quimioterapia relevante (por ejemplo, ciclofosfamida, doxorubicina, etopósido) . En un ejemplo, 5 x 106 RS4; 11 células (establecidas de la médula ósea de un paciente con leucemia linfoblástica aguda) que expresa establemente luciferasa se inyectan por la vena de la cola en ratones NOD-SCID 3 hrs después de que se han sometido a irradiación corporal total. Si se deja sin tratamiento, esta forma de leucemia es fatal en 3 semanas en este modelo. La leukemia se monitorea fácilmente, por ejemplo, al inyectar el ratón con D-luciferina (60 mg/kg) y formar en imágenes los animáis anestesiados (por ejemplo, Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . La bioluminiscencia corporal total se cuantifica por integración de flujo fotónico ( fotones/seg) por Living Image Software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . Los macrociclos peptidomiméticos solos o en combinación con dosis sub-óptimas de agentes quimioterapéuicos relevantes, por ejemplo, se administrant a ratones leucémicos (10 días después de la inyección/dia 1 del experimento, en el intervalo de bioluminiscencia de 14-16) por la vena de la cola o rutas IP en dosis en el intervalo desde O.lmg/kg hasta 50 mg/kg durante 7 hasta 21 dias. Opcionalmente, los ratones se procesan en imagen a lo largo del experimento cada otro día y la sobrevivencia se monitorea diariamente por la duración del experimento. Los ratones muertos opcionalmente se someten a necropsia al final del experimento. Otro modelo animal se implanta en ratones NOD-SCID de DoHH2, una linea celular derivada de linfoma folicular humano, que expresa establemente la luciferasa. Estas pruebas in vivo opcionalmente generan datos farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicologia preliminares.

Pruebas clínicas.

Para determinar la idoneidad de los macrociclos peptidomiméticos para tratamiento de humanos, se realizan pruebas clínicas. Por ejemplo, los pacientes diagnosticados con cáncer y que necesitan del tratamiento pueden seleccionarse y separarse en el tratamiento y uno o más grupos de control, en donde el grupo de tratamiento se administra de un macrociclo peptidomimético, mientras que los grupos de control reciben un placebo o un fármaco anti-cáncer conocido. La eficacia y seguridad del tratamiento de los macrociclos peptidomiméticos pueden de esta manera evaluarse al realizar comparaciones de los grupos de pacientes con respecto a los factores tales como sobrevivencia, y calidad de vida. En este ejemplo, el grupo de pacientes tratado con un macrocilo peptidomimético puede mostrar sobrevivencia de larga duración mejorada comparada con un grupo de control de pacientes tratado con un placebo.

Composiciones farmacéuticas y rutas de administración Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen macrociclos peptidomiméticos y derivados farmacéuticamente aceptables o profármacos de las mismas. Un "derivado farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal farmacéuticamente aceptable, éster, sal de un éster, profármaco u otro derivado de un compuesto descrito en la presente que, durante la administración a un receptor, es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto descrito en la presente. Los derivados farmacéuticamente aceptables particularmente favorecidos son aquellos que incrementan la biodisponibilidad de los compuestos cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, al incrementar la absorción en la sangre de un compuesto oralmente administrado) o que incrementa el suministro del compuesto activo para un compartimiento biológico (por ejemplo, el cerebro o sistema linfático) con relación a la especie precursora. Algunos derivados farmacéuticamente aceptables incluyen un grupo químico que incrementa solubilidad acuosa o transporte activo a través de la mucosa gastrointestinal .

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos se modifican al unir covalentemente o no covalentemente grupos funcionales apropiados para aumentar las propiedades biológicas selectivas. Tales modificaciones incluyen aquellas que incrementan la penetración biológica en un compartimiento biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central) , incrementa la disponibilidad oral, incrementa la solubilidad para permitir la administración por inyección, altera el metabolismo, y altera la tasa de excreción .

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente incluyen aquellos derivados de bases y ácidos orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales de ácido adecuadas incluyen acetato, adipato, benzoato, bencensulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, lactato, maleato, malonato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metal alcalino (por ejemplo, sodio) , metal alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio), amonio y N- (alquil) 4+.

Para preparar composiciones farmacéuticas de los compuestos descritos en la presente, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen ya sea portadores sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, pildoras, cápsulas, saquitos, supositorios, y gránulos dispersables . Un portador sólido puede ser una o más sustancias, que también actúan como diluyentes, agentes saborizantes , aglutinantes, conservadores, agentes desintegradores de comprimido, o un material de encapsulamiento . Los detalles de técnicas para la formulación y administración están bien descritos en la literatura de patente y científica, ver, por ejemplo, la última edición de Remington' s Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

En polvos, el portador es un sólido finamente dividido, que está en una mezcla con el componente activo finamente dividido. En comprimidos, el componente activo se mezcla con el portador que tiene las propiedades de enlace necesarias en proporciones adecuadas y compactadas en la forma y tamaño deseado.

Los excipientes sólidos adecuados son rellenadores de proteína o carbohidrato incluyen, pero no se limitan a azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa, u otras plantas; celulosa tal como metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas incluyendo arábica y tragacanto; así como proteínas tal como gelatina y colágeno. Si se desea, se agregan agentes solubilizantes o desintegrantes, tal como el polivinil pirrolidona reticulado, agar, ácido alginico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Las preparaciones en forma liquida incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, por ejemplo, soluciones de agua o agua/propilen glicol. Para preparaciones liquidas, de inyección parenteral pueden formularse en solución en solución de polietilen glicol acuosa.

La preparación farmacéutica puede estar en forma de dosificación unitaria. De tal forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empacada, el empaque contiene cantidades discretas de preparación, tal como comprimidos empacados, cápsulas, y polvos en viales o ampolletas. También, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, saquito, o pastilla por si mismo, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empacada.

Cuando una o más composiciones descritas en la presente comprenden una combinación de un macrociclo peptidomimético y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deberá presentarse en niveles de dosificación de entre alrededor de 1 hasta 100%, y más preferiblemente entre alrededor de 5 hasta 95% de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia. En algunas modalidades, los agentes adicionales se administran separadamente, como parte de un régimen de dosis múltiple, de uno o más compuestos descritos en la presente. Alternativamente, aquellos agentes son parte de una forma de dosificación sencilla, mezclados junto con los compuestos descritos en la presente en una composición sencilla .

Métodos de Uso En un aspecto, se proporcionan en la presente macrociclos peptidomiméticos novedosos que son útiles en ensayos de enlace competitivos para identificar agentes que enlazan a los ligandos naturales de las proteínas o péptidos de los cuales los macrociclos peptidomiméticos se modelan. Por ejemplo, en el sistema p53/MDMX, los macrociclos peptidomiméticos etiquetados basados en p53 pueden usarse en un ensayo de enlace MDMX junto con moléculas pequeñas que enlazan competitivamente a MDMX. Los estudios de enlace competitivos se permiten para determinación y evaluación in vitro rápida de candidatos de fármaco específicos para el sistema p53/MDMX. Tales estudios de enlace pueden realizarse con cualquiera de los macrociclos peptidomimeticos descritos en la presente y sus compañeros de enlace.

Se proporcionan además métodos para la generación de anticuerpos contra los macrociclos peptidomiméticos . En algunas modalidades, estos anticuerpos enlazan específicamente tanto el macrociclo peptidomimético como los péptidos precursores, tal como p53, a los cuales los macrociclos peptidomiméticos se relacionan. Tales anticuerpos, por ejemplo, interrumpen la interacción de proteína-proteína nativa, por ejemplo, enlace entre p53 y MDMX.

En otros aspectos, se proporcionan en la presente tanto métodos profilácticos como terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con actividad o expression aberrante (por ejemplo, insuficiente o excesivo) de las moléculas incluyendo p53, MDM2 o MDMX .

En otra modalidad, un trastorno es provocado, al menos en parte, por un nivel anormal de p53 o MDM2 o MDMX, (por ejemplo, sobre o bajo expresión) , o por la presencia de actividad anormal exhibiendo p53 o MDM2 o MDMX. Como tal, la reducción en el nivel y/o actividad de p53 o MDM2 o MDMX, o la mejora del nivel y/o actividad de p53 o MDM2 o MDMX, por macrociclos peptidomiméticos derivados de p53, se usa, por ejemplo, para aliviar o reducir los síntomas adversos del trastorno.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para tratar o prevenir una enfermedad incluyendo enfermedad hiperproliferativa y trastorno inflamatorio al interferir con la interacción o enlace entre los compañeros de enlace, por ejemplo, entre p53 y MDM2 o p53 y MDMX. Estos métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de un compuesto para un animal de sangre caliente, incluyendo un humano. En algunas modalidades, la administración de uno o más compuestos descritos en la presente inducen detención del crecimiento celular o apoptosis.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o aplicación o administración de un agente terapéutico para una linea celular o tejido aislado de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de la enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito curar, sanar, aliviar, disminuir, alterar, remediar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos pueden usarse para tratar, prevenir, y/o diagnosticar cánceres y afecciones neoplásticas. Como se usa en la presente, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplástico" se refiere a células que tienen la capacidad para crecimiento autónomo, esto es, una afección o estado anormal caracterizado al proliferar rápidamente el crecimiento celular. Los estados de enfermedad neoplástica e hiperproliferativa pueden categorizarse como patológica, esto es, caracterizar o constituir un estado de enfermedad, o puede categorizarse como no patológico, esto es, una desviación de normal pero no asociado con un estado de la enfermedad. El término significa incluir todos los tipos de procesos orgánicos o crecimientos cancerosos, células malignamente transformadas o tejidos metastáticos , tejidos, u órganos, independientemente de la etapa o tipo histopatológico de invasividad. Un tumor metastático puede surgir de una multitud de tipos de tumor primarios, incluyendo pero no limitadas a aquellos de origen de mama, pulmón, hígado, colon y ovarios. Las células "hiperproliferativas patológicas" ocurren en estados de la enfermedad caracterizados por crecimiento de tumor maligno. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen proliferación de células asociadas con reparación de herida. Los ejemplos de trastornos diferentes y/o proliferativos celulares incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, o trastornos metastáticos. En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos son agentes terapéuticos novedosos para controlar el cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de colon, cáncer pulmonar, metástasis de tales cánceres y los similares.

Los ejemplos de cánceres o afecciones neoplásticas incluyen, pero no se limitan a, un fibrosarcoma, misarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer de la piel, cáncer de mama, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de célula pequeña, carcinoma de pulmón de célula no pequeña, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústica, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linforna, o sarcoma Kaposi.

En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer pulmonar, cáncer de mama, o glioma.

