KR100375183B1 - 사이클린 ｇ 또는 그것의 유전자를 이용한 자궁근종 진단방법 및 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클린 G 염기서열, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체, 이들의 단편, 이들에서 유래되는 펩타이드 및 이들에 대한 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나를 이용하여 자궁근종을 진단하는 방법 및 이에 이용할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.

Description

사이클린 Ｇ 또는 그것의 유전자를 이용한 자궁근종 진단 방법 및 진단 키트 {Leiomyoma diagnosis method using cyclin G and a gene thereof and a diagnosis kit useful therefor}

본 발명은 자궁근종의 진단 방법 및 그것에 사용되는 진단 키트에 관한 것이다.

자궁근종(leiomyoma)는 여성에게 가장 빈번한 종양 중의 하나로 자궁절제의 주요 원인이다. 30세 이상의 여성 중 20%가 이런 종양을 가지고 있는 것으로 보고되고 있으며, 다른 질병에 의해 자궁절제를 한 환자들의 77% 정도가 자궁근종을 가지고 있는 것으로 미루어 보아 실제로 그 빈도는 더 높을 것으로 추측된다. 자궁근종 환자에게서 유전자 재배열, 전이, 삭제 등이 관찰되며, 자궁근종의 크기와 유전적인 결함 사이에 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 이런 사실은 종양내에유전적인 결함이 먼저 있은 후에 종양이 진행된다는 것을 시사한다. 그러나, 어떤 유전적인 결함이 종양을 진행시키는지에 대해서는 알려진 바가 없다. 최근 연구에 의하면 정상 자궁근육과 자궁근종 사이에는 유전자 발현의 차이가 있다는 사실이 보고되고 있다(Anderson, J. and Barbieri, R.L. (1995) J. Soc. Gynecol. Invest. 2:663-672). 이러한 비정상적인 유전자 발현이 자궁근육의 분화가 잘못 조절되고 있음에 기인한 것이라고 보고되고 있으며, 특히 임신시에 높은 발현을 보이는 에스트로젠에 의하여 조절되는 유전자들이 과량으로 자궁근종에서 발현된다는 것이 보고되었다.

한편, 사이클린 G는 세포주기를 조절한다고 알려진 사이클린 계열의 단백질 일종으로 최근 그 염기서열이 밝혀졌다(GeneBank accession No. D78341). 사이클린 G는 다른 사이클린 단백질과 몇 가지 다른 점을 가지고 있으며, p53 단백질에 의해 발현이 유도되는 유일한 사이클린이다. p53 단백질은 핵 내의 전사조절인자로 정상세포 내에서 세포의 성장과 분화를 적절히 조절하지만 돌연변이가 일어나면 세포의 성장이 비정상적으로 일어나 암화로 발전하게 된다. 종양억제유전자인 p53에 의해 사이클린 G의 발현이 유도된다는 사실은 이 사이클린이 p53이 조절하는 세포성장조절에 관여하고 있음을 시사한다. 다른 사이클린과의 높은 유사성에도 불구하고 사이클린 G와 결합하여 세포 주기를 조절할 것으로 예측되는 사이클린-의존성 카이네이즈(cyclin-dependent kinase)가 보고된 바 없으며, 생물학적 기능에 대해서도 밝혀진 바가 없다. p53이 조절한다고 알려진 다른 단백질과는 달리, 사이클린 G는 종양을 억제하기보다는 세포성장을 촉진하는 역할을 담당하고 있는 것으로 보고되고 있다(Smith, M.L. et al. (1997) Exp. Cell Res. 230:61-68).

본 발명의 목적은 자궁근종 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 자궁근종 진단용 키트를 제공하는 것이다.

도 1은 사람 자궁근종 조직에서의 사이클린 G의 웨스턴 블롯 분석 결과이다.

도 2은 사람 자궁근종 조직에서의 사이클린 G의 노던 블롯 분석 결과이다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 언급한 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

'아미노산 서열', '폴리펩타이드' 또는 '단백질'은 완전한 천연의 아미노산 서열로 한정되는 것은 아니다.

