JPH05246895A - ウイルスの標的となる新生細胞の破壊 - Google Patents

ウイルスの標的となる新生細胞の破壊

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JPH05246895A
JPH05246895A JP3236166A JP23616691A JPH05246895A JP H05246895 A JPH05246895 A JP H05246895A JP 3236166 A JP3236166 A JP 3236166A JP 23616691 A JP23616691 A JP 23616691A JP H05246895 A JPH05246895 A JP H05246895A
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ロバート・エル・マートゥーザ
Xandra O Breakfield
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、新生細胞を選択的な細胞死の標的
とすることができる遺伝子産物の遺伝子を含有するレト
ロウイルスベクターに該新生細胞を感染させることによ
って該新生細胞を選択的に死滅させる方法を提供するも
のである。 【効果】 本方法を用いて、特に神経系腫瘍を効果的に
治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルスおよびウイル
スベクターを用いる新生細胞の処置方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】新形成は、細胞の増殖および分化を調節
する正常な制御機序が損なわれて進行性の増殖の結果に
なる過程である。新形成中には、細胞の転換および増殖
を制御することに特徴的な欠如が存在する。この制御の
欠如は、腫瘍が進行的に増殖して身体の生命維持に必要
な領域において大きくなり、ある場所を占めるようにな
る原因となる。この腫瘍が周囲の組織に侵入し、遠くの
部位に移送されると、この腫瘍の性向は個体を死に至ら
しめるものとなろう。
【０００３】米国における全個体の１／３には癌が現れ
る(1990年のAmerican Cancer Society Yearly Outloo
k)。これら患者の５年間生存率は、この疾患の普及、早
期診断および治療の結果としてほぼ５０％まで上昇した
(1990年のAmerican Cancer Society Yearly Outlook)。
しかし、癌はこの国における死の原因として心臓疾患に
次いで第２の位置を保っている(1990年のAmerican Canc
er Society Yearly Outlook)。今年に死亡する米国人の
ほぼ２０％は癌による死となろう(1990年のAmerican Ca
ncer Society Yearly Outlook)。これら死の半分は、３
種類の最もありふれた癌(肺癌、乳癌および結腸癌)によ
るものであろう。
【０００４】最近になって癌治療に急速な進展が見られ
た。新しい治療法が開発されつつあるが、ほとんどの癌
種を治療するための改良法がなお求められている。正常
細胞に有害作用を及ぼすことなく癌細胞を優先的に死滅
させることが癌療法の望ましい目標である。過去におい
て、これが種々の方法を用いて為されてきた。これらの
方法には、化学物質の投与、化学療法、照射、放射療
法、および手術が含まれる。
【０００５】放射療法は、局在の癌の制御に用いられる
局所形態の治療法である[Devita,V.T., 「Harrison's Pr
inciples of Internal Medicine」, Braunwaldら編，McG
raw-Hill Inc., New York, p.431-446 (1987)を参照]。
放射療法は、悪性疾患の一部が照射による損傷に比較的
感受性が高いことに基づいている。この感受性の相違
は、正常細胞の方が新生細胞に比べて細胞間修復の能力
が高いこと、および正常器官が部分的にのみ損傷を受け
たときにはそれが十分に機能し続けることができること
に基づいている。周囲の組織がある腫瘍の照射量の２倍
に耐えることができるときに、この腫瘍は放射感受性で
ある。他方、腫瘍の一部は放射療法で治療することがで
きない。両方の肺が広範囲に関係している癌は、周囲の
肺組織の放射感受性がなお一層高くなっているので放射
療法によって効果的に治療することができない[Devita,
V.T., 「Harrison's Principles of Internal Medicin
e」, Braunwaldら編，McGraw-Hill Inc., New York, p.4
31-446 (1987)を参照]。
【０００６】手術はほとんどの早期癌の第１の治療法で
あると今なお考えられている[Devita,V.T., 「Harrison'
s Principles of Internal Medicine」, Braunwaldら
編，McGraw-Hill Inc., New York, p.431-446 (1987)を
参照]。しかし、ほとんど腫瘍は手術可能であるが完全
には切除することができない。切除可能に見える腫瘍の
一部は、腫瘍領域の外側に微細な転移疾患を有してい
る。これが、最初の発生部位の近くに癌の再発を導く。
あるレベルの転移を示す癌の全ては、手術によって効果
的に治療することができない。他の型の局所療法(非全
身性)が検討されている。これらには、局所低体温[Salo
manら, J.Neuro-Oncol. 1: 225-236 (1983)]、光力学療
法[Chengら, Surg.Neurol. 25: 423-435 (1986)]、およ
び間隙照射[Gutinら, J.Neurosurgery 67: 864-873 (19
87)]が含まれる。現在まで、これらの治療法は限られた
成功しか修めていない。
【０００７】放射療法および手術は、手術法または高用
量の放射療法が適用可能な身体の特定の領域の腫瘍塊を
減少させる方法を提供する。ほとんどの癌患者に特徴的
に存在する広範囲に広がった腫瘍細胞または循環腫瘍細
胞を破壊するのに適用できる方法は存在しない。これ
が、化学療法などの癌の全身治療法を開発することの刺
激となっている。広く使用されるようになっているが、
化学物質の使用はほとんどの癌種の治療においてその効
果が限定されていることがわかっている。癌の治療に細
胞毒性物質を使用することの欠点の１つは、それらの重
い副作用である。これらには、悪心、嘔吐、ＣＮＳ低
下、局所痛、骨髄低下、出血、腎臓損傷、低血糖および
高血糖、ならびに過敏反応が含まれる。他の欠点は、こ
れらが急速に分裂している細胞に対してのみ効果的であ
るということである。比較的最近の化学療法の研究は、
毒性物質を癌細胞それ自体に向けることにある。これ
は、実験的には、正常細胞よりも腫瘍細胞に対して高い
親和性を有する抗体または毒性分子のいずれかに化学療
法薬物を結合させることによって行われる。これらの指
向性の毒性薬包は今なお開発の初期臨床状態にあり、市
販のものを利用することができない。
【０００８】ある種の癌、例えばヒト脳に発生する最も
ありふれた１次腫瘍である神経膠腫は、現在の治療様式
では解決されない。手術、化学療法および放射療法を行
っても、最もありふれた神経膠腫であるグリオーマ芽腫
はほとんど全てが致死性である[Schoenberg,B.S., 「神
経系腫瘍の疫学」，Oncology of the Nervous System
中, M.D.Walker編, Boston, MA, Martinus Nijhoff (19
83); Levinら, 「中枢神経系の新生物」, 46章, pp.1557
-1611, Cancer:Principles and Practice of Oncology
中, 第2巻, 第3版, De Vitaら編，Philadelphia, Lippi
ncott Press (1989)]。従って、正常な脳細胞に害を与
えることなく神経膠腫を選択的に破壊する方法を開発す
ることが求められている。通常、このような治療法は、
全ての種類の新生細胞を選択的に破壊するために普遍的
に使用しうる可能性を有している。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新生細胞を
選択的に死滅させるための組成物および方法を提供する
ものである。特に、レトロウイルスベクターを用いて新
生細胞において遺伝子または遺伝子産物の発現を目的と
させる。遺伝子は、その遺伝子産物が腫瘍細胞の選択的
な死滅を目的とすることができるように選択する。この
方法は、特に神経系腫瘍の治療にその用途を有する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、新生細胞を選
択的に死滅させることに関する。新生細胞を選択的な細
胞死の対象にすることができる遺伝子産物を発現する遺
伝子を担持するレトロウイルスベクターを利用する。新
生細胞とは、分裂している細胞、通常は急速に分裂して
いる細胞を意図するものである。本発明の目的において
は、新生細胞に腫瘍、新生物、癌、肉腫、白血病、リン
パ腫などの細胞が含まれる。これらには、星状細胞腫、
乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣細胞腫、神経鞘
腫、神経線維肉腫、グリア芽腫などが含まれる。特に本
発明に関係している新生細胞は脳腫瘍の新生細胞であ
る。成体の脳腫瘍は独特であり、これらは実質的に分裂
しない細胞のバックグラウンドの中で分裂細胞の塊を構
成している。即ち、本発明はこの代謝上の相違を利用し
て標的接近法を展開し、新生細胞を選択的に死滅させる
ものである。本発明は、良性および悪性の両新生細胞を
選択的に死滅させるために用いることができる。
【００１１】本発明のレトロウイルスベクターは分裂細
胞のゲノム中にのみ組込まれうる。従って、このベクタ
ーは分裂細胞を選択的な標的とするための有用な担体を
提供する。レトロウイルスベクターは宿主範囲に限定が
なく、既に多数の別種細胞を感染させるのに成功してい
るので、これらのベクターは別の利点をも与える。例え
ば、Cepko,C., 「レトロウイルスベクターによる神経細
胞の系統分析および永久化」, Neuromethods, Vol.16,
pp.177-218, Clifton, NJ, The Humana Press,Inc. (19
89); Friedmann,T., Science 244: 1275-1281 (1889)を
参照。レトロウイルスベクターは当分野で一般によく知
られている。Breakfieldら[Molec.Neuro.Biol. 1: 339
(1987)]およびShihら[Vaccines 85, Cold Spring Harbo
r Press, Cold Spring Harbor, New York, pp.177-180
(1985)]を参照。さらに、同時係属の米国特許出願Ｎo.0
7/304,619および07/508,731は単純疱疹ウイルス発現ベ
クターに関係している。これら出願の開示は参考として
本明細書中に組入れられる。これらの出願は、レトロウ
イルスベクターの構築および使用についてさらに詳細な
情報を与える。
【００１２】上に記されているように、通常、本発明の
レトロウイルスベクターは複製-欠損であり、レトロウ
イルスＲＮＡのパッケージングに必要なタンパク質をコ
ードしているレトロウイルス配列を含んでいるが自身の
ＲＮＡをパッケージングすることができないトランスフ
ェクションされたセルラインによって感染性レトロウイ
ルス粒子にパッケージングされうる。Mannら[Cell 33:
153-159 (1983)]；DanosおよびMulligan[Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 85:6460-6464 (1988)]を参照。レトロウイル
スおよびそれから導かれたベクターは宿主細胞ゲノム中
に組込まれるので、これらの配列は全ての娘細胞に伝達
される。このレトロウイルスの特徴が、例えば神経系の
細胞系統を追跡するのに用いられて成功している[Price
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 156-160 (1987); Lusk
inら, Neuron 1: 635-647 (1988); WalshおよびCepko,
Science 241: 1342-1345 (1988)]。
【００１３】レトロウイルスベクターによって新生細胞
中に移すための遺伝子は、通常は宿主新生細胞における
遺伝子産物の発現によって宿主細胞を標的とするような
遺伝子から選ばれる。「遺伝子産物」とは広く特定の遺
伝子によってコードされているタンパク質を指す。しか
し、本発明の目的に対しては、遺伝子の転写産物、特に
アンチセンスＲＮＡとして用いるための産物も遺伝子産
物の中に含まれる。本ベクターの標的となる宿主細胞