Los ejemplos de trastornos proliferativos incluyen trastornos neoplásticos hematopoyéticos . Como se usa en la presente, el término "trastornos neoplásticos hematopoyéticos" incluye enfermedades que involucran células hiperplásticas/neoplásticas de origen hematopoyético, por ejemplo, que surgen de mieloide, linajes linfoide o eritroide, o células precursoras de los mismos. Las enfermedades pueden surgir de leucemias agudas pobremente diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Los trastornos de mieloide ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, leucemia promieloide aguda (APML) , leucemia mielogenosa aguda (AML) y leucemia mielogenosa crónica (CML) (revisada en Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol . /He otol . 11:267-97); malignidades de linfoide incluyen, pero no se limitan a leucemia linfoblástica aguda (ALL) que incluye ALL linaje B y ALL linaje T, leucemia linfocitico crónica (CLL) , leucemia prolinfocitica (PLL), leucemia de la célula del cabello (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom ( M) . Las formas adicionales de linfomas malignos incluyen, pero no se limitan a linfoma no de Hodgkin y variantes del mismo, linfomas de célula T periférica, leucemia/linforna de célula T humana (ATL) , linfoma de célula T cutánea (CTCL) , leucemia linfocítica granular grande (LGF) , enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Reed-Stemberg.

Los ejemplos de trastornos diferentes y/o proliferativos celulares de la mama incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de mama proliferativa incluyendo, por ejemplo, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante, y papilomas del ductor pequeño; tumores, por ejemplo, tumors estromales tal como fibroadenoma, tumor filodo, y sarcomas, y tumores epiteliales tal como papiloma del ducto grande; carcinoma de la mama incluyendo carcinoma in situ (no invasivo) que incluye carcinoma ductal in situ (incluyendo enfermedad de Paget) y carcinoma lobular in situ, y carcinoma invasivo (infiltrado) incluyendo, pero no limitado a, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucinoso) , carcinoma tubular, y carcinoma papilar invasivo, y neoplasmas malignos misceláneos. Los trastornos en la mama masculina incluyen, pero no se limitan a, ginecomastia y carcinoma.

Los ejemplos de trastornos diferente y/o proliferativos celulares de la piel incluyen, pero no se limitan a enfermedad de la piel proliferativo tal como melanomas, incluyendo mucosal melanoma, melanoma de propagación superficial, melanoma nodular, lentigo (por ejemplo lentigo maligna, melanoma de lentigo maligna, o melanoma lentiginoso acral) , melanoma amelanótico, melanoma desmoplástico, melanoma con características de un Spitz nevus, melanoma con células tipo nevus pequeño, melanoma de polipoide, y melanoma de tejido suave; carcinomas de célula basal incluyendo carcinoma de célula basal micronodular, carcinoma de célula basal superficial, carcinoma de célula basal nodular (úlcera del roedor) , carcinoma de célula basal quística, carcinoma de célula basal cicatricial, carcinoma de célula basal pigmentada, carcinoma de célula basal aberrante, carcinoma de célula basal infiltrante, síndrome de carcinoma de célula basal nevoide, carcinoma de célula basal polipoide, carcinoma de célula basal tipo poro, y fibroepitelioma de Pinkus; carcinomas de célula escamosa incluyendo acantoma (acantoma de célula grande) , carcinoma de célula escamosa adenoide, carcinoma de célula escamosa basaloide, carcinoma de célula escamosa de célula transparente, carcinoma de célula escamosa de célula de anillo grabado, carcinoma de célula escamosa de célula de huso, ulcera de Marjolin, eritroplasia de Queyrat, y enfermedad de Bowen; u otros tumores subcutáneos o piel.

Los ejemplos de trastornos diferentes y/o proliferativos celulares del pulmón incluyen, pero no se limitan a, carcinoma broncogénico, incluyendo síndromes paraneoplásticos , carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tal como carcinoide bronquial, tumores misceláneos, y tumores metastáticos; patologías de la pleura, incluyendo efusiones pleurales inflamatorias, efusiones pleurales no inflamatorias, neumotóras, y tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

Los ejemplos de trastornos diferente y/o proliferativos celulares del colon incluyen, pero no se limitan a, pólipos no neoplásticos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorectal, carcinoma colorectal, y tumores de carcinoide.

Los ejemplos de trastornos diferentes y/o proliferativos celulares del hígado incluyen, pero no se limitan a, hiperplasias nodulares, adenomas, y tumores malignos, incluyendo carcinoma primario del hígado y tumores metastáticos.

Los ejemplos de trastornos diferentes y/o proliferativos celulares de los ovarios incluyen, pero no se limitan a, tumores de ovarios tales como, tumores de epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores de endometrioide, adenocarcinoma de célula transparente, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliales de superficie; tumores de célula germinal tal como teratomas maduras (benignas) , teratomas monodérmicas , teratomas malignas inmaduras, disgerminoma, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma; tumores del cordón estomal del sexo tales como, tumores de célula granulosa-teca, tecomafibromas , androblastomas, tumores de célula de la colina, y gonadoblastoma; y tumores metastáticos tal como tumores Krukenberg.

Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en la presente, será obvio para aquellos experimentados en la técnica que tales modalidades se proporcionan a manera de ejemplo únicamente. Numerosas variaciones, cambios, y sustituciones ahora ocurrirán por aquellos experimentados en la técnica sin alejarse de la invención. Deberá entenderse que varias alternativas para las modalidades descritas en la presente pueden emplearse al practicar la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance y tales métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes se cubran por los mismos.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Síntesis de aminoácidos 6-clorotriptofano Fmoc cuantitativo 6-cloro-3-formil-lH-indol-l-carboxilato de tert-butilo, 1. A una solución agitada de DMF seco (12 mL) se agregó gota a gota P0C13 (3.92 mL, 43 mmol, 1.3 equiv) a 0°C bajo Argón. La solución se agitó a la misma temperatura durante 20 min antes se agregó gota a gota una solución de 6-cloroindol (5.0 g, 33 mmol, 1 eq.) en DMF seco (30 mL) . La mezcla resultante se permitió entibiar a temperatura ambiente y se agitó durante unas 2.5h adicionales. Se agregó agua (50 mL) y la solución se neutraliza con NaOH acuoso 4M ( H ~ 8). El sólido resultante se filtró completamente, lavó con agua y secó bajo vacio. Este material se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. A una solución agitada del formil indol crudo (33 mmol, 1 eq. ) en THF (150 mL) se agregó sucesivamente Boc20 (7.91 g, 36.3 mmol, 1.1 equiv) y DMAP (0.4 g, 3.3 mmol, 0.1 equiv) a temperatura ambiente bajo N2. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1.5h y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se tomó en EtOAc y lavó con HC1 1N, secó y concentró para dar el formil indol 1 (9 g, 98% durante 2 etapas) como un sólido blanco. lti RMN (CDC13) d 1.70 (s, Boc, 9H) ; 7.35 (dd, 1H) ; 8.21 (m, 3H) ; 10.07 (s, 1H) . 6-cloro-3- (hidroximetil) -lH-indol-l-carboxilato de tert-butilo, 2. A una solución del compuesto 1 (8.86g, 32 mmol, 1 eq. ) en etanol (150 mL) se agregó NaBH4 (2.4g, 63 mmol, 2 eq.). La reacción se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se vació en dietil éter y agua. La capa orgánica se separó, secó sobe sulfato de magnesio y concentró para dar un sólido blanco (8.7g, 98%). Este material se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (CDCI3) d 1.65 (s, Boc, 9H) ; 4.80 (s, 2H, CH2) ; 7.21 (dd, 1H) ; 7.53 (m, 2H) ; 8.16 (bs, 1H) . 3- (bromometil ) -6-cloro-lH-indol-l-carboxilato de tert-butilo, 3. A una solución del compuesto 2 (4.1g, 14.6 mmol, 1 eq. ) en diclorometano (50 mL) bajo argón se agregó una solución de trifenilfosfina (4.59g, 17.5 mmol, 1.2 eq.) en diclorometano (50 mL) a -40°C. La solución de reacción se agitó unos 30 min adicionales a 40°C. Luego se agregó NBS (3.38g, 19 mmol, 1.3 eq.). La mezcla resultante se permitió entibiar a temperatura ambiente y agitó durante la noche. Se evaporó el diclorometano, se agregó Tetracloruro de carbono (100 mL) y la mezcla se agitó durante lh y filtró. El filtrado se concentró, cargo en un tapón de sílice y rápidamente eluyó con EtOAc al 25% en hexanos. La solución se concentró para dar una espuma blanca (3.84g, 77%) . 1H RMN (CDCI3) d 1.66 (s, Boc, 9H) ; 4.63 (s, 2H, CH2) ; 7.28 (dd, 1H) ; 7.57 (d, 1H) ; 7.64 (bs, 1H) ; 8.18 (bs, 1H) . aMe-6Cl-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 4. A S-Ala-Ni-S-BPB (2.66g, 5.2 mmol, 1 eq.) y KO-tBu (0.87g, 7.8 mmol, 1.5 eq.) se agregó 50 mL de DMF bajo argón. El compuesto derivado de bromuro 3 (2.68g, 7.8 mmol, 1.5 eq. ) en solución de DMF (5.0 mL) se agregó por medio de jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante lh. La solución luego se apagó con ácido acético acuoso al 5% y diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, secó y concentró. El producto aceitoso 4 se purificó por cromatografía instantánea (carga sólida) en fase normal usando EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un sólido rojo (1.78g, 45% de rendimiento). aMe-6Cl-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 4: M+H cale. 775.21, M+H obs. 775.26; XH RMN (CDC13) d 1.23 (s, 3H, aMe) ; 1.56 (m, 11H, Boc + CH2) ; 1.82-2.20 (m, 4H, 2CH2) ; 3.03 (m, 1H, CHa) ; 3.24 (m, 2H, CH2) ; 3.57 y 4.29 (sistema AB, 2H, CH2 (bencilo), J= 12.8Hz); 6.62 (d, 2H) ; 6.98 (d, 1H) ; 7.14 (m, 2H) ; 7.23 (m, 1H) ; 7.32-7.36 (m, 5H) ; 7.50 (m, 2H) ; 7.67 (bs, 1H) ; 7.98 (d, 2H) ; 8.27 (m, 2H) .

