CN104519989B - 制备包含气体微泡的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备超声波造影介质的方法，具体而言，涉及包含气体微泡的组合物，且更具体而言，涉及由蛋白质包囊的微泡。通过本发明的方法生成的微泡将具有窄尺寸分布。本发明还涉及可用于本发明的方法中的设备。

Description

制备包含气体微泡的组合物

发明领域

本发明涉及超声波造影介质。更具体而言，本发明涉及制备超声波造影介质的方法，特别是，涉及包含气体微泡的组合物，且更特别是，涉及使用机械能制备的由蛋白质包囊的微泡。

发明背景

已经熟知，例如在脉管系统(特别是在心动描记法中)和组织微脉管系统的研究中，超声波成像为有价值的诊断工具。已经建议了各种超声波造影介质来增强所获得的声学图像，包括固态粒子的悬浮液、乳化液滴、气泡和包囊的气体或液体。最成功的超声波造影介质通常由可静脉注射的小气泡的分散体组成。例如WO 97/29783和WO93/05819描述这样的微泡分散体。如果适当地稳定化，则微泡常在有利的低剂量下可容许例如脉管系统和组织微脉管系统的高效超声波可视化。这种造影介质通常包含使气体稳定的材料，例如乳化剂、油、增稠剂或糖，或通过将气体夹带或包囊在各种系统中，例如作为多孔含气体的微粒或作为包囊的气体微泡。微泡包含对于超声波造影剂的性能必不可少的气体，并且已经发现各种气体增强诸如微泡稳定性和产生回波作用的持续时间的性质。制备一组超声波造影介质并将其作为包含包囊的气体微泡的液态组合物的预制备制剂传送。

可使用各种方法来制备微泡。这种含气体的微泡可通过在合适气体或气体混合物存在下振荡或超声处理含有成膜材料的液体来生成。其他方法包括喷雾干燥。然而，通过所述技术生成的微泡具有宽尺寸分布，其在各批次之间可能不同，此外，产率—即最终形成适当尺寸的微泡的成膜材料的百分数，在各批次之间也可能不同。US5,552,133描述使用胶体磨制备包含包囊气体的可热变性蛋白质的包囊的气体微球的方法。将可热变性蛋白质的水溶液与气体组合，且通过施加机械剪切力混合成混合物以形成气体微泡的悬浮液，其中该蛋白质变性并沉积在气-溶液界面上。

在制备微泡时，重要的是具有重复地提供符合产品规格的产品的稳健方法。所生成的微泡将理想地具有所要微泡尺寸左右(通常1-7μm、例如3-5μm)的窄尺寸分布。诸如大于7μm的大微泡的百分数理想地应该最低且严格受限。为此，微泡尺寸的标准偏差应该较小。这在使用现有技术的方法时并没有实现。一种挑战是在加工周期中和在工艺每次进行时都生成具有窄尺寸分布的可重现的微泡。已经探索了用于制备造影介质、诸如用于制备包含由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物的稳健方法。

发明概述

鉴于本领域的需要，本发明提供用于制备造影介质、诸如用于制备包含由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物的稳健方法。已经确定并研发了其中可改善产率且避免尺寸过大或过小的微泡的过度生成的方法。在本发明的方法中，将可热变性蛋白质的水溶液与气体组合，且使用高剪切力将它们机械混合。已经意外地发现，在混合所述蛋白质与所述气体之前，所述蛋白质和所述气体都将被加热，提供其中所产生的微泡具有窄尺寸分布的稳健方法。

因此，一方面，本发明提供用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的方法，其包括以下序贯的步骤：

i) 提供处于实现初步变性所必需的温度的可热变性蛋白质的蛋白质水溶液；

ii) 通过使用来自所述加热的蛋白质溶液的热来加热气体；

iii) 混合所述加热的气体与所述加热的蛋白质溶液以获得气/液混合物；

iv) 通过使所述气/液混合物经受机械剪切力而将所述气体分散到所述蛋白质溶液中以形成由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物。

