DE69130996T2

DE69130996T2 - Gezielte Zerstörung neoplastischer Zellen mit Hilfe von Retrovirusvektor-produzierenden Packungszelllinien

Info

Publication number: DE69130996T2
Application number: DE69130996T
Authority: DE
Inventors: Xandra O. Newton Massachusetts 02159 Breakfield; Robert L. Lexington Massachusetts 01273 Martuza
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1991-09-16
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2011-09-17
Also published as: EP0476953A2; CA2051288C; JPH05246895A; ATE177648T1; EP0476953B1; CA2051288A1; DE69130996D1; EP0476953A3

Description

Diese Erfindung betrifft die Behandlung neoplastischer Zellen unter Verwendung von Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen.
Die Neoplasie ist ein Prozeß, durch den die normalen Steuerungsmechanismen, die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung regulieren, beeinträchtigt werden, was zu einem progressiven Wachstum führt. Während der Neoplasie gibt es ein charakteristisches Versagen, die Zellerneuerung und das Zellwachstum zu steuern. Dieser Mangel an Steuerung verursacht ein progressives Tumorwachstum, wodurch Räume in lebenswichtigen Bereichen des Körpers vergrößert und besetzt werden. Wenn der Tumor in umgebendes Gewebe eindringt und zu entfernten Stellen transportiert wird, tendiert dieser Tumor dazu, den Tod des Patienten herbeizuführen.
Ein Drittel aller Personen in den Vereinigten Staaten wird an Krebs erkranken (American Cancer Society Yearly Outlook for 1990). Die fünfjährige Überlebensrate für diese Patienten ist aufgrund des Fortschrittes und der frühen Diagnose und Therapie der Erkrankung auf nahezu 50% gestiegen (American Cancer Society Yearly Outlook for 1990). Krebs steht jedoch als Todesursache nur hinter Herzerkrankungen an zweiter Stelle in diesem Land (American Cancer Society Yearly Outlook for 1990). Nahezu 20% aller Amerikaner, die dieses Jahr sterben, sterben an Krebs (American Cancer Society Yearly Outlook for 1990). Die Hälfte dieser Todesfälle ist auf die drei häufigsten Krebsarten zurückzuführen: Lunge, Brust und Dickdarm.
In jüngster Zeit gab es eine rasche Expansion von Krebsbehandlungen. Obwohl ständig neue Behandlungen entwickelt werden, besteht nach wie vor der Bedarf an verbesserten Verfahren für die Behandlung der meisten Krebsarten.
Das bevorzugte Abtöten von Krebszellen ohne schädliche Wirkung für normale Zellen ist das gewünschte Ziel in der Krebstherapie. In der Vergangenheit wurde dies unter Anwendung einer Reihe von Verfahren erreicht. Zu diesen Verfahren zählen die Verabreichung von chemischen Produkten, die Chemotherapie, die Bestrahlung, die Radiotherapie und die Chirurgie.
Die Radiotherapie ist eine regionale Form der Behandlung, die zur Kontrolle lokalisierter Krebserkrankungen verwendet wird (siehe Devita, V.T., in Harrisons Principles of Internal Medicine, Hrsg. Braunwald et al., 1987, McGraw-Hill, Inc., New York, S. 431-446). Die Radiotherapie beruht auf der Tatsache, daß einige bösartige Erkrankungen stärker für eine Schädigung durch Strahlung anfällig sind. Dieser Unterschied in der Anfälligkeit hängt davon ab, daß normale Zellen eine höhere Kapazität für eine interzelluläre Wiederherstellung als neoplastische Zellen haben, und daß normale Organe weiterhin gut funktionieren, wenn sie nur segmentförmig beschädigt sind. Wenn das umgebende Gewebe die zweifache Strahlungsdosis eines bestimmten Tumors vertragen kann, ist der Tumor strahlenempfindlich. Andererseits können einige Tumore nicht mit Radiotherapie behandelt werden. Krebs, der beide Lungen weiträumig befallt, kann aufgrund der größeren Strahlenempfindlichkeit des umgebenden Lungengewebes nicht effektiv mit einer Strahlungstherapie behandelt werden (siehe Devita, V.T., in Harrisons Principles of Internal Medicine, Hrsg. Braunwald et al., 1987, McGraw-Hill, Inc., New York, S. 431-446).
Bei den meisten frühen Krebserkrankungen wird die Chirurgie nach wie vor als primäre Behandlung angesehen (siehe Devita, V.T., in Harrisons Principles of Internal Medicine, Hrsg. Braunwald et al., 1987, McGraw-Hill, Inc., New York, S. 431-446). Die meisten Tumore sind jedoch operierbar, aber nicht vollständig entfernbar. Einige Tumore, die entfernbar erscheinen, weisen eine mikrometastatische Erkrankung außerhalb des Tumorfeldes auf. Dies führt zu einem Wiederauftreten des Krebses nahe der anfänglichen Auftrittsstelle. Jeder Krebs, der ein gewisses Maß an Metastasen aufweist, kann durch Chirurgie nicht effektiv geheilt werden.
Es wurden andere Arten einer lokalisierten (nichtsystemischen) Therapie untersucht. Zu diesen zählen die lokale Hypothermie (Saloman et al., J. Neuro-Oncol. 1: 225-236 (1983)), die photodynamische Therapie (Cheng et al., Surg. Neurol. 25: 423-435 (1986)), und die interstitielle Bestrahlung (Gutin et al., J. Neurosurgery 67: 864-873 (1987)). Bisher waren diese Therapien begrenzt erfolgreich.
Die Radiotherapie und Chirurgie bieten Möglichkeiten, die Tumormasse in bestimmten Körperregionen zu verringern, die durch chirurgische Techniken oder hohe Radiotherapiedosen zugänglich sind. Keine ist bei der Zerstörung von weit verbreiteten oder zirkulierenden Tumorzellen anwendbar, die für gewöhnlich bei den meisten Krebspatienten vorhanden sind. Dies ist der Anreiz für die Entwicklung systemischer Behandlungen von Krebs wie die Chemotherapie.
Die Verwendung chemischer Produkte, die zwar weitgehend eingesetzt wird, hat sich als begrenzt wirksam in der Behandlung der meisten Krebsarten erwiesen. Ein Nachteil bei der Verwendung zytotoxischer Mittel für die Behandlung von Krebs sind deren starken Nebenwirkungen. Dazu zählen Übelkeit, Erbrechen, ZNS-Depression, örtlicher Schmerz, Knochenmarkdepression, Blutung, Nierenschaden, Hypo- und Hyperglykämie und Überempfindlichkeitsreaktionen. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß sie nur bei sich rasch teilenden Zellen wirksam sind.
Eine modernere Vorgangsweise in der Chemotherapie besteht darin, die toxischen Substanzen auf die Krebszellen selbst zu richten. Dies wird experimentell durchgeführt, indem das chemotherapeutische Mittel entweder an Antikörper oder toxische Moleküle gebunden wird, die eine höhere Affinität für Tumorzellen als normale Zellen haben. Diese gelenkten toxischen Geschosse befinden sich noch in einer frühen klinischen Phase der Entwicklung und sind im Handel nicht erhältlich.
Bestimmte Krebsarten, zum Beispiel Gliome, welche die am häufigsten primären Tumore sind, die im menschlichen Gehirn entstehen, widerstehen den gegenwärtigen Behandlungsmodalitäten. Trotz Chirurgie, Chemotherapie und Radiotherapie ist das Glioblastom, das häufigste der Gliome, fast generell fatal (Schoenberg, B.S., "The epidemiology of nervous system tumors", in Oncology of the Nervous System, M.D. Walker, Hrsg., Boston, MA, Martinus Nijhoff (1983); Levin et al., "Neoplasms of the Central Nervous System", Kapitel 46, S. 1557-1611, in Cancer: Principles and Practice of Oncology, Band 2, 3. Auflage, De Vita et al., Hrsg., Philadelphia, Lippincott Press (1989)). Daher besteht ein Bedarf an der Entwicklung einer Technik, die Gliome selektiv zerstört, während normale Gehirnzellen verschont bleiben. Im allgemeinen könnte eine derartige Behandlung möglicherweise generell für die selektive Zerstörung aller Arten von neoplastischen Zellen verwendet werden.
Es werden Zusammensetzungen zum selektiven Abtöten neoplastischer Zellen bereitgestellt. Insbesondere werden Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen für eine zielorientierte Expression eines Gens oder Genprodukts in neoplastischen Zellen verwendet. Es werden Gene gewählt, deren Genprodukte imstande sind, Zellen für ein selektives Abtöten von Tumorzellen anzupeilen. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere in der Behandlung von Tumoren des Nervensystems Anwendung.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen in der Zubereitung einer antineoplasfischen Zellsubstanz oder einer sensibilisierenden Substanz gegen neoplastische Zellen, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, bereitgestellt, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:
1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder
2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können.
Die Erfindung zieht auch Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen zur Verwendung in der Medizin in Betracht, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist;
1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder
2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können.
Zusätzlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend:
a) Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:
1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder
2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können, und
b) einen pharmazeutisch annehmbaren (z. B. sterilen) Träger.
Diese Zusammensetzung kann eine injizierbare Zusammensetzung, zum Beispiel eine sterile Lösung, sein.
Die Erfindung zieht zusätzlich Verfahren für die Herstellung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen in Betracht, wobei das Verfahren das Vermischen der Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen und des pharmazeutisch annehmbaren Trägers umfaßt.
Die Erfindung kann zusätzlich ein Produkt beinhalten, welches:
a) Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:
1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder
2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können, und
b) eine Chemikalie zur Verwendung in der chemischen Behandlung,
als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen, aufeinanderfolgenden oder getrennten Verwendung in der Tumortherapie enthält.
Der Retrovirusvektor, der durch Packungszellen hergestellt wird, die in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, wird üblicherweise nur in das Genom von sich teilenden Zellen integriert. Der Vektor kann somit selektiv auf sich teilende (z. B. neoplastische) Zellen gerichtet werden und umfaßt ein Gen, das in der Zelle ein Genprodukt erzeugt. Das Gen oder Genprodukt kann somit dazu ausgebildet sein, neoplastische Zellen direkt oder indirekt abzutöten oder diese zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder durch Strahlung abgetötet werden können.
Die chemische Behandlung kann die Behandlung mit Antikörpern, einem Mittel, welches das Genprodukt erkennt und somit die neoplastische Zelle selektiv abtötet, oder einem Nucleosidanalog wie Acyclovir, Gancyclovir oder FIAU enthalten.
Die Erfindung zieht eine beachtliche Vielzahl von Möglichkeiten in Betracht, mit welchen eine neoplastische Zelle abgetötet oder sensibilisiert werden kann, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder durch Strahlung abgetötet werden kann. Sie wird nun kurz besprochen.
Was das Genprodukt betrifft, so kann dieses eine oder alle der folgenden Eigenschaften aufweisen:
(1) es kann die Zelle für eine weitere Behandlung (wie Bestrahlung oder chemische Behandlung) sensibilisieren;
(2) es kann die Zelle abtöten, indem es zum Beispiel eine Antisense-Nucleinsäure ist (die zum Beispiel für ein essentielles Protein kodiert) oder indem es ein toxisches Protein ist.
Was das Gen selbst betrifft, so kann dieses eine oder alle der folgenden Eigenschaften aufweisen:
(1) es kann für die Zelle toxisch sein;
(2) es kann die Zelle stärker antigen machen (Xenogenisation der Zelle), indem zum Beispiel die Expression nichthumaner und/oder einzigartiger Oberflächenantigene verursacht wird, die eine weitere chemische Behandlung ermöglicht, wie die Verwendung von Antikörpern und bevorzugt markierten Antikörpern, um ein Abtöten der Zelle zu versuchen; und
(3) es kann einen Zelltötungsmechanismus bereitstellen, wobei das Gen zum Beispiel das Herpes-simplex-Virus 1-Thymidinkinase-Gen umfassen kann.
Das Retrovirus kann durch Verpflanzen einer Packungszellinie abgegeben werden. In bevorzugten Ausführungsbeispielen kann die neoplastische Zelle später mit Strahlung in Kontakt gebracht werden.
Vorzugsweise kann auch ein Helfervirus vorgesehen sein, zum Beispiel in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, und begleitet daher üblicherweise die Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen. Das Helfervirus dient daher dem Zweck der bevorzugten Co-Infektion, wodurch die Genabgabe erhöht wird. Das Helfervirus ist zweckdienlich ein ökotropes (wie ein Wildtyp-) Retrovirus. In einigen Ausführungsbeispielen sind die Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen auch mit dem Helfervirus transfektiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit das selektive Abtöten neoplastischer Zellen. Es werden Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen verwendet, die imstande sind, Vektoren zu erzeugen, die ein Gen tragen, dessen Genprodukt neoplastische Zellen abtöten oder für einen selektiven Zelltod anpeilen kann.
Unter neoplastischen Zellen werden sich teilende, üblicherweise sich rasch teilende Zellen verstanden. Für den Zweck der Erfindung umfassen neoplastische Zellen Zellen von Tumoren, Neoplasmen, Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Lymphomen und dergleichen. Von besonderem Interesse sind Zentralnervensystemtumore. Zu diesen zählen Astrocytome, Oligodendrogliome, Meningiome, Neurofibrome, Ependymome, Schwannome, Neurofibrosarcome, Glioblastome usw. Die neoplastischen Zellen von besonderem Intersse für die Erfindung sind jene Zellen von Gehirntumoren. Erwachsene Gehirntumore sind einzigartig, da sie Massen von sich teilenden Zellen in einem Hintergrund von im wesentlichen nicht teilenden Zellen bilden. Daher nutzt die vorliegende Erfindung diese metabolischen Unterschiede, um die Entwicklung einer zielgerichteten Methode zum selektiven Abtöten neoplastischer Zellen auszubauen. Die Erfindung kann zum selektiven Abtöten sowohl gutartiger als auch bösartiger neoplastischer Zellen verwendet werden.