Fmoc-aMe-6Cl-Trp (Boc) -OH, 6. A una solución de HCl/MeOH 3N (1/3, 15 mL) a 50°C se agregó una solución del compuesto 4 (1.75g, 2.3 mmol, 1 eq.) en MeOH (5 mi) gota a gota. El material de partida desapareció dentro de 3-4 h. La solución ácida luego se enfrió hasta 0°C con un baño de hielo y se apagó con una solución acuosa de a2C03 (1.21g, 11.5 mmol, 5 eq. ) . Se removió el metanol y 8 equivalentes más de Na2C03 (1.95g, 18.4 mmol) se agregaron a la suspensión. El dihidrato de sal de disodio EDTA de barrido de níquel (1.68g, 4.5 mmol, 2 eq.) luego se agregó y la suspensión se agitó durante 2h. Una solución de Fmoc-OSu (0.84g, 2.5 mmol, 1.1 eq. ) en acetona (50 mL) se agregó y la reacción se agitó durante la noche. Más tarde, la reacción se diluyó con dietil éter y HC1 1N. La capa orgánica luego se secó sobe sulfato de magnesio y concentró in vacuo. El producto deseado 6 se purificó en fase normal usando acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (0.9g, 70% de rendimiento). Fmoc-aMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6: M+H cale. 575.19, M+H obs . 575.37; XH RMN (CDC13) 1.59 (s, 9H, Boc) ; 1.68 (s, 3H, Me); 3.48 (bs, 2H, CH2); 4.22 (m, 1H, CH) ; 4.39 (bs, 2H, CH2) ; 5.47 (s, 1H, NH) ; 7.10 (m, 1H) ; 7.18 (m, 2H) ; 7.27 (m, 2H) ; 7.39 (m, 2H) ; 7.50 (m, 2H) ; 7.75 (d, 2H) ; 8.12 (bs, 1H) . 6C1-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 5. A Gly-Ni-S-BPB (4.6g, 9.2 mmol, 1 eq.) y KO-tBu (1.14g, 10.1 mmol, 1.1 eq. ) se agregó 95 mL de DMF bajo argón. El compuesto derivado de bromuro 3 (3.5g, 4.6 mmol, 1.1 eq. ) en solución de DMF (10 mL) se agregó por medio de jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante lh. La solución luego se apagó con ácido acético acuoso al 5% y diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, secó y concentró. El producto aceitoso 5 se purificó por cromatografía instantánea (carga sólida) en fase normal usando EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un sólido rojo (5g, 71% de rendimiento) . 6Cl-Trp(Boc) -Ni-S-BPB, 5: M+H cale. 761.20, M+H obs. 761.34; :H R N (CDCI3) d 1.58 (m, 11H, Boc + CH2) ; 1.84 (m, 1H) ; 1.96 (m, 1H) ; 2.24 (m, 2H, CH2) ; 3.00 (m, 1H, CHJ ; 3.22 (m, 2H, CH2) ; 3.45 y 4.25 (sistema AB, 2H, CH2 (bencilo) , J= 12.8Hz); 4.27 (m, 1H, CHa) ; 6.65 (d, 2H) ; 6.88 (d, 1H) ; 7.07 (m, 2H) ; 7.14 (m, 2H) ; 7.28 (m, 3H) ; 7.35-7.39 (m, 2H) ; 7.52 (m, 2H) ; 7.96 (d, 2H) ; 8.28 (m, 2H) .

Fmoc-6Cl-Trp (Boc) -OH, 7. A una solución de HCl/MeOH 3N (1/3, 44 mL) a 50°C se agregó una solución del compuesto 5 (5g, 6.6 mmol, 1 eq. ) en MeOH (10 mi) gota a gota. El material de partida desapareció dentro de 3-4 h. La solución ácida luego se enfrió hasta 0°C con un baño de hielo y apagó con una solución acuosa de a2C03 (3.48g, 33 mmol, 5 eq. ) . El metanol se removió y 8 equivalentes más de Na2C03 (5.57g, 52 mmol) se agregaron a la suspensión. El dihidrato de sal de disodio EDTA de barrido níquel (4.89g, 13.1 mmol, 2 eq.) y la suspensión se agitó durante 2h. Una solución de Fmoc-OSu (2.21g, 6.55 mmol, 1.1 eq.) en acetona (100 mL) se agregó y la reacción se agitó durante la noche. Más tarde, la reacción se diluyó con dietil éter y HCl 1N. La capa orgánica luego se secó sobe sulfato de magnesio y concentró in vacuo. El producto deseado 7 se purificó en fase normal usando acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (2.6g, 69% de rendimiento). Fmoc-6Cl-Trp (Boc) -OH, 7: M+H cale. 561.17, M+H obs. 561.37; XH RMN (CDC13) 1.63 (s, 9H, Boc); 3.26 (m, 2H, CH2) ; 4.19 (m, 1H, CH) ; 4.39 (m, 2H, CH2) ; 4.76 (m, 1H) ; 5.35 (d, 1H, NH) ; 7.18 (m, 2H) ; 7.28 (m, 2H) ; 7.39 (m, 3H) ; 7.50 (m, 2H) ; 7.75 (d, 2H) ; 8.14 (bs, 1H) .

Ejemplo 2: Macrociclos peptidomiméticos Los macrociclos peptidomiméticos se sintetizaron, purificaron y analizaron como se describe previamente y como se describe a continuación ( Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); alensky et al., Science 305:1465-1470 (2004); y Patente de E.U.A. No. 7,192,713). Los macrociclos peptidomiméticos se diseñaron al reemplazar dos o más aminoácidos que se presentan naturalmente con los aminoácidos sintéticos correspondientes. Las sustituciones se hicieron en posiciones i y i+4, y i y i+7. La síntesis del péptido se realiza ya sea manualmente o en un sintetizador de péptido automático (Applied Biosystems, model 433A) , usando condiciones de fase sólida, resina AM de amida de pista (Novabiochem) , y química de grupo protector de cadena principal Fmoc. Para el acoplamiento de aminoácidos protegidos Fmoc naturales (Novabiochem) , se emplearon 10 equivalentes de aminoácido y una relación molar 1:1:2 de reactivos de acoplamiento HBTU/HOBt (Novabiochem) /DIEA. Los aminoácidos no naturales (4 equiv) se acoplaron con una relación molar 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems ) /HOBt/DIEA. Las terminales N de los péptidos sintéticos se acetilaron, mientras que las terminales C se amidaron.

La purificación de compuestos reticulados se logró por cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) (Varían ProStar) en una columna C18 de fase inversa (Varían) para proporcionar los compuestos puros. La composición química de los productos puros se confirmó por espectrometría de masa LC/MS (Micromass LCT de interfaz con sistema Agilent 1100 HPLC) y análisis de aminoácido (Applied Biosystems, modelo 420A) .

El siguiente protocolo se usó en la síntesis de macrociclos peptidomiméticos reticulados con dialquino, incluyendo SP662, SP663 y SP664. Los péptidos enlazados a resina completamente protegidos se sintetizaron en una resina PEG-PS (carga 0.45 mmol/g) en una escala de 0.2 mmol. La desprotección del grupo Fmoc temporal se logró por tratamientos de 3 ? 10 min del péptido de enlace de resina con piperidina al 20% (v/v) en DMF. Después del lavado con NMP (3x), diclorometano (3x) y MP (3x) , el acoplamiento de cada aminoácido sucesivo se logró con incubación de 1 ? 60 min con el derivado de aminoácido Fmos preactivado apropiado. Todos los aminoácidos protegidos (0.4 mmol) se disolvieron en NMP y activaron con HCTU (0.4 mmol) y DIEA (0.8 mmol) antes de la transferencia de la solución de acoplamiento para el péptido de enlace de resina desprotegido. Después de que el acoplamiento se completó, la resina se lavó en la preparación para el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento. La acetilación de la terminal amino se llevó a cabo en presencia de anhídrido acético/DIEA en NMP. El análisis LC-MS de una muestra desprotegida y escindida obtenida de una alícuota del péptido de enlace de resina completamente ensamblada se alcanzó con objeto de verificar la terminación de cada acoplamiento. En un ejemplo típico, tetrahidrofurano (4ml) y trietilamina (2ml) se agregaron a la resina de péptido (0.2 mmol) en un vial de vidrio 40ml y agitaron durante 10 minutos. Luego se agregaron Pd ( PPh3) 2C12 (0.014g, 0.02 mmol) y yoduro de cobre (0.008g, 0.04 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó mecánicamente 16 horas mientras que se abre a la atmósfera. Los péptidos enlazados de resina ciclizados por diina se desprotegieron y escindieron del soporte sólido por tratamiento con TFA/H20/TIS (95/5/5 v/v) durante 2.5 h a temperatura ambiente. Después de la filtración de la resina, la solución TFA se precipitó en dietil éter frío y centrifugó para proporcionar el producto deseado como un sólido. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa.

El siguiente protocolo se usó en la síntesis de macrociclos peptidomimét icos reticulados con alquino sencillo, incluyendo SP665. Los péptidos enlazados con resina completamente protegidos se sintetizaron en una resina MBHA de amida Rink (carga 0.62 mmol/g) en una escala de 0.1 mmol. La desprotección del grupo Fmoc temporal se logró por tratamientos 2 ? 20 min del péptido de enlace con resina con piperidina al 25% (v/v) en NMP. Después del lavado de flujo extensivo con NMP y diclorometano , el acoplamiento de cada aminoácido sucesivo se logró con incubación 1 ? 60 min con el derivado de aminoácido Fmoc preactivado apropiado. Todos los aminoácidos protegidos (1 mmol) se disolvieron en NMP y activaron con HCTU (1 mmol) y DIEA (1 mmol) antes de la transferencia de la solución de acoplamiento para el péptido de enlace de resina desprotegido. Después de que el acoplamiento se completó, la resina se lavó extensivamente con flujo en la preparación para el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento. La acetilación de la terminal amino se llevó a cabo en presencia de anhídrido acético/DIEA en NMP /NMM. El análisis LC-MS de una muestra escindida y desprotegida obtenida de una alícuota del péptido de enlace de resina completamente ensamblada se logró con objeto de verificar la terminación de cada acoplamiento. En un ejemplo típico, la resina de péptido (0.1 mmol) se lavó con DCM. La resina se cargó en un vial de microondas. El recipiente se evacuó y purgó con nitrógeno. Se agregó molibdenohexacarbonilo (0.01 eq, Sigma Aldrich 199959) . Clorobenceno anhidro se agregó al recipiente de reacción. Luego se agregó 2-fluorofenol (leq, Sigma Aldrich F12804) . La reacción luego se cargó en el microondas y mantuvo a 130°C durante 10 minutos. La reacción puede necesitar impulsar un tiempo posterior para la terminación. Los péptidos de enlace de resina metátesis de alquino se desprotegieron y escindieron del soporte sólido por tratamiento con TFA/H20/TIS (94/3/3 v/v) durante 3 h a temperatura ambiente. Después de la filtración de la resina, la solución TFA se precipitó en dietil éter frío y centrifugó para proporcionar el producto deseado como un sólido. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa.

La Tabla 1 muestra una lista de macrociclos pept idomimét icos preparados.

Tabla 1 La Tabla la muestra una selección de macrociclos peptidomiméticos .

Tabla la La Tabla Ib muestra una selección adicional de macrociclos peptidomiméticos .