第二方面，本发明提供可用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的进料管道，其中所述进料管道包括：

i) 提供两个路径的相应开口的第一入口和第二入口，

ii) 包括隔开这两个路径的纵向壁的传热区段，

iii) 一个可与混合装置的入口连接的出口。

第三方面，本发明提供包括本发明的进料管道的设备。根据该方面的设备可包括：

i) 产生高机械剪切力且具有入口和出口的混合装置；

ii) 进料管道，其包括：

提供两个路径的相应开口的第一入口和第二入口，

包括隔开这两个路径的纵向壁的传热区段，

一个与所述混合装置的入口连接的出口；

iii) 与所述进料管道的第一入口连接的供液态组合物用的进料罐；

iv) 与所述进料管道的第二入口连接的气罐。

附图简述

图1示意性表示可用于制备包含由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物的设备；

图2a、2b和2c示意性表示根据本发明的进料管道，其包括两个路径：一个路径用于传输气体且一个路径用于蛋白质溶液；

图3a、3b和3c示意性表示根据本发明的供选的进料管道。

发明详述

第一方面，本发明提供用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的方法，其包括以下序贯的步骤：

i) 提供处于实现初步变性所必需的温度的可热变性蛋白质的蛋白质水溶液；

ii) 通过使用来自所述加热的蛋白质溶液的热来加热气体；

iii) 混合所述加热的气体与所述加热的蛋白质溶液以获得气/液混合物；

iv) 通过使所述气/液混合物经受机械剪切力而将所述气体分散到所述蛋白质溶液中以形成由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物。

使用本发明的方法，在蛋白质溶液和气体进入在步骤iv)中使用的混合装置之前加热蛋白质溶液和气体两者，避免气体在进料到混合装置时膨胀。已经发现这在提供稳定的工艺和窄尺寸分布的微泡方面是一项关键因素。所述方法使用来自蛋白质溶液的热来加热气体，之后将它们组合。因此，在引入混合装置之前，将蛋白质溶液和欲包囊的气体两者预热。将蛋白质加热到发生蛋白质的初步变性的温度。该变性温度为最先观察到不溶性物质的温度。该变性温度可从文献中的热蛋白质变性的表格中获得，或通过任何已知方法用实验获得。在溶液中的蛋白质的变性温度通常会在50-100℃范围内，根据不同蛋白质、纯度和来源等而变化。在本发明的方法中，白蛋白为提供包囊的微泡的优选蛋白质。当使用白蛋白溶液时，将其加热到60-80℃，更优选65-75℃且最优选68-72℃。所需要的精确温度取决于几个参数，并且还应该考虑当气体/蛋白质溶液混合物进入混合装置时由于暴露于机械能而引起的温度可能略微增加。当这些组分进入混合装置时，热已经从蛋白质溶液传递到气体，保证气体具有接近在混合装置中的温度的温度，因此气体在进入混合装置时不会显著地膨胀。该气体因此将被加热到接近加热的蛋白质的温度的温度，诸如至少达到变性温度减20℃、更优选变性温度减15℃且更优选变性温度减10℃的温度。最优选该蛋白质溶液和该气体在进入混合装置时具有大致相同的温度。该蛋白质例如通过使用换热器加热。热从蛋白质溶液向气体的传递可通过在互相紧靠着并其平行前进的路径中传输气体和加热的蛋白质，之后将两个单独的物流组合并使它们进入混合装置来实现。因此，热优选经隔开管道的不同路径的导热壁从蛋白质溶液传递到气流。