'염기서열의 변이체'는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 사이클린 G의 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기서열을 의미한다.

'아미노산 서열의 변이체'는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 사이클린 G에서 유래된 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.

'사이클린 G 유도체'는 사이클린 G 염기서열이 그것이 코딩하는 단백질의 생물학적 특성은 그대로 유지하면서 화학적으로 변형된 것을 의미한다.

사이클린 G 유전자는 정상 자궁근육에는 낮은 수준의 발현을 보이는 반면 자궁근종에서는 그 발현이 현격히 증가한다. 이와 같은 사이클린 G 유전자 발현특성을 이용하여 자궁근종 진단에 이용할 수 있다.

자궁근종을 가진 환자에게서 종양 조직과 정상조직을 분리하여 사이클린 G의 단백질 수준을 조사하여 보았을 때에 정상조직에서는 낮은 수준의 발현을 보이는 반면 종양조직에서는 높은 수준의 사이클린 G를 관찰할 수 있다. 그러나, 또 다른 종양세포인 간암세포나 류케미아 세포에서 사이클린 G의 양은 그리 많지 않았다.

또한 자궁근종을 가진 환자에게서 종양 조직에서 분리한 RNA와 정상 조직에 분리한 RNA에서 사이클린 G 유전자의 발현 수준을 조사하여 보았을 때에 정상조직에서는 낮은 수준의 발현을 보이는 반면 종양조직에서는 높은 수준의 사이클린 G mRNA를 관찰할 수 있다.

본 발명은 사이클린 G 염기서열, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체, 이들의 단편, 이들에서 유래되는 펩타이드 및 이들에 대한 항체로 구성되는 하나를 이용하여 자궁근종을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 진단 방법은, 검체의 자궁 조직을 분리하고, 분리한 조직을 사이클린 G 발현을 검출할 수 있는 제제로 처리하여 사이클린 G의 발현 정도를 검사하고, 건강한 조직에서의 사이클린 G 발현 정도와 비교하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 진단 방법에서 사이클린 G 발현을 검출할 수 있는 제제는 예를 들어 사이클린 G 유전자, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체 및 이들의 단편 등이다. 이러한 제제를 사용하여, 예를 들어 하이브리다이제이션에 의해 검체 조직 또는 건강한 조직에서 사이클린 G의 발현 정도를 측정할수 있다.

본 발명에 따른 진단 방법에서 사이클린 G의 또 다른 예는 사이클린 G 유전자, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체 또는 이들의 단편에서 유래되는 펩타이드에 대한 항체이다. 이러한 항체를 이용하여 검사하고자 하는 개체의 조직에서 사이클린 G의 발현 정도를 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 항체는 상용화된 것을 사용하거나, 사이클린 G 염기서열, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체 또는 이들의 단편에서 유래되는 펩타이드를 사용하여, 이 분야에서 널리 알려진 방법에 따라 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체로 만들 수 있다. 제조된 항체는 자궁근종이 있는 개체를 대상으로 면역반응성을 스크리닝한 후 사용하는 것이 바람직하다.

따라서 본 발명에 따른 진단 방법의 구체적인 한 예는 검체의 자궁 조직으로부터 테스트할 조직을 분리하고, 상기 분리한 조직에 사이클린 G 단백질을 검출할 수 있는 제제, 예를 들어 사이클린 G 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 상기 분리한 조직에서의 사이클린 G의 발현 정도를 검사하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 진단 방법의 구체적인 또다른 예는 검체의 자궁 조직으로부터 테스트할 조직을 분리하고, 상기 분리한 조직에 사이클린 G mRNA와 특이적으로 하이브리디제이션할 수 있는 누클레오타이드 서열을 제공하고, 상기 분리한 조직에서 사이클린 G mRNA 발현 정도를 검사하는 것으로 이루어진다.

본 발명에서 테스트 조직에서의 사이클린 G 발현 정도는 건강한 조직에서의 사이클린 G 발현 정도와 비교함에 의해 결정될 수 있다.