は、ウイルスが感染して所望の遺伝子産物を発現するよ
うな細胞である。従って、宿主細胞はレトロウイルスベ
クターに感染する新生細胞からなる。
【００１４】この点に関して、有用な遺伝子産物の１例
には、腫瘍の位置決定のために利用することができるイ
メージング化合物が含まれる。従って、このレトロウイ
ルスは、新生増殖の位置および程度を診断するための手
段として利用される。例えば、Glatsteinら[Int.J.Radi
at.Oncol.Biol.Phys. 11: 299-314 (1985)]を参照。
【００１５】遺伝子産物それ自体が選択的に細胞を死滅
させることができるような遺伝子も選ばれる。例えば、
この遺伝子産物は複製タンパク質などの必須の細胞タン
パク質のアンチセンス核酸からなっていてもよい(これ
は、宿主細胞がさらに増殖および分裂できないようにす
る)。アンチセンス調節については、Rosenbergら[Natur
e 313: 703-706 (1985)]; Preissら[Nature 313: 27-32
(1985)]; Melton[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 144-14
8 (1985)]; IzantおよびWeintraub[Science 229: 345-3
52 (1985)]; KimおよびWald[Cell 42: 129-138 (198
5)]; Pestkaら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 7525-7528
(1984)]; Colemanら[Cell 37: 683-691 (1984)]; およ
びMcGarryおよびLindquist[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
3: 399-403 (1986)]が開示している。
【００１６】細胞増殖を遅くするのに有用なその他の遺
伝子には、腫瘍抑制遺伝子、細胞増殖を抑制する転写因
子をコードしている遺伝子、細胞によって放出される毒
性タンパク質などが含まれる。例えば、ＥＧＦリガンド
と結合させた毒素との融合タンパク質を開示しているHe
inbrookら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 4697(1990)]を
参照。毒素遺伝子も、例えばBarkerら[Gene 86: 285-29
0 (1990)]; Itoら[Microb.Pathog. 8: 47-60 (1990)];
Gannonら[J.Gen.Microbiol. 136: 1125-1136 (1990)]が
開示している。また、細胞増殖特性を変えるか、または
細胞増殖を変調させる遺伝子、例えば網膜芽腫のＲb遺
伝子などの腫瘍抑制遺伝子[Huangら, Science 242: 156
3-1566 (1988)]または結腸癌のｐ５３遺伝子[Bakerら,
Science 249: 912-915 (1980)]を挿入することもでき
る。他の抑制または変調遺伝子を用いることもできる。
【００１７】遺伝子産物が宿主細胞をさらに抗原性にす
るように作用する遺伝子も本発明において利用される。
この抗原効果は、宿主細胞の表面に新規な抗原を導入し
て腫瘍を外来と認識する免疫系を増強することによって
達成することができる。新規抗原の宿主細胞表面への導
入は細胞の異種化と呼ばれる[Austinら, Ad.in Cancer
Res. 30: 301-345 (1979); Kobayashiら, Ad.in Cancer
Res. 30: 279-299 (1979)]。任意の非ヒト表面抗原を
用いることができ、これらにはArakiら[Gene 89: 195-2
02 (1990)]; Takleら[Mol.Biochem.Parasitol. 37: 57-
64 (1989)]; Raneyら[J.Virol. 63: 3919-3925 (198
9)]; Tondravi,M.M.[Curr.Genet. 14: 617-626 (198
8)]; およびMiyandharaら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:
1-5 (1983)]に開示されているものが含まれる。
【００１８】また、新生細胞における非ヒトあるいは独
特の表面抗原の発現を利用し、次いでラベルした抗体と
結合させることによって、そのような新生細胞の位置決
定をすることができる。例えば、Le Doussalら[Cancer
Res. 50: 3445-3452 (1990)]; Palabricaら[Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 86: 1036-1040 (1989)]; Berendsら[Canc
er Immunol.Immunother. 26: 243-249 (1988)]; および
Weltら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 4200-4204 (198
7)]を参照。
【００１９】別法では、遺伝子産物が分裂細胞の条件的
死滅機序を提供するように遺伝子または暗号配列を選択
することもできる。この方法においては、特定のタンパ
ク質の発現とそれに続く処理が新生細胞を死滅させるの
に有効である。この後処理には化学的および物理的処理
が含まれる。化学的処理のための物質には、遺伝子産物
と反応して宿主細胞を死滅させる酵素あるいはその他の
化合物の使用が含まれる。物理的な処理には、細胞を照
射、ＵＶ光などに付すことが含まれる。
【００２０】例えば、単純疱疹ウイルスＩ型(ＨＳＶ-
１)のチミンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子はこのような分裂細
胞の条件的死滅機序を与える。ＨＳＶ-１のＴＫを用い
ることの選択的利点は、この酵素が哺乳動物ＴＫよりも
ある種のヌクレオシド類似体、例えばアシクロビア(acy
clovir)、ガンシクロビア(gancyclovir)およびＦＩＡＵ
などにさらに高い親和性を有しているということに由来
する[McLarenら,「HerpesVirus and Virus Chemotherap
y」, R.Kono編, pp.57-61, Amsterdam, Elsevier(198
5)]。これらの薬物はヌクレオチド様の前駆体に変換さ
れて複製細胞のＤＮＡ中に導入され、こうしてゲノムの
完全性を破壊して最終的に細胞死に導く。ＴＫの条件的
毒性を利用していくつかの研究が行われ、以下のところ
で成功している：トランスジェニックマウスの発生研究
において[Borrelliら, Nature 339: 538-541 (1989); H
eymanら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 2698-2702 (198
9)]、培養細胞における非相同の組換え現象に対する選
択マーカーとして[Capecchi,M.R., Trends in Genetics
5(3):70-76 (1989)]、野生型疱疹ウイルスを保持する
細胞を死滅させるために[CoreyおよびSpear, N.Engl.J.
Med. 314:686-691(1986); CoreyおよびSpear, N.Engl.
J.Med. 314:749-756 (1986)]、およびＴＫ活性を欠く疱
疹ウイルス突然変異体の選択に[Coenら, Science 234:5
3-59 (1986)]。
【００２１】また、この遺伝子産物は、宿主細胞を放射
感受性にして照射による死滅を一層受け易くする化学物
質またはタンパク質をコードしていてもよい。即ち、後
に照射に付すと宿主細胞が選択的に死滅する。例えば、
Snydermanら[Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg. 112:
1147-1150 (1986)]；およびSealyら[Cancer 54: 1535-1
540 (1984)]を参照。他の方法には、化学療法物質の標
的性を改善するための腫瘍特異的な免疫コンジュゲート
の開発に関連した、細胞表面の抗原性マーカーの選択的
移転が含まれる[Reisfeld,R.A.,「Molecular Probes Tec
hnology and Medical Applications」,Albertini,A.ら,R
aven Press,New York(1989)を参照]。
【００２２】目的の遺伝子が当分野で既知の任意の方法
で修飾されていてもよいことは理解されよう。例えば、
この遺伝子は異種の調節領域の支配下に置かれていてよ
く、これにはウイルスプロモーター、新生細胞もしくは
腫瘍特異的なプロモーターまたはコントロール要素の使
用が含まれる。このようにして、遺伝子産物を特定の細
胞型にさらに標的化する。このような発現ベクターの構
築方法は当分野で既知である。
【００２３】目的の細胞をレトロウイルス感染させるた
めの方法は当分野で一般に知られている。通常は、ウイ
ルスを新生増殖部位またはその近くに注射する。ほとん
どの場合、標的細胞を感染させ、死滅させる治療学的有
効量でウイルスを供する。注射用には、通常、約１０1
〜約１０10プラーク形成単位(ＰＦＵ)の範囲の濃度でウ
イルスを供し、一般的には約５ｘ１０4〜約１ｘ１０6Ｐ
ＦＵを供し、さらに一般的には約１ｘ１０5〜約４ｘ１
０5ＰＦＵを供するが、この範囲は変わることもある。
別法では、パッケージング・セルラインを腫瘍中または
その近くに移植してウイルスの一層長く永続的な供給源
を得てもよい。
【００２４】このレトロウイルスの選択的死滅化および
毒性遺伝子の放出を、ヘルパーウイルスとの同時感染に
よって増強することができる。即ち、ヘルパーウイルス
が遺伝子放出を高める。このようにして、レトロウイル
スベクターのウイルス粒子を調製するためのパッケージ
ング・セルラインをヘルパーウイルスと同時感染させる
ことができる。次いで、パッケージング細胞またはウイ
ルス接種物を宿主の感染部位またはその近くに注射する
[Cepko,C.(1989)、上記; Rosenbergら，Science242: 157
5-1578 (1988); およびMannら, Cell 33: 153-159 (198
3)を参照]。このようなヘルパーウイルスには、エコト
ロピック(ecotropic)野生型レトロウイルス、例えばＭo
ＭＬＶが含まれる[Danosら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5: 6460-6464 (1988); Cepko,C.,「Neuromethods」,Vol.1
6, Molecular NeurobiologicalTechniques, Boultonら
編, Clifton, NJ: Humana (1989); およびMannら, Cell
33: 153-159 (1983)を参照]。
【００２５】ヘルパーウイルスを利用するため、パッケ
ージング系統(ライン)またはレトロウイルスベクター感
染系統を引き続いて培養物中の野生型ウイルスに感染さ
せ、そしてこれら細胞を移植することができる[Rosenbe
rgら, Science 242: 1575-1578(1988)およびWolffら,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9011-9014(1989)を参照]。パ
ッケージング細胞を、約０.１〜約２０のＭＯＩの範囲
のヘルパーに感染させる。毒性物質に対する腫瘍細胞の
感受性をヘルパーウイルスを利用して増強する。このヘ
ルパーウイルスは、レトロウイルスベクターに感染した
細胞をパッケージング・セルラインに変える。ヘルパー
ウイルスによる同時感染によって、本発明のレトロウイ
ルスベクターは、腫瘍細胞が腫瘍の塊から離れていると
きであっても、これら腫瘍細胞を尚一層標的とすること
ができることを結果が示している。また、ヘルパーウイ
ルスを用いたときには、腫瘍細胞はより早く死滅し、毒
性物質に対するさらに高い感受性を示す。
【００２６】本発明は、グリア芽腫の治療に特別の用途
を有する。グリア芽腫はヒトにおける悪性脳腫瘍の最も
ありふれた形態であり、ほとんど常に全てが死に至る。
グリア芽腫は全１次脳腫瘍のほぼ３０％〜５０％を占
め、手術、化学療法および放射療法にかかわらず、ほと
んど全てが死に至る。平均の生存は１年未満であり、５
年間生存率は３％〜５％にすぎない。治療の後に、疾患
の再発が元の部位の２cm以内に現れることが多い。転移
は極めてまれであり、神経学的機能障害および死は局所
的な増殖と大脳侵入による。従って、局所(非全身性)治
療の効果の可能性が検討されている。これらには、局所
低体温、光力学療法、および間隙放射の検討が含まれ
る。本発明以前には、悪性神経膠腫の患者の結果に実質
的な影響を与える治療様式は存在しなかった。