Tabla Ib En las secuencias mostradas arriba y en cualquier lugar, las siguientes abreviaturas se usan: "Nle" representa norleucina, "Aib" representa ácido 2-aminoisobutirico, "Ac" representa acetilo, y "Pr" representa propionilo. Los aminoácidos representados como son aminoácidos de alfa-Me S5-pentenil-alanina olefina conectados por un reticulador todo de carbono que comprende un enlace doble. Los aminoácidos representados como "$r5" son aminoácidos de alfa-Me R5-pentenil-alanina olefina conectados por un carbono completo que comprenden un enlace doble. Los aminoácidos representados como "$s8" son aminoácidos alfa-Me S8-octenil-alanina olefina conectados por un reticulador todo de carbono que comprende un enlace doble. Los aminoácidos representados como "$r8" son aminoácidos de alfa-Me R8-octenil-alanina olefina conectados por un reticulador todo de carbono que comprende un enlace doble. "Ahx" representa una ligadura de aminociclohexilo . Los reticuladores son reticulador lineales todos de carbono que comprenden ocho u once átomos de carbono entre los carbonos alfa de cada aminoácido. Los aminoácidos representados como "$/" son aminoácidos de alfa-Me S5-pentenil-alanina olefina que no se conectan por ningún reticulador. Los aminoácidos representados como "$/r5" son aminoácidos de alfa-Me R5-pentenil-alanina olefina que no se conectan por ningún reticulador. Los aminoácidos representados como "$/s8" son aminoácidos de alfa-Me S8-octenil-alanina olefina que no se conectan por ningún reticulador. Los aminoácidos representados como "$/r8" son aminoácidos de alfa-Me R8-octenil-alanina olefina que no se conectan por ningún reticulador. Los aminoácidos representados como "Amw" son aminoácidos de alfa-Me triptofano. Los aminoácidos representados como "Aml" son aminoácidos de alfa-Me leucina. Los aminoácidos representados como "Amf" son aminoácidos de alfa-Me fenilalanina . Los aminoácidos representados como "2ff" son aminoácidos de 2-fluoro-fenilalanina . Los aminoácidos representados como "3ff" son aminoácidos de 3-fluoro-fenilalanina . Los aminoácidos representados como "St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina, cada una de la cual está reticulada con otro aminoácido como se indica. Los aminoácidos representados como "St//" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina que no se reticulan. Los aminoácidos representados como "%St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina, cada una de la cual se retícula con otro aminoácido como se indica por medio de reticulaciones de hidrocarburo completamente saturadas. Los aminoácidos representados como "Ba" son beta-alanina . El carácter en minúscula "e" o "z" dentro de la designación de un aminoácido reticulado (por ejemplo "$er8" o "$zr8") representa la configuración del enlace doble (E o Z, respectivamente) . En otros contextos, las letras minúsculas tal como "a" o "f" representan aminoácidos D (por ejemplo D-alanina, o D-fenilalanina, respectivamente) . Los aminoácidos designados como "NmW" representan N-metiltriptofano . Los aminoácidos designados como "NmY" representan N-metiltirosina . Los aminoácidos designados como "NmA" representan N-metilalanina . "Kbio" representa un grupo biotina unido al grupo amino de cadena lateral de un residuo de lisina. Los aminoácidos designados como "Sar" representan sarcosina. Los aminoácidos designados como "Cha" representan ciclohexil alanina. Los aminoácidos designados como "Cpg" representan ciclopentil glicina. Los aminoácidos designados como "Chg" representan ciclohexll glicina. Los aminoácidos designados como "Cba" representan ciclobutil alanina. Los aminoácidos designados como "F4I" representan 4-yodo fenilalanina . "7L" representa leucina isotópica N15. Los aminoácidos designados como "F3C1" representan 3-cloro fenilalanina . Los aminoácidos designados como "F4cooh" representan 4-carboxi fenilalanina . Los aminoácidos designados como "F34F2" representan 3,4-difluoro fenilalanina . Los aminoácidos designados como "6cl " representan ß-cloro triptofano. Los aminoácidos designados como "$rda6" representan aminoácidos alfa-Me R6-hexinil-alanina alquinilo, reticulados por medio de un enlace dialquino para un segundo aminoácido alquinilo. Los aminoácidos designados como "$da5" representan aminoácidos de alfa-Me S5-pentinil-alanina alquinilo, en donde el alquino forma una mitad de un enlace dialquino con un segundo aminoácido alquinilo. Los aminoácidos designados como "$ra9" representan aminoácidos de alfa-Me R9-noninil-alanina alquinilo, reticulados por medio de una reacción de metátesis alquino con un segundo aminoácido alquinilo. Los aminoácidos designados como "$a6" representan aminoácidos alfa-Me S6-hexinil-alanina alquinilo, reticulados por medio de una reacción de metátesis alquino con un segundo alquinilo aminoácido. La designación "isol" o "iso2" indica que el macrociclo peptidomimético es un isómero sencillo.

Los aminoácidos designados como "Cit" representan citrulina. Los aminoácidos designados como "Cou4", "Cou6", "Cou7" y "Cou8", respectivamente, representan las siguientes estructuras : Cou7 Cou8 En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético se obtiene en más de un isómero, por ejemplo debido a la configuración de un enlace doble dentro de la estructura del reticulador (E contra Z) . Tales isómeros pueden o no pueden ser separables por métodos cromatográficos convencionales. En algunas modalidades, un isómero tiene propiedades biológicas mejoradas con relación al otro isómero. En una modalidad, un isómero de olefina reticulador E de un macrociclo peptidomimético tiene mejor solubilidad, mejor afinidad objetivo, mejor eficacia in vivo o in vitro, helicidad superior, o permeabilidad celular mejorada con relación a su contraparte Z. En otra modalidad, un isómero de olefina de reticulador Z de un macrociclo peptidomimético tiene mejor solubilidad, mejor afinidad objetivo, mejor eficacia in vivo o in vitro, helicidad superior, o permeabilidad celular mejorada con relación a su contraparte E.

La Tabla le muestra macrociclo peptidomimético ejemplar: Tabla le En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos excluyen macrociclos peptidomiméticos mostrados en la Tabla 2a: Tabla 2a En la Tabla 2a, X representa S o cualquier aminoácido. Los péptidos mostrados pueden comprender un grupo tapado de terminal N tal como acetil o una ligadura adicional tal como beta-alanina entre el grupo tapado y el inicio la secuencia de péptido.

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos no comprenden una estructura de macrociclo peptidomimético como se muestra en la Tabla 2a.

En otras modalidades, los macrociclos peptidomiméticos luyen macrociclos peptidomiméticos mostrados en la Tabla Tabla 2b En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente no comprenden una estructura de macrociclo peptidomimético como se muestra en la Tabla 2b.

La Tabla 2c muestra los ejemplos de polipéptidos no reticulados que comprenden D-aminoácidos .

Ejemplo 3: Co-cristalografía por rayos x de macrociclos peptidomiméticos en complejo con MDMX Para co-cristalización con péptido 46 (Tabla 2b), una cantidad estequiométrica del compuesto a partir de una solución madre 100 mM en DMSO se agregó a la solución de proteina MDMX de pez cebra y permitió colocarse durante la noche a 4°C antes del establecimiento de experimentos de cristalización. Los procedimientos fueron similares a aquellos descritos por Popowicz et al., con algunas variaciones, como se señala a continuación. La proteina (residuos 15-129, L46V/V95L) se obtuvo de un sistema de expresión E. coli BL21(DE3) usando el vector pET15b. Las células se hicieron crecer a 37°C e indujeron con IPTG 1 mM en un ??ß?? de 0.7. Las células se permitieron crecer unas 18 hr adicionales a 23°C. La proteina se purificó usando Ni-NT Agarosa seguido por solución amortiguadora Superdex 75 con NaP04 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM, TCEP 2 mM y luego se concentró hasta 24 mg/ml. La solución amortiguadora se intercambió hasta Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, DTT 2 mM para experimentos de cristalización. Los cristales iniciales se obtuvieron con el Nextal (Qiagen) AMS pantalla #94 y el reservorio optimizado final fue AMS 2.6 M, Hepes 75 mM, pH 7.5. Los cristales verdes rutinariamente como placas delgadas a 4°C y se crio- protegieron jalándolos a través de una solución que contiene malonato concentrado (3.4 ) seguido por enfriamiento instantáneo, almacenamiento, y envió en nitrógeno liquido.

La recolección de datos se realizó en el APS en la linea de haz 31-ID (SGX-CAT) a -173.15°C (100°K) y longitud de onda 0.97929Á. La linea de haz se equipó con un detector Rayonix 225-HE. Para la recolección de datos, los cristales se giraron a través de 180° en incrementos de 1° usando tiempos de exposición de 0.8 segundos. Los datos se procesaron y redujeron usando osflm/escala (CCP4; ver The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallogr. D50, 760-763 (1994); P.R. Evans. Joint CCP4 y ESF-EACBM Newsletter 33, 22-24 (1997)) en el grupo de espacio C2 (célula unitaria: a = 109.2786, b = 81.0836, c = 30.9058Á, a = 90, ß = 89.8577, ? = 90°). El reemplazo molecular con program Molrep (CCP4; ver A.Vagin & A. Teplyakov. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997)) se realizó con el componente MDMX de la estructura determinada por Popowicz et al. (2Z5S; ver G.M. Popowicz, A. Czarna, U. Rothweiler, A. Szwagierczak, . Krajewski, L. Weber & T.A. Holak. Cell Cycle 6, 2386-2392 (2007)) e identificó dos moléculas en la unidad asimétrica. El refinamiento inicial de sólo las dos moléculas del MD X del pez cebra con el programa Refmac (CCP4; ver G.N. Murshudov, A. A. Vagin & E.J. Dodson. Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997)) resulta en un R-factor de 0.3424 (Rii re = 0.3712) y valores rmsd para enlaces (0.018 Á) y ángulos (1.698°). La densidad del electrón para los componentes de péptido básicos, iniciando con Gln19 e incluyendo todo del básico alifático, fue muy clara. El refinamiento adicional con CNX (Accelrys) usando datos para la resolución 2.3 Á resultando en un modelo (compuesto de 1448 átomos de MDMX, 272 átomos de los péptidos básicos y 46 moléculas de agua) que está bien refinado (Rf = 0.2601, Riibre = 0.3162, enlaces rmsd = 0.007 Á y ángulos rmsd = 0.916°) .

Los resultados de este Ejemplo se muestran en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 4: Análisis de dicroismo circular (CD) de alfa-helicidad Las soluciones de péptido se analizaron por espect rocopia CD usando un espect opolarimetro Jasco J-815 (Jasco Inc., Easton, MD) con el software de sistema Jasco Spectra Manager Ver.2. Un controlador de temperatura Peltier se usó para mantener el control de temperatura de la célula óptica. Los resultados se expresan como elipticidad molar media [T] (deg cm2 dmol-1) como se calcula de la ecuación [ T] =0obs -MRW/10*l*c donde Gobs es la elipticidad observada en miligrados, MRW es el peso de residuo medio del péptido (peso/número molecular del péptido de los residuos) , 1 es la longitud de la trayectoria óptica de la célula en los centímetros, y c es la concentración de péptido en mg/ml. las concentraciones de péptido se determinaron por análisis de aminoácido. Las soluciones madre de los péptidos se prepararon en solución amortiguador CD benigna (ácido fosfórico 20 raM, pH 2) . Las soluciones madre se usaron para preparar soluciones de péptido de 0.05 mg/ml en cualquier solución amortiguadora CD benigna o solución amortiguadora CD con trifluoroetanol al 50% (TFE) para análisis en una célula de longitud de trayectoria de 10 mm. Las mediciones de la longitud de onda variables de las soluciones de péptido se escanearon a 4°C desde 195 hasta 250 nm, en incrementos de 0.2 nm, y una tasa de escaneo 50 nm por minuto. Se reporta el promedio de seis escaneos.