在本发明的另一实施方案中，所述加热的气体和所述加热的蛋白质溶液的混合在所述混合装置的入口处或非常靠近所述入口处发生。因此，气体和蛋白质溶液刚好在分散步骤发生之前预混合。已经发现，如果气体和蛋白质溶液在距混合装置的入口的长距离处组合，则产生活塞式流动，且这产生所生成的微泡的尺寸分布的变化。当在混合装置的入口处组合这两种组分时，实现对混合工艺好得多的控制。所述蛋白质溶液和所述气体因此刚好在进入混合装置之前或在进入混合装置时组合。这通过在彼此紧密接触且平行前进的路径中传输蛋白质溶液和气体，之后将这两个加热的物流在混合装置的进入口附近组合来实现。通过这样做，所述气流和所述蛋白质溶液流将作为一种均匀分布的均质混合物进入混合装置，而没有任何活塞式流动，且其随后经受机械混合，生成微泡。随着气泡在诸如研磨机的混合装置中的制造非常迅速地进行，已经发现，重要的是所述气体和所述包囊蛋白质在进入混合装置时是均匀分布的，在整个生产周期具有稳定的浓度。

此外，已经发现，与其例如通过使用蠕动泵将蛋白质溶液泵送到混合装置，还不如在稳定的进料压力下提供蛋白质溶液，例如与控制流速的控制阀相组合，这积极地影响所产生的微泡的尺寸分布。根据经验，当制备包括将加热的蛋白质溶液泵送到诸如胶体磨的混合装置的生产线时，泵产生的压力脉冲加宽在混合装置中产生的微泡的尺寸分布。因此，在本发明的另一实施方案中，所述方法包括将所述蛋白质溶液在稳定压力下进料而不产生任何压力脉冲的步骤，之后将所述蛋白质溶液加热并与所述气体混合。这样的稳定进料压力通过使用加压的进料罐实现。所述方法因此优选使用稳定压力的蛋白质溶液进料流，且其提供稳定的流速，诸如0.5-3.0升/分钟，例如1-2升/分钟的速率。优选在加热开始之前控制并任选地调节来自所述进料罐的蛋白质溶液的流量及其流速。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下所有要素：加热所述气流和所述蛋白质溶液，在所述混合装置的入口处组合所述加热的气体和所述加热的蛋白质溶液和在稳定的压力下进料所述蛋白质溶液。

在本发明的方法中，所述气体与所述蛋白质溶液的混合物通过使其经受机械剪切力而充分混合。所采用的机械剪切力制备所要求尺寸的微泡。这通过使用在其中生成高机械剪切力的混合装置如高速混合器、研磨机、转子定子、流化装置等实现。在本发明的一个优选的实施方案中，在分散所述蛋白质溶液和所述气体的步骤(iv)中使用诸如胶体磨或锥形磨的研磨机。所述研磨机包括高速转子和具有相对面的伴随定子。利用转子和固定的定子的混合器通常在生成高转子端速的显著高的旋转速度下操作。在转子和定子之间的速差在转子和定子之间的间隙中赋予极高的剪切和湍流能。因此，当考虑向产物的剪切输入量时，该端速是一项非常重要的因素。在本发明的方法中，转子和定子表面的相对速度应该为至少20m/s。如果所述转子为锥形的，这样是优选的，则在表面处的速度将取决于直径且因此在锥体上从尖端向基底改变。因此，气体和蛋白质溶液的所述加热混合物穿过这样的区，在其中其经受通过在尖端以至少20m/s、优选至少25m/s、特别优选至少30m/s且更特别优选至少35m/s、例如高达100m/s、更特别地高达60m/s且特别是高达50m/s的速度相对于彼此移动的表面施加的剪切力。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在步骤iv之后的另一步骤：将所制备的组合物转移到散装容器(bulk container)或直接转移到填充罐。所述散装容器例如为例如体积为10-100升的挠性大袋。在将所制备的产物，即包含包囊的气体微泡的组合物从所述混合装置转移到所述散装容器或填充罐之前，所述组合物的温度例如通过使用换热器降低。将从所述混合装置中流出的产物的温度例如降到20-30℃、诸如25-28℃的温度。