Die Retrovirusvektoren, die durch die Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen der Erfindung erzeugt werden können, können nur in das Genom der sich teilenden Zellen integriert werden. Somit stellen die Vektoren ein zweckdienliches Vehikel für das selektive Anpeilen von sich teilenden Zellen dar. Retrovirusvektoren bieten weitere Vorteile, da es keine Einschränkungen im Wirtbereich gibt, und diese Vektoren bereits erfolgreich zur Infektion verschiedener Zelltypen verwendet wurden. Siehe zum Beispiel Cepko, C., "Lineage analysis and immortalization of neural cells via retrovirus vectors", in Neuromethods, Band 16, S. 177-218, Clifton, NJ, The Humana Press, Inc. (1989); Gilboa, E., BioEssays 5(6): 252-257 (1987); Friedmann T., Science 244: 1275-1281 (1989).
Im allgemeinen sind Retrovirusvektoren in der Wissenschaft gut bekannt. Siehe Breakfield et al., Molec. Neuo. Biol. 1: 339 (1987); und Shih et al., in: Vaccines 85, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1985), S. 177-180. Ferner betrifft U.S. Patent Nr. 5501979 Herpex-simplex-Virus-Expressionsvektoren.
Sie liefern weitere Information über die Konstruktion und Verwendung von Retrovirusvektoren.
Wie zuvor angegeben, sind im allgemeinen die Retrovirusvektoren, die durch die Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können, replikationsdefekt. Sie können in infektiöse retrovirale Partikel durch transfektierte Zellinien gepackt werden, die retrovirale Sequenzen enthalten, die für jene Proteine kodieren, die zur Verpackung retroviraler RNA notwendig sind, die aber ihre eigene RNA nicht verpacken können. Siehe Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983); Danos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464 (1988). Da Retroviren und davon abgeleitete Vektoren in das Wirtszellgenom integriert werden, werden ihre Sequenzen zu allen Tochterzellen übertragen. Dieses Merkmal von Retroviren wurde zum Beispiel erfolgreich zum Verfolgen von Zellstammbäumen im Nervensystem verwendet (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987); Luskin et al., Neuron 1: 635-64.7 (1988); Walsh und Cepko, Science 241: 1342-1345 (1988)).
Gene für den Transfer in die neoplastischen Zellen durch Retrovirusvektoren, die von Packungszellen erzeugt werden, werden aus jenen, welche die Wirtszelle ansteuern, üblicherweise durch die Expression eines Genprodukts in den neoplastischen Wirtszellen ausgewählt. "Genprodukt" betrifft allgemein Proteine, für die das besondere Gen kodiert. Für den Zweck der Erfindung jedoch enthält Genprodukt auch Transkriptionsprodukte des Gens, insbesondere zur Verwendung als Antisense-RNA. Die Wirtszellen, die durch die vorliegende Erfindung angepeilt werden, sind jene Zellen, welche das Virus, das von den Packungszellen erzeugt wird, infiziert und in welchen es das gewünschte Genprodukt exprimiert. Die Wirtszellen stellen somit neoplastische Zellen dar, die von den Retrovirusvektoren infiziert werden, die durch die Packungszellen erzeugt werden.
Es werden Gene ausgewählt, deren Genprodukte Wirtszellen töten und/oder deren Produkte die Wirtszelle für den Zelltod sensibilisieren. Der Zelltod kann durch den Kontakt der Wirtszellen, die das Genprodukt umfassen, mit einer folgenden Behandlung, entweder einer Bestrahlung oder chemischen Behandlung, herbeigeführt werden. Als Alternative können die Genprodukte selbst zum Abtöten der Wirtszellen dienen.
Genprodukte, die selbst zu einem selektiven Abtöten von Zellen imstande sind, können Antisense-Nucleinsäure für essentielle Zellproteine umfassen, wie Replikationsproteine, die dazu dienen, die Wirtszellen für ein weiteres Zellwachstum und eine Zellteilung unfähig zu machen. Die Antisense-Regulation wurde von Rosenberg et al., Nature 313: 703-706 (1985); Preiss et al., Nature 313: 27-32 (1985); Melton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 144-148 (1985); Izant und Weintraub, Science 229: 345-352 (1985); Kim und Wald, Cell 42: 129-138 (1985); Pestka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7525-7528 (1984); Coleman et al., Cell 37: 683-691 (1984); und McGarry und Lindquist, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 399-403 (1986) beschrieben.
Andere Gene, die zur Verlangsamung des Zellwachstums Anwendung finden, umfassen Tumor-Suppressorgene, Gene, die für Transkriptionsfaktoren kodieren, die das Zellwachstum unterdrücken, toxische Proteine, die von Zellen freigesetzt werden, und dergleichen. Siehe zum Beispiel Heinbrook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4697 (1990), worin ein Fusionsprotein mit Toxin beschrieben wird, das an den EGF-Liganden gekoppelt ist. Es wurden auch Toxingene beschrieben, wie zum Beispiel von Barker et al., Gene 86: 285-290 (1990); Ito et al., Microb. Pathog. 8: 47-60 (1990); Ganon et al., J. Gen. Microbiol. 136: 1125-1136 (1990). Es können auch Gene eingefügt werden, welche die Zellwachstumseigenschaften verändern oder das Zellwachstum modulieren, wie zum Beispiel ein Tumor-Suppressorgen wie das Rb-Gen in Retinoblastomen (Huang et al., Science 242: 1563-1566 (1988)) oder das p53-Gen im Dickdarmkrebs (Baker et al., Science 249: 912-915 (1980)). Andere Suppressor- oder modulierende Gene können ebenso verwendet werden.
Gene, deren Produkte dazu dienen, die Wirtszellen stärker antigen zu machen, finden ebenso in der Erfindung Anwendung. Diese antigene Wirkung kann durch Einfügen neuer Antigene an der Oberfläche der Wirtszellen erreicht werden, wodurch das Immunsystem beim Erkennen des Tumors als Fremdkörper gestärkt wird. Das Einfügen neuer Antigene an der Oberfläche der Wirtszellen wird als Xenogenisation der Zellen bezeichnet (Austin et al., Ad. in Cancer Res. 30: 301-345 (1979); Kobayashi et al., Ad. in Cancer Res. 30: 279-299 (1979)). Es kann jedes nichthumane Oberflächenantigen verwendet werden, einschließlich jener, die in Araki et al., Gene 89: 195-202 (1990); Takle et al., Mol. Biochem. Parasitol. 37: 57-64 (1989); Raney et al., J. Virol. 63: 3919-3925 (1989), Tondravi, M.M., Curr. Genet. 14: 617-626 (1988); und Miyandhara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1-5 (1983), beschrieben sind.
Es kann ein Gen oder eine Kodierungssequenz gewählt werden, deren Produkte einen bedingten Tötungsmechanismus für sich teilende Zellen bereitstellen. Auf diese Weise ist die Expression eines bestimmten Proteins, auf welche die anschließende Behandlung folgt, zum Abtöten der neoplastischen Zellen wirksam. Die anschließende Behandlung umfaßt die chemische Behandlung oder Bestrahlung. Mittel zur chemischen Behandlung umfassen die Verwendung von Enzymen oder anderen Verbindungen, die mit dem Genprodukt zum Abtöten der Wirtszelle reagieren.
Zum Beispiel stellt das Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Thyminkinase- (TK-) Gen einen solchen bedingten Tötungsmechanimus für sich teilende Zellen bereit. Der selektive Vorteil der Verwendung von HSV-1-TK leitet sich von der Tatsache ab, daß das Enzym eine stärkere Affinität für bestimmte Nucleosidanaloge wie Acyclovir, Gancyclovir und FIAU als Säugetier-TK hat (Mc Laren et al., in: Herpes Virus and Virus Chemotherapy, R. Kono, Hrsg., S. 57-61, Amsterdam, Elsevier (1985)). Diese Arzneimittel werden zu nucleotidartigen Vorläufern umgewandelt und in die DNA replizierender Zellen eingebaut, wodurch die Integrität des Genoms aufgebrochen wird, was letztendlich zum Tod der Zelle führt. In mehreren Studien wurde die bedingte Toxizität von TK in Entwicklungsstudien transgener Mäuse (Borelli et al., Nature 339: 538-541 (1989); Heyman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2698-2702 (1989)), als selektierbarer Marker gegen nichthomologe Rekombinationsereignisse in gezüchteten Zellen (Capecchi, M.R., Trends in Geneticcs 5(3): 70-76 (1989)), zum Abtöten von Zellen, die Herpesviren vom Wildtyp aufgenommen haben (Corey und Spear, N. Engl. J. Med. 314: 686-691 (1986); Corey und Spear, N. Engl. J. Med. 314: 749-756 (1986)) und zum Selektieren von Herpesvirusmutanten, welchen TK-Aktivität fehlt (Coen et al., Science 234: 53-59 (1986)), erfolgreich genutzt.
Das Genprodukt kann auch für eine Chemikalie oder ein Protein kodieren, das die Wirtszellen strahlenempfindlich und somit für ein Abtöten durch Strahlung anfälliger macht. Somit werden die Wirtszellen bei anschließender Bestrahlung selektiv abgetötet. Siehe zum Beispiel Snyderman et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112: 1147-1150 (1986); und Sealy et al., Cancer 54: 1535-1540 (1984). Zu weiteren Strategien zählen der selektive Transfer von antigenen Zellenoberflächenmarkern in Verbindung mit der Entwicklung tumorspezifischer Immunokonjugate zur Verbesserung der zielgerichteten Steuerung chemotherapeutischer Substanzen. Siehe Reisfeld, R.A., in Molecular Probes Technology and Medical Applications, Albertini, A., et al., Raven Press, New York (1989).
Es ist offensichtlich, daß das Gen von Interesse durch jede in der Wissenschaft bekannte Methode modifiziert sein kann. Zum Beispiel kann das Gen unter die Steuerung heterologer Regulationsregionen gebracht werden, einschließlich der Verwendung viraler Promotoren, für neoplastische Zelle oder den Tumor spezifischer Promotoren oder Steuerelemente. Auf diese Weise wird das Genprodukt zielgerichteter auf spezifische Zelltypen gelenkt. Methoden zur Konstruktion solcher Expressionsvektoren sind in der Wissenschaft bekannt.
Im allgemeinen sind Verfahren in der Wissenschaft zur retroviralen Infektion der Zellen von Interesse bekannt. Üblicherweise wird das Virus in den Wirt an oder nahe der Stelle des neoplastischen Wachstums injiziert. In den meisten Fällen wird das Virus in einer therapeutisch wirksamen Menge bereitgestellt, um Zielzellen zu infizieren und zu töten. Im allgemeinen wird das Virus zur Injektion in einer Konzentration im Bereich von etwa 10¹ bis etwa 10¹&sup0; plaquebildender Einheiten (PFU) bereitgestellt, im allgemeinen von etwa 5 · 10&sup4; bis etwa 1 · 10&sup6; PFU, insbesondere von etwa 1 · 10&sup5; bis etwa 4 · 10&sup5;, obwohl die Bereiche unterschiedlich sein können. Als Alternative kann die Packungszellinie nahe dem oder in den Tumor verpflanzt werden, um eine länger anhaltende Virusquelle bereitzustellen.
Dieses selektive Abtöten des Retrovirus und die Abgabe des toxischen Gens können durch Co-Infektion mit einem Helfervirus verstärkt werden. Das heißt, das Helfervirus erhöht die Genabgabe. Auf diese Weise können die Packungszellinien zur Herstellung von Viruspartikeln der Retrovirusvektoren mit einem Helfervirus co-infiziert werden. Die Packungszellen werden dann an oder nahe der Infektionsstelle in den Wirt injiziert. (Siehe Cepko, C. (1989), supra; Rosenberg et al., Science 242: 1575-1578 (1988); und Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983)). Zu solchen Helferviren zählen ökotropische Wildtyp-Retroviren, zum Beispiel MoMLV (siehe Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464 (1988); Cepko, C. in Neuromethods, Band 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al. (Hrsg.), Clifton, NJ: Humana (1989), und Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983)).
Zur Verwendung eines Helfervirus kann die Packungslinie anschließend mit Wildtyp-Virus in Kultur infiziert werden, und diese Zellen können verpflanzt werden. (Siehe Rosenberg et al., Science 242: 1575-1578 (1988); und Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9011-9014 (1989)). Die Packungszellen werden mit dem Helfer im Bereich einer MOI (Infektionsmultiplizität) von etwa 0,1 bis etwa 20 infiziert.
Die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber toxischen Substanzen wird unter Verwendung von Helferviren erhöht. Die Helferviren wandeln Zellen, die mit Retrovirusvektoren infiziert sind, zu Packungszellinien um. Die Ergebnisse zeigen, daß durch eine Co-Infektion mit einem Helfervirus die Retrovirusvektoren der Erfindung imstande sind, mehr Tumorzellen, selbst jene Tumorzellen, die sich entfernt von der Tumormasse befinden, anzupeilen. Ferner sterben die Tumorzellen rascher und zeigen eine höhere Empfindlichkeit gegenüber toxischen Substanzen, wenn ein Helfervirus verwendet wird.
Die Erfindung findet insbesondere bei der Behandlung von Glioblastomen Anwendung. Glioblastome sind die häufigste Form eines bösartigen Gehirntumors beim Menschen und sind nahezu immer generell fatal. Die Glioblastome stellen etwa 30% oder 50% aller primären Gehirntumore dar und sind trotz Chirurgie, Chemotherapie und Radiotherapie nahezu generell fatal. Die mittlere Überlebensrate ist weniger als ein Jahr und die fünfjährige Überlebensrate beträgt nur 3% oder 5%. Nach der Behandlung kommt es häufig zu einem Wiederauftreten der Erkrankung innerhalb von zwei Zentimetern der ursprünglichen Stelle. Metastasen sind äußerst selten; eine neurologische Funktionsstörung und der Tod sind auf ein örtliches Wachstum und einen zerebralen Befall zurückzuführen. Daher wurde die mögliche Wirksamkeit örtlicher (nichtsystemischer) Behandlungen untersucht. Einige davon beinhalten Studien der lokalen Hypothermie, der photodynamischen Therapie und der interstitiellen Bestrahlung. Bis zur vorliegenden Erfindung wirkte sich keine therapeutische Modalität wesentlich auf den Folgezustand von Patienten mit bösartigen Gliomen aus.
Die Erfindung wird nun anhand eines Beispiels mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, von welchen:
Fig. 1 eine Graphik ist, welche die in vivo Studie von Gancyclovir zeigt; und
Fig. 2 eine Graphik der Gancyclovirkonzentration gegenüber der Überlebensrate in Prozent in einem Gancyclovir-Empfindlichkeitstest ist.
Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die nur der Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung anzusehen sind. (Wenn Beispiele nicht im Umfang der vorliegenden Ansprüche liegen, sind sie zu Referenzzwecken angeführt).