La Tabla 3 muestra los datos de dicroismo circular para macrociclos peptidomiméticos seleccionados: Tabla 3 Ejemplo 5: Ensayo de enlace directo MDM2 con polarización de fluorescencia (FP) El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir MDM2 (Interno, 41kD) en solución amortiguadora FP (Solución amortiguadora de sal alta-Nacl 200mM, CHAPS 5m , pH 7.5) para hacer solución madre de trabajo 10µ?. 2. Agregar 30µ1 de 10µ de solución madre de proteina en el pozo Al y Bl de microplaca HE negra de 96 pozos (Molecular Devices) . 3. Rellenar en 30µ1 de solución amortiguadora FP en la columna A2 hasta A12, B2 hasta B12, Cl hasta C12, y DI hasta D12. . 2 o 3 veces de dilución en serie de proteina madre de Al, Bl en A2, B2; A2, B2 hasta A3, B3; ... para alcanzar la concentración nM de dígito sencillo en el último punto de dilución . 5. Diluir lmM (en DMSO al 100%) de péptido lineal etiquetado FAM con DMSO hasta ???µ? (dilución 1:10). Luego, diluir desde ???µ? hasta ??µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde ??µ? hasta 40nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que será una concentración ???? en el pozo (dilución 1:4). Mantener el péptido etiquetado FAM diluido en la oscuridad hasta el uso. 6. Agregar ??µ? de ???? de péptido etiquetado FAM en cada pozo e incubar, y leer en diferentes puntos de tiempo. Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 (SEQ ID NO: 943) es -13.38 nM.

Ejemplo 6: Ensayo de polarización de fluorescencia competitiva para MDM2 El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir MDM2 (Interno, 41kD) en solución amortiguadora FP (Solución amortiguadora de sal alta -Nací 200mM, CHAPS 5m , H 7.5) para hacer solución madre de trabajo 84nM (2X) . 2. Agregar 20µ1 de 84nM (2X) de solución madre de proteina en cada pozo de microplaca HE negra de 96 pozos (Molecular Devices) 3. Diluir lmM (en DMSO al 100%) de péptido lineal etiquetado FAM con DMSO hasta ???µ? (dilución 1: 10) . Luego, diluir desde ???µ? hasta ??µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde ??µ? hasta 40nM (dilución 1:250) . Esta es la solución de' trabajo que será una concentración ???? en el pozo (dilución 1:4) . Mantener el péptido etiquetado FAM diluido en la oscuridad hasta el uso. 4. Hacer la placa de dosis del péptido no etiquetado con solución amortiguadora FP partiendo con ?µ? (final) de péptido y hacer 5 veces de diluciones en serie para 6 puntos usando el siguiente esquema de dilución.

Diluir lOmM (en DMSO al 100%) con DMSO hasta 5mM (dilución 1: 2) . Luego, diluir desde 5mM hasta 500µ? con H20 (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde 500µ? hasta 20µ? (dilución 1:25) . Hacer 5 veces de diluciones en serie desde 4µ? (4X) para 6 puntos. 5. Transferir ??µ? de péptidos no etiquetados diluidos en serie para cada pozo que se rellena con 20µ1 de 84nM de proteina. 6. Agregar ??µ? de ???? (4X) de péptido etiquetado FAM en cada pozo e incubar durante 3hr para lectura.

Ejemplo 7: Ensayo de enlace directo MDMX con polarización de fluorescencia (FP) El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir MDMX (Interno, 40kD) en solución amortiguadora FP (Solución amortiguadora de sal alta - Nací 200mM, CHAPS 5mM, pH 7.5) para hacer solución madre de trabajo ??µ?. 2. Agregar 30µ1 de ??µ? de solución madre de proteina en el pozo Al y Bl de microplaca HE negra de 96 pozos (Molecular Devices ) . 3. Rellenar en 30µ1 de solución amortiguadora FP en la columna A2 hasta A12, B2 hasta B12, Cl hasta C12, y DI hasta D12. 4. 2 o 3 veces de dilución en serie de proteina madre de Al, Bl en A2, B2; A2, B2 hasta A3, B3; ... para alcanzar la concentración nM de dígito sencillo en el último punto de dilución. '5. Diluir lmM (en DMSO al 100%) de péptido lineal etiquetado FAM con DMSO hasta ???µ? (dilución 1: 10) . Luego, diluir desde ???µ? hasta 10µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde 10µ? hasta 40nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que será una concentración ???? en el pozo (dilución 1:4). Mantener el péptido etiquetado FAM diluido en la oscuridad hasta el uso. 6. Agregar ??µ? de ???? de péptido etiquetado FAM en cada pozo e incubar, y leer en diferentes puntos de tiempo.

Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 (SEQ ID NO: 943) es -51 nM.

Ejemplo 8: Ensayo de polarización de fluorescencia competitiva para MDMX El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir MDMX (Interno, 40kD) en solución amortiguadora FP (Solución amortiguadora de sal alta -Nací 200mM, CHAPS 5mM, pH 7.5.) para hacer solución madre de trabajo 300nM (2X) . 2. Agregar 20µ1 de 300nM (2X) de solución madre de proteina en cada pozo de microplaca HE negra de 96 pozos (Molecular Devices) 3. Diluir lmM (en DMSO al 100%) de péptido lineal etiquetado FAM con DMSO hasta ???µ? (dilución 1: 10). Luego, diluir desde ???µ? hasta 10µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde 10µ? hasta 40nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que será una concentración ???? en el pozo (dilución 1:4). Mantener el péptido etiquetado FAM diluido en la oscuridad hasta el uso. 4. Hacer la placa de dosis del péptido no etiquetado con solución amortiguadora FP partiendo con 5µ? (final) de péptido y hacer 5 veces de diluciones en serie para 6 puntos usando el siguiente esquema de dilución. 5. Diluir lOmM (en DMSO al 100%) con DMSO hasta 5mM (dilución 1: 2). Luego, diluir desde 5mM hasta 500µ? con H20 (dilución 1:10) y luego diluir con solución amortiguadora FP desde 500µ? hasta 20µ (dilución 1:25). Hacer 5 veces de diluciones en serie desde 20µ? (4X) para 6 puntos. 6. Transferir ??µ? de péptidos no etiquetados diluidos en serie para cada pozo que se rellena con 20µ1 of 300nM de proteina . 7. Agregar ??µ? de ???? (4X) de péptido etiquetado FAM en cada pozo e incubar durante 3hr para lectura.

Los resultados de los Ejemplos 5-8 se muestran en la Tabla 4. La siguiente escala se usa: "+" representa un valor mayor que 1000 nM, "++" representa un valor mayor que 100 y menor que o igual a 1000 nM, "+++" representa un valor mayor que 10 nM y menor que o igual hasta 100 nM, y "++++" representa un valor de menos de o igual hasta 10 nM.

Tabla 4 Ejemplo 9: ELISA de enlace de competición (MDM2 y MDMX) La proteina p53-His6 ("His6" descrita como SEQ ID NO: 1501) (30 nM/pozo) se recubre durante la noche a temperatura ambiente en los pozos de las placas Immulon de 96 pozos. En el día del experimento, las placas se lavan con IX PBS-Tween 20 (0.05%) usando un lavador de placa ELISA automático, bloqueado con pozo ELISA Micro bloqueado durante 30 minutos a temperatura ambiente; el agente de bloqueo en exceso se lava completamente por placas de lavado con IX PBS-Tween 20 (0.05%). Los péptidos se diluyen a partir de soluciones madres DMSO 10 mM hasta solución madre de trabajo 500 µ? en agua estéril, las diluciones adicionales se hacen en DMSO 0.5% para mantener la concentración de D SO constante a través de las muestras. Los péptidos se agregan a los pozos en concentraciones deseadas 2X en volúmenes 50 µ?, seguido por adición de proteina GST-MDM2 o GST-HMDX diluida (concentración final: ????) . Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 2h, las placas se leen con PBS-Tween 20 (0.05%) antes de agregar 100 µ? de anticuerpo anti-GST HRP-conjugado [Hypromatrix, INC] diluido hasta 0.5 g/ml en solución amortiguadora que estabiliza HRP. Después de 30 min de incubación con anticuerpo de detección, las placas se lavan e incuban con 100 µ? por pozo de la solución de sustrato TMB-E hasta 30 minutos; las reacciones se detienen usando HCL 1M y absorbancia medida en 450 nm en lector de microplaca. Los datos se analizan usando software Graph Pad PRISM.

Ejemplo 10: Ensayo de viabilidad celular El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: Colocar en placa celular: Tripsinizar, contar y sembrar células en las densidades pre-determinadas en placas de 96 pozos un dia antes del ensayo. Después, las densidades celulares se usan para cada linea celular en uso: • SJSA-1: 7500 células/pozo • RKO: 5000 células/pozo • RKO-?ß: 5000 células/pozo • HCT-116: 5000 células/pozo • S -480: 2000 células/pozo • MCF-7: 5000 células/pozo En el día del estudio, reemplazar los medios con medios frescos con FBS al 11% (medios de ensayo) a temperatura ambiente. Agregar 180 L de los medios de ensayo por pozo.

Controlar los pozos sin células, recibir 200 µ? de medios.

Dilución del péptido: todas las diluciones se hacen a temperatura ambiente y se agregan a células a temperatura ambiente .

• Preparar soluciones madre 10 mM de los péptidos en DMSO.

Diluir en serie la solución madre usando 1:3 esquema de dilución para obtener soluciones 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, O.OlmM usando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos con DMSO en serie 33.3 veces usando agua estéril. Esto da el intervalo de soluciones madre de trabajo 10X. también preparar DMSO/agua estéril (DMSO 3%) mezclada para pozos de control.

• De esta manera el intervalo de concentración de soluciones madre de trabajo µ? será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar el pozo en cada etapa de dilución usando multicanal .

• La fila H tiene el control. Hl- H3 recibirán 20 ul de medios de ensayo. H4-H9 recibirán 20 ul de vehículo de DMSO-agua al 3%. H10-H12 tendrá medios de control solos sin células.

• Control positivo: inhibidor de molécula pequeña DM2, Nutlin-3a (10 mM) se usa como control positivo. Nutlina se diluye usando el mismo esquema de dilución como péptidos .

Adición de solución madre de trabajo a células: • Agregar 20 µ? de concentraciones deseadas 10X al pozo apropiado para lograr las concentraciones finales en volumen 200 µ? total en el pozo. (20 µ? de 300 µ? de péptido + 180 µ? de células en los medios = 30 µ? concentración final en 200 µ? volumen en pozos) . Mezclar suavemente unas pocas veces usando pipeta. De esta manera el intervalo de concentración final usado será 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 & 0 µ? (para péptidos potentes se incluyen diluciones adicionales) .