使用本发明的方法，实现所产生的微泡的窄尺寸分布，且所述方法重复地提供符合产品规格的产品。这对于提供经济上适宜的方法是重要的，特别是，因为所使用的成分昂贵且通过该方法避免由于生成不符合规格要求的微泡而损失材料。除了要求保护的方法的改进之外，诸如气体的流量和蛋白质溶液的流量和它们之间的比率、蛋白质溶液的温度和混合器的速度(转子速度)的参数也影响产物的特性并且需要优化。对于任何给定的产物，其特性是临床限定的。例如，对于Optison™，平均直径范围为3.0-4.5µm，其中95%小于10µm。浓度规格为5.0-8.0 x 10⁸个微泡/毫升。通过本发明的方法制备的微泡具有窄尺寸分布和具有低标准偏差的界限分明的平均粒度。所生成的微泡将具有大约为所要微泡尺寸、通常1-7µm、例如3-5µm的窄尺寸分布，且标准偏差较小。在所进行的实施例的范围内，如在实施例1中所示，所实现的平均粒度非常稳定且在2.8µm和4.3µm之间变化。通过使用本发明的方法，诸如在生成人类血清白蛋白和全氟代气体的微泡时，实现0.18-0.25µm的粒度标准偏差。以百分数给出，通过所述方法实现小于20%、诸如小于10%的粒度标准偏差。当制备具有在3.0-4.5µm范围内的平均粒度的粒子时，实现7.3%或更小的标准偏差。另外，实现具有低标准偏差的界限分明的微泡浓度(粒子/体积)。如在实施例1中所报道，实现3.1-11.8 x10⁸个微泡/毫升的浓度，其中大部分操作提供5.0-8.0 x 10⁸个微泡/毫升的浓度。浓度的标准偏差例如为0.40-0.70 x 10⁸个微泡/毫升。以百分数给出，所获得浓度的标准偏差小于15%，且更优选小于12%。因此，符合关于浓度和粒度的产品规格的要求通过本发明方法实现。

根据本发明的方法制备的气体微泡通过稳定剂稳定，所述稳定剂包围所述气体微泡，延迟气体向周围液体的扩散并防止微泡之间的融合。对于本发明的方法，所述稳定剂是热敏的，因此其可在制造过程期间通过加热而变得部分不溶解。用于形成所述微泡的优选材料为氨基酸聚合物。所述聚合物可通过蛋白水解酶作用而生物降解。有用的氨基酸聚合物包括天然氨基酸(蛋白质)和合成氨基酸聚合物。优选的蛋白质为白蛋白，其可为动物白蛋白或人类白蛋白，但最优选为人类血清白蛋白。诸如血红蛋白的其他水溶性蛋白质可替代白蛋白，优选为人类血红蛋白。有用的合成氨基酸聚合物包括聚-L-赖氨酸和聚-L-谷氨酸。例如，可单独或与诸如白蛋白的另一聚合物组合使用在20,000-50,000的分子量范围内的聚-L-赖氨酸或聚-L-谷氨酸。蛋白质衍生物或蛋白质的片断也在本发明的范围内。实际变性温度在根据所使用的蛋白质或蛋白质衍生物而变的一个范围内。

可将生物相容性气体用于所述组合物的微泡中，应该了解术语“气体”包括在37℃的正常人体温度下基本或完全以气态(包括蒸气)形式的任何物质(包括混合物)。所述气体因此可例如包括空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；一氧化氮；惰性气体，诸如氦气、氩气、氙气或氪气；硫氟化物，诸如六氟化硫、十氟化二硫或三氟甲基五氟化硫；六氟化硒；任选卤代的硅烷，诸如四甲基硅烷；低分子量烃(例如，含有多达7个碳原子)，例如烷烃，诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷烃，诸如环丁烷或环戊烷，烯烃，诸如丙烯或丁烯，或炔烃，诸如乙炔；醚；酮；酯；卤代低分子量烃(例如，含有多达7个碳原子)；或任何上述气体的混合物。

