PT1135513E - Terapia génica mediada por adenovírus - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Terapia genica mediada por adenovírus"

Campo da invenção A presente invenção refere-se ao tratamento de tumores do cérebro utilizando terapia génica.

Antecedentes da invenção 0 tratamento de glioma maligno continua a desafiar médicos e cientistas. A terapia génica com timidina-quinase, utilizando o gene da timidina-quinase do vírus Herpes Simplex (HSVtk), é uma das modalidades de tratamento mais promissoras, na tentativa de alterar a sobrevivência de pacientes de glioma maligno. A terapia génica com HSVtk baseia-se na capacidade da timidina-quinase catalisar a fosforilação do ganciclovir (GCV). 0 GCV fosforilado actua como um análogo nucleotídico tóxico, conduzindo à morte das células alvo. Este fenómeno é adicionalmente intensificado por um efeito circunstante, onde células vizinhas são também destruídas mesmo sem transfecção. Pensa-se que este efeito se deve à libertação de análogos de nucleótidos tóxicos pelas células transfectadas para células vizinhas por via de junções de hiatos.

Os retrovírus e os adenovírus têm sido utilizados como vectores para terapia génica. Ambos os vectores possuem certas vantagens e limitações. Os tumores do cérebro são especialmente adequados para a transferência de genes mediada por retrovírus, pois os retrovírus apenas conseguem infectar células em proliferação enquanto o tecido cerebral normal, sem estar em divisão, permanece intacto. A eficiência da

transferência de genes de retrovírus é relativamente baixa, mas pode ser melhorada utilizando células de empacotamento de retrovírus em vez de vírus isolados. 0 tempo de transdução pode teoricamente ser prolongado e o número de células transfectadas aumentado. Com retrovírus, o gene transfectado incorpora-se no genoma da célula alvo e portanto pode ser conseguida a expressão do gene de longo prazo. Gliomas experimentais foram tratados com terapia génica mediada por adenovírus transduzindo células tumorais in situ com ADV 2

ΕΡ 1 135 513 /PT defectivo para replicação portador do gene de HSV-tk Perez-Cruet et al. 1994. Journal of Neuroscience Research, 39:506 e

Chen, S.-H. et al. 1994. PNAS, 91:3054.

Sumário da invenção

Um adenovírus compreende um gene que codifica timidina-quinase, e medicamentos que o contêm são úteis para o tratamento de uma cavidade de tumor cerebral. Em particular, a cavidade tumoral é tratada após a administração de gangciclovir ou um composto equivalente. O gene da timidina-quinase será tipicamente o derivado do vírus Herpes Simplex (HSVtk).

Mostra-se que a construção génica adenovírus/timidina-quinase é mais benéfica do que a transferência de genes de retrovírus.

Descrição da invenção

Uma construção da invenção pode ser utilizada para tratar uma cavidade tumoral. O tratamento pode compreender os passos de: (i) administração de um adenovírus compreendendo um gene que codifica uma timidina-quinase, na parede da cavidade tumoral; e (ii) administração de um composto que forma um composto citotóxico quando fosforilado. O composto utilizado no passo (ii) pode ser ganciclovir ou um seu derivado. Este método pode ser utilizado para tratar qualquer cavidade tumoral, preferivelmente uma cavidade de tumor do cérebro, e.g. um glioma maligno. A composição utilizada no passo (i) pode ser administrada repetidamente, preferivelmente em 40 a 80 aplicações separadas. A composição utilizada na presente invenção é preferivelmente formulada sem a adição de proteínas (outras que não as associadas ao adenovírus) . Crê-se que isto é preferível às composições em que albumina é adicionada para reduzir os efeitos de enzimas degradativas sobre os 3

ΕΡ 1 135 513 /PT componentes activos. Preferivelmente, esta composição compreende glicerol como estabilizante. A quantidade de produtos activos que devem ser administrados a um paciente, no uso da invenção, pode ser determinada pelos peritos na especialidade, com base na informação aqui proporcionada e em considerações usuais como a via de administração, a condição a tratar e o seu estado, etc. 0 Exemplo que se segue ilustra a invenção.