또한 본 발명은 자궁근종의 진단을 위한 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 진단 키트는 사이클린 G의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제로 이루어진다. 본 발명의 진단 키트에서 사이클린 G의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제는 예를 들어, 사이클린 G 유전자, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체 및 이들의 단편 등이다. 또 다른 예로는, 사이클린 G 유전자, 그것의 변이체, 그것의 유도체, 이들의 대립형질적 변이체 또는 이들의 단편에서 유래되는 펩타이드에 대한 항체이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 사람 자궁근종 조직에서 사이클린 G의 발현양상조사

Burnette, W. N.에 의해 개발된 웨스턴 블롯 방법 (Burnette, W. N. (1981)Anal. Biochem.128:195-203)을 이용하여 자궁근종 환자로부터 조직을 분리하여 사이클린 G의 발현정도를 조사하였다.

7인의 환자에 대하여, 자궁에서 자궁근중 조직과 정상 조직을 분리하였다. 단백질 추출 완충액(50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.25% 소디움 디옥시콜레이트, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mg/ml leupeptin)를 이용하여 각 조직으로부터 단백질을 분리한 후, 동량의 단백질(50 μg)을 13.5%의 폴리아크릴아마이드 젤에서 환원 조건으로 전기영동하였다. 젤 내의 단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore)에 전이시킨 후, 사이클린 G에 대한 항체(Santa Cruz)를 반응시켰다. 반응하지 않은 항체를 0.1% Tween-20이 포함된 PBS로 씻어준 다음, 서양고추냉이 퍼옥시데이즈가 붙어 있는 2차 항체로 반응시켰다. 0.1% Tween-20이 포함된 PBS로 씻어 비특이적인 반응을 제거한 후, Enhanced Chemiluminscence(ECL, Amersham)를 이용하여 특이적인 항체반응을 조사하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이 정상적인 자궁근육 샘플에 비교하여 자궁근종에서는 사이클린 G의 발현이 현격히 증가하였다.

다른 종양에서의 사이클린 G 발현을 알아보기 위하여, 백혈병 세포인 HL 60과 간암세포인 SNU 476을 사용하여 동일한 실험을 하였다. 사이클린 G의 과다발현 현상은 다른 종양인 간암세포나 백혈병 세포 등에서는 관찰되지 않았다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

실시예 2. 사람 자궁근종 조직에서 노던 블롯에 의한 사이클린 G의 발현양상조사

사이클린 G 유전자의 사람 자궁조직 내 발현을 조사하기 위해 사람의 자궁조직으로부터 총 RNA를 추출하여 노던 블롯 하이브리디제이션을 수행하였다 (Sambrook, J. 등, (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). 자궁근종 환자 5명으로부터 추출된 총 RNA(30 μg)가각각 결합되어 있는 멤브레인에 [α-³²P]dCTP로 표지한 사이클린 G의 DNA 프로브로 하이브리디제이션시켜 이를 24시간 반응시킨 후 2X SSC, 0.1 % SDS 용액에서 상온에서 10분간, 0.1X SSC, 0.1% SDS 용액에서 50 ℃에서 30분간 세척하였다. 세척한 멤브레인을 X-선 필름에 1주일간 -70℃에서 노출시킨 뒤 현상하였다. RNA 추출이 제대로 수행되었음을 확인하고 또한 RNA 로딩량이 동일하다는 것을 확인하기 위하여 각각의 총 RNA로부터 18S 라이보조말 RNA 양을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 사이클린 G의 발현은 정상조직과 자궁근종 사이에 큰 차이를 보였으며, 사이클린 G mRNA는 환자의 정상 조직에서보다 자궁근종 조직에서 분리한 RNA에서 과다 발현을 보였다.

본 발명에 의해 간단하게 자궁근종을 진단할 수 있다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 사이클린 G 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁근종 진단용 키트.
5. 삭제
6. 사이클린 G를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁근종 진단용 키트.