优选包含卤代低分子量烃的组合物。在卤代气体中的至少一些卤素原子有利地为氟原子。因此，生物相容性卤代烃气体例如可选自溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷和全氟化碳，例如全氟烷烃，诸如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如，全氟正丁烷，任选与其他异构体如全氟异丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷和全氟庚烷；全氟烯烃，诸如全氟丙烯、全氟丁烯(例如，全氟丁-2-烯)和全氟丁二烯；全氟炔烃，诸如全氟丁-2-炔；和全氟环烷烃，诸如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷。其他卤代气体包括氟代酮，例如全氟代酮，诸如全氟丙酮；和氟代醚，例如全氟代醚，诸如全氟二乙醚。可对于包含诸如硫氟化物或氟碳化合物(例如，全氟化碳)的氟代气体的组合物进一步有利地使用本发明的方法，已知它们形成特别稳定的微泡悬浮液，其中优选SF₆、全氟丙烷和全氟丁烷且特别优选全氟丙烷。

最优选本发明的方法用于制备包含包含蛋白质、最优选包含白蛋白的微泡的组合物，所述蛋白质包囊全氟化碳气体、最优选全氟丙烷、也称作八氟丙烷(OFP)或全氟丙烷(perflutren)。在一个优选的实施方案中，产品Optison™根据本发明方法制造。

第二方面，本发明提供根据第一方面的方法制备的组合物。所述组合物可用于治疗或诊断目的，或组合目的，且优选作为超声波造影介质用于诊断用途。所述组合物优选为预制备的制剂，即，所述组合物优选为气体微泡在生理学可接受的水性载剂中、诸如在注射用水中的分散体。在填充到较小的容器中，诸如填充到小瓶或瓶子中并加盖之后，可能必须通过温和地振荡来再悬浮，以在注射到患者之前提供均质的悬浮液。所述组合物因此准备好注射到患者中，所述患者为人类或动物。还包括超声波造影介质，其中微泡包含对生物靶具有亲和性的载体。在超声波应用中可采用多种成像技术，例如，包括基波和谐波B模式成像及基波和谐波多普勒成像；如果需要的话，则可使用三维成像技术。

第三方面，本发明提供可用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的进料管道，其中所述进料管道包括：

i) 提供两个路径的相应开口的第一入口和第二入口，

ii) 包括隔开这两个路径的纵向壁的传热区段，

iii) 一个可与混合装置的入口连接的出口。

这两个入口设计用来例如通过使用诸如树状夹(tree clamp)的夹具与转移线或管连接，提供防漏连接。优选一个入口可与传输诸如可热变性蛋白质的水溶液的液态组合物的管连接，且另一入口可与传输诸如全氟化碳气体的气体的管连接。这两个入口为单独的，提供两个管道区段的开口，从外部看，它们在传热区段的开始处为组合的。

所述传热区段优选构成所述管道的主要部分，其中这两个路径平行前进且热可从在一个路径中传输的物流传递到在另一路径中的物流。优选所述管道在所述传热区段至少具有提供在一个圆柱形管道中的两个单独路径的外部圆柱形表面，其中所述路径通过防止在路径中行进的物流混合的纵向内壁隔开。在一个实施方案中，所述内部圆柱形体积被提供两个对半管道的纵向壁分成两半，一个对半管道用于一个路径。在另一实施方案中，这两个路径通过具有在外部管道内行进的一个内部管道而隔开。因此，在该实施方案中，所述纵向壁构成圆柱形内部管道，从而一个路径在另一路径内行进，其中这两个管道优选具有同一中心线。优选所述气流在内部路径中行进，而所述液态组合物在外部路径中行进。当在这两个路径中的物流之间存在温差时，该差别将随着物流向出口平行移动而减小。所述管道的长度应该足够长以使得热能够从一个路径的物流传递到另一路径的物流。所述传热区段的长度足够长以保证所要的换热且例如为10-100cm，诸如15-50cm，优选20-40cm。供所述液态组合物用的入口的适当内径尺寸为5-40mm，诸如15-25mm。供所述气体用的入口的适当直径尺寸为0.5-40mm。在其中管道被分成两个对半管道的实施方案中，所述气体入口可具有与供所述蛋白质溶液用的入口相同的尺寸。在其中气流在内部管道中行进的实施方案中，所述气体管道的直径优选比供所述蛋白质溶液用的管道的直径显著要小，例如，仅0.5-3.0mm。对于所述传热区段，外径优选与供所述蛋白质溶液用的第一管道区段的外径大致相同，例如10-45mm。