Exemplo

Neste Exemplo, compararam-se a segurança e a eficácia da terapia génica com HSVtk mediada por células de empacotamento de retrovirus e mediada por adenovirus, para o tratamento de glioma maligno. No ensaio, a terapia génica com células de empacotamento de retrovirus não melhora a sobrevivência dos pacientes de glioma maligno, em comparação com um grupo de controlo transfectado com lacZ. Estava presente progressão do tumor em todos os pacientes, conforme avaliado por imagens de ressonância magnética (MRI) três meses após a ressecção do tumor e a transferência de genes. A terapia génica com adenovirus, contudo, melhorou significativamente o resultado nos pacientes. Igualmente, em três dos sete pacientes tratados com adenovirus, a MRI indicou que os tumores permaneciam estáveis.

Retrovirus e linha de células de empacotamento de retrovirus

Preparou-se uma linha de células de empacotamento PA317/tk como descrito em Poptani et al, Câncer Gene Ther. 5:101-109 (1998). Resumidamente, subclonou-se ADNc de HSV1-TK de 1,2 kb (McKnight, Nucleic Acid Res. 8:5949-5964 (1980)) no plasmideo retroviral pLXSN (Miller et al, Mol. Cell. Biol., 5:2985-3902 (1986)) para criar o plasmideo pLTKSN. A expressão da HSV1-TK é conduzida por LTR do virus do sarcoma murino de Moloney 5'. O vector contém também um promotor interno de SV40 que conduz um gene de resistência a neomicina (NEO) . A linha celular PA317 foi transfectada com o plasmideo pLTKSN utilizando precipitação com fosfato de cálcio. A linha celular PA317/3.0D5 (PA317/tk) produziu 106 cfu/ml de retrovirus como

ΕΡ 1 135 513 /PT determinado no ensaio de fibroblastos 209F (Ylâ-Herttuala et

Antes das expandidas, de Optimem isentas de e vírus de al, J. Clin. Invest. 95: 2692-2698 (1995)). injecções, as células de empacotamento foram tripsinizadas e diluídas para 109 células/10 ml (Gibco BRL) . Mostrou-se que as células estavam micoplasma, outros contaminantes microbiológicos tipo selvagem.

Produziram-se retrovírus BAG contendo β-galactosidase (lacZ) em (pCRIP. Produziram-se títulos de 6xl05 cfu/ml e utilizaram-se na forma de sobrenadante de cultura não concentrado (DMEM, 0,5% NCS, Gibco).

Adenovirus

Em adenovirus com HSVtk, a cassete de expressão que consiste no elemento promotor e potenciador de citomegalovírus humano (hCMV) - ADNc de 1-TK de HSV - sinal de poliadenilação do vírus símio 40 (SV40) foi subclonada no plasmídeo pAdenogal (Barr et al, Gene Ther., 1:51-58 (1994)) para criar o plasmídeo pAdCMVTK. O pAdCMVTK linearizado e ADN adenoviral sub360 (McClane et al, Hum. Gene Ther. 8:739-746 (1997)) foram co-transfectados em células 293 (ATCC CRL1573) e foi gerado adenovirus recombinante, AdCMVTK, através de recombinação homóloga. O clone do vírus foi purificado através de três ciclos de ensaio de formação de placas fágicas e após cada ciclo a presença da cassete de expressão de TK no genoma do adenovirus foi confirmada por PCR. A preparação em grande escala de AdCMVTK foi realizada em células 293 e o lisado do vírus foi purificado e concentrado em gradiente de CsCl, dialisado e armazenado a -80°C. Determinou-se o título de vírus por ensaio de formação de placas fágicas em células 293. A preparação de adenovirus foi analisada quanto à integridade da cassete de expressão de TK utilizando digestão com enzimas de restrição seguida por análise Southern hlot. A ausência de vírus do tipo selvagem competente para replicação foi confirmada por ensaio citopático em células HeLa (ATCC CCL-2) e A549 (ATCC CC 185). A preparação de vírus foi também testada como isenta de contaminantes microbiológicos e lipopolissacáridos (ensaio de Limulus, Sigma). 5

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Em lacZ, ADNc de β-galactosidase direccionado por adenovírus nuclear sob um promotor de β-actina e um potenciador de CMV, foi clonado na região eliminada EI do genoma adenoviral utilizando recombinação homóloga. Os adenovirus foram concentrados até um titulo de 3 x IO10 pfu/ml por ultracentrifugação. 0 vírus purificado foi recolhido e dialisado com Hepes 5 mM (pH 7,8) e finalmente com Hepes 5 mM (pH 7,8) contendo 20% de glicerol.