【００２７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。実施例１ １次性のヒト脳腫瘍(悪性神経膠腫)は被包性でなく、従
って外科手術により完全に除去することは困難である。
これらの腫瘍の多くは転移性でなく、時に周囲組織へ数
センチメートル侵食するのみである。しかし、外科手
術、放射線治療および化学療法は、冒された固体の病的
状態および致死性の全体には単に穏やかな影響を及ぼす
にすぎない。悪性神経膠腫の新規かつ標的性の治療方法
は探索に値するものである。
【００２８】脳腫瘍は、本質的に非分裂細胞の環境の中
に分裂細胞の塊を構成する点において独特である。標的
性の治療方法を開発する上で、この代謝における差異を
利用することができる。レトロウイルスのベクターは選
択的標的化に対して有用な担体を提供するが、これは次
の理由による：(１)レトロウイルスが分裂細胞のゲノム
中にのみ組み込まれ得る；(２)宿主細胞の範囲に制限が
ない；(３)これらのベクターはすでに多くの異なる細胞
種への感染に用いることに成功している[次の総説を参
照：Cepko,C., In Neuromethods, Vol.16: Molecular N
eurobiologicalTechniques, Boulton,A.A.ら(編), Clif
ton, N.J., The Humana Press, pp.177-218 (1989); Gi
lboa,E., BioEssays 5:252-257 (1987); Friedmann,T.,
Science 244:1275-1281 (1989)]。レトロウイルスのベ
クターは複製欠損であり、レトロウイルスのＲＮＡのパ
ッケージングのために必要なタンパク質をコードしてい
るレトロウイルスの配列を含むがそれ自身のＲＮＡはパ
ッケージすることができないトランスフェクションされ
たセルラインによって、感染性レトロウイルス粒子にパ
ッケージされ得る[例えば、Mann,R.ら, Cell 33:153-15
9 (1983); Danos,O.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:6460-6464 (1988)を参照]。それらから導いたレトロ
ウイルスおよびベクターは宿主細胞のゲノムに組み込ま
れるから、それらの配列は全ての子細胞に伝達される。
レトロウイルスのこの性質を、例えば、神経系において
細胞系を追跡する際に使用することに成功している[Pri
ce,J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (19
87); Luskin, M.B.ら, Neuron 1:635-647 (1988); Wals
h, C.ら, Science 241:1342-1345 (1988)]。
【００２９】ヘルペス単純ウイルス型１(ＨＳＶ−１)チ
ミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子は、分裂細胞に対する条件
付きの死滅機序を提供する。ＨＳＶ−１−ＴＫを使用す
ることの選択的な有効性は、この酵素がアシクロビア、
ガンシクロビアおよびＦＩＡＵなどのある種のヌクレオ
シド類似体に対して、哺乳類のＴＫよりも高い親和性を
有しているという事実に由来している[McLaren C.ら, I
n Herpes Virus and Virus Chemotherapy, Kono, R.
(編), Amsterdam:Elsevier, pp.57-61 (1985)]。これら
の薬剤は、ヌクレオチド様の前駆体に変換されて複製細
胞のＤＮＡに導入され、これによりゲノムの完全性を崩
壊させて最後には細胞の死を導く。いくつかの研究によ
り、この条件付きの毒性を使用するのに成功しており、
トランスジェニックマウスの発生に関する研究における
使用[Borrelli,E.ら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:7
572-7576 (1988); Heyman,R.A.ら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:2698-2702 (1989)]、培養細胞における非
相同組換えに対する選択マーカーとしての使用[Capecch
i,M.R., Trends in Genetics 5(3):70-76 (1989)]、野
生型ヘルペスウイルスを保持している細胞を死滅させる
ための使用[Corey, L.ら, N. Engl. J. Med.314:686-69
1 (1986); Corey, L.ら, N. Engl. J, Med. 314:749-75
6 (1986)]、およびＴＫ活性を欠損しているヘルペスウ
イルス突然変異体を選択するための使用[Coen, D.M.ら,
Science 234:53-59 (1986)]がなされている。
【００３０】本研究において、発明者らはラットＣ６神
経膠腫細胞を１次性脳腫瘍型モデルとして用いた。Ｃ６
細胞は、成体ラットＣＮＳに注射後、迅速に非被包、非
転移腫瘍を形成する。さらに、誘導セルラインが入手可
能で、これには内因性のＴＫ活性を欠くもの(Ｃ６−Ｂ
ＵＩ)、またはlacＺ遺伝子を有するもの(Ｃ６−ＢＡＧ)
があり、これらは実験を行う上で有用である。ＨＳＶ−
１−ＴＫ遺伝子が強力な構成性のレトロウイルスＬＴＲ
プロモーターにより調節されているレトロウイルスのベ
クターを調製した。Ｃ６−ＢＵＩ細胞をこのベクターで
感染させ、ＨＡＴ培地における増殖によりＴＫ活性につ
いて選択した。親細胞と感染細胞を用いて、ラット腎臓
下被膜への接種の後にインビボで、および培養液中でガ
ンシクロビアに対する濃度依存性の感受性の試験を行っ
た。
【００３１】材料および方法 ベクターの構築 ＨＳＶ−１ ＴＫ遺伝子(プラスミドpＢＲＴＫから得た)
の２kbの３'非暗号領域(polyＡ付加部位を含む)、およ
び完全な暗号配列を含有する２.８kbのＢamＨＩフラグ
メントを、レトロウイルスプラスミドpＬ(Ｘ)ＲＮＬの
ＢamＨＩ部位にクローニングした。得られたプラスミド
をpＬＴＫＲＮＬと称する。pＬ(Ｘ)ＲＮＬプラスミド
は、モロニーネズミ白血病レトロウイルス(ＭoＭＬＶ)
およびモロニーネズミ肉腫レトロウイルス(ＭｏＭＳＶ)
から導かれ、次の要素を含有している：レトロウイルス
パッケージング配列(psi)；ラウス肉腫ウイルス(ＲＳ
Ｖ)プロモーターの転写支配下に設置されているトラン
スポゾンＴn５由来のネオマイシン耐性(neoR)遺伝子；c
olＥ１細菌性複製起点；および細菌アンピシリン耐性遺
伝子。このプラスミドは、neoRを起動させるためにＲＳ
Ｖプロモーターを使用することを除いては、基本的にWo
lffら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (19
89)；Shortら, Davel. Neurosci. 12:34-45 (1990)；お
よびPriceら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160
(1987)に報告されているものと同様のものである。Ｂ
ＡＧレトロウイルスベクターは、レトロウイルスＬＴＲ
プロモーターの転写支配下の大腸菌lacＺ遺伝子、ＳＶ
４０初期プロモーターエンハンサー要素の転写支配下の
トランスポゾンＴn５ neoR遺伝子、および上記に示した
他の特徴を有する[Priceら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 84:156-160(1987)]。
【００３２】細胞培養 マウス線維芽細胞系統由来のエコトロピックなレトロウ
イルスパッケージングラインpsi２を用いた[Mannら, Ce
ll 33:153-159(1983)]。用いたＣ６ラット神経膠腫由来
のセルラインは、内因性のチミジンキナーゼ活性の欠損
についてＢＵdＲにおいて選択したセルラインＣ６−Ｂ
Ｕ１[Amanoら, Exp. Cell Res. 85:399-408(1974)]およ
びＢＡＧウイルスによる感染の後にβ−ガラクトシダー
ゼ活性を発現するＣ６−ＢＵＩの誘導体であるＣ６−Ｂ
ＵＩ−ＢＡＧである。ＢＡＧウイルスを得るために、ps
i２由来のセルラインpsi２−ＢＡＧ−２−１４[Short
ら,Dev. Neurosci. 12:34-45 (1990)]を用いた。全ての
セルラインは、１０％子牛胎児血清(ＦＢＳブランド)、
ペニシリン(１００単位)およびストレプトマイシン(１
００μg/ml)を含むＤulbecco's modified Ｅagle培地
(ＧＩＢＣＯ)中で増殖させた。ネオマイシン耐性の細胞
を選択し、Ｇ４１８(ネオマイシン類似体、ＧＩＢＣＯ)
(１mg/ml)を補充した同培地中で維持した。ＨＳＶ−１
−ＴＫを発現している細胞を、増殖培地中にＨＡＴ(ヒ
ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン、ＧＩＢＣ
Ｏ)を含有させることにより選択した。
【００３３】トランスフェクション、ウイルスの生産お
よび感染 複製欠損のＨＳＶ−１−ＴＫを有するレトロウイルスベ
クター(v−ＴＫ)を製造するために、pＬＴＫＲＮＬプラ
スミドＤＮＡ(１０μg)を、常法によりグリセロールシ
ョックを用いたリン酸カルシウム共沈法によってpsi２
細胞にトランスフェクションした。トランスフェクショ
ンされたpsi２コロニーをＧ４１８を含む培地中で選択
した。ウイルス保存液を作成するために、Ｇ４１８を有
する培地中で細胞が８０％全面になるまで培養物を維持
し、次いでＧ４１８を含まない培地で培養し、２４時間
後にウイルスを含む("培養")培地を取り、０.４５μm孔
サイズのフィルターで濾過し、−７０℃で保存した。受
容細胞を有する１００mm組織培養皿上の培地を、４μg/
mlのポリブレン(Sigma)および様々な量のウイルス保存
液を含む培地(２ml)と置き換えることにより、全ての感
染を行った。psi２−v−ＴＫセルラインのウイルス力価
の測定を、Ｃ６−ＢＵＩ細胞を感染させて、ウイルス保
存液の単位容量当たりに得られたＨＡＴ耐性コロニー数
を測定することにより行った。２つのＨＡＴ耐性コロニ
ー、Ｃ６ＴＫ−vＴＫ１および３を以降の実験に用い
た。psi２−ＢＡＧセルラインについては同様の方法で
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用い、Ｇ４１８耐性を選択すること
によりウイルス力価を測定した。
【００３４】β−ガラクトシダーゼに対する組織化学的
染色 β−ガラクトシダーゼの発現を視覚化するために、細胞
をリン酸緩衝生理食塩水(pＨ７.３)中の０.５％グルタ
ルアルデヒド中に室温で５分間固定し、次いで５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドイル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼを用いて３７℃で３０分から４時間染色した[Tur
nerおよびCepko, Nature 328:131-136(1987)]。
【００３５】培養液中のガンシクロビア感受性 セルラインＣ６、ＣＣ６−ＢＵ１、Ｃ６−ＶＩＫ１およ
びＣ６ＢＩＫ３について、ヌクレオシド類似体ガンシク
ロビア(Cytovene,Burroughs Wellcome)の濃度依存性毒
性を調べた。１００mmの培養皿あたり１００の密度にな
るよう細胞を撒いた。７２時間後、ガンシクロビアを様
々な濃度で各培養皿に加え、９日間インキュベートを続
け、３日毎にガンシクロビアを含む培地を交換した。試
験を行ったガンシクロビアの濃度は、０、３、１０、３
０、１００および３００μモルであり、各３回試験を行
った。９日目に培地を除去し、皿をＰＢＳで洗浄し、１
００％メタノールで１０分間固定し、蒸留水中の１：１
０希釈Ｇiemsa(Fisher)でさらに１０分間染色し、再び
水で洗浄し、次いで乾燥した[Freshney, R.I., Culture
of Animal Cells - A Manual of Basic Technique, 2n
d ed., New York, Alan R. Liss,Inc. (1987)]。コロニ
ーを計数し、ガンシクロビアを含まない培養皿上の数を
生存１００％として表した。
【００３６】結 果 ベクターの構築 プラスミドpＬＴＫＲＮＬ中のＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の
完全性および配向を制限マッピングにより確認した。Ｂ
amＨＩによる切断により、ＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子および
pＬ(Ｘ)ＲＮＬベクターの各々のサイズから予想された
様に、約２.８kbおよび６.７kbの２つのバンドが得られ
た。また、ＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の配列[McKnight, S.