所述进料管道的出口可使用例如诸如树状夹的夹具与混合装置的入口连接，提供防漏连接。在所述管道的出口处或其附近，纵向内壁末端与所述管道的两个路径组合，使得在其中行进的物流将混合，提供贯穿该工艺持续相同的均匀组合物。因此，当所述进料管道与混合装置连接时，新混合的组合物将进入所述混合装置中或所述液态组合物和所述气体将在入口处混合或刚好在进入其中之后混合。在其中所述气体在内部管道中行进的实施方案中，该管道可在与所述蛋白质溶液的出口相同的地点终止并具有出口。因此，所述内部管道和所述外部管道具有相同的长度。或者，所述内部管道可略微在所述外部管道的出口之前终止，保证这两种组分在进入所述混合装置之前混合。在又一供选例中，所述内部管道可比所述外部管道长并在所述外部管道的出口外部延伸。在该供选例中，当所述进料管道与所述混合装置连结时，所述内部管道将延伸到所述混合装置中。在其中所述管道的传热区段被纵向壁分成两个对半管道的实施方案中，该壁将在所述管道的出口处或者略微在所述出口之前终止，保证这些组分在进入所述混合装置之前混合。

所述进料管道可为任何方便的材料或材料组合，但理想地为金属或陶瓷，特别是金属，诸如钢铁，优选不锈钢。

另一方面，本发明提供用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的设备，所述设备包括如在本发明的第三方面中所述的进料管道。

本发明的设备因此包括：

i) 产生高机械剪切力且具有入口和出口的混合装置；

ii) 进料管道，其包括：

提供两个路径的相应开口的第一入口和第二入口，

包括隔开这两个路径的纵向壁的传热区段，

一个与所述混合装置的入口连接的出口；

iii) 与所述进料管道的第一入口连接的供液态组合物用的进料罐；

iv) 与所述进料管道的第二入口连接的气罐。

所述混合装置为在其中生成高机械剪切力的装置，诸如高速混合器、研磨机、转子定子、流化装置等。在本发明的一个优选的实施方案中，所述混合装置为研磨机，诸如胶体磨或锥形磨，且其用于分散所述蛋白质溶液和所述气体。所述研磨机包括高速转子和具有相对面的伴随定子，即如下混合器：起始混合物穿过通过两个表面的相对转动对其施加剪切力的区，一个表面在被称为转子的元件上，另一表面在被称为定子的元件上。利用转子和固定的定子的混合器通常在生成高转子端速的显著高的旋转速度下操作。在转子和定子之间的速差在转子和定子之间的间隙中赋予极高的剪切和湍流能。在本发明的设备的混合装置中，相对彼此移动以产生剪切力区的表面理想地彼此相距小于2mm、优选小于1mm、特别优选小于600μm，例如300-500μm。优选可调节转子和定子之间的距离，例如为0.2-0.6mm。优选间距将取决于穿过剪切力区的混合物的粘度，且最小间距可由制造限制条件施加。将蛋白质溶液/气体混合物在转子和定子的表面之间分散并空腔化(cavity)。所述混合装置优选还包括布置了转子和包括发动机和轴承的用于转子的驱动机构的混合室。所述混合器具有处于面对转子的关系的定子，定子和转子可具有光滑表面或在一个实施方案中可具有轴向延伸的互锁隆起和凹槽，这些凹槽提供有径向延伸的流体传送机构，由此限定多个剪切力区以供流体从入口在转子和定子之间径向穿过。在本发明的混合器设备中，所述入口优选径向定位在剪切力区的内部，优选在转子的旋转轴上或在该旋转轴附近。理想地，所述混合装置的入口邻近转子的驱动轴，从而如果需要的话，来自所述进料管道出口的气体和蛋白质溶液混合物可在进入剪切力区之前在预混合室中进一步预混合。