• Los controles incluyen pozos que obtienen no péptidos pero contienen la misma concentración de DMSO como los pozos que contienen los péptidos, y pozos que no contienen células.

• Incubar durante 72 horas a 37°C en atmósfera C02 al 5% humidificada .

• La variabilidad de células se determina usando reactivo MTT de Promega. La viabilidad de células SJSA-1, RKO, RK0-E6, HCT-116 se determina en el dia 3, células MCF-7 en el dia 5 y células SW-480 en el dia 6. Al final del tiempo de incubación designado, permite que las placas vuelvan a temperatura ambiente. Remover 80 µ? de medios de ensayo de cada pozo. Agregar 15 µ? de reactivo MTT descongelado a cada pozo.

• Permitir que la placa se incube durante 2h a 37 °C en atmósfera de C02 al 5% humidificada y agregar 100 µ? de reactivo de solubilización como por el protocolo del fabricante. Incubar con agitación durante lh a temperatura ambiente y leer en lector de placa múltiple Synergy Biotek para absorbancia en 570nM.

• Analizar la viabilidad celular contra los controles DMSO usando herramientas de análisis GraphPad PRISM.

Reactivos : • Medios de cultivo de célula Invitrogen i. Placas tratadas con cultivo de célula transparente de 96 pozos Falcon (Nunc 353072) • DMSO ( Sigma D 2650) • RPMI 1640 (Invitrogen 72400) • MTT (Promega G4000) Instrumentos: Lector de placa múltiple para lectura de absorbancia (Sinergia 2).

Los resultados de los ensayos de viabilidad celular se muestran en las Tablas 5 y 6. La siguiente escala se usa: "+" representa un valor mayor que 30 µ?, "++" representa un valor mayor que 15 µ? y menor que o igual hasta 30 µ?, "+++" representa un valor mayor que 5 µ y menor que o igual hasta 15 µ?, y "++++" representa un valor de menos de o igual hasta 5 µ?. "Relación IC50" representa la relación de IC50 promedio en células p53+/+ con relación al IC50 promedio en células p53-/-.

Tabla 5 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 Tabla 6 El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: Colocar en placa celular: • Tripsinizar, contar y sembrar células SJSAl en la densidad de 7500 células/100 µ?/???? en placas 96-pozos un dia antes del ensayo.

• En el dia del estudio, reemplazar los medios con RPMI- 11% FBS fresco (medios de ensayo) . Agregar 90µ1, de los medios de ensayo por pozo. Controlar los pozos sin células, recibir 100 µ? de los medios.

Dilución del péptido: · Preparar soluciones madre 10 mM de los péptidos en DMSO.

Diluir en serie la solución madre usando 1:3 esquema de dilución para obtener soluciones 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, O.OlmM usando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos DMSO en serie 33.3 veces usando agua estéril. Esto da el intervalo de soluciones madre de trabajo 10X. También preparar DMSO/agua estéril (DMSO al 3%) mezclada para pozos de control.

• De esta manera el intervalo de concentración de las soluciones madre de trabajo µ? será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar el pozo en cada etapa de dilución usando multicanal.

• La fila H tiene control. Hl- H3 recibirán 10 ul de medios de ensayo. H4-H9 recibirán 10 ul de vehículo DMSO-agua 3%. H10-H12 tendrán medios de control solos sin célul,as.

• Control positivo: Inhibidor de molécula pequeña MDM2, Nutlin-3a (10 mM) se usó como control positivo. Nutlin se diluyó usando el mismo esquema de dilución como los péptidos .

Adición de las soluciones madre de trabajo para células: • Agregar 10 µ? de concentración deseada 10X para pozo apropiado para lograr las concentraciones finales en el volumen 100 µ? total en el pozo. (10 µ? de péptido 300 µ? + 90 µ? de células en los medios = concentración final 30 µ? en 100 µ? de volumen en pozos) . De esta manera el intervalo de concentración final usado será 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?.

• Los controles incluirán pozos que no dan péptidos pero contienen la misma concentración de DMSO como los pozos que contienen los péptidos, y pozos que no contienen células . • 20h después de la incubación, se aspiran los medios; se lavan las células con IX PBS (sin Ca++/Mg++) y se lisan en 60 µ? de solución amortiguadora de lisis celular IX (tecnologías de señalización celular 10X solución amortiguadora diluida hasta IX y complementada con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) en hielo durante 30 min.

• Centrifugar placas en una velocidad de 5000 rpm a 4°C durante 8 min; recolectar los sobrenadantes claros y congelarlos a -80°C hasta el uso adicional.

Estimación de la proteína: • El contenido de proteína total de los lisados se mide usando kit de detección de proteina BCA y estándares BSA de Thermofisher . Típicamente alrededor de 6-7 µq de proteína se espera por pozo.

• Usar 50 µ? del lisado por pozo para ajustar p21 ELISA. p21 ELISA total humano: el protocolo de ensayo ELISA se sigue como por las instrucciones del fabricante. 50 µ? de lisado se usa para cada pozo, y cada pozo se ajusta en triplicado.

Reactivos: • -Ensayo basado en célula (-)-Nutlin-3 (10 mM) : Cayman Chemicals, catálogo # 600034 • - OptiMEM, Invitrogen catálogo # 51985 • -Solución amortiguadora de lisis de señalización célula (10X), tecnología de señalización celular, catálogo # 9803 • -Comprimidos de cóctel del inhibidor de proteasa (mini) , Roche Chemicals, catálogo # 04693124001 • -Comprimido de cóctel del inhibidor de fosfatasa, Roche Chemicals, catálogo # 04906837001 • -kit de p21 ELISA total humano, R&D Systems, DYC1047-5 • -Solución de PARO (HCL 1M) , Cell Signaling Technologies, Catálogo # 7002 Instrumentos: Micro centrífugo- Eppendorf 5415D y Lector de Placa múltiple para lectura de absorbancia (Sinergia 2).

Ejemplo 12: Ensayo de detección de caspasa 3: El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: Colocar en placa celular: Tripsinizar, contar y sembrar células SJSA1 en la densidad de 7500 células/ 100 µ?/???? en placas de 96 pozos un día antes del ensayo. En el día del estudio, reemplazar los medios con RPMI-FBS al 11% fresco (medios de ensayo) . Agregar 180pL de los medios de ensayo por pozo. Controlar los pozos sin células, recibir 200 µ? de medios.

Dilución del péptido: • Preparar soluciones madre 10 mM de los péptidos en DMSO.

Diluir en serie la solución madre usando 1:3 esquema de dilución para obtener soluciones 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, O.OlmM usando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos DMSO en serie 33.3 veces usando agua estéril. Esto da el intervalo de las soluciones madre de trabajo 10X. También preparar DMSO/agua estéril (DMSO al 3%) mezclada para pozos de control.

· De esta manera el intervalo de concentración de las soluciones madre de trabajo µ? será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar el pozo en cada etapa de dilución usando multicanal. Agregar 20 ul de soluciones madre de trabajo 10X para pozos apropiados.

• La fila H tiene control. Hl- H3 recibirán 20 ul de medios de ensayo. H4-H9 recibirán 20 ul de vehículo DMSO-agua al 3%. H10-H12 tendrán medios de control solos sin células.

• Positivo control: Inhibidor de molécula pequeña MDM2, Nutlin-3a (10 mM) se usa como positivo control. Nutlin se diluye usando el mismo esquema de dilución como péptidos .

Adición de soluciones madre de trabajo para células: • Agregar 10 µ? de concentración deseada 10X para pozo apropiado para alcanzar las concentraciones finales en 100 µ? de volumen total en el pozo. (10 µ? de péptido 300 µ? + 90 µ? de células en los medios = concentración final 30 µ? en volumen 100 µ? en los pozos) . De esta manera el intervalo de concentración final usado será 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?.

• Los controles incluirán pozos que no dan péptidos pero contienen la misma concentración de DMSO como los pozos que contienen los péptidos, y pozos que no contienen células . • 48 h después de la incubación, aspirar 80 µ? de medios de cada pozo; agregar 100 µ? de reactivo de ensayo Caspasa3/7Glo (sistema de ensayo Promega Caspasa 3/7 glo, G8092) por pozo, incubar con agitación suave durante lh a temperatura ambiente.

• Leer en un lector de placa múltiple Synergy Biotek para luminiscencia .

• Los datos se analizan como activación de Caspasa 3 sobre células tratadas con DMSO.

Los resultados de los Ejemplos 11 y 12 se muestran en la Tabla 7: Tabla 7 Ejemplo 13. Lisis celular por macrociclos peptidomiméticos Las células SJSA-1 se colocaron en placa un dia por adelantado en placas de fondo plano transparentes (Costar, catálogo número 353072) en 7500células/pozo con 100ul/pozo de medios de crecimiento, dejando la fila H columnas 10-12 vacias para los medios solos. En el día del ensayo, los medios se intercambiaron con medio FBS al 1% RPMI, 90uL de medios por pozo.

Las soluciones madre 10 mM de los macrociclos peptidomiméticos se prepararon en DMSO al 100%. Los macrociclos peptidomiméticos luego se diluyeron en serie en DMSO al 100%, y luego se diluyeron además 20 veces en agua estéril para preparar soluciones madre de trabajo en DMSO/agua al 5% de cada macrociclo peptidomimético en concentraciones en el intervalo desde 500 uM hasta 62.5 uM. 10 uL de cada compuesto se agregó a los 90 uL de células SJSA-1 para proporcionar concentraciones finales de 50 uM hasta 6.25 uM en medios que contienen DMSO 0.5%. La muestra de control negativo (no lítica) fue DMSO solo al 0.5% y muestras de control positivo (liticas) incluyen Melittin 10 uM y Tritón X-100 al 1%.

Las placas celulares se incubaron durante 1 hora a 37C. después de la incubación de 1 hora, la morfología de las células se examina por microscopía y luego las placas se centrifugan en 1200rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 40uL de sobrenadante para cada macrocilo peptidomimético y la muestra de control se transfiere a placas de ensayo transparente. La liberación LDH se mide usando el kit ensayo de citotoxicidad LDH de Caymen, catálogo # 1000882. Los resultados se muestran en la Tabla 8: Tabla 8 Ejemplo 14; Ensayo p53 GRIP El Ensayo de Redistribución Thermo Scientific* Biolmage p53-MDM2 monitorea la interacción de la proteina con MDM2 y transubicación celular de p53 etiquetado GFP en respuesta a los compuestos del fármaco u otros estímulos. Las células CHO-hlR recombinantes establemente expresan p53 (1-312) humano fusionado a la terminal C de proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) y PDE4A4-MDM2 ( 1-124 ) , una proteína de fusión entre PDE4A4 y MDM2 (1-124). Se proporciona un sistema de ensayo lista para uso para medir los efectos de las condiciones experimentales en la interacción de p53 y MDM2. Se realiza el análisis y la formación de imágenes con una plataforma HCS.