L., Nucleic Acids Res. 8(24):5949-5964(1980)]に基
づき、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩの制限エンドヌクレアー
ゼによる切断により予想されたサイズのフラグメントも
得られた。pＬ(Ｘ)ＲＮＬベクターのＢamＨＩ部位への
ＨＳＶ−１ＴＸ遺伝子の挿入により、それがＭoＭＬＶ
ＬＴＲプロモーターの支配下に設置された。
【００３７】トランスフェクション、感染 パッケージングセルラインpsi２−ＴＫを１０Xcfu/mlで
調製した。このクローンによるいかなるヘルパーウイル
スの産生も検出されなかった。psi２−ＴＫから得たウ
イルスを用いて、ＨＡＴ培地中で増殖するＣ６由来(Ｃ
６−vＴＫ)セルラインを確立した。
【００３８】培養液中のガンシクロビア感受性 感受性試験においてセルラインＣ６、Ｃ６−ＢＵ１、Ｃ
６ＶＩＫ−１およびＣ６ＶＩＫ−３の比較を行った。
【００３９】インビボにおけるガンシクロビア感受性 ９匹のラットの腎臓下部の被膜にＣ６ＶＩＫ細胞を接種
した。この過程で生存した４匹を以降の実験に用いた。
接種５日後、腫瘍を計測した。動物２匹をガンシクロビ
ア(２０mg/kg、腹腔内、毎日)で処置し、あとの２匹を
生理用食塩水で毎日処置した。腫瘍サイズを１６日間に
わたり再評価した。対照の腫瘍２例は４倍から１２倍に
増殖した。これに対して、ガンシクロビアで処置した２
例の腫瘍は、治療後には治療前よりも小さくなった。
【００４０】考 察 これらの実験において、ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を有す
るレトロウイルスを用いて、細胞培養液中およびインビ
ボでＣ６神経膠腫細胞に薬物感受性を付与することがで
きることが示された。これは、活性なＨＳＶ−１−ＴＫ
遺伝子を有すると記述された最初のレトロウイルスベク
ターである。これは数多くの潜在的使用を有しているで
あろう。まず、詳しくは以下に述べるが、このベクター
が、"キラー"遺伝子を脳中の腫瘍細胞に向けて選択的に
送り込む際に有用であることがわかるはずである。他の
毒性遺伝子産物と比較したときのＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝
子の明白な有用性は、細胞を死に至らせるために第二の
打撃、すなわちヌクレオシド類似体による処置を必要と
することである。さらに、毒性には細胞のＤＮＡ複製が
必要であり、従って分裂細胞のみが殺されることにな
る。第二に、このレトロウイルスベクターを用いて、移
植に用いる遺伝子的に修飾された細胞にＨＳＶ−１−Ｔ
Ｋ遺伝子を導入することも可能である[例えば、Rosenbe
rgら, Science 242:1575-1578 (1988)を参照]。これに
より、実験中の指定した時点で移植細胞を除去して、こ
れら細胞が周囲組織に及ぼす影響を評価することができ
るであろう。第三に、このベクターは、初代胚芽細胞に
感染させて、発生後期および一生涯の子孫細胞の性質お
よび機能を評価するのに有用であることがわかるであろ
う。次いで、このベクターは、培養液中およびインビボ
における分裂細胞を効率的に感染させるための手段、お
よび薬物の投与により指定した時点でこれら細胞もしく
はその子孫細胞を死滅させるのに用いることができる遺
伝子をそのゲノムに挿入するための手段を提供する。
【００４１】米国で毎年約１２,０００人の１次性脳腫
瘍の新しい患者が生まれている。１次性脳腫瘍の２５％
は神経膠芽腫であるが、これは現在可能な治療法の全て
に一時的に反応するのみであるかまたは全く耐性を有す
る。神経膠芽腫はほとんど全てが致死性であって、診断
から５年生存する患者は３〜５％にすぎないといわれて
いる。しかし、神経膠芽腫からの転移は非常にまれであ
る。多くの場合、放射線照射または化学療法により局所
の増殖を阻止された神経膠芽腫では、腫瘍はもとの部位
から２センチメートル以内に再発する。この知見は、あ
る種の腫瘍が局所的な標的化された治療法によって治療
されうることを示唆する。局所の治療において様々な試
みがなされており、光力学的治療[Salcmanら, J. Neur
o. Virol.1:225-236 (1983)]、局所高熱によるもの[Che
ngら, Surg. Neurol. 28:423-435(1986)]、侵入性放射
性同位元素移植体による局所照射法[Ortinら, J. Neuro
surg. 67:864-873 (1987)]などがある。今日まで、これ
らの全ての技術はほんの限られた成功しか収めておら
ず、神経膠芽腫の治療には二義的な影響しか与えていな
い。
【００４２】この限られた成功のために、本発明者ら
は、有力な治療法の新しい手段としてレトロウイルスベ
クターを探索することを決意した。悪性の神経膠腫は成
人の脳を構成する非分裂細胞の集団の中の分裂細胞の集
団であるという事実をレトロウイルスは利用する。レト
ロウイルスは、毒性のある遺伝子を脳の腫瘍細胞に送り
込むことにより腫瘍細胞に対する選択の方法を提供す
る。３種の毒性遺伝子産物を用いてトランスジェニック
マウスでの除去実験が行われている[BernsteinおよびBr
eitman, Mol. Biol. Med. 6:523-530(1989)]。これらの
うち２つはリシンおよびジフテリア毒素であるが、これ
らは神経系に放出されると、脳、血管、骨髄およびその
他の組織に毒性を及ぼし、これらの毒素を含有する細胞
の毒性の進行を阻止することができない。この理由のた
めに、本発明者らは、それ自体では害を及ぼさないが、
ガンシクロビアなどの外来性の投与薬物に対して細胞を
感作する特徴を持つＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を使用する
腫瘍細胞破壊の方法を探索することを選択した。このよ
うにして細胞の破壊を制御することができる。
【００４３】本発明者らは、ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を
ラットＣ６神経膠腫細胞に挿入することができること、
およびこれにより細胞がガンシクロビアに対して感作さ
れることを示した。ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を発現して
いるＣ６神経膠腫細胞をインビボで死滅させ得ることを
示すために、本発明者らはラットにおける腎臓下部被膜
試験系を用いた。この試験系を用いた理由は、腫瘍体積
を直接計測することができ、小さな(＜１mm)体積の変化
の検出が可能で、腫瘍の血管新生を見ることができ、そ
して非経口の薬剤投与が可能であるからである。このモ
デルは、大脳内の腫瘍移植体のサイズを直接見ることが
できないという問題、および無傷の脳血管関門を通って
ガンシクロビアが到達できるか否かという懸念を克服す
るものである。本発明者らは、この腎臓下部被膜のモデ
ルを用いて、腹腔内投与されたガンシクロビアにより増
殖性Ｃ６神経膠腫細胞を死滅させることができるであろ
うことを示した。
【００４４】実施例２ グリア芽腫は成人の１次脳腫瘍の約３０％を占めている
[Schoenberg,B.S.,「Oncology of the Nervous System」,
Walker,M.D.編，Boston, MA: Martinus Nijhoff (198
3)]。これは侵入性であり、悪性であり、通常の治療様
式に耐性であり、従って実質的に治療不可能と考えられ
ている[DeVita,V.T.ら, Cancer: Principles and Pract
ice of Oncology, Vol.2, 第3版, Philadelphia: Lippi
ncott Press (1989); Shapiro,W.R.ら, J.Neurosurg. 7
1: 1-9 (1989); Onoyama,Y.ら, Am.J.Roentegnol. 126:
481-492 (1976); Salazar,O.M.ら, Int.J.Rad.Oncol.B
iol.Phys. 5: 1733-1740 (1979); Walker,M.D.ら, N.En
gl.J.Med. 303: 1323-1329 (1980)]。再発疾患が元の部
位の２cm以内に発生することが多い[Hochberg,F.J.ら,
Neurol. 30: 907-911 (1980)]。多数の複数様式の研究
にもかかわらず診断後の平均生存が１年未満であること
および５年後の生存患者が５％にすぎないことから[Mah
aley,M.S.ら, J.Neurosurg. 71: 826-836 (1989); Scho
enberg,B.S., 「Oncology of the Nervous System」, Wal
ker,M.D.編, Boston, MA: Martinus Nijhoff (1983); K
im,T.S.ら, J.Neurosurg.(印刷中); Daumas-Duport,C.