Beispiel 1

Primäre humane Gehirntumore (bösartige Gliome) sind nicht eingekapselt, und es ist daher schwierig, deren vollständige chirurgische Entfernung zu garantieren. Viele dieser Tumore sind nichtmetastasisch und können gelegentlich nur einige Zentimeter in das umgebenden Gewebe eindringen. Chirurgie, Radiotherapie und Chemotherapie hatten jedoch nur eine mäßige Auswirkung auf die Gesamtmorbidität und -mortalität betroffener Patienten. Neuartige, zielgerichtete Verfahren zur Behandlung bösartiger Gliome sind eine Untersuchung Wert.
Gehirntumore sind einzigartig, da sie Massen von sich teilenden Zellen in einem Hintergrund von im wesentlichen nicht teilenden Zellen darstellen. Diese metabolischen Unterschiede können in der Entwicklung zielgerichteter Therapieverfahren genutzt werden. Retrovirusvektoren stellen ein zweckdienliches Vehikel zur selektiven Anpeilung dar, da (1) sie nur in das Genom sich teilender Zellen integriert werden können; (2) es keine Einschränkungen im Wirtsbereich gibt; und (3) diese Vektoren bereits erfolgreich zum Infizieren vieler verschiedener Zellarten verwendet wurden (für einen Überblick siehe Cepko, C., in Neuromethods, Band 16: Molecular Neurobiological Techniques, Boulton, A.A., et al., (Hrsg.), Clifton, N.J., The Humana Press, S. 177-218 (1989); Gilboa, E., BioEssays 5: 252-257 (1987); Friedmann, T., Science 244: 1275-1281 (1989)). Die Retrovirusvektoren sind replikationsdefekt und können in infektiöse retrovirale Partikel durch transfektierte Zellinien verpackt werden, die retrovirale Sequenzen enthalten, die für Proteine kodieren, die für die Verpackung retroviraler RNA notwendig sind, die aber ihre eigene RNA nicht verpacken können (z. B., Mann. R., et al., Cell 33: 153-159 (1983); Danos, O., et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 85: 6460-6464 (1988)). Da Retroviren und davon abgeleitete Vektoren in das Wirtszellgenom integriert werden, werden ihre Sequenzen zu allen Tochterzellen übertragen. Dieses Merkmal von Retroviren wurde zum Beispiel erfolgreich zum Verfolgen von Zellstammbäumen im Nervensystem verwendet (Price, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987); Luskin, M.B., et al., Neuron 1: 635-647 (1988); Walsh, C., et al., Science 241: 1342-1345 (1988)).
Das Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Thyminkinase-('TK-) Gen stellt einen bedingten Abtötungsmechanimus für sich teilende Zellen bereit. Der selektive Vorteil der Verwendung von HSV-1-TK wird von der Tatsache abgeleitet, daß dieses Enzym eine stärkere Affinität für bestimmte Nucleosidanaloge wie Acyclovir, Gancyclovir und FIAU als Säugetier-TK hat (Mc Laren, C., et al., in: Herpes Virus and Virus Chemotherapy, Kono, R. (Hrsg.), Amsterdam, Elsevier, S. 57-61 (1985)). Diese Arzneimittel werden zu nucleotidartigen Vorläufern umgewandelt und in die DNA replizierender Zellen eingebaut, wodurch die Integrität des Genoms aufgebrochen wird, was letztendlich zum Tod der Zelle führt. In einigen Studien wurde dessen bedingte Toxizität in Entwicklungsstudien transgener Mäuse (Borelli, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7572-7576 (1988); Heyman, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2698-2702 (1989)), als selektierbarer Marker gegen nichthomologe Rekombinationsereignisse in gezüchteten Zellen (Capecchi, M.R., Trends in Genetics 5(3): 70-76 (1989)), zum Abtöten von Zellen, die Herpesviren vom Wildtyp aufgenommen haben (Corey, L., et al., N. Engl. J. Med. 314: 686-691 (1986); Corey, L., et al., N. Engl. J. Med. 314: 749-756 (1986)) und zum Selektieren von Herpesvirusmutanten, welchen TK-Aktivität fehlt (Coen, D.M., et al., Science 234: 53-59 (1986)), erfolgreich genutzt.
In dieser Studie verwendeten wir Ratten-C6-Gliomzellen als Modell des primären Gehirntumortyps. C6-Zellen bilden rasch einen nicht eingekapselten, nicht metastatischen Tumor nach der Injektion in das ZNS einer erwachsenen Ratte. Ferner sind Derivatzellinien verfügbar, welchen endogene TK-Aktivität fehlt (C6-BUI) oder die das lacZ-Gen tragen (C6-BAG), die experimentell nützlich sind. Es wurde ein Retrovirusvektor erzeugt, in dem das HSV-1-TK-Gen durch den starken, konstitutiven Retrovirus-LTR-Promotor reguliert ist. C6-BUI-Zellen wurden mit diesem Vektor infiziert und durch Züchten in HAT-Medium auf TK-Aktivität selektiert. Parenterale und infizierte Zellen wurden auf ihre dosisabhängige Empfindlichkeit gegenüber Gancyclovir in Kultur und in vivo nach dem Einimpfen in die subrenale Kapsel der Ratte getestet.