Pacientes

Trataram-se quinze tumores em 14 pacientes com terapia génica com HSVtk. Em adição, 7 pacientes de controlo foram transf ectados com gene marcador lacZ de controlo 4-5 dias antes da ressecção. Todos os pacientes tinham uma pontuação de Karnofsky superior a 70. A média de idades dos pacientes era de 51 anos (gama de 20-70 anos) . O tumor foi recorrente em 13 casos (59%). Todos os pacientes receberam corticosteróides e medicação antiepiléptica e utilizou-se terapia de radiação nos tumores de novo.

Operação e transferência de genes

Todos os pacientes foram submetidos a craniotomia e ressecção dos tumores. A ressecção foi tão radical quanto possível ao microscópio. O diagnóstico de glioma maligno foi confirmado por secções congeladas no momento da operação. Após a ressecção dos tumores, injectaram-se células de empacotamento de retrovírus com HSVtk (109 células/10 ml) ou adenovírus (3xl010 pfu/lOml) na parede da cavidade tumoral em quantidades de 0,1-0,3 ml, 10 mm de profundidade, com 30-70 injecções/paciente. O tratamento com GCV (5 mg/kg/d) foi administrado intravenosamente através da veia subclávia duas vezes por dia durante 14 dias. Iniciou-se a medicação 14 dias ou 5 dias após a ressecção dos tumores e a transferência de genes nos pacientes de retrovírus ou adenovírus, respectivamente. O gene da β-galactosidase foi transferido para sete pacientes do grupo de controlo por via de um cateter que foi estereotacticamente inserido no tumor. O cateter foi deixado no lugar até o tumor ser ressecionado por craniotomia. Os vectores de transferência de genes (retrovírus BAG, título de 6xl05 cfu, e adenovírus, título de 3xl08 a 3xl010 pfu) foram 6 ΕΡ 1 135 513 /PT injectados no tumor durante três dias consecutivos, seguindo-se a ressecção dos tumores 1-2 mais tarde. Os pacientes com o gene marcador da β-galactosidase não foram tratados com GCV. Todos os pacientes foram tratados de acordo com a prática clinica Standard com terapia de radiação.

Imagem de Ressonância Magnética

Os pacientes tratados com HSVtk foram seguidos por MRI no primeiro dia pós-operatório, 4, 8 e 12 semanas após a transferência de genes e posteriormente mês sim, mês não. A imagem de MRI foi obtida num 1.5 T Magnetom Vision (Siemens) e consistia em sequências axiais, coronais e sagitais ponderadas a TI (580/14/1 = tempo de repetição/tempo de eco/aquisição) também após meio de contraste (gadopentetatodimeglumina a 0,1 mmol/kg); e sequências ponderadas a turbo-T2 (5400/99/2) e FLAIR (recuperação de inversão atenuada de fluido; TR=9000, TE=119, AC=1). Todas as imagens foram adquiridas com secções de 5 mm de espessura, contíguas, e uma matriz de 256x256. De acordo com a MRI do primeiro dia pós-operatório, a ressecção cirúrgica foi classificada como ressecção total, quando mais de 98% do volume do tumor foi removido; ressecção subtotal, quando mais de 66% mas menos de 98% do volume tumor foi removido, e ressecção parcial, quando menos de 66% do volume do tumor foi removido. De acordo com as MRI de seguimento, classificou-se o comportamento do tumor como: progressivo, quando havia o mais pequeno sinal de novo crescimento do tumor, estável, quando o estado do tumor permaneceu igual, e regressivo, quando o volume do tumor diminuiu.

Análise de amostras de sangue, urina e tecido

Analisaram-se amostras de sangue e urina utilizando métodos de rotina antes da transferência de genes, no primeiro dia pós-operatório e semanalmente durante a hospitalização, excepto para a contagem diferencial de leucócitos que foi medida dia sim, dia não, durante a medicação com GCV. Mediram-se os anticorpos anti-vírus antes e duas semanas após a transferência de genes. Realizaram-se PCR e ensaios ao vírus do tipo selvagem a partir das amostras de plasma e urina antes da transferência de genes e 3, 5, 7 e 21 dias após a transferência de genes. 7

ΕΡ 1 135 513 /PT Ο diagnóstico histológico foi realizado a partir de secções congeladas no momento da operação e confirmado mais tarde com secções em parafina utilizando colorações de hematoxilina-eosina e GFAP (Boehringer). A actividade de proliferação dos tumores foi medida por coloração de Ki67 (Dako). Após a ressecção, os tumores transfectados com lacZ foram analisados por coloração de X-gal como descrito em Puumalainen et al, Hum. Gene Ther., 9:1769-1774 (1998).