ら, Cancer 62: 2152-2165 (1988)]、新規な治療法が必
要とされている。
【００４５】１つの方法は、神経膠腫細胞を変調させる
か、または破壊する外来遺伝子を供給するウイルスベク
ターを利用することである。レトロウイルスは成体脳の
腫瘍細胞に選択的に感染させる可能性ある手段を与える
が、これは、レトロウイルスが分裂細胞のゲノム中にの
み組込まれ、ほとんどの成体脳細胞が細胞増殖の不活発
な非受容段階にあるためである[レトロウイルスの概説
については、Varmus,H., Science 240: 1427-1435 (198
8)を参照]。これらのＲＮＡウイルスは、培養物および
胚中の分裂細胞に遺伝子を供給するためのベクターとし
て広く利用されている[その概説については、Cepko,C.,
「Neuromethods」, Vol.16, Molecular Neurobiological
Techniques, Boulton,A.A., Boulton編, Clifton, NJ:
Humana (1989); Gilboa,E.ら, BioTechniques 4: 504-
512 (1986)を参照]。外来遺伝子およびプロモーター要
素を、パッケージング・シグナル psiを保持しているレ
トロウイルスゲノムのプラスミドＤＮＡ等価物中に挿入
することができる。次いで、これらのプラスミドを、自
らのＲＮＡをビリオン粒子にパッケージングするのに必
要なpsi要素を欠く野生型レトロウイルス配列を保持す
るパッケージング・セルライン中にトランスフェクショ
ンする[Cone,R.D.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA81: 6349
-6353 (1984); Miller,A.D.ら, Mol.Cell.Biol. 6: 289
5-2902 (1986); Mann,R.ら, Cell 33: 153-159 (198
3)]。このパッケージング・ラインは、外来遺伝子を保
持するレトロウイルス配列中にコードされているpsiを
保持するＲＮＡをビリオン粒子に挿入することができ
る。次いで、これらのラインは外来遺伝子配列を含む複
製欠損ビリオンだけを培地中に放出し、複製成分ビリオ
ンは放出しない。これらの複製欠損ビリオンは他の分裂
細胞に効率的に感染することができ、外来遺伝子をその
ゲノム中に挿入することができる。
【００４６】多数のレトロウイルスベクターが神経科学
で応用するために開発されている。これらには、組織化
学マーカーのための遺伝子lacＺを保持するベクター[Pr
ice,J.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 156-160 (198
7)]、神経成長因子のための遺伝子を保持するベクター
[Wolf,D.ら, Mol.Biol.Med. 5: 43-59 (1988); Rosenbe
rg,M.B.ら, Science 242: 1575-1578 (1988)]、チロシ
ンヒドロキシラーゼのための遺伝子を保持するベクター
[Wolff,J.A.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 9011-901
4 (1989); Horellou,P.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6: 7233-7237 (1989)]、およびその他のタンパク質のた
めの遺伝子を保持するベクター[Fredericksen,K.ら, Ne
uron 1: 439-448 (1988); Cepko,C., 「Neuromethods」,
Vol.16, Molecular Neurobiological Techniques, Boul
ton,A.A., Boulton編, Clifton, NJ:Humana (1989); Ce
pko,C., Ann.Rev.Neurosci. 12: 47-65 (1989)]が含ま
れる。lacＺを保持するレトロウイルス(例えば、ＢＡ
Ｇ)の胚組織へのインビボでの直接注射によって、例え
ば上皮、網膜および大脳皮質において観察されるよう
に、神経芽細胞およびその分化した娘細胞への遺伝子供
給を得ることができる[Gray,G.E., Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85: 7356-7360 (1988); Turner,D.ら, Nature(Lo
nd.) 328: 131-136 (1987); Walsh,C.ら, Science 241:
1342-1345 (1988); Luskin,M.B.ら, Neuron 1: 635-64
7 (1988)]。この種のベクターを成体神経組織に注射し
た後には、これら細胞の有糸分裂インデックスが低いこ
とおよびレトロウイルス粒子の半減期(培養物中で〜４
時間)が比較的短いことから予想されるように、細胞の
ラベルは報告されていない[Cepko,C., 「Neuromethods」,
Vol.16, Molecular Neurobiological Techniques, Bou
lton,A.A., Boulton編, Clifton, NJ:Humana (1989)]。
培養物中の分裂細胞を感染させ、次いでこれらの遺伝的
に修飾された細胞を脳に移植することにより、これらレ
トロウイルスベクターを成体齧歯類の脳に間接的に「遺
伝子供給」するために利用しうることがいくつかの研究
で示されている[Gage,F.H.ら, Neuroscience 23: 795-8
07 (1987)]。この方法をlacＺベクターと共に用いて、
移植されたラットＣ６神経膠腫細胞および線維芽細胞の
発育が追跡された[Shimohama,S.ら, Mol.Brain Res. 5:
271-278 (1989)]。ＮＧＦおよびＴＨ保持ベクターで感
染させたラット線維芽細胞ライン、ＮＧＦベクターで感
染させたラット褐色細胞腫細胞、およびＴIIベクターで
感染させたマウス下垂体ラインを用いて、生物学的に活
性なＮＧＦおよび／またはＬ-ドーパおよびドーパミン
が成体ラットの脳領域に供給された[Rosenberg,M.B.ら,
Science 242: 1575-1578 (1988); Wolff,J.A.ら, Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 86: 9011-9014 (1989); Horello
u,P.ら, Eur.J.Neurosci. 2: 116-119 (1990)]。いくつ
かの新規な多潜在性の神経セルラインが、mycおよびＳ
Ｖ４０Ｔ腫瘍遺伝子を保持するレトロウイルスベクター
による感染の後に開発されている[Snyder,E.Y.ら, Neur
osci.Abst. 9: 9 (1989); Lendahl,U.ら, Cell 60: 585
-595 (1990); Ryder,E.F.ら, J.Neurobiol. 21: 356-37
5 (1990)]。
【００４７】本研究において、我々は齧歯類神経膠腫モ
デルを用いて、インビボで腫瘍細胞に外来遺伝子を供給
するためにレトロウイルスベクターを利用することの可
能性を検討した。ＢＡＧレトロウイルスベクターを用い
て、成体ラット脳に移植したラット神経膠腫細胞に既報
の遺伝子lacＺを供給した。ＢＡＧレトロウイルスの直
接注射またはこのウイルスベクターを放出するpsi２-Ｂ
ＡＧパッケージング・ラインの移植の後に、内生の脳細
胞およびＣ６神経膠腫細胞の感染を評価した。培養細胞
および組織切片を、細菌性β-ガラクトシダーゼの組織
化学的染色(成功裏の遺伝子供給のインデックスとして)
によって、ならびに神経膠線維の酸性タンパク質(ＧＦ
ＡＰ)およびＳ１００の免疫染色(神経膠腫細胞と星状細
胞のマーカーとして)[Bignami,A.ら, Brain Res. 43: 4
29-435 (1972)]およびフィブロネクチンの免疫染色(線
維芽細胞由来のパッケージング・ラインのマーカーとし
て)によって評価した。
【００４８】材料および方法 細胞培養、レトロウイルス感染およびβ-ガラクトシダ
ーゼ染色 M.Rosenberg(UCSD)を介してC.Cepko(Harvard Medical S
chool)から得たエコトロピックレトロウイルス産生ライ
ンpsl２−ＢＡＧ２-１４[Price,J.ら, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84: 156-160 (1987); Short,M.P.ら, Dev.Neur
osci. 12: 34-45 (1990)]を、１００Ｕ／mlペニシリ
ン、１００μg／mlストレプトマイシン(Ｄ１０Ｐ／Ｓ)
および５００μg／mlネオマイシン類似体Ｇ４１８を含
むダルベッコ改良イーグル培地、１０％ウシ胎児血清中
で増殖させた。細胞培養材料の全てはＧＩＢＣＯから得
た。ほぼ全面の培養物の重層培地をＧ４１８不含の少量
の新鮮培地で置換することによってウイルスを集めた。
ウイルス粒子を含有する培養培地を２４〜４８時間後に
取り、酢酸セルロースメンブラン(孔の大きさ０.４５μ
m；Nalgene)で濾過し、−７０℃で保存した。このウイ
ルスを、Ｇ４１８の存在下に３Ｔ３細胞を用いてコロニ
ー形成単位(cfu)として滴定した。ウイルスの力価は１
〜３ｘ１０4cfu／mlであった。一部においては、ウイル
ス保存物を遠心によって１〜３ｘ１０5cfu／mlまで濃縮
した[Price,J.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 156-16
0 (1987)]。
【００４９】ラット神経膠腫セルラインＣ６[Benda,P.