Materialien und Methoden

Vektorkonstruktion. Ein 2,8 kb BamHI-Fragment, das die volle Kodierungssequenz umfaßte, und 2 kb der 3' nichtkodierenden Region (welche die Poly(A)-Additionsstelle enthielt) des HSV-1-TK-Gens (von Plasmid pBRTK) wurden in die BamHI-Stelle eines retroviralen Plasmids, pL(X)RNL, geklont. Das erhaltene Plasmid wird als pLTKRNL bezeichnet. Das pL(X)RNL-Plasmid wird vom Moloney-Maus-Leukämie-Retrovirus (MoMLV) und dem Moloney-Maus-Sarkom-Retrovirus (MoMSV) abgeleitet und enthält die folgenden Elemente: eine retrovirale Packungssequenz, psi; das Neomycin-Resistenz- (neoR-) Gen vom Transposon Tn5, das unter die transkriptionale Kontrolle eines Rous-Sarkom-Virus-(RSV-)Promotors gestellt ist; den colEl bakteriellen Replikationsursprung; und das bakterielle Ampicillinresistenzgen. Das Plasmid ist im Prinzip ähnlich jenen, von welchen in Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9011-9014 (1989); Short et al., Devel. Neurosci. 12: 34-45 (1990); und Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160 (1987); berichtet wird, mit der Ausnahme, daß es einen RSV-Promotor zum Antreiben von neoR verwendet.
Der BAG-Retrovirusvektor enthält das Escherichia coli lacZ-Gen unter der transkriptionalen Kontrolle eines retroviralen LTR-Promotors, das Transposon Tn5 neoR-Gen unter der transkriptionalen Kontrolle des SV40 frühen Promotor-Verstärkerelements, und andere Elemente wie oben (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160 (1987)).
Zellkultur: Eine ökotropische Retrovirus-Packungslinie, psi2, wurde verwendet, die von einer Maus-Fibroblastlinie abgeleitet wurde (Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983)). Die verwendeten C6-Rattengliom-abgeleiteten Zellinien waren: C6-BU1 (Amano et al., Exp. Cell Res. 85: 399-408 (1974)), eine Linie, die in BUdR auf einen Verlust der endogenen Thymidinkinaseaktivität selektiert wurde; und C6-BUI-BAG, ein Dervat von C6-BUI, das β-Galactosidaseaktivität nach einer Infektion mit dem BAG-Virus exprimiert. Die psi2-abgeleitete Linie psi2-BAG-2-14 (Short et al., Dev. Neurosci. 12: 34-45 (1990)) wurde verwendet, um das BAG-Virus zu bekommen. Alle Zellinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (GIBCO) gezüchtet, das 10% fötales Rinderserum (FBS Marke), 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml enthielt. Neomycin-resistente Zellen wurden selektiert und in demselben Medium, ergänzt mit 1 mg/ml 6418 (Neomycinanalog, GIBCO) gehalten. Zellen, die HSV-1-TK exprimierten, wurden durch Einbringen von HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin, GIBCO) in das Wachstumsmedium selektiert.
Transfektionen, Virusproduktion und Infektionen: Zur Erzeugung von replikafionsdefekten, HSV-1-TK-tragenden Retrovirusvektoren (v-TK) wurden 10 ug pLTKRNL-Plasmid DNA in psi2-Zellen durch die Kalziumphosphat-Copräzipitationsmethode unter Verwendung eines Glycerolschocks nach Standardmethode hergestellt. Transfektierte psi2-Kolonien wurden in einem Medium, das 6418 enthielt, selektiert. Zur Herstellung von Virusstämmen wurden Kulturen in Medium mit G418 gehalten, bis sie 80% Konfluenz erreichten, dann wurde ihnen Medium ohne G418 zugeführt, und 24 Stunden später wurde das virushaltige ("konditionierte") Medium entfernt, durch einen Filter mit 0,45 um Porengröße gefiltert und bei -70ºC gelagert.
Alle Infektionen erfolgten durch Austausch des Mediums auf einer 100 mm Gewebekulturschale von Empfängerzellen durch 2 ml Medium, das 4 ug/ml Polybren (Sigma) und unterschiedliche Mengen des Virusstamms enthielt.
Virustiter der psi2-v-TK-Linie wurden durch Infizieren von C6-BUI-Zellen und Bestimmen der Anzahl HAT-resistenter Kolonien, die pro Einheitsvolumen Virusstamm erhalten wurden, bestimmt. Zwei HAT-resistente Klone, C6TK-vTK1 und 3 wurden für weitere Studien verwendet. Für die psi2-BAG-Linien wurden Virustiter auf dieselbe Weise unter Verwendung von NIH3T3-Zellen und Selektion auf G418-Resistenz bestimmt.
Histochemische Färbung für β-Galactosidase: Zum Sichtbarmachen der β-Galactosidase-Expression wurden Zellen in 0,5% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,3, 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und dann mit 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-B-D-galactosidase 30 Minuten bis 4 Stunden bei 37ºC gefärbt (Turner und Cepko, Nature 328: 131-136 (1987)).
Gancyclovir-Empfindlichkeitstests in Kultur: Die folgenden Zellinien, C6, CC6-BU1, C6-VIK1 und 3 wurden auf dosisabhängige Toxizität des Nucleosidanalogs Gancyclovir getestet (Cytovene, Burroughs Wellcome). Die Zellen wurden mit einer Dichte von 100 pro 100 mm Schale ausgestrichen. 72 Stunden später wurde Gancyclovir in unterschiedlichen Konzentrationen jeder Schale zugegeben und die Inkubation 9 Tage fortgesetzt, wobei das Gancyclovir-haltige Medium alle 3 Tage gewechselt wurde. Die getesteten Konzentrationen von Gancyclovir waren: 0, 3, 10, 30, 100 und 300 um in dreifacher Ausführung. Am 9. Tag wurde das Medium entfernt, die Schalen mit PBS gewaschen, mit 100% Methanol 10 Minuten fixiert, mit einer 1 : 10 Verdünnung Giemsa (Fisher) in destilliertem Wasser weitere 10 Minute gefärbt, erneut mit Wasser gewaschen und dann getrocknet (Freshney, R.I., Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, New York, Alan R. Liss, Inc. (1987)). Die Kolonien wurden gezählt, und die Anzahl von Schalen ohne Gancyclovir wurde zur Darstellung einer 100% Überlebensrate angenommen.

Ergebnisse

Vektorkonstruktion: Die Integrität und Orientierung des HSV-1-TK-Gens in Plasmid pLTKRNL wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Nach der Spaltung mit BamHI wurden zwei Banden von etwa 2,8 kb und 6,7 kb erhalten, wie nach den jeweiligen Größen des HSV-1-TK-Gens und des pL(X)RNL-Vektors zu erwarten war. Basierend auf der Sequenz des HSV-1-TK-Gens (McKnight, S.L., Nucleic Acids Res. 8(24): 5949-5964 (1980)) wurden auch Fragmente in der erwarteten Größe nach dem Spalten mit den Restriktionsendonucleasen PstI und SmaI erhalten. Das Einfügen des HSV-I-TX-Gens in die BamHI-Stelle des pL(X)RNL-Vektors stellte es unter die Kontrolle des MoMLV LTR-Promotors.
Transfektion, Infektion: Die Packungslinie psi2-TK erzeugte 10x cfu/ml. Es konnte keine Helferviruserzeugung durch diesen Klon festgestellt werden. Virus von psi2-TK wurde zur Bildung von C6-abgeleiteten (C6-vTK) Zellinien verwendet, die in HAT-Medium wuchsen.
Gancyclovir-Empfindlichkeit in Kultur: Die Zellinien, die in dem Empfindlichkeitstest verglichen wurden, waren C6, C6-BU1 und C6VIK-1 und -3.
Gancyclovir-Empfindlichkeit in vivo: Neun Ratten wurden C6VIK-Zellen in die subrenale Kapsel implantiert. Vier überlebten das Verfahren zur weiteren Untersuchung. 5 Tage nach der Implantation wurden die Tumore gemessen. Zwei Tiere wurden mit Gancyclovir behandelt (20 mg/kg intraperitoneal pro Tag) und zwei täglich mit Kochsalzlösung. Die Tumorgröße wurde in einem 16-tägigen Zeitraum wieder bewertet. Die beiden Kontrolltumore wuchsen um das Vier- bis Zwölffache. Im Gegensatz dazu waren die beiden mit Gancyclovir behandelten nach der Behandlung kleiner als zuvor.
Diese Studien zeigen, daß ein Retrovirus, welches das HSV-1-TK-Gen trägt, dazu verwendet werden kann, C6-Gliomzellen in Kultur und in vivo Arzneimittelempfindlichkeit zu verleihen. Dies ist der erste beschriebene Retrovirusvektor, der ein aktives HSV-1-TK-Gen trägt. Er sollte über eine Reihe von möglichen Verwendungen verfügen. Erstens, wie in der Folge ausführlich beschrieben wird, sollte er sich bei der selektiven Abgabe dieses "Killergens" an Tumorzellen im Gehirn als zweckdienlich erweisen. Ein charakteristischer Vorteil des HSV-1-TK-Gens im Vergleich zu anderen toxischen Genprodukten besteht darin, daß ein zweiter Vorgang, eine Behandlung mit einem Nucleosidanalog, erforderlich ist, um den Zelltod herbeizuführen. Ferner ist eine zelluläre DNA-Replikation für die Toxidzität erforderlich, so daß nur sich teilende Zellen abgetötet werden können. Zweitens sollte es auch möglich sein, diesen Retrovirusvektor zur Eingliederung des HSV-1-TK-Gens in genetisch modifizierte Zellen zu verwenden, die zum Verpflanzen verwendet werden (z. B. Rosenberg et al., Science 242: 1575-1578 (1988)). Dies ließe die Elimination der verpflanzten Zellen zu einem bestimmten Punkt im Experiment zu, um die Wirkungen dieser Zellen auf das umgebende Gewebe zu bewerten. Drittens sollte sich dieser Vektor als zweckdienlich für die Infektion von Nachkommen-Stammzellen erweisen, um die Art und Funktion ihrer Nachkommenschaft in späteren Entwicklungsstadien und während des Lebens zu bewerten. Dieser Vektor stellt dann ein Mittel bereit, um sich teilende Zellen in Kultur und in vivo effizient zu infizieren und in ihr Genom ein Gen einzufügen, das zum Abtöten dieser Zellen oder ihrer Nachkommenschaft zu einem bestimmten Zeitpunkt durch Verabreichung eines Arzneimittels verwendet werden kann.
Jedes Jahr erkranken etwa 12000 neue Patienten in den Vereinigten Staaten an primären Gehirntumoren. 25 Prozent der primären Gehirntumore sind Glioblastome, die nur vorübergehend auf alle Formen gegenwärtig verfügbarer Therapie ansprechen oder vollständig resistent sind. Glioblastome sind nahezu generell fatal: Heilungen bleiben anektodenhaft, wobei nur 3-5% der Patienten fünf Jahre nach der Diagnose überleben. Metastasen von Glioblastomen sind jedoch äußerst selten. Glioblastome töten durch örtliches Wachstum, und in vielen Fällen treten Tumore, die mit Strahlung oder Chemotherapie behandelt wurden, innerhalb von 2 Zentimetern der ursprünglichen Stelle wieder auf. Dieser Befund läßt darauf schließen, daß einige Tumore mit einer lokalen, zielgerichteten, therapeutischen Methode behandelt werden können. Es wurden verschiedene Versuche zu lokalen Therapien durchgeführt, einschließlich der photodynamischen Therapie (Salcman et al., J. Neuro Virol. 1: 225-236 (1983)), der lokalen Hyperthermie (Cheng et al., Surg. Neurol. 28: 423-435 (1986)), der Herdbestrahlung mit interstitiellen Radioisotopimplantaten (Ortin et al., J. Neurosurg. 67: 864-873 (1987)). Bisher waren alle diese Techniken nur begrenzt erfolgreich und hatten nur eine geringe Auswirkung auf die Behandlung von Glioblastomen.
Aufgrund dieses begrenzten Erfolges wurde entschieden, Retrovirusvektoren als neuen Weg einer möglichen Therapie zu untersuchen. Retroviren nutzen die Tatsache, daß ein bösartiges Gliom eine sich teilende Zellpopulation in der Population sich nicht teilender Zellen ist, die das erwachsene Gehirn bilden. Retroviren können daher einen Selektivitätsmodus für die Gehirntumorzellen bieten, indem sie an diese ein toxisches Gen abgeben. Es wurden drei toxische Genprodukte für Ablationsstudien in transgenen Mäusen verwendet (Bernstein und Breituran, Mol. Biol. Med. 6: 523-530 (1989)). Zwei davon, Ricin und Diphtherietoxin, könnten jedoch, sobald sie in das Nervensystem abgegeben werden, für das Gehirn, die Blutgefäße, das Knochenmark und andere Gewebe toxisch sein, und Zellen, in welchen sie enthalten sind, könnten nicht abortiert werden. Aus diesem Grund wurde beschlossen, eine Strategie der Tumorzellzerstörung zu untersuchen, die das HSV-1-TK-Gen verwendet, das an sich nicht schädlich ist, aber Zellen für exogen verabreichte Arzneimittel wie Gancyclovir empfindlich macht. Auf diese Weise kann die Zellzerstörung kontrolliert werden.
Wir haben nachgewiesen, daß das HSV-1-TK-Gen in Ratten-C6-Gliomzellen eingesetzt werden kann und daß diese Zellen dadurch für Gancyclovir empfindlich werden. Für den Nachweis, daß C6-Gliomzellen, die das HSV-1-TK-Gen exprimieren, in vivo abgetötet werden können, verwendeten wir das subrenale Kapsel-Testsystem bei Ratten, da es eine direkte Messung des Tumorvolumens ermöglicht, die Erfassung kleine (< 1 mm) Volumsänderungen zuläßt und weil die Tumorvaskularisierung beobachtbar ist und das Eindringen parenteral verabreichter pharmazeutischer Substanzen ermöglicht. Dieses Modell löst die Probleme, daß eine direkte Beobachtung der Größe eines intrazerebralen Tumorimplantats nicht möglich ist, und hebt die Bedenken über eine Abgabe von Gancyclovir durch eine intakte Blut-Hirn-Schranke auf. Bei diesem subrenalen Kapselmodell zeigten wir, daß intraperitoneal verabreichtes Gancyclovir wachsende C6-Gliomzellen abtötet.