Neuropsicologia

Realizaram-se testes neuropsicológicos para determinar as funções cognitivas e a qualidade de vida antes da operação e mês sim, mês não, após o tratamento. A avaliação das funções de memória utilizou a Escala de Memória de Wechsler (WMS), que contém sete subtestes para capacidades de memória de curto prazo, o teste de aprendizagem associado, recordação atrasada, atenção e flexibilidade de processamento mental. A qualidade de vida foi medida de acordo com uma avaliação normalizada de dificuldades de dormir, cansaço, funções da memória, desordens somáticas, humor, funções sensoriais e motoras, tensão, actividade, depressão, irritação, ineficiência e incerteza. Os pacientes transfectados com LacZ não foram submetidos aos testes neuropsicológicos.

Estatística A análise estatística dos resultados de MRI foi realizada com o teste de Kruskal Wallis para SPSS. 0 resultado dos pacientes foi analisado com o teste exacto de Fisher para SPSS. A estatística para as análise laboratoriais e neuropsicológicas foi avaliada com Anova para SPSS.

Resultados A Tabela 1 mostra os resultados das experiências de terapia génica.

Todos os pacientes foram tratados com ressecção dos tumores. Utilizaram-se células de empacotamento de retrovírus (PA317/tk) para sete pacientes e adenovírus (Adv/tk) para sete pacientes. Um paciente (#) recebeu tratamento repetido com 8 ΕΡ 1 135 513 /PT células PA317/tk para dois tumores diferentes. Seis dos casos eram tumores de novo, outros eram recidivas de operação anterior (op), terapia de radiação (rd) ou quimioterapia (ch). 0 tumor estava localizado no lóbulo temporal (temp), occipital (occ), frontal (front) ou parietal (pariet). (Sin) indica o lado esquerdo e (dx) o lado direito. Os anticorpos para o virus foram medidos a partir de sangue periférico antes e duas semanas após a terapia génica. 0 diagnóstico foi confirmado como glioblastoma (gb) em 82% dos pacientes, dois pacientes tinham astrocitoma anaplásico (aa) e dois oligodendroglioma anaplásico (ao). A actividade de proliferação dos tumores foi medida por coloração imuno-histoquímica de ki67. A identidade dos tumores foi confirmada por imunocoloração com proteína ácida fibrilar glial (GFAP). 0 resultado foi medido em meses e (*) indica a morte do paciente. A diferença entre pacientes tratados com retrovírus e adenovírus de acordo com a sobrevivência foi significativa (p<0,05) pelo teste exacto de Fisher. A primeira MRI pós-operatória foi realizada nos dias 1 ou 2 pós-operatórios após a ressecção dos tumores e a terapia génica e a segunda MRI pós-operatória foi realizada 3 meses mais tarde. A ressecção foi total se mais de 98% da massa do tumor foi resseccionada, subtotal se a ressecção foi entre 66-98% e parcial se menos de 66% do tumor foi resseccionado. Nas MRI de seguimento avaliou-se o crescimento como progressivo (prog) se havia o mínimo sinal de novo crescimento do tumor. A diferença no crescimento progressivo entre pacientes tratados com retrovírus e adenovírus de acordo com os resultados de MRI foi significativa (p<0,05); teste de Kruskal Wallis. NA = não analisado.

As transferências de genes foram clinicamente seguras tanto com vectores retrovirais como adenovirais, não produzindo efeitos adversos graves. Contudo, aumentaram os ataques epilépticos em dois pacientes que receberam adenovírus embora ambos estes pacientes tivessem tido anteriormente experiências de sintomas epilépticos. Um paciente teve hemiparese parcialmente reversível e afasia como complicação da ressecção do tumor frontal bifocal. Ela teve terapia génica com células de empacotamento de retrovírus combinada com a 9 ΕΡ 1 135 513 /PT ressecção do tumor. Dois pacientes tiveram reacções de febre após a transferência de genes mediada por adenovírus com aberturas ventriculares. A temperatura corporal aumentou até 39,0°C, mas as reacções foram de curto prazo e reversíveis sem quaisquer sintomas remanescentes. Não foram observadas alterações maiores nas medições laboratoriais de rotina. Apenas um paciente teve uma leucopenia moderada e reversível durante o tratamento com GCV sem sintomas. Os anticorpos para o adenovírus aumentaram marcadamente em 3 de 7 pacientes tratados com Adv/tk; dois tiveram também uma reacção de febre. Não houve alterações significativas nas funções renal e hepática. Não foi detectada entrega sistémica de vírus nas amostras de plasma e urina utilizando PCR e ensaios ao vírus de tipo selvagem. As amostras post-mortem de um paciente foram analisadas por PCR, que mostrou que o tumor e todos os outros tecidos analisados eram negativos para o transgene 6 meses após a transferência de genes.