ら, Science 161: 370-371(1968)]をＤ１０Ｐ／Ｓ中で
増殖させた。Ｃ６神経膠腫細胞をＢＡＧベクターに感染
させ、Ｇ４１８選択のもとで単一細胞サブクローンを単
離することによってＣ６-ＢＡＧラインを調製した。組
織化学的分析によって細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性
を調べた[Price,J.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 15
6-160 (1987)]。＞９９％の細胞が少なくとも６継代の
後にβ-ガラクトシダーゼポジティブであるサブクロー
ン(Ｃ６-ＢＡＧ Ｂ２-１０)を継代２または３で次の実
験に用いた。
【００５０】成体ラット脳への細胞移植およびレトロウ
イルス接種 体重が１５１〜１７５gの成体FischerラットをEquithes
in[Short,C., 「Principles and Practice of Veterinar
y Medicine」, Williams and Wilkins, Baltimore, MD
(1987)]の腹腔内注射によって麻酔した。２〜５匹の動
物をそれぞれの実験組に用い、全ての実験を少なくとも
２回行った。大脳注射の立体的座標は成体ラットの立体
地図から取った[Paxinos,G.ら, 「Rat Brain in Stereot
axic Coordinates」, 第2版, Academic Press, New York
(1986)]。細胞とウイルスを、斜めの２５ゲージ注射針
の付いた１０μlのHamilton注射器を用いて８μg／mlポ
リブレンまたは対照培地と共に注射した。注射(５μl)
は５分間で行い、注射針は除去するまでさらに２分間そ
のままにした。大部分の動物が手術に耐え、数匹の動物
だけが麻酔中に死んだ。
【００５１】移植実験のために、全面培養物をＣa++お
よびＭg++を含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水(Ｐ
ＢＳ)ですすぎ、０.０５％トリプシンと共にインキュベ
ートした。細胞をＤ１０中に取り、１２００ｘｇで５分
間遠心することによってペレット化した。細胞ペレット
をＰＢＳ中に再懸濁し、遠心して集めた。最終の細胞懸
濁液を完全ＰＢＳ[１μg／mlのＭgＣl2とＣaＣl2、０.
１％グルコース、および５％ラット血清(ＧＩＢＣＯ)を
含有するＰＢＳ]中、１０5細胞／μlの密度で調製し、
移植のときまで４℃で維持した。
【００５２】組織の調製 灌流の前にラットをEquithesin[Short,C., 「Principles
and Practice of Veterinary Medicine」, Williams an
d Wilkins, Baltimore,MD(1987)]で麻酔した。灌流は、
１０,０００単位／mlのヘパリン・ナトリウムを含有す
る冷ＰＢＳ(５０ml)とそれに続いてＰＢＳ中の冷３％パ
ラホルムアルデヒド(２５０ml)を用いて上行大動脈から
行った。４℃で一晩の後固定の後に、脳が沈降するまで
４℃で増加割合(１５、２０、３０％)のスクロース中に
維持した。脳をドライアイス上で凍結させ、切開するま
で−８０℃で維持した。切片は、凍結ミクロトーム上で
４０μmに切断し、染色まで３３％ポリエチレングリコ
ール中もしくは０.１％アジ化ナトリウムを含む０.５Ｍ
トリス-ＨＣl(pＨ７.４)中、４℃で維持するか、または
冷凍器で１０〜１５μmに切断し、ゼラチンを下塗り(Fi
sher; 100 Bloom)したスライドに乗せ、染色まで乾燥剤
と共に４℃で保存した。
【００５３】組織学 組織(および細胞)のβ-ガラクトシダーゼ組織化学のた
めに、TurnerおよびCepkoの方法[Turner,D.ら, Nature
(London) 328: 131-136 (1987)]の改良法を用いた。簡
単に説明すると、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
イル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド(Ｘ-ガル；Boehringer Man
nheim)をＤＭＳＯ中の４％保存溶液として調製した。浮
遊またはスライドに乗せた切片(または組織培養皿の細
胞)を、２mＭ ＭgＣl2、３５mＭ Ｋ3Ｆe(ＣＮ)6、３５m
Ｍ Ｋ4Ｆe(ＣＮ)6、０.０１％デオキシコール酸ナトリ
ウムおよび０.０２％ ＮＰ４Ｏを含むＰＢＳ溶液(pＨ
７.３)中で、０.１％ Ｘ-ガルをインキュベート直前に
加えて３７℃でインキュベートした。３７℃で一晩イン
キュベートした後、培養細胞を直接見て切片をＰＢＳで
すすぎ、下塗りしたスライドに乗せ、次いでヘマトキシ
リンとエオシンまたはニュートラルレッドで逆染色し
た。次に、これらを水ですすぎ、増加濃度のアルコール
中で洗浄し、水中に入れた後に水性マウンティング媒体
Crystal Mount(Biomedia)で被覆するか、またはキシレ
ン中に入れた後にPermount(Fisher)で被覆した。
【００５４】また、切片の一部は免疫細胞化学的に染色
してＧＦＡＰ、Ｓ１００またはフィブロネクチンを同定
した。切片をＰＢＳ中ですすぎ、ブロッキング血清と共
に３０分間インキュベートし、次いで以下の抗体と共に
室温で一晩インキュベートした：ヒトＧＦＡＰに対する
マウスモノクローナル抗体(Boehringer Mannheim)(１：
３希釈)；ウシＳ１００に対するウサギポリクローナル
抗体(Dako)(１：７５０希釈)；または、ヒトフィブロネ
クチンに対するマウスモノクローナル抗体(Cappell)
(１：８０希釈)；これらの全てはそれぞれのラット抗原
と交差反応する。抗体は、０.９％ ＮaＣl、０.２５％
Triton-Xおよび３％ブロッキング血清を含む１０mＭリ
ン酸緩衝液で希釈した。すすぎを行った後、緩衝液で
１：２００に希釈したビオチン化ウマ抗マウスＩgＧ、
ビオチン化ヤギ抗ウサギＩgＧまたはウサギ抗ヤギＩgＧ
(Vectastain)のいずれかと共に切片を２時間インキュベ
ートし、次いでＰＢＳで数回すすいだ。次いで、この切
片を、緩衝液で１.５：１００に希釈したアビジンとビ
オチン化西洋ワサビペルオキシダーゼのコンプレックス
(Vectastain；ＡＢＣエリート・キット)と共に３０分間
インキュベートした。５０mＭトリス-ＨＣl(pＨ７.３)
中の０.０５％ ３,３−ジアミノベンジジン・四塩酸
塩、０.０４％ ＮiＣl2および０.０１％ Ｈ2Ｏ2と室温
で５〜１０分間反応させることによってペルオキシダー
ゼを可視化した。一部においては、切片を初めにβ-ガ
ラクトシダーゼ活性について組織化学的に染色し、次い
でＧＦＡＰについて免疫染色した。他の場合には、連続
切片をβ-ガラクトシダーゼとＧＦＡＰまたはＳ１００
のどちらかにについて染色した。
【００５５】結 果 培養物中のpsi２−ＢＡＧ細胞の組織化学的染色は、β-
ガラクトシダーゼに対してほぼ１００％のポジティブ染
色とＧＦＡＰに対して染色されないことを示したが、一
方、Ｃ６細胞の大部分はＧＦＡＰ抗原に対してポジティ
ブに染色され、その全てが使用した中性条件のもとでは
β-ガラクトシダーゼ染色に対してネガティブであっ
た。Ｃ６細胞に感染しうるＢＡＧウイルスを放出するps
i２−ＢＡＧ細胞の能力は、これら２種類の細胞種のそ
れぞれを含む被覆スリップを同じ培養皿中の別々の位置
に置くことによって証明された。psi２−ＢＡＧ細胞の
存在下では、Ｃ６細胞の被覆スリップ上の絶えず増加す
る細胞は９６時間にわたってβ-ガラクトシダーゼに対
してポジティブに染色された。本質的に、神経膠腫の被
覆スリップ上の全ての細胞もＧＦＡＰポジティブであっ
た。このことは、psi２−ＢＡＧ細胞によって放出され
たＢＡＧウイルスの神経膠腫細胞ゲノムへの成功裏の組
込みと矛盾するものではない。
【００５６】５μlのＢＡＧレトロウイルスベクター(９
０〜９００cfu)を成体ラットの海馬または尾に直接接種
することによって、インビボで内生脳細胞への遺伝子移
転の効率を試験した。同時に、対照動物に完全ＰＢＳを
接種した。注射の７日後に動物を犠牲にした。ウイルス
の直接注射を受けた動物ならびに対照動物において、β
-ガラクトシダーゼに対してポジティブな細胞は実質内
には全く観察されなかった。両群の切片の一部には、以
前に記載されているように[Shimohama,S.ら,Mol.Brain
Res. 5: 271-278 (1989)]、脈絡叢内にβ-ガラクトシダ
ーゼに対するわずかにポジティブな染色が認められた。
これら対照切片においては、ポジティブに染色される細
胞が腫瘍の塊内に存在する動物のものとその染色が質的
に異なっていた(以下を参照)。
【００５７】神経膠腫細胞が接種後に増殖の遅れを生
じ、従って最初はウイルス組込みに適した細胞分裂の段
階にないかもしれないとの仮定のもと、Ｃ６細胞移植と
ウイルス注射の間の時間の間隔を変えて脳における腫瘍
細胞の直接接種の効果を試験した。移植と感染の部位は
右前頭葉である。神経膠腫細胞とＢＡＧウイルスの同時
注射のために、Ｃ６細胞(５ｘ１０5)を５μlのウイルス
保存液(９０〜９００cfu)に浮遊させた。他の動物は、
先にＣ６細胞を移植した部位にウイルス保存液を遅れて