Beispiel 2

Glioblastome stellen etwa 30% der primären Gehirntumore bei Erwachsenen dar (Schoenberg, B.S., in Oncology of the Nervous System, Walker, M.D. (Hrsg.), Boston, MA: Martinus Nijhoff (1983)). Sie sind invasiv, bösartig und gegenüber herkömmlichen Behandlungsmodalitäten resistent, und werden daher im Prinzip als unheilbar angesehen. DeVita, V.T., et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Band 2, 3. Auflage, Philadelphia: Lippincott Press (1989); Shapiro, W.R., et al., J. Neurosurg. 71: 1-9 (1989); Onoyama, Y., et al., Am. J. Roentgenol. 126: 481-492 (1976); Salazar, O.M., et al., Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 5: 1733-1740 (1979); Walker, M.D., et al., N. Engl. J. Med. 303: 1323-1329 (1980). Eine wiederauftretende Krankheit tritt häufig innerhalb von 2 cm der ursprüngliche Stelle auf (Hochberg, F.J., et al., Neurol. 30: 907-911 (1980)). Bei einer mittleren Überlebensrate von weniger als einem Jahr und bei nur 5% Patienten, die fünf Jahre nach einer Diagnose trotz zahlreicher unterschiedlicher Methoden leben (Mahaley, M.S., et al., J. Neurosurg. 71: 826-836 (1989); Schoenberg, B.S., in Oncology of the Nervous System, Walker, M.D. (Hrsg.), Boston, MA: Martinus Nijhoff (1983); Kim, T.S., et al., J. Neurosurg. (in Druck); Daumas-Duport, C., et al., Cancer 62: 2152-2165 (1988), kann der Bedarf an neuartigen Behandlungsstrategien nicht überbewertet werden.
Eine Strategie ist die Verwendung viraler Vektoren zur Abgabe von Fremdgenen zur Modulation oder Zerstörung von Gliomzellen. Retroviren stellen ein mögliches Mittel für eine selektive Infektion von Tumorzellen im erwachsenen Gehirn dar, da sie nur in das Genom von sich teilenden Zellen integriert werden können und sich die meisten erwachsenen Gehirnzellen in einem ruhenden, nicht aufnahmefähigen Stadium des Zellwachstums befinden (für einen Überblick über Retroviren, siehe Varmus, H., Science 240: 1427-1435 (1988)). Diese RNA-Viren werden weitgehend als Vektoren zur Abgabe von Genen an sich teilende Zellen in Kulturen und in Embryos verwendet (für einen Überblick siehe Cepko, C., in Neuromethods, Band 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton, A.A., Boulton (Hrsg.), Clifton, NJ: Humana (1989); Gilboa, E., et al., BioTechniques 4: 504-512 (1986)). Fremdgene und Promotorelemente können in Plasmid DNA-Äquivalente des retroviralen Genoms eingesetzt werden, die das Packungssignal, psi, enthalten. Diese Plasmide werden dann in Packungszellinien transfektiert, die retrovirale Widltyp-Sequenzen tragen, welchen das psi-Element fehlt, das zur Verpackung ihrer eigenen RNA in Virionpartikel erforderlich ist (Cone, R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6349-6353 (1984); Miller, A.D., et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902 (1986); Mann, R., et al., Cell 33: 153-159 (1983)). Die Packungslinie kann die psi-tragende RNA, für die in den Fremdgen-tragenden Retrovirussequenzen kodiert wird, in Virionpartikel einsetzen. Diese Linien geben dann in das Medium nur replikationsdefekte Virionen ab, die Fremdgensequenzen und keine Replikationskomponentenvirionen enthalten. Diese replikationsdefekten Virionen können andere, sich teilende Zellen effizient infizieren und die Fremdgene in ihr Genom einsetzen.
Es wurde ein Reihe von Retrovirusvektoren für Anwendungen in der Neurowissenschaft entwickelt, einschließlich jener, die Gene für den histochemischen Marker lacZ (Price, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987)), den Nervenwachstumsfaktor (Wolf, D., et al., Mol. Biol. Med. 5: 43-59 (1988); Rosenberg, M.B., et al., Science 242: 1575-1578 (1988)), für Tyrosinhydroxylase (Wolff, J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 9011-9014 (1989); Horellou, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 7233-7237 (1989); und andere Proteine (Fredericksen, K., et al., Neuron 1: 439-448 (1988); Cepko, C., in Neuromethods, Band 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton, A.A., Boulton (Hrsg.), Clifton, NJ: Humana (1989); Cepko, C. Ann. Rev. Neurosci. 12: 47-65 (1989)) tragen. Die direkte Injektion von lacZ-tragenden Retroviren (z. B. BAG) in embryonische Gewebe in vivo kann zu einer Genabgabe in Neuroblasten und deren differenzierte Tochterzellen führen, wie zum Beispiel im Epithel, in der Retina und der Großhirnrinde beobachtet wurde (Gray, G.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7356-7360 (1988); Turner, D., et al. Nature (Lond.) 328: 131-136 (1987); Walsh, C., et al., Science 241: 1342-1345 (1988); Luskin, M.B., et al., Neuron 1: 635-647 (1988)). Es wurde keine Markierung von Zellen nach der Injektion dieser Art von Vektor in erwachsenes Nervengewebe berichtet, wie aus dem geringen Mitose-Index dieser Zellen und der relativ kurzen Halbwertszeit von Retroviruspartikeln hervorgeht (-4 Std. in Kultur; Cepko, C., in Neuromethods, Band 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton, A.A., Boulton (Hrsg.), Clifton, NJ: Humana (1989)). Einige Studien haben gezeigt, daß es möglich ist, ihre Retrovirusvektoren für die indirekte "Genabgabe" in das Gehirn erwachsener Nagetiere zu verwenden, indem sich teilende Zellen in Kultur infiziert werden und diese genetisch modifizierten Zellen dann in das Gehirn verpflanzt werden (Gage, F.H., et al., Neuroscience 23: 795-807 (1987). Dieses Verfahren wurde bei dem lacZ-Vektor zur Verfolgung des Schicksals verpflanzter Ratten-C6-Gliomzellen und Fibroblasten verwendet (Shimohama, S., et al., Mol. Brain Res. 5: 271-278 (1989)).
Ratten-Fibroblastlinine, die mit NGF- und TH-tragenden Vektoren infiziert waren, Ratten-Phäochromozytomzellen, die mit dem NGF-Vektor infiziert waren, und eine Maus-Hypophysenlinie, die mit einem TII-Vektor infiziert war, wurden zur Abgabe von biologisch aktivem NGF und/oder L-Dopa und Dopamin an Gehirnregionen erwachsener Ratten verwendet (Rosenberg, M.B., et al., Science 242: 1575-1578 (1988); Wolff, J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9011-9014 (1989); Horellou, P., et al., Eur. J. Neurosci. 2: 116-119 (1990). Mehrere neue multipotente neurale Zellinien wurden nach der Infektion mit Retrovirusvektoren, die myc und SV40T Onkogene trugen, entwickelt (Snyder, E.Y., et al., Neurosci. Abst. 9 : 9 (1989); Lendahl, U., et al., Cell 60: 585-595 (1990); Ryder, E.F., et al., J. Neurobiol. 21: 356-375 (1990)).
In dieser Studie verwendeten wir ein Nagetier-Gliommodell zur Untersuchung der möglichen Verwendung von Retrovirusvektoren zur Abgabe von Fremdgenen an Tumorzellen in vivo. Der BAG-Retrovirusvektor wurde zur Abgabe des Reportergens lacZ in Rattengliomzellen verwendet, die in das Gehirn einer erwachsenen Ratte implantiert waren. Es wurde die Infektion endogener Gehirnzellen und C6-Gliomzellen nach der direkten Injektion des BAG-Retrovirus oder nach dem Verpflanzen der psi2-BAG-Packungslinie, die diesen Virusvektor freisetzt, bewertet. Kultivierte Zellen und Gewebeschnitte wurden durch histochemische Färbung auf bakterielle Beta-Galactosidase als Index für eine erfolgreiche Genabgabe, und durch Immunfärbung auf gliales, fibrilläres, saures Protein (GFAP) und S100 als Marker für Gliomzellen und Astrozyten (Bignami, A., et al., Brain Res. 43: 429-435 (1972)), und auf Fibronektin als Marker für die Fibroblast-abgeleitete Packungslinie bewertet.