Las células CHO-hlR se mantienen regularmente en medios F12 de Ham complementados con Penicilna-Estreptomicina al 1%, 0.5 mg/ml de Geneticina, 1 mg/ml de Zeocina y FBS al 10%. Las células se siembran en placas de 96-pozos en la densidad de 7000 células/ 100 µ? por pozo 18-24 horas antes del funcionamiento del ensayo usando medios de cultivo. El siguiente día, el medio se refresca y PD177 se agrega a las células para la concentración final de 3µ? para activar la formación de focos. Los pozos de control se mantienen sin la solución PD-177. 24h después de la estimulación con PD177, las células se lavan una vez con medio Opti-MEM y 50 L del medio Opti-MEM complementado con PD-177(6 µ?) se agrega a células. Los péptidos se diluyen de soluciones madre DMSO 10 mM hasta soluciones madre de trabajo 500 µ? en agua estéril, las diluciones adicionales hechas en DMSO al 0.5% mantienen la concentración de DMSO constante a través de las muestras. La concentración DMSO más alta final es 0.5% y se usa como el control negativo. Se usa el Ensayo con base en célula Cayman Chemicals (-)-Nutlin-3 (10 mM) como positivo control. La Nutlina se diluyó usando el mismo esquema de dilución como péptidos. Se agregan 50 µ? de 2X concentraciones deseadas al pozo apropiado para lograr las concentraciones deseadas finales. Las células luego se incuban con péptidos durante 6 h a 37°C en atmósfera C02 al 5% humidificada . Después del periodo de incubación, las células se fijan al aspirar suavemente el medio y agregar 150 µ? de solución fija por pozo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijas se lavan 4 veces con 200 µ? de PBS por pozo cada vez. Al final del último lavado, se agrega 100 µ? de solución de tinción ?µ? Hoechst. Las placas selladas incubadas durante al menos 30 min en la oscuridad, se lavan con PBS para remover la tinción en exceso PBS se agrega a cada pozo. Las placas pueden almacenarse a 4°C en la oscuridad hasta 3 días. La transubicación de p53/MDM2 se forma en imagen usando el módulo de transubicación molecular en instrumento Cellomics Arrayscan usando 10x conjuntos de filtro XF-100, objetivos para Hoechst y GFP. Los parámetros de salida fueron ean-CircRINGAvelntenRatio (la relación de las intensidades de fluorescencia promedio de núcleo y citoplasma, (pozo promedio) ) . El número mínimamente aceptable de células por pozo usado para análisis de imagen se ajustó hasta 500 células .

Ejemplo 15: Estudio del cáncer de mama MCF-7 usando SP315, SP249 y SP154 Se realizó un estudio de xenoinjerto para probar la eficacia de SP315, SP249 y SP154 al inhibir el crecimiento del tumor en ratones atímicos en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7. Un péptido básico de control negativo. SP252, una mutación de punto de SP154 (F hasta A en la posición 19) también se probó en un grupo; este péptido no ha mostrado actividad en el ensayo viabilidad in vitro SJSA-1. Los peletizados de 17 -estradiol de 0.72 mg del día 90 de liberación lenta (Innovative Research, Sarasota, FL) se implantaron subcutáneamente (se) en la nuca del cuello un día antes del implante de la célula de tumor (día -1) . En el día 0, las células de tumor MCF-7 se implantaron se en el flanco de ratones sin pelo hembra (Crl : NU-Foxnlnu) . En el día 18, los tumores se resultantes se midieron usando calibradores para determinar su longitud y ancho y los ratones se pesaron. Los tamaños del tumor se calcularon usando la fórmula (longitud x ancho2 )/2 y expresaron como milímetros cúbicos (mm3) . Los ratones con tumores más pequeños que 85.3 mm3 o mayor que 417.4 mm3 se excluyeron de la formación del grupo posterior. Trece grupos de ratones, 10 ratones por grupo, se formaron por aleatorización de manera que los tamaños del tumor medios del grupo fueron esencialmente equivalentes (media de los grupos ± desviación estándar de los grupos = 180.7 ± 17.5 mm3) .

Las soluciones de dosificación SP315, SP249, SP154 y SP252 se prepararon de los péptidos formulados en un vehículo que contiene MPEG (2K) -DSPE en concentración 50 mg/mL en una solución amortiguadora salina de Histidina 10 mM en pH 7. Esta formulación se prepare una vez para la duración del estudio. Este vehículo se usó como el control de vehículo en el estudio posterior.

Cada grupo se asignó a un régimen de tratamiento diferente. El grupo 1, como el grupo de control negativo de vehículo, recibe el vehículo administrado en el peso corporal de 8 mL/kg intravenosamente (iv) tres veces por semana de los días 18-39. Los grupos 2 y 3 reciben SP154 como una inyección iv en 30 mg/kg tres veces por semana o 40 mg/kg veces por semana, respectivamente. El grupo 4 recibe 6.7 mg/kg SP249 como una inyección iv tres veces por semana. Los grupos 5, 6, 7 y 8 reciben SP315 como una inyección iv de 26.7 mg/kg tres veces por semana, 20 mg/kg dos veces por semana, 30 mg/kg dos veces por semana, o 40 mg/kg dos veces por semana, respectivamente. El grupo 9 recibe 30 mg/kg SP252 como una inyección iv tres veces por semana.

Durante el periodo de dosificación los ratones se pesaron y los tumores se midieron 1-2 veces por semana. Los resultados en términos de volumen de tumor se muestran en las Figuras 3-6 y la inhibición del crecimiento del tumor comparado con el grupo de vehículo, cambio de peso corporal y número de ratones con 20% de pérdida de peso corporal o muerte se muestran en la Tabla 9. Se calculó la inhibición del crecimiento de tumor (TGI) como %TGI=100- [ (TuVoldiatratado x Y0 -j^díatratadol8^ ^TuVolcontro-1- negativo de vehículo-día x_'J1UYQ ^control negativo de vehículo- díaia ) *100 f donde x= día que el efecto del trataminto se está evaluando. El grupo 1, el grupo de control negative del vehículo, muestra buena tasa de crecimiento de tumor para este modelo tumor.

Para SP154, en el grupo dosificado con 40 mg/kg dos veces a la semana 2 ratones mueren durante el tratamiento, indicando que este régimen de dosificación no fue tolerable. El régimen de dosificación de 30 mg/kg de SP154 tres veces por semana se toleró bien y proporcionó un TGI de 84%.

Para SP249, el grupo dosificado con 6.7 mg/kg tres veces por semana 4 ratones mueren durante el tratamiento, indicando que este régimen de dosificación no fue tolerable.

Todos los regímenes de dosificación usados para SP315 muestran buena tolerabilidad, sin muertes o pérdida de peso corporal señaladas. La dosificación con 40 mg/kg de SP315 dos veces por semana produce el TGI más alto (92%) . Los regímenes de dosificación de SP315 de 26.7 mg/kg tres veces por semana, 20 mg/kg dos veces por semana, 30 mg/kg dos veces por semana producen TGI de 86, 82, y 85%, respectivamente.

Para SP252, la mutación de punto de SP154 que no muestra actividad apreciable en ensayos in vitro, la dosificación con 30 mg/kg tres veces por semana se toleró bien sin muertes o pérdida de peso corporal señaladas. Mientras que TGI de 88% se señaló por el Día 32, que TGI se redujo hasta 41% por el Día 39.

Los resultados de este Ejemplo se muestran en las Figuras 3-6 y se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9 *p = 0.05 con'bra Control de vehículo Ejemplo 21: Determinación de solubilidad para macrociclos peptidomiméticos Los macrociclos peptidomiméticos se disuelven primero en N, N-dimetilacetamida puro (DMA, Sigma-Aldrich, 38840-1L-F) para hacer solución madre 20X sobre un intervalo de concentración de 20-140 mg/mL. Las soluciones madre DMA se diluyen 20 veces en un vehículo acuoso que contiene Solutol- HS-15 al 2%, Histidina 25 mM, 45 mg/mL de Manitol para obtener concentraciones finales de 1-7 mg/ml de los macrociclos peptidomiméticos en DMA al 5%, Solutol-HS-15 al 2%, Histidina 25 mM, 45 mg/mL de Manitol. Las soluciones finales se mezclan suavemente al repetir el pipeteo o colocación en vórtice de luz, y luego las soluciones finales se sonican durante 10 min a temperatura ambiente en un baño de agua ultrasónico. La observación visual cuidadosa luego se realiza bajo luz de cubierta usando un amplificador visual 7x para determinar si el precipitado existe en el fondo o como una suspensión. Los intervalos de concentración adicionales se prueban como sea necesarios para determinar el limite de solubilidad máxima para cada macrociclo peptidomimético . Los resultados de este Ejemplo se muestran en la Figura 7.

Ejemplo 22: Preparación de Macrociclos peptidomiméticos usando un aminoácido protegido Boc.