注射した。３日および５日前にＣ６細胞を移植した立体
座標と同じ座標にウイルス保存液を５μlづつ注射し
た。対照動物にはウイルスなしでＣ６またはＣ６−ＢＡ
Ｇ細胞の移植を行った。最後のウイルス注射の７〜１０
日後に全動物を犠牲にした。Ｃ６細胞とＢＡＧウイルス
の同時注射の場合には、少しの腫瘍細胞(０.１％未満)
だけがβ-ガラクトシダーゼ活性について染色された。
一部においては、染色された内皮細胞が腫瘍塊の内部お
よび周囲の血管に観察された。腫瘍移植とウイルス注射
の間に遅れがある動物でも、少しのポジティブ細胞だけ
が観察された。ウイルス注射を遅らせた動物においてポ
ジティブに染色された細胞数とＣ６およびＢＡＧウイル
スを同時注射した動物におけるそれとの間には注意すべ
き相違はなかった。Ｃ６およびＣ６ＢＡＧ細胞の注射に
よって同じ大きさの腫瘍が生成した。ウイルスなしでＣ
６細胞を注射したときには青色の細胞は全く観察され
ず、Ｃ６ＢＡＧ注射の場合には、以前に記載されている
ように[Shimohama,S.ら,Mol.Brain Res. 5: 271-278 (1
989)]、腫瘍細胞の全てがβ-ガラクトシダーゼについて
ポジティブであった。
【００５８】psi２−ＢＡＧパッケージング細胞の移植
体の先行きを調べるために、動物の右前頭葉にpsi２−
ＢＡＧ細胞(５ｘ１０5細胞)を注射し、対照として左前
頭葉に同数のpsi２細胞を注射した。移植後の異なる時
間に動物を犠牲にした。１日後にβ-ガラクトシダーゼ
ポジティブ細胞の密集塊が右前部注射の部位に観察され
た。ポジティブに染色された細胞は１日目の左側には全
く観察されず、また、移植後の５、９、１４および２１
日目に犠牲にした動物から採取した切片のどちらの側に
も観察されなかった。この期間中の脳における腫瘍形成
またはその他の退行性の変化を示すものはなかった。
【００５９】次いで、パッケージング・ラインpsi２−
ＢＡＧの同時移植によるＣ６へのlacＺ遺伝子のその場
での遺伝子移転の効率を試験した。同時移植のための細
胞浮遊液は、Ｃ６細胞 １に対してpsi２−ＢＡＧ細胞
５の割合の細胞混合物を含有していた。遅延注射のため
には、１日目にＣ６細胞(２ｘ１０5細胞)を動物に移植
し、次いで３日目または７日目に５μlのpsi２−ＢＡＧ
細胞(５ｘ１０5細胞)を注射した。全ての場合に、psi２
−ＢＡＧ細胞を移植して７日後に動物を犠牲にした。対
照のpsi２−ＢＡＧおよびＣ６単独は平行して他の動物
に注射した。Ｃ６およびpsi２−ＢＡＧ細胞の同時移植
を受けた動物由来の組織化学的に染色した切片において
は、青色と非青色細胞の両方が腫瘍塊の中に観察され
た。これらβ-ガラクトシダーゼポジティブ細胞の一部
はＧＦＡＰまたはＳ１００について同時染色され、これ
らがＣ６神経膠腫細胞であることを示した。また、β-
ガラクトシダーゼについてはポジティブではない腫瘍塊
内にも多数のＧＦＡＰまたはＳ１００ポジティブ細胞が
存在した。他のβ-ガラクトシダーゼポジティブ細胞の
一部は、ＧＦＡＰまたはＳ１００を全く発現しないか、
または少しだけ発現するＣ６細胞である可能性があっ
た。事実、脳中に単独で移植されたＣ６細胞において
は、得られた腫瘍塊中の細胞の約半分だけがＳ１００ポ
ジティブであり、さらに少ない細胞がＧＦＡＰポジティ
ブであった。また、β-ガラクトシダーゼポジティブ細
胞の一部は、脳実質と比較して腫瘍塊内でさらに長く生
存することもあるpsi２−ＢＡＧ細胞である可能性もあ
るが、フィブロネクチンに対する免疫染色によって７日
後の同時移植体にはpsi２−ＢＡＧ細胞が存在しないこ
とがわかった。これら腫瘍の連続切片の試験によってβ
-ガラクトシダーゼポジティブ細胞を全く含まない多く
の切片が明らかになり、我々の最良の見積は、腫瘍中の
細胞の約１％がpsi２−ＢＡＧ細胞とＣ６細胞の同時注
射を受けた動物においてlacＺ遺伝子を発現するという
ものである。対照的に、腫瘍塊にパッケージング・ライ
ンを遅れて注射した動物から採取した切片は、腫瘍全体
の全ての切片にβ-ガラクトシダーゼについてポジティ
ブに染色された多くの細胞を含んでおり、１０％までの
細胞がポジティブであり、最もポジティブな細胞は腫瘍
の周辺部に存在していた。グリア特異的な抗原Ｓ１００
およびβ-ガラクトシダーゼに対する同時染色によっ
て、腫瘍内の細胞の多くがグリア由来であり、その一部
がβ-ガラクトシダーゼ活性に対してポジティブである
ことがわかった。即ち、腫瘍細胞は、腫瘍細胞とパッケ
ージング細胞を同時注射したときよりも、腫瘍細胞を確
立した後にパッケージング・ラインを移植したときの方
がより効率的に感染するようである。注射の遅延が３日
の動物と７日の動物の間に有意の相違は全く存在しない
ようであった。
【００６０】考 察 本研究において、我々は、培養物中のラット神経膠腫細
胞およびラット脳にリポーター遺伝子lacＺを供給する
複製欠損レトロウイルスベクターの効力を証明した。培
養物において、psi２−ＢＡＧ細胞から放出されるＢＡ
Ｇレトロウイルスベクターは、β-ガラクトシダーゼ活
性に対する染色によって示されるように、同じ皿中のＣ
６細胞に感染することに成功した。ＧＦＡＰに対する免
疫反応性と形態によって、β-ガラクトシダーゼポジテ
ィブ細胞と神経膠腫細胞の同一性を確認した。次いで、
インビボでＣ６細胞または内生脳細胞にlacＺ遺伝子を
移転させる効果を２種類の方法で比較した：即ち、ＢＡ
Ｇウイルスの直接注射あるいはこのウイルスを放出する
パッケージング・ラインの移植によって比較した。イン
ビボで最も高い効率は、レトロウイルスのパッケージン
グ・ラインをＣ６腫瘍細胞の確立床に移植することによ
って得られた。
【００６１】正常な成体ラット脳の実質中にウイルスを
直接注射することによってリポーター遺伝子を供給しよ
うとする最初の試みによってはβ-ガラクトシダーゼポ
ジティブな細胞は実質的に得られなかった。これらの動
物ならびに完全ＰＢＳを接種した対照においては、わず
かにポジティブな染色が脈絡叢中に観察されたが、実質
中には観察されなかった。このリソソーム性β-ガラク
トシダーゼの内生ポジティブ染色は以前に報告されてお
り[Shimohama,S.ら, Mol.Brain Res. 5: 271-278 (198
9)]、切片をニュートラルレッドで逆染色したときに遮
蔽された。このウイルスベクターによる直接の遺伝子供
給の不成功は驚くことではなかった。これは、若い出生
後動物であっても成体ラット中の細胞の大部分が有糸分
裂後のものであり、細胞分裂がレトロウイルスの組込み
に必要とされるためである。接種部位、即ち海馬は組込
みの成功の可能性を高めるために選択した。これは、こ
の領域の細胞が誕生後に分裂を停止する最後の領域であ
るためである[Das,G.D.ら, Brain Research 22: 122-12
7 (1970)]。神経膠腫細胞と同時に、またはこの細胞の
移植から遅れてＢＡＧウイルスを接種した動物において
は、少しの隔離腫瘍細胞だけが感染に成功した。これ
は、恐らく、インビボでのレトロウイルスの比較的短い
半減期および神経膠腫細胞の分裂段階を反映するもので
あろう。この少しのβ-ガラクトシダーゼポジティブ細
胞のうち、大部分は、有糸分裂活性が最も高いと考えら
れている腫瘍の端部に見い出された。時により染色され
る内皮細胞が観察されたが、これは、内皮細胞が脳の血
管中で、特に空洞化腫瘍床中で分裂し続けるためである
と予想された。
【００６２】ウイルス力価と接種量の両方が、直接のウ
イルス注射を用いて組込みのより高い成功率を得ようと
する際の大きな制限となる。遠心によってウイルス力価
を高める試みは力価を１０〜１００倍に高めるにすぎな
い。約１０5細胞で始まるグリア腫瘍を５μlのレトロウ
イルス保存液(１０4〜１０6cfu／ml)と共に接種したと
きには、ウイルスの細胞に対する割合は１：１あたりで
ある(感染の多重度 ＭＯＩ＜０.０１)。３のＭＯＩでＢ
ＡＧレトロウイルスベクターを用いて培養物中の急速分
裂Ｃ６細胞を感染させる効率は約３０％である。従っ
て、腫瘍の直接接種がインビボで効率的ではないことは
驚くべきことではない。
【００６３】パッケージング・ラインの移植は、長期に
わたって腫瘍中にウイルスを放出することにより直接接
種の制限の一部を克服するようである。本研究は、パッ
ケージング・ラインpsi２−ＢＡＧと神経膠腫細胞の同
時移植が、直接のウイルス移植に比べてより効率的にこ
れら腫瘍細胞にリポーター遺伝子lacＺを供給するよう
に作用することを証明するものである。この効率は、ps
i２−ＢＡＧ細胞の移植の３日または７日前に神経膠腫
細胞を移植した動物の方が、これら２種類の細胞種を同
時に移植した動物に比べて高かった。遅延した注射を受
けた動物の脳から採取した切片の組織化学的分析によっ
て、腫瘍の大きな領域が感染に成功していることがわか
った。この脳はpsi２−ＢＡＧ移植の１週間後に試験し
たが、これは、psi２−ＢＡＧ細胞を単独で移植した別
の実験において５日後にそれが検出できなかったためで
ある。さらに、７日後の同時移植体の免疫染色によって
フィブロネクチンポジティブな細胞は認められなかっ
た。このことは、psi２−ＢＡＧ移植体がラット株での
相違の故に免疫拒絶されたか、またはレトロウイルスコ
ード化遺伝子が存在するならそれがもはや発現されなか
った、のいずれかを示唆するものである[Palmer,T.D.