Materialien und Methoden

Zellkultur, Retrovirusinfektion und Beta-Galactosidasefärbung. Die ökotropische Retrovirus-Erzeugerlinie, psi2-BAG 2-14, die durch M. Rosenberg (UCSD) von C. Cepko (Harvard Medical School) (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987); Short, M.P., et al., Dev. Neurosci. 12: 34-45 (1990)) erhalten wurde, wurde in Dulbeccos modfiziertem Eagle's Medium, 10% fötalem Kälberserum mit 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin (D10 P/S) und 500 ugl ml Neomycinanalog, G418, gezüchtet. Alle Zellkulturmaterialien wurden von GIBCO bezogen. Virus wurde geerntet, indem das darüberliegende Medium von nahezu konfluenten Kulturen durch ein verringertes Volumen frischen Mediums ohne 6418 ersetzt wurden. Das konditionierte Medium, das virale Partikel enthielt, wurde 24-48 Stunden später entfernt, durch Zelluloseacetatmembrane (Porengröße 0,45 um, Nalgene) gefiltert und bei -70ºC gelagert. Das Virus wurde als koloniebildende Einheiten (cfu) auf 3T3 Zellen in Gegenwart von G418 titriert. Die viralen Titer betrugen 1-3 · 10&sup4; cfu/ml. In einigen Fällen wurde der Virusstamm durch Zentrifugation (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987)) auf 1-3 · 10&sup5; cfu/ml konzentriert.
Die Ratten-Gliomzellinie C6 (Benda, P., et al., Science 161: 370-371 (1968)) wurde in D 10 P/S gezüchtet. Eine C6-BAG-Linie wurde durch Infektion von C6-Gliomzellen mit dem BAG-Vektor und Isolieren einzelner Zell-Subklone unter C418-Selektion hergestellt. Die Zellen wurden durch histochemische Analyse (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 156-160 (1987)) auf Beta-Galactosidase-Aktivität untersucht. Ein Subklon (C6-BAG B2-10), in dem > 99% der Zellen nach mindestens 6 Passagen Beta-Galactosidase-positiv waren, wurden in folgenden Experimenten in Passage 2 oder 3 verwendet.

Zellverpflanzung und Retrovirusimpfung in das Gehirn erwachsener Ratten

Erwachsene Fischer-Ratten, die zwischen 151-175 g wogen, wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Equithesin narkotisiert (Short, C., Principles and Practice of Veterinary Medicine, Williams und Wilkins, Baltimore, MD (1987)). Für jedes experimentelle Paradigma wurden zwei bis fünf Tiere verwendet, und alle Experimente wurden zumindest zweimal ausgeführt. Stereotaktische Koordinaten für die intrazerebrale Injektion wurden einem stereotaktischen Atlas der erwachsenen Ratte entnommen (Paxinos, G., et al., in Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 2. Auflage, Academic Press, New York (1986)). Zellen und Virus wurden mit 8 ugl ml Polybren oder Kontrollmedium unter Verwendung einer 10 ul Hamilton-Spitze mit einer abgeschrägten Nadel der Stärke 25 injiziert. Die Injektionen (5 ul) wurden in einem 5 Min. Intervall verabreicht, und die Nadel wurde weitere 2 Min. vor der Entfernung an Ort und Stelle belassen. Der chirurgische Eingriff wurden von den meisten Tieren gut vertragen; nur einige Tiere starben während der Narkose.
Für Verpflanzungsexperimente wurden konfluente Kulturen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca++ und Mg++ gewaschen und mit 0,05% Trypsin inkubiert. Die Zellen wurden in D 10 dispergiert und durch Zentrifugation über 5 Min bei 1200 · g pelletiert. Die Zellpellets wurden in PBS resuspendiert und durch Zentrifugation gesammelt. Die endgültigen Zellsuspensionen wurden mit einer Dichte von 105 Zellen/ul in kompletter PBS (PBS, die jeweils 1 ug/ml von MgCl&sub2; und CaCl&sub2;, 0,1% Glucose und 5% Rattenserum (GIBCO) enthält) hergestellt und bis zur Implantation bei 4ºC gehalten.
Gewebevorbereitung. Vor der Perfusion wurden die Ratten mit Equithesin narkotisiert (Short, C., Principles and Practice of Veterinary Medicine, Williams und Wilkins, Baltimore, MD (1987)). Die Perfusion erfolgte über die aufsteigende Aorta mit 50 ml kalter PBS, die 10000 Einheiten/ml Natriumheparin enthielt, worauf 250 ml kalter 3% Paraformaldehyd in PBS folgten. Nach der Nachfixierung über Nacht bei 4ºC wurden die Gehirne in zunehmenden Prozentsätzen (15, 20, 30) Sucrose bei 4ºC gehalten, bis sie sanken. Die Gehirne wurden auf Trockeneis gefroren und bis zum Sektionieren bei -80ºC gehalten. Die Schnitte wurden entweder bei 40 um auf einem Gefriermikrotom geschnitten und bei 4ºC in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, mit 0,1% Natriumazid oder in 33% Polyethylenglycol bis zur Färbung gehalten; oder bei 10-15 um auf einem Kryostat geschnitten und direkt auf Objektträgern mit Gelatine-Grundschicht (Fisher, 100 Bloom) befestigt und bei 4ºC mit Trockenmittel bis zur Färbung gelagert.
Histologie. Für die Beta-Galactosidase-Histochemie von Geweben (und Zellen) wurde eine Modifizierung der Methode von Turner und Cepko (Turner, D., et al., Nature (London) 328: 131-136 (1987) verwendet. Kurz, es wurde 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-B-D-galactosid (X-gal, Boehringer Mannheim) als 4% Stammlösung in DMSO zubereitet. Frei schwimmende oder befestigte Schnitte (oder Zellen auf Gewebekulturschalen) wurden bei 37ºC in einer Lösung von PBS inkubiert, die 2 mM MgCl&sub2;, 35 mM K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 35 mM K&sub4;Fe(CN)&sub6;, 0,01% Natriumdesoxycholat und 0,02% NP4O, pH 7,3, enthielt; 0,1% X-gal wurde unmittelbar vor der Inkubation zugesetzt. Nach der Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden gezüchtete Zellen direkt betrachtet und Schnitte mit PBS gespült, auf grundbeschichteten Objektträgern befestigt und dann mit Hämatoxylin und Eosin oder neutralem Rot gegengefärbt. Sie wurden in Wasser gespült, in zunehmenden Alkoholkonzentrationen gereinigt, und vor der Bedeckung mit wässerigem Einbettungsmedium, Crystal Mount (Biomedia) in Wasser gelegt, oder vor der Bedeckung mit Permount (Fisher) in Xylol gelegt:
Einige Schnitte wurden zur Identifizierung von GFAP, S100 oder Fibronectin auch immunhistochemisch gefärbt. Die Schnitte wurden in PBS gespült, 30 Minuten mit Blockierungsserum und dann über Nacht bei Raumtemperatur mit den folgenden Antikörpern inkubiert: monoklonale Maus-Antikörper gegen humanes GFAP (Boehringer Mannheim), verdünnt 1 : 3, polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Rinder S100 (Dako, verdünnt 1 : 750, oder monoklonaler Maus-Antikörper gegen Human-Fibronectin (Cappell), verdünnt 1 : 80, die alle mit ihren entsprechenden Ratten-Antigenen kreuzreagieren. Die Antikörper wurden in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt, der 0,9% NaCl, 0,25% Triton-X und 3% Blockierungsserum enthielt. Nach dem gründlichen Spülen wurden die Schnitte 2 Stunden entweder mit biotinyliertem Pferd-Antimaus-IgG, biotinyliertem Ziegen-Antikaninchen-IgG, oder Kaninchen-Antiziegen-IgG (Vectastain), verdünnt 1 : 200 in dem Puffer, inkubiert, worauf mehrere Spülungen in PBS folgten. Die Schnitte wurden dann 30 Min. mit einem Komplex aus Avidin und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (Vectastain, ABC Elite-Kit), verdünnt 1,5 : 100 in dem Puffer, inkubiert. Die Peroxidase wurde durch Reaktion mit 0,05% 3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid, 0,04% NiCl&sub2; und 0,01% H&sub2;O&sub2; in 50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 5-10 Min. bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. In einigen Fällen wurden die Schnitte zu Beginn histochemisch für die Beta-Galactosidase-Aktivität gefärbt und dann für GFAP immungefärbt. In anderen Fällen wurden Schnittserien abwechselnd für Beta-Galactosidase und GFAP oder S100 gefärbt.