Os resultados de MRI de seguimento não mostraram efeito, ou mostraram um efeito muito limitado, para a terapia génica com células de empacotamento de retrovírus. Todos os pacientes tinham doença progressiva três meses após a ressecção dos tumores e a terapia génica. Para a terapia génica mediada por adenovírus, os resultados de MRI foram significativamente melhores (p<0,05) com doença estável em 3 de 7 pacientes, três meses após o tratamento.

Em comparação com o grupo de controlo tratado com lacZ, a sobrevivência dos pacientes no grupo de retrovírus não apresentou qualquer melhoria. A diferença entre o resultado de pacientes tratados com retrovírus e adenovírus foi significativa (p<0,05). 10

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Tabela 1.

Pac. na . Idade/ Sexo Dg Localiz. do tumor Ki67 GFAP Tratamento prévio Terapia genica Ab do virus lfl MEU pós—op. 2fl MEU pós—op. Meses de sobrev 1 . 6 7 /M gb occ dx 20% + - Retro/LacZ rubéola NA NA 3* 2 . 37/M gb front sin 20% + op+rad+ch Retro/LacZ - NA NA 10* 3 . 63/F gb temp dx 25% + - Adv/LacZ - NA NA 7* 4 . 44/F ao front sin 25% + op+rad Adv/LacZ - NA NA 5 * 5 . 45 /M gb temp sin 40% + - Adv/LacZ - NA NA 12* 6 . 32/M ao front dx 14% + op+rad+ch Adv/LacZ adeno 64 NA NA 10* 7 . 39/F aa temp dx 15% + op+rad Adv/LacZ - NA NA 11* 8 . 3 6 /M gb temp sin 15% + - PA317/tk - parcial prog 13* 9.# 64/M gb occ sin 14% + - PA317/tk - subtotal prog - 10 . 44/F gb temp dx 15% + op+rad PA317/tk - subtotal prog 7* 11.# 65/M gb occ sin 14% + op+rad PA317/tk - subtotal prog 8* 12 . 45 /F gb temp dx 20% + op+rad PA317/tk - subtotal prog 9* 13 . 7 0 /F gb front sin, muitif 25% + - PA317/tk adeno 64 subtotal prog 4* 14 . 20/F gb temp et pariet dx 30% + op+rad PA317/tk - subtotal prog 7* 15 . 56/M gb temp et pariet dx 25% + op+rad PA317/tk - subtotal prog 4* 16 . 49/F gb temp dx 10% + op+rad Adv/tk adeno 64 parcial prog 12* 17 . 6 0 /M gb temp dx 20% + - Adv/tk - subtotal prog 10 18 . 61/M gb pariet sin 30% + - Adv/tk adeno>256 parcial prog 9 19 . 3 9/M aa front sin 40% + op+rad Adv/tk adeno 128 parcial estáv. 8* 20 . 65/M gb parieto-occ dx 20% + - Adv/tk - total estáv. 8 21 . 59/F gb frontopariet sin <1% + op+rad Adv/tk - subtotal estáv. 7 22 . 56/M gb pariet sin 20% + op+rad Adv/tk - subtotal prog a 6 §

Lisboa

Claims (6)

1. ΕΡ 1 135 513 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um adenovirus possuindo um gene de timidina-quinase funcional, para o fabrico de um medicamento para tratamento de uma cavidade de tumor do cérebro resultante da ressecção do tumor.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o adenovirus está isento de proteínas outras que não as naturalmente associadas ao adenovirus.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o gene de timidina-quinase é o gene de timidina-quinase do vírus Herpes Simplex.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o medicamento compreende um estabilizante.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o estabilizante é glicerol.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o tumor do cérebro é um glioma maligno. Lisboa,