ら；個人的書簡]。免疫細胞化学によって、我々は、腫
瘍内の細胞の一部がβ-ガラクトシダーゼ活性とＧＦＡ
ＰまたはＳ１００抗原の両方について染まることを確か
め、psi２−ＢＡＧ細胞から放出されたＢＡＧウイルス
による神経膠腫細胞の感染の成功を確認した。しかし、
腫瘍内にβ-ガラクトシダーゼネガティブであるＧＦＡ
ＰおよびＳ１００ポジティブな細胞が存在し、腫瘍細胞
の不完全な感染を示唆した。
【００６４】レトロウイルスパッケージング・ラインの
同時移植によって脳中の神経膠腫細胞の感染の効率を高
めるためにいくつかの方法を考えることができる。１つ
の方法は、パッケージング・ラインの連続注射を行っ
て、より長期にわたって腫瘍床内にウイルスを放出する
細胞の数を増加させることであろう。レトロウイルス放
出の量および期間を増加させる別の方法は、宿主に免疫
適合性であり、従って移植の後により長く生存するパッ
ケージング・ラインを開発することであろう。また、星
状細胞由来のパッケージング・ラインを使用することに
よって腫瘍周囲の脳実質を含む比較的広い領域への放出
を達成することができよう。移植された新生および胚星
状細胞は元の注射部位から５mm程度まで移動しうること
が示されており、線維芽細胞よりも浸透性グリア腫瘍細
胞に到達するのに優れている[Jacqueら, (1986); Zhou,
H.F.ら, J.Comp.Neurol. 292: 320-330 (1990); Hatto
n,J.D.ら, Soc.for Neurosci.Abstracts 15: 1369 (198
9)]。さらに、内生の脳細胞であるグリアから導かれた
グリア由来パッケージング・ラインは生存性が高く、そ
の場での刺激に対する反応性がさらに高いであろう。自
然発生の脳腫瘍の場合には、腫瘍塊を除去し(腫瘍細胞
の一部が背後に残る)、パッケージング・ラインを直接
この損傷内に移植する方法を取ることもできよう。これ
が、移植されうるパッケージング細胞の数および腫瘍細
胞に対するパッケージング細胞の割合を高めるように働
き、その結果、腫瘍細胞に感染する可能性が高くなる。
【００６５】本研究は、現在腫瘍学において独特の挑戦
をし続けている中枢神経系(ＣＮＳ)の悪性グリア腫瘍に
治療的可能性のある遺伝子を供給するのに用いることが
できるモデル系を示すものである。この腫瘍細胞は正常
な脳中に浸透するので、完全な手術による切除は不可能
である。放射療法は、正常な脳が放射損傷に対して感受
性であることにより制限される。化学療法は血液脳関門
の存在によって妨げられる：即ち、この関門を通過して
浸透性腫瘍細胞に到達することができない薬物の有用性
を減少させる。レトロウイルスは可能性ある治療学的物
質であり、腫瘍細胞に遺伝的な感作を与えることができ
る。１つの例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ
(ＨＳＶ-ＴＫ)遺伝子を含有するビリオンを放出するレ
トロウイルス パッケージング・ラインであろう[Moolte
n,F.L.ら, J.Natl.Cancer Inst.82: 297-300 (1990)]。
哺乳動物細胞のゲノムに組込まれると、ＨＳＶ-ＴＫ遺
伝子はヌクレオシド類似体(アシクロビア、ガンシクロ
ビアおよびＦＩＡＵ)などの化学療法物質に対する感受
性を与える[Borrelli,E.ら, Nature 339: 538-541 (198
9); Moolten,F., Cancer Res. 46: 5276-5281 (198
6)]。細胞培養研究によって、このレトロウイルスに感
染したＣ６神経膠腫細胞およびその他の細胞が、未感染
細胞を死滅させるのに必要なガンシクロビア濃度よりも
１００倍少ない濃度で死滅することがわかった[Moolte
n,F.L.ら, J.Natl.Cancer Inst. 82: 297-300(1990)]。
また、続けて行うＨＳＶ-ＴＫウイルス パッケージング
・ラインの同時移植とヌクレオシド類似体による動物の
処置によってＣ６神経膠腫細胞を死滅させることもでき
る。さらに、腫瘍管がＨＳＶ-ＴＫ遺伝子を用いる本発
明の死滅系の別の標的であってもよい。
【００６６】実施例３ レトロウイルスベクターを用いて遺伝子を分裂細胞のゲ
ノムに移転させることができる。遺伝子供給の効率およ
びガンシクロビアの死滅作用を高めるために、我々はＣ
６ＶＩＫ細胞をエコトロピック野生型レトロウイルス
(ＭoＭＬＶ)に感染させることによって新規なパッケー
ジング・ライン(Ｃ６ＶＩＫ-ＷＴ)を開発した。Mannら
[Cell 33: 153-159 (1983)]; Priceら[Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84: 156-160 (1987)]; およびCepko,C.[「Neuro
methods: Molecular Neurobiological Techniques」, Vo
l.16, Boultonら編 (Clifton, NJ, Humana), pp.177-21
9]を参照。腫瘍細胞は脳実質中の深くまで移動すること
ができるので、腫瘍塊から離れた腫瘍細胞にベクターを
供給することができるべきである。培養物においては
０.０２４μＭのＧＣＶが５０％のＣ６ＶＩＫ-ＷＴ細胞
を死滅させるが、５０％のＣ６ＶＩＫ細胞を死滅させる
ためには７.３μＭのＧＣＶが必要であった。このこと
は、Ｃ６ＶＩＫ-ＷＴ細胞が、ＨＳＶ-ＴＫ遺伝子の多重
組込みまたはＧＣＶ毒性産物に対するＣ６ＶＩＫ-ＷＴ
細胞の高い感受性により、Ｃ６ＶＩＫよりも高いＨＳＶ
-ＴＫ活性を有していることを示唆する。Ｃ６ＶＩＫと
Ｃ６ＶＩＫ-ＷＴをＣ６ＢＡＧ細胞(lacＺ遺伝子でラベ
ルされており、従ってβ-ガラクトシダーゼ組織化学に
よって検出可能である)と共に培養したときには、ＧＣ
Ｖ処理の後に、Ｃ６ＶＩＫ細胞と同時培養したときより
もＣ６ＶＩＫ-ＷＴ細胞と同時培養したときの方が実質
的に多くのＣ６ＢＡＧ細胞が死滅した。恐らくは、Ｃ６
ＶＩＫ-ＷＴ細胞は野生型レトロウイルスとＨＳＶ-ＴＫ
遺伝子を含有するレトロウイルスベクターの両方を生成
し(Ｃ６ＶＩＫ細胞はこのどちらも生成しない)、Ｃ６Ｂ
ＡＧ細胞の死がレトロウイルス感染および／または自己
生成ＧＣＶ毒性産物によって介されているのであろう。
インビボでのＧＣＶ処理は、Ｃ６ＶＩＫ-ＷＴ細胞を、
またはＣ６ＶＩＫ-ＷＴ細胞とＣ６ＢＡＧ細胞を同時に
皮下接種したヌードマウスのほとんどにおいて腫瘍の退
化を引き起こしたが、Ｃ６ＢＡＧ細胞単独では引き起こ
さなかった。これらの知見は、レトロウイルス媒介の遺
伝子供給の効率および腫瘍細胞の毒性物質に対する感受
性を、ヘルパーウイルス(レトロウイルスベクターに感
染した細胞をパッケージング・セルラインに変える)の
使用によって増強しうることを示唆するものである。
【００６７】遺伝子供給のためのレトロウイルスベクタ
ーの使用は、腫瘍破壊のために設計した遺伝子系に限定
されない。腫瘍形成または腫瘍変調に関与している遺伝
子の供給も検討する価値に値するであろう。グリア腫瘍
における染色体１７、１０、および比較的少ないが染色
体２２上のＤＮＡマーカーの異種接合性の損失は、腫瘍
抑制遺伝子がこれら染色体領域に存在していることを示
唆するものである[Bigner,S.H.ら, Hereditas 101: 103
-113 (1984); Bigner,S.H.ら, Cancer Res. 88: 405-41
1 (1988); James,C.D.ら, Cancer Res. 48: 5546-5551
(1988); El-Azouzi,M.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:
7186-7190 (1989)]。網膜芽腫遺伝子機能の修復によっ
て、培養物中の網膜芽種細胞および骨肉腫細胞の増殖が
阻害されることが示されている[Huang,H.-J.S.ら, Scie
nce 242: 1563-1566 (1988)]。
【００６８】医薬、免疫学、ハイブリドーマ法、薬理
学、および／またはその関連分野に携わる者には明らか
な本発明実施の際の上記態様の修飾は、先に挙げた特許
請求の範囲の範囲内にあるものとする。本明細書中に挙
げた刊行物および特許出願の全ては、本発明が属してい
る分野の技術レベルを示すものである。これら刊行物お
よび特許出願の全ては、参考として本明細書中に組入れ
られるものである。本発明の理解を助けるために例を挙
げて本発明を説明したが、ある種の変更および修飾が本
発明の範囲内にあることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ガンシクロビアをインビボで研究した結果を
示すグラフである。
【図２】 ガンシクロビアの感受性試験の結果を示すグ
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ザンドラ・オー・ブレイクフィールド アメリカ合衆国02159マサチューセッツ州 ニュートン、ホーマー・ストリート127番

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 新生細胞を選択的に死滅させるための方
    法であって、該新生細胞を選択的な細胞死の標的とする
    ことができる遺伝子産物の遺伝子を含有するレトロウイ
    ルスベクターで該新生細胞を感染させることからなる方
    法。
  2. 【請求項２】 該新生細胞を、該遺伝子産物を認識して
    該新生細胞を選択的に死滅させる物質と接触させる工程
    をさらに含有する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該遺伝子がアンチセンス核酸をコードし
    ている請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 該新生細胞を照射にかける工程をさらに
    含有する請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該遺伝子産物がチミジンキナーゼであ
    り、該物質がガンシクロビアである請求項２に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 該新生細胞が神経系腫瘍の細胞からなる
    請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 該腫瘍が星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜
    腫、神経線維腫、グリア芽腫、上衣細胞腫、神経鞘腫お
    よび神経線維肉腫からなる群から選ばれる請求項６に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 該腫瘍がグリア芽腫である請求項７に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 該レトロウイルスがＶＩＫである請求項
    １に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 グリア芽腫細胞を選択的に死滅させる
    方法であって、該細胞を選択的な細胞死の標的とするこ
    とができる遺伝子産物の遺伝子を含有するレトロウイル
    スベクターで該細胞を感染させることからなる方法。
  11. 【請求項１１】 該細胞を、該遺伝子産物を認識して該
    新生細胞を選択的に死滅させる物質と接触させる工程を
    さらに含有する請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該細胞を照射にかける工程をさらに含
    有する請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該遺伝子産物がチミジンキナーゼであ
    り、該物質がガンシクロビアである請求項１０に記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 該細胞を、エコトロピック野生型レト
    ロウイルスであるヘルパーウイルスで同時感染させるこ
    とをさらに含有する請求項１または１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 グリア芽腫細胞を選択的に死滅させる
    ための方法であって、該細胞を選択的な細胞死の標的と
    することができる遺伝子産物の遺伝子を含有する第１の
    レトロウイルスベクターおよび第２のヘルパーウイルス
    で該細胞を同時感染させることからなる方法。
  16. 【請求項１６】 該遺伝子産物がチミジンキナーゼであ
    り、該方法が該細胞をガンシクロビアと接触させること
    をさらに含有する請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該ヘルパーウイルスがエコトロピック
    野生型レトロウイルスである請求項１６に記載の方法。
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