Ergebnisse

Die histochemische Färbung von psi2-BAG-Zellen in Kultur zeigte eine nahezu 100% positive Färbung für Beta-Galactosidase und keine Färbung für GFAP, während die meisten C6-Zellen positiv für GFAP-Antigen färbten und alle unter den neutralen verwendeten Bedingungen eine negative Färbung für Beta-Galactosidase aufwiesen. Die Fähigkeit der psi2-BAG-Zellen, das BAG-Virus freizusetzen, das C6-Zellen infizieren könnte, wurde nachgewiesen, indem Deckgläser, die jede dieser beiden Zellarten enthielten, an getrennten Stellen in dieselbe Kulturschale eingebracht wurden. In Gegenwart von psi2-BAG-Zellen färbte sich ein ständig zunehmender Prozentsatz von Zellen auf dem Deckglas, das C6-Zellen trug, in einem 96 stündigen Zeitraum positiv für Beta-Galactosidase. Im wesentlichen waren alle Zellen auf dem Gliom-Deckglas auch GFAP-positiv. Dies stimmt mit dem erfolgreichen Einbau des BAG-Virus, der von psi2-BAG-Zellen freigesetzt wird, in Gliom-Zellgenome überein.
Die Wirksamkeit des in vivo Gentransfers in endogene Gehirnzellen wurde durch direkte Impfung von 5 ul BAG-Retrovirusvektor (90-900 cfu) in den Hippocampus oder Nucleus caudatus erwachsener Ratten getestet. Kontrolltiere wurden auf gleiche Weise mit kompletter PBS geimpft. 7 Tage nach den Injektionen wurden die Tiere getötet. Bei den Tieren, welche die direkte Virusinjektion empfangen hatten, wie auch bei den Kontrolltieren wurden im Parenchym keine Zellen entdeckt, die Beta-Galactosidase-positiv waren. Einige Schnitte von beiden Gruppen zeigten eine schwache positive Färbung für Beta-Galactosidase innerhalb des Plexus choroideus, wie zuvor festgehalten wurde (Shimohama, S., et al., Mol. Brain Res. 5: 271-278 (1989)). In diesen Kontrollschnitten war die Färbung qualitativ anders als bei Tieren, in welchen positiv verfärbte Zellen in der Tumormasse vorhanden sind (siehe unten).
Die Wirksamkeit der direkten Impfung von Tumorzellen in das Gehirn wurde mit verschiedenen Intervallen zwischen dem Zeitpunkt der C6-Zellimplantate und der Virusinjektion unter der Annahme getestet, daß die Gliomzellen nach der Impfung eine Wachstumsverzögerung erfahren könnten und sich somit zunächst nicht in einem Stadium der Zellteilung befinden könnten, das für eine Virusintegration geeignet ist. Die Stelle der Implantation und Infektion war der rechte Stirnlappen. Zur gleichzeitigen Injektion von Gliomzellen und BAG-Virus wurden C6-Zellen (5 · 10&sup5;) in 5 ul Virusstamm (90-900 cfu) suspendiert. Andere Tiere erhielten spätere Injektionen des Virusstamms in die frühere Stelle des C6-Zellimplantats. Fünf ul-Teilmengen des Virusstamms wurden unter Verwendung derselben stereotaktischen Koordinaten, mit welchen die C6-Zellen 3 und 5 Tage zuvor implantiert worden waren, injiziert. Kontrolltiere erhielten Implantate von C6- oder C6-BAG-Zellen ohne Virus. Alle Tiere wurden sieben bis zehn Tage nach der letzten Virusinjektion getötet. Bei gleichzeitigen Injektionen von C6-Zellen und BAG-Virus färbten sich nur einige Tumorzellen (weniger als 0,1%) für eine Beta-Galactosidase-Aktivität. In einigen Fällen wurden auch gefärbte Endothelzellen in Gefäßen innerhalb der und um die Tumormasse festgestellt. Bei den Tieren, bei welchen es eine Verzögerung zwischen dem Tumorimplantat und der Virusinjektion gab, wurden wieder nur einige wenige positive Zellen gesehen. Es gab keinen bemerkenswerten Unterschied zwischen der Anzahl von positiv verfärbten Zellen bei Tieren, die eine Verzögerung vor der Virusinjektion erfahren hatten, im Vergleich zu jenen, die eine gleichzeitige Injektion von C6 und BAG-Virus erhalten hatten. Injektionen von C6- und C6-BAG-Zellen führten zu Tumoren ähnlicher Größe. Bei den C6-Zellinjektionen ohne Virus wurden keine blauen Zellen gesehen; bei den C6-BAG-Injektionen waren alle Tumorzellen Beta-Galactosidase positiv, wie zuvor festgestellt wurde (Shimohama, S., et al., Mol. Brain Res. 5: 271-278 (1989)).
Zur Untersuchung des Schicksals von Implantaten von psi2-BAG-Packungszellen wurden Tieren psi2-BAG-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen) in den rechten Stirnlappen injiziert und als Kontrolle eine gleiche Anzahl von psi2-Zellen in den linken Stirnlappen. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation getötet. Nach einem Tag wurde eine kompakte Masse Beta-Galactosidase-positiver Zellen an der Injektionsstelle an der rechten Stirn beobachtet. An der linken Seite wurden am Tag 1 keine positiv gefärbten Zellen erkannt, auch nicht an einer der Seiten in den Schnitten, die von Tieren erhalten wurden, die am Tag 5, 9, 14 bzw. 21 nach der Implantation getötet wurden. Es gab keinen Hinweis auf eine Tumorbildung oder andere degenerative Veränderungen im Gehirn in diesem Zeitraum.
Dann wurde die Wirksamkeit des in situ Gentransfers des lacZ-Gens in C6 durch Co-Implantation der Packungslinie, psi2-BAG, getestet. Für gleichzeitige Co-Implantate enthielt die Zensuspension eine Mischung von Zellen in einem Verhältnis von einer C6-Zelle zu fünf psi2-BAG-Zellen. Die Stelle der Implantation war wieder der rechte Stirnlappen. Für verzögerte Injektionen empfingen Tiere Implantate von C6-Zellen (2 · 10&sup5; Zellen) am Tag 1, gefolgt von Injektionen von 5 ul psi2-BAG-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen) an Tag 3 oder 7. In allen Fällen wurden die Tiere sieben Tage nach der Implantation der psi2-BAG-Zellen getötet. Kontrollen mit nur psi2-BAG und C6 wurden anderen Tieren parallel injiziert. In histochemisch gefärbten Schnitten von Tieren, die gleichzeitige Co-Implantate von C6 und psi2-BAG-Zellen erhielten, wurden sowohl blaue als auch nicht blaue Zellen in der Tumormasse erkannt. Einige dieser Beta-Galactosidase-positiven Zellen verfärbten sich auch für GFAP oder S100, was darauf hinweist, daß sie C6-Gliomzellen waren. Es gab auch viele GFAP- oder S100-positive Zellen in der Tumormasse, die nicht Beta-Galactosidase-positiv waren. Einige der anderen Beta-Galactosidase-positiven Zellen könnten C6-Zellen ohne oder mit geringer Expression von GFAP oder S100 sein. Tatsächlich war bei C6-Zellen, die alleine in das Gehirn implantiert wurden, nur etwa die Hälfte der Zellen in der erhaltenen Tumormasse S100-positiv, und noch weniger waren GFAP-positiv. Einige der Beta-Galactosidase-positiven Zellen könnten auch psi2-BAG-Zellen sein, die in der Tumormasse im Vergleich zu dem Gehirnparenchym länger überlebt haben; die Immunfärbung auf Fibronectin zeigte jedoch keine psi2-BAG-Zellen in Co-Implantaten nach 7 Tagen. Die Untersuchung von Schnittserien dieser Tumore zeigte viele Schnitte ohne Beta-Galactosidase-positive Zellen, und unsere beste Schätzung ist, daß etwa 1% der Zellen in dem Tumor das lacZ-Gen in Tieren exprimierte, die eine gleichzeitige Injektion von psi2-BAG-Zellen und C6-Zellen erhielten. Im Gegensatz dazu enthielten Schnitte, die von Tieren erhalten wurden, die verzögerte Injektionen der Packungslinie in die Tumormasse erhalten hatten, in allen Schnitten im gesamten Tumor viele Zellen, die positiv für Beta-Galactosidase gefärbt waren, wobei bis zu 10 % der Zellen positiv waren und sich die meisten positiven Zellen am Umfang des Tumors befanden. Die Co-Färbung für das gliaspezifische Antigen S100 und Beta-Galactosidase enthüllte, daß viele der Zellen in dem Tumor Glia-abgeleitet waren und einige davon auch positiv für Beta-Galactosidase-Aktivität waren. Die Infektion der Tumorzellen scheint somit effizienter zu sein, wenn die Packungslinie nach der Etablierung der Tumorzellen verpflanzt wird, als bei der gleichzeitigen Injektion von Tumor- und Packungszellen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Tieren, bei welchen der Abstand zwischen Injektionen drei Tage betrug, und jenen, bei welchen er sieben Tage betrug.
Diese Studie zeigt die Wirksamkeit eines replikationsdefekten Retrovirusvektor bei der Abgabe des Reportergens lacZ an Gliomzellen der Ratte in Kultur und im Rattengehirn. In Kultur infizierte der BAG-Retrovirusvektor, der von psi2-BAG-Zellen freigesetzt wird, C6-Zellen erfolgreich in derselben Schale, wie durch Färben auf Beta-Galactosidase-Aktivität nachgewiesen wurde. Die Morphologie und Immunreaktivität gegenüber GFAP bestätigte die Identität der Beta-Galactosidase-positiven Zellen als Gliomzellen. Die Wirksamkeit der Übertragung des lacZ-Gens auf endogene Gehirnzellen oder auf C6-Zellen in vivo wurde dann durch zwei Techniken verglichen: die direkte Injektion des BAG-Virus oder die Verpflanzung der Packungslinie, die das Virus freisetzt. Die höchste in vivo Wirksamkeit wurde durch Verpflanzen der Retrovirus-Packungslinie in eine gebildete Schicht von C6-Tumorzellen erhalten.
Anfängliche Versuche zur Abgabe des Reportergens durch direkte Injektion des Virus in das Parenchym eines normalen Gehirns einer erwachsenen Ratte erzeugten im wesentlichen keine Beta-Galactosidase-positiven Zellen. Bei diesen Tieren wie auch bei Kontrollen, die mit kompletter PBS geimpft wurden, wurde eine schwache positive Färbung im Plexus choroideus gesehen, nicht aber im Parenchym. Diese endogene positive Färbung von lysosomaler Beta-Galactosidase wurde zuvor berichtet (Shimohama, S., et al., Mol. Brain Res. 5: 271-178 (1989)) und war maskiert, wenn Schnitte mit neutralem Rot gegengefärbt wurden. Die erfolglose direkte Genabgabe durch den Virusvektor war nicht überraschend, da die Mehrzahl von Zellen in erwachsenen Raten, selbst in jungen postnatalen Tieren, postmitotisch sind und die Zellteilung für eine Integration des Retrovirus notwendig ist. Die Impfstelle, der Hippocampus, wurde gewählt, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Integration zu erhöhen, da Zellen in dieser Region die letzten sind, die mit der Teilung nach der Geburt aufhören (Das, G.D., et al., Brain Research 22: 122-127 (1970)). Bei Tieren, welchen das BAG-Virus entweder gleichzeitig mit Gliomzellen oder mit Abstand nach dem Gliomimplantat eingeimpft wurde, wurden nur einige isolierte Tumorzellen erfolgreich infiziert. Dies reflektiert wahrscheinlich die relativ kurze Halbwertszeit des Retrovirus in vivo und den Teilungszustand der Gliomzellen. Von den wenigen Beta-Galactosidase-positiven Zellen wurden die meisten an den Rändern des Tumors gefunden, wo die höchste mitotische Aktivität vermutet wird. Gelegentlich wurden gefärbte Endothelzellen beobachtet, die zu erwarten waren, da Endothelzellen sich in den Blutgefäßen des Gehirns weiter teilen, insbesondere in einer gefäßreichen Tumorschicht.
Sowohl der Virustiter als auch das Volumen des Impfmaterials stellen wesentliche Begrenzungen für das Erreichen eines höheren Maßes einer erfolgreichen Integration unter Verwendung der direkten Virusinjektion dar. Versuche zur Erhöhung des Virustiters durch Zentrifugation erhöhten den Titer nur um das 10- bis 100-Fache. Bei der Beimpfung eines Gliatumors, die mit etwa 10&sup5; Zellen begann, mit 5 ul eines Retrovirusstamms von 10&sup4;-10&sup6; cfu/ml, ist das Verhältnis von Virus zu Zelle viel geringer als eins zu eins (Infektionsmultiplizität (MOI) ≤ 0,01). Bei uns ist die Wirksamkeit der Infektion sich rasch teilender C6-Zellen in Kultur mit dem BAG-Retrovirusvektor bei einer MOI von 3 etwa 30%. Daher ist es nicht überraschend, daß die direkte Impfung des Tumors in vivo ineffizient war.
Die Implantation der Packungslinie scheint einige der Einschränkungen der direkten Beimpfung zu überwinden, indem das Virus über einen längeren Zeitraum in den Tumor freigesetzt wird. Diese Studie zeigt, daß die gleichzeitige Verpflanzung der Packungslinie, psi2-BAG und Gliomzellen dazu dient, das Reportergen lacZ effizienter an diese Tumorzellen abzugeben als bei einer direkten Virusbeimpfung. Die Wirksamkeit war bei Tieren, welchen Gliomzellen 3 oder 7 Tage vor der Implantation von psi2-BAG-Zellen implantiert wurden, im Vergleich zur gleichzeitigen Verpflanzung dieser beiden Zelltypen größer. Die histochemischen Analysen von Schnitten, die von den Gehirnen von Tieren erhalten wurden, die verzögerte Injektionen erhalten hatten, zeigten, daß größere Bereiche des Tumors erfolgreich infiziert waren. Die Gehirne wurden eine Woche nach der psi2-BAG-Implantation untersucht, da sie in einem eigenen Experiment, in dem nur die psi2-BAG-Zellen implantiert wurden, fünf Tage später nicht nachweisbar waren. Ferner zeigte die Immunfärbung von Co-Implantaten nach 7 Tagen keine Fibronectin-positiven Zellen. Dies läßt darauf schließen, daß es entweder zu einer Immunabstoßung des psi2-BAG-Implantats aufgrund eines Unterschiedes in den Rattenstämmen gekommen war, oder daß das retrovirale kodierte Gen, falls vorhanden, nicht mehr exprimiert wurde (Palmer, T.D., et al., persönliche Mitteilung). Durch Immunhistochemie stellten wir fest, daß einige der Zellen in dem Tumor sich sowohl für Beta-Galactosidase-Aktivität als auch für GFAP- oder S100-Antigene verfärbten, was eine erfolgreiche Infektion von Gliomzellen durch das BAG-Virus bestätigte, das von den psi2-BAG-Zellen freigesetzt wird. Es gibt jedoch GFAP- und S100-positive Zellen in dem Tumor, die Beta-Galactosidase-negativ sind, was auf eine unvollständige Infektion von Tumorzellen schließen läßt.
Es können mehrere Mittel zur Erhöhung der Effizienz der Infektion von Gliomzellen im Gehirn durch gleichzeitige Verpflanzung von Retrovirus-Packungslinien in Betracht gezogen werden. Eine Möglichkeit wäre, eine Reihe von Injektionen der Packungslinie auszuführen, um die Anzahl von Zellen zu erhöhen, die das Virus in der Tumorschicht über einen längeren Zeitraum freisetzen. Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Menge und Dauer der Virusfreisetzung wäre die Entwicklung einer Packungslinie, die mit dem Wirt immunverträglich ist und somit nach der Verpflanzung länger überlebte. Die Freisetzung in ein größeres Gebiet, welches das den Tumor umgebende Gehirnparenchym enthält, könnte auch unter Verwendung einer Astrozyt-abgeleiteten Packungslinie erreicht werden. Es hat sich gezeigt, daß verpflanzte neugeborene und embryonische Astrozyten bis zu 5 mm von ihrer ursprünglichen Injektionsstelle aus wandern können und besser als Fibroblasten infiltrierende gliale Tumorzellen erreichen können (Jacque et al. (1986); Zhou, H.F., et al., J. Comp. Neurol. 292 : 320-330 (1990); Hatton, J.D., et al., Soc. for Neurosci. Abstracts 15: 1369 (1989)). Zusätzlich könnte eine Glia-abgeleitete Packungslinie, die von Glia abgeleitet wird, die endogene Gehirnzellen sind, eine verbesserte Überlebensrate haben und auf in situ Signale besser ansprechen. Im Falle von spontanen Gehirntumoren wäre ein Schema denkbar, in dem die Tumormasse entfernt wird, einige Tumorzellen zurückgelassen werden und die Packungslinie direkt in die Läsion verpflanzt wird. Dies würde dazu dienen, die Anzahl von Packungszellen, die eingepflanzt werden kann, und das Verhältnis von Packungszellen zu Tumorzellen zu erhöhen und somit die Möglichkeit zur Infektion von Tumorzellen zu verbessern.
Diese Studie stellt ein Modellsystem vor, das zur Abgabe von Genen mit therapeutischem Potential an bösartige gliale Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) verwendet werden kann, die zur Zeit eine einzigartige Aufgabe in der Onkologie darstellen. Eine vollständige chirurgische Entfernung ist unmöglich, da die Tumorzellen in das normale Gehirn infiltrieren. Die Strahlungstherapie ist durch die Anfälligkeit des normalen Gehirns für eine Strahlenschädigung begrenzt. Die Chemotherapie wird durch die Gegenwart einer Blut-Hirn-Schranke behindert, welche die Nützlichkeit von Mitteln verringert, die nicht imstande sind, diese Schranke zu durchqueren, um die infiltrierenden Tumorzellen zu erreichen. Retroviren stellen mögliche therapeutische Mittel dar, die Tumorzellen eine genetische Empfindlichkeit verleihen können. Ein Beispiel wäre eine Retroviruspackungslinie, die Virionen freisetzt, welche das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-(HSV-TK-)Gen enthalten (Moolten, F.L., et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 297-300 (1990)). Bei der Integration in das Säugetierzellgenom, verleiht das HSV-TK-Gen eine Empfindlichkeit für chemotherapeutische Mittel wie die Nucleosidanaloge Acyclovir, Gancyclovir und FIAU (Borelli, E., et al., Nature 339: 538-541 (1989); Moolten, F., Cancer Res. 46: 5276-5281 (1986)). Zellkulturstudien haben gezeigt, daß C6-Gliomzellen und andere Zellen, die mit diesem Retrovirus infiziert sind, bei Konzentrationen von Gancyclocir abgetötet werden, die um das 100-Fache geringer sind als jene, die zum Abtöten nicht infizierter Zellen notwendig sind (Moolten, F.L., et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 297-300 (1990)).
Es kann auch möglich sein, C6-Gliomzellen durch anschließende gleichzeitige Verpflanzung der HSV-TK-Viruspackungslinie und Behandlung von Tieren mit einem Nucleosidanalog abzutöten. Ferner können Tumorgefäße ein zusätzliches Ziel für ein vorgeschlagenes Abtötungssystem unter Verwendung des HSV-TK-Gens sein.