Los precursores de macrociclo peptidomimético se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 que comprende un aminoácido R8 en la posición "i" y un aminoácido S5 en la posición "i+7". El aminoácido en la posición "i+3" fue un triptofano protegidos Boc que se incorporó durante la síntesis de fase sólida. Específicamente, el aminoácido de triptofano protegido Boc se muestra a continuación (y está comercialmente disponible, por ejemplo, de Novabiochem) se usó durante la síntesis de fase sólida: La metátesis se realizó usando un catalizador de rutenio antes de las etapas de desdoblamiento y desprotección. La composición obtenida después de la ciclización se determinó por análisis HPLC para contener principalmente macrociclos peptidomiméticos que tienen una reticulación que comprende una trans olefina ("iso2", que comprende el enlace doble en una configuración E) . Inesperadamente, una relación de 90:10 se observe para los productos trans y cis, respectivamente.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un macrociclo peptidomimético de la Fórmula: caracterizado porque: cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6- rp7-Ala8-Gln9-Leuio- ii-Seri2 (SEQ ID N0:8), donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo , heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3 cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2Í -SR6, -SOR6, -S02R6f - 02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E;. v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5. 2. Un macrociclo peptidomimético de la Fórmula: caracterizado porque: cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaae, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii- Alai2 (SEQ ID NO: 9), donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y Rz son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, C0, C02, o C0NR3; cada R¾ es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2/ -SR6, -S0R6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; w es un entero desde 3-1000, por ejemplo 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un entero desde 1-5. 3. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene afinidad de enlace mejorada a MDM2 o MDMX con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 4. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene una relación reducida de afinidades enlazadas a MDMX contra MDM2 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 5. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene eficacia anti-tumor in vitro mejorada contra lineas celulares de tumor positivas p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 6. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético muestra inducción de apoptosis in vitro mejorada en lineas celulares de tumor positivas p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 7. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene una relación de eficacia anti-tumor in vitro mejorada para lineas celulares de tumor mutante o p53 positivo contra p53 negativo con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 8. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el macrociclo peptidomimético tiene eficacia anti-tumor in vivo mejorada contra tumores positivos p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 9. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene inducción de apoptosis in vivo mejorada en tumores positivos p53 con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 10. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene permeabilidad celular mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. 11. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene solubilidad mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, l o 2. 12. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque Xaas es Glu o un análogo de aminoácido del mismo. 13. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque Xaa5 es Glu o un análogo de aminoácido del mismo y en donde el macrociclo peptidomimético tiene una propiedad mejorada, tal como afinidad de enlace mejorada, solubilidad mejorada, eficacia celular mejorada, helicidad mejorada, permeabilidad celular mejorada, eficacia anti-tumor in vivo o in vitro mejorada, o inducción de apoptosis mejorada con relación a un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaa5 es Ala. 14. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque cada E es independientemente un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido a-aminoisobutirico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) . 15. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque [D]v es -Leui-Thr2. 16. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque w es 3-10. 17. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque w es 3-6. 18. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque w es 6-10. 19. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque w es 6. 20. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque v es 1-10. 21. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque v es 2-10. 22. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque v es 2-5. 23. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque v es 2. 24. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula : Fórmula (I) en donde: cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido; B es un aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] , o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo 1/ conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada L o 1/ es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-; Li y 1¡2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(Re)2/ -SRe -SOR6, -SO2 6, -CO2R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente enteros desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; u es un entero desde 1-10, por ejemplo 1-5, 1-3 o 1-2; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10, por ejemplo la suma de x+y+z es 2, 3, o 6; n es un entero desde 1-5; y en donde el macrociclo peptidomimético no es un macrociclo peptidomimético de las Tablas 2a o 2b. 25. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque cada E es independientemente un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido a-aminoisobutirico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) . 26. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque [D]v es -Leui-Thr2. 27. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le, en donde el macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula: Fórmula (I) en donde : cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido; B es un aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] , o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-; Li y L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R¾; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N ( R6) 2 , -SRe, -SOR6, -S02R6 , -C02R6 , una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente enteros desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; u es un entero desde 1-10, por ejemplo 1-5, 1-3 o 1-2; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10, por ejemplo la suma de x+y+z es 6; n es un entero desde 1-5; en donde w>2 y cada uno de los primeros dos aminoácidos representado por E comprende una cadena lateral no cargada o una cadena lateral negativamente cargada, con la condición de que el macrociclo peptidomimético no es un macrociclo peptidomimético de la Tabla 2a y no tiene la secuencia de: Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2 (SEQ ID NO:l) Ac-$r8SQQTFS$LWRLLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 3), Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2 (SEQ ID NO : 4 ) , Ac-QS$r5QTFStNL $LLAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 5) o Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2 (SEQ ID NO: 6), en donde Aib representa ácido 2-aminoisobutírico, $ representa un aminoácido de alfa-Me S5-pentenil-alanina olefina conectada por un reticulador todo de carbono que comprende un enlace doble, $r5 representa los aminoácidos alfa-Me R5-pentenil-alanina olefina conectados por un carbono completo que comprende un enlace doble, y $r8 representa un aminoácido de alfa-Me R8-octenil-alanina olefina conectada por un reticulador todo de carbono que comprende un enlace doble . 28. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque cada E es independientemente un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido -aminoisobutirico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) . 29. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque [D]v es -Leui-Thr2. 30. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el primer aminoácido de terminal C y/o el segundo aminoácido de terminal C representado por E comprende una cadena lateral hidrofóbica. 31. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cadena hidrofóbica es una cadena lateral hidrofóbica grande. 32. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le, en donde el macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula: Fórmula (I) en donde: cada A, C, D, y E independientemente un aminoácido; B es un aminoácido, -NH-L3-CO-] , [-NH-L3-SO2 o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo 1 conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada L o 1/ es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li~L2-; Li y L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2f ~SR6, -SORe, -S02R6r _C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, 0 parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, 0 parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente enteros desde 1-1000, por ejemplo 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10; u es un entero desde 1-10, por ejemplo 1-5, 1-3 o 1-2; x, y, y z son independientemente enteros desde 0-10, por ejemplo la suma de x+y+z es 6; n es un entero desde 1-5; y w>2 , en donde el tercer aminoácido representado por E comprende una cadena lateral hidrofóbica grande, con la condición de que el macrociclo peptidomimético no es un macrociclo peptidomimético de la Tabla 2a y no tiene la secuencia de: Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2 (SEQ ID N0:7). 33. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque cada E diferente del tercer aminoácido representado por E un aminoácido seleccionado de Ala (alanina) , D-Ala (D-alanina) , Aib (ácido a-aminoisobutírico) , Sar (N-metil glicina) , y Ser (serina) . 34. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque [D]v es -Leui~Thr2. 35. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 32-34, caracterizado porque cada uno de los primeros dos aminoácidos representado por E comprende una cadena lateral no cargada o una cadena lateral negativamente cargada. 36. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 32-34, caracterizado porque el tercer aminoácido representado por E es aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Fenilalanina (F), Tritofano ( ) , y Tirosina (Y) . 37. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 36, caracterizado porque Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, o heterocicloarileno, cada uno siendo opcionalraente sustituido con R5. 38 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 36 , caracterizado porque Li y L2 son independientemente alquileno o alquenileno. 39 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 36 , caracterizado porque L es alquileno, alquenileno, o alquinileno . 40 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 39 , caracterizado porque L es alquileno. 41 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 40 , caracterizado porque L es alquileno C3-C16. 42 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado porque L es alquileno Cio- C14. 43 . El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-. 44. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque Ri y í son H. 45. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque Ri y R2 son independientemente alquilo. 46. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque Ri y R2 son metilo. 47. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque x+y+z = 6. 48. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque u es 1. 49. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético no es un macrociclo de la Tabla 2a o Tabla 2b. 50. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque cada E es Ser o Ala o un análogo del mismo. 51. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de la reivindicación precedente, caracterizado porque comprende al menos un aminoácido que es un análogo de aminoácido . 52. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque es de la fórmula: (SEQ ID NO: 163) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 53. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque es de la fórmula: (SEQ ID NO: 124) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 54. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque es de la fórmula: Leu-Thr-Phe-HN ,Ser-Ala-Ala-NH2 N (SEQ ID NO:123) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 55. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO: 108) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 56. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: [SEQ ID NO:397) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 57. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:340) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 58. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:454) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 59. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:360) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 60. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:80) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 61. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:78) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 62. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID N0:16) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 63. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO: 169) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 64. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:324) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 65. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:258) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 66. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:446) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 67. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:358) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 68. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:464) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 69. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque e la fórmula: (SEQ ID NO:466) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 70. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO: 67) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 71. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO: 376) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 72. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque (SEQ ID NO:471) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 73. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:473) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 74. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO: 475) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. (SEQ ID NO:476) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 76. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:481) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 77. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque la fórmula: (SEQ ID NO:482) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 78. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:487) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 79. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO: 572) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 80. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque s de la fórmula: (SEQ ID NO:572) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 81. Un macrociclo peptidomimético, caracterizado porque es de la fórmula: (SEQ ID NO:1500) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 82. Un método para tratar el cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer pulmonar, cáncer de mama, y glioma. 84. Un método para modular la actividad de p53 y/o MDM2 y/o MDMX en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes . 85. Un método para antagonizar la interacción entre las proteínas p53 y MD 2 y/o entre p53 y MDMX en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes . 86. Un método para preparar una composición que comprende un macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I): Fórmula ( I ) , caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es alrededor de 60% hasta alrededor de 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla la, Tabla Ib, o Tabla le, el método comprende tratar un compuesto de la Fórmula (II) Fórmula (II) , con un catalizador para resultar en el compuesto de la Fórmula I en donde en los compuestos de la Fórmula e (I) y (II) cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido; cada B es independientemente un aminoácido, [- NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-] , o [-NH-L3-] ; cada Ri y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halógeno; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada R3 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -Li-L2-/ cada Li, L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4'-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; cada R4 y R4- es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es independientemente 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2 "SR6, -S0R6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R7 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; cada Re es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; cada v y w son independientemente enteros desde 1-1000; u es un entero desde 1-10; cada x, y, y z son independientemente enteros desde 0- 10; cada n es independientemente un entero desde 1-5; cada o es independientemente un entero desde 1 hasta 15; cada p es independientemente un entero desde 1 hasta 15; "(E)" indica un enlace doble trans; y uno o más de los aminoácidos A, C y/o B cuando B es un aminoácido, presente en los compuestos de la Fórmula e (I) y (II), tiene una cadena lateral que porta un grupo protector. 87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el grupo protector es un grupo protector de átomo de nitrógeno. 88. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-87, caracterizado porque el grupo protector es un grupo Boc. 89. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 87-88, caracterizado porque la cadena lateral del aminoácido que porta el grupo protector que comprende un indol protegido. 90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el aminoácido que porta el grupo protector en su cadena lateral es triptofano (W) que se protege por el grupo protector en su indol nitrógeno. 91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el aminoácido que porta el grupo protector en su cadena lateral es triptofano (W) que se protege en su indol nitrógeno por un grupo Boc. 92. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-91, caracterizado porque después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en cantidades iguales o superiores que un compuesto correspondiente que es un isómero Z. 93. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en una cantidad 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces mayor que el compuesto correspondiente que es un isómero Z. 94. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-93, caracterizado porque el catalizador es un catalizador de rutenio. 95. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-94, caracterizado porque además comprende la etapa de tratar los compuestos de la Fórmula (I) con un agente reductor o un agente oxidante. 96. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-95, caracterizado porque el compuesto de la Fórmula (II) se une a un soporte sólido. 97. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-95, caracterizado porque el compuesto de la Fórmula (II) no se une a un soporte sólido. 98. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-97, caracterizado porque además comprende remover los grupos protectores de los compuestos de la Fórmula ( I ) . 99. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-98, caracterizado porque la metátesis de cierre de anillo se conduce a una temperatura en el intervalo desde alrededor de 20°C hasta alrededor de 80°C. 100. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-99, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) tiene la Fórmula : en donde: cada uno de Xaa3 , Xaas, Xaa6 , Xaa7, Xaas, Xaag, y Xaai0 es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3 , Xaas, Xaa6 / as, Xaag, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio-Xii-Seri2 (SEQ ID NO : 8 ) , donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-, en donde L comprende al menos un enlace doble en la configuración E; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2^ ~SRe, -S0R6, -S02 6, -CO2R6Í una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000; w es un entero desde 3-1000; n es un entero desde 1-5; y Xaa7 es triptofano protegido con Boc. 101. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-99, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) tiene la Fórmula : en donde : cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos como el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leuio/Cba10-Xii-Alai2 (SEQ ID NO: 9), donde cada X es un aminoácido; cada D y E es independientemente un aminoácido; Ri y R.2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, sustituido o no sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma una ligadura que forma macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente una ligadura que forma macrociclo de la fórmula -L1-L2-, en donde L comprende al menos un enlace doble en la configuración E; Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno siendo opcionalmente sustituido con R5; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3 ; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2Í ~SR6, -S0R6, -S02R6Í -CC^Re* una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un entero desde 1-1000; w es un entero desde 3-1000; n es un entero desde 1-5; y Xaa7 es triptofano protegido con Boc. 102. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 86-101, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) comprende un a-hélice.