Beispiel 3

Retrovirusvektoren können zur Übertragung von Genen in das Genom sich teilender Zellen verwendet werden. Zur Erhöhung der Wirksamkeit der Genabgabe und des Abtötungseffekts von Gancyclovir entwickelten wir eine neue Packungslinie (C6VIK-WT) durch Infektion von C6VIK-Zellen mit einem ökotropischen Wildtyp-Retrovirus (MoMLV). Siehe Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983); Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160 (1987); und Cepko, C., in Neuromethods: Molecular Neurobiological Techniques, Band 16, Boulton et al., Hrsg. (Clifton, NJ, Humana), S. 177-219. Da Tumorzellen tief in das Gehirnparenchym wandern können, sollten sie imstande sein, den Vektor an Tumorzellen abseits der Tumormasse abzugeben. In Kultur wurden 50% der C6VIK-WT-Zellen bei 0,024 uM GCV abgetötet, während 7,3 uM GCV zum Abtöten von 50% der C6VIK-Zellen erforderlich waren. Dies läßt darauf schließen, daß C6VIK-WT-Zellen aufgrund der mehrfachen Integration des HSV-TK-Gens oder aufgrund einer erhöhten Empfindlichkeit von C6VIK-WT-Zellen für toxische GCV-Produkte eine höhere HSV-TK-Aktivität haben als C6VIK. Wenn C6VIK und C6VIK-WT mit C6-BAG-Zellen (die mit dem LacZ-Gen markiert und somit durch Beta-Galactosidase-Histochemie nachweisbar waren) kultiviert wurden, wurden nach der GCV-Behandlung deutlich mehr C6-BAG-Zellen abgetötet, wenn sie gemeinsam mit C6VIK-WT kultiviert wurden als mit C6VIK-Zellen. Vermutlich produzieren C6VIK-WT-Zellen sowohl Wildtyp-Retrovirus als auch Retrovirusvektoren, die das HSV-TK-Gen enthalten (keine von beiden werden von C6VIK-Zellen erzeugt) und der Tod von C6-BAG-Zellen könnte durch eine Retrovirusinfektion und/oder selbst erzeugte toxische GCV-Produkte herbeigeführt werden. Die in vivo GCV-Behandlung bewirkte eine Regression von Tumoren bei den meisten nackten Mäusen, die subkutan mit C6VIK-WT-Zellen oder gleichzeitig mit C6VIK-WT- und C6BAG- Zellen aber nicht nur mit C6BAG-Zellen beimpft wurden. Diese Befunde lassen darauf schließen, daß die Wirksamkeit einer durch Retroviren vermittelten Genabgabe und die Empfindlichkeit gegenüber toxischen Substanzen von Tumorzellen unter Verwendung eines Helfervirus erhöht werden kann, das Zellen, die mit Retrovirusvektoren infiziert sind, zu Packungszellinien umwandelt.
Die Verwendung von Retrovirusvektoren zur Genabgabe muß nicht auf Gensysteme beschränkt sein, die zur Tumorzerstörung konstruiert sind. Die Abgabe von Genen, die an der Tumorentstehung oder Tumormodulierung beteiligt sind, könnte auch eine nützliche zu untersuchende Strategie sein. Der Verlust der Heterozygotie für DNA-Marker an Chromosom 17, 10 und, weniger häufig, Chromosom 22 in glialen Tumoren läßt darauf schließen, daß die Tumorsuppressorgene in diesen chromosomalen Regionen liegen (Bigner, S.H., et al. Hereditas 101: 103-113 (1984); Bigner, S.H., et al. Cancer Res. 88: 405-411 (1988); James, C.D., et al., Cancer Res. 48: 5546-5551 (1988); El-Azouzi, M., et al., Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 86: 7186-7190 (1989)). Es hat sich gezeigt, daß die Wiederherstellung der Retinoblastom-Genfunktion das Wachstum von Retinoblastomen und Osteosarkomzellen in Kultur hemmt (Huang, H.-J.S., et al., Science 242: 1563-1566 (1988)).
Modifizierungen der zuvor beschriebenen Formen zur Ausführung der Erfindung, die bekannt sind oder von Fachleuten in der Medizin, Immunologie, Hybridomtechnologie, Pharmakologie und/oder verwandten Gebieten routinemäßig gefolgert werden können, sollen im Umfang der folgenden Ansprüche enthalten sein.

Claims

1. Verwendung von Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen in der Zubereitung einer antineoplastischen Zellsubstanz oder einer sensibilisierenden Substanz gegen neoplastische Zellen, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:

1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder

2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die neoplastischen Zellen Zellen eines Nervensystemtumors umfassen.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Nervensystemtumor ein Zentralnervensystemtumor ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Zentralnervensystemtumor ein Astrocytom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neurofibrom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrosarcom und/oder insbesondere ein Glioblastom ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Genprodukt Thymidinkinase ist und die chemische Behandlung eine Behandlung mit Gancyclovir ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei auch ein Helfervirus zur Erhöhung der Genbildung bereitgestellt ist.

7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Packungszellen mit einer Chemikalie kombiniert sind, die zur Verwendung in der genannten chemischen Behandlung geeignet ist.

8. Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen zur Verwendung in der Medizin, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:

1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder

9. Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 8, wobei das Genprodukt Thymidinkinase ist und die chemische Behandlung eine Behandlung mit Gancyclovir ist.

10. Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 8 oder 9, umfassend ein Helfervirus oder kombiniert mit diesem.

11. Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen zur Verwendung in der Medizin nach einem der Ansprüche 8 bis 10, kombiniert mit einer Chemikalie zur Verwendung in der genannten chemischen Behandlung.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

a) Retrovirusvektor-produzierende Packungszellen, wobei der Retrovirusvektor, der von den Packungszellen erzeugt wird, neoplastische Zellen infizieren kann, die bereits in einem Patienten vorhanden sind, und wobei der Retrovirusvektor ein Gen enthält, dessen Genprodukt imstande ist:

1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder

2) die neoplastischen Zellen zu sensibilisieren, so daß sie durch zusätzliche chemische Behandlung oder Strahlung abgetötet werden können, und

b) einen pharmazeutisch annehmbaren (z. B. sterilen) Träger.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, die eine injizierbare Lösung ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Genprodukt Thymidinkinase ist und die chemische Behandlung eine Behandlung mit Gancyclovir ist.

15. Produkt, umfassend:

1) die neoplastischen Zellen abzutöten, oder

b) eine Chemikalie zur Verwendung in der chemischen Behandlung,

als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen, aufeinanderfolgenden oder getrennten Verwendung in der Tumortherapie.

16. Produkt nach Anspruch 15, ferner umfassend ein Helfervirus.

17. Produkt nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Genprodukt Thymidinkinase ist und die Chemikalie Gancyclovir ist.

18. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, umfassend das Vermischen der Retrovirusvektor-produzierenden Packungszellen und des pharmazeutisch annehmbaren Trägers.