为了保证发生充分混合，可提供第二转子，且如果需要的话，可提供另外的转子，例如多达5个转子，它们由同一驱动机构、优选旋转驱动轴驱动。在提供第二转子的情况下，所述混合器将理想地具有第二混合室，所述第二混合室具有与第一腔室的出口孔连通的进口孔且具有其自己的出口孔。

所述转子和定子可为任何方便的材料或材料组合，但理想地将具有金属或陶瓷，特别是金属，诸如钢铁。此外，如果需要，则可将转子和定子表面涂布或处理以提供最终产物的最优产量或特性。转子和定子组件的尺寸将取决于制造转子的材料、预定的气泡上限尺寸、旋转速度、转子直径和混合物粘度，但通常对于不锈钢组件、5000-12000rpm的旋转速度和水性混合物，可使用高达25cm、例如7.5-15cm的转子直径。然而，这些参数不受限制且可用于本发明的设备中的混合装置可用其他尺寸、材料和操作速度制造。

因为本发明的设备的混合装置可产生显著的加热效应且因为微泡的尺寸和稳定性可受温度影响，所以特别希望提供具有温度控制机构的混合装置，所述温度控制机构例如为恒温器控制的加热或冷却设备，诸如包围混合室的冷却夹套或者在定子或转子内或与定子或转子热连接的冷却元件如换热器，或者或另外在转子驱动轴或包围转子驱动轴的机械密封件内或与该转子驱动轴或该机械密封件热连接的冷却元件。所述混合物的温度可在各混合室的出口处或在转子的边缘处监测且这可用以控制所述温度控制机构。还希望提供具有与来自混合装置的出口的产物流热连接的冷却元件如换热器的混合装置，以将从混合装置中流出的产物流的温度例如降到20-30℃，诸如降到25-28℃。所述出口优选朝向研磨机的底部安置。

所述设备的进料管道描述在第三方面中。

所述设备还包括经由如下所述的其他实体与所述进料管道的第一入口连接的用于诸如蛋白质溶液的液态组合物的进料罐。所述进料罐为提供稳定进料压力的加压进料罐，且已经发现这积极影响所产生的微泡的尺寸分布，提供窄尺寸分布。所述进料罐例如通过将诸如压缩空气或氮气的惰性气体吹入所述进料罐而加压。优选该气体经无菌过滤器加入。在所述进料罐中的压力例如为0.5-3.0barG (等于1.5-4.0barA)且优选为1-2barG。所述加压进料罐还可包括混合机构，诸如搅拌器，提供欲加热并传送到所述混合装置中的均质溶液。所述进料罐例如为10-200升，诸如50-150升，且提供稳定的流速，诸如0.5-3.0升/分钟、例如1-2升/分钟的流速。优选在加热开始之前控制并任选调节来自所述进料罐的蛋白质溶液的流量及其流速。这可通过在所述进料罐的出口处包括流量控制器和调节阀来进行。另外，在所述进料罐和所述进料管道之间，将所述蛋白质溶液进料流加热到实现蛋白质的初步变性所必需的温度。希望提供具有温度控制机构的进料流，例如诸如通过在所述进料流内或与所述进料流热连接的换热器进行恒温器-可控加热。可在所述蛋白质溶液进料流进入所述进料管道之前监测其温度，其中热将从所述蛋白质溶液进料流传递到所述气体。

所述设备还包括经由如下所述的其他实体与所述进料管道的第二入口连接的气罐。所述气罐为欲包囊在微泡中的气体的来源。优选在所述气体进入所述进料管道之前，控制并任选调节其气体流速，所述气体在所述进料管道中被加热。该调节可通过在所述气罐的出口处包括流量控制器和调节阀来进行。所述气罐提供处于低于例如1-4barG的压力下的气体。所述气体流速例如为0.5-2.5升/分钟。然而，进入所述研磨机的所述气体的压力通过转数/分钟和流速来设定，而不能通过所述气体容易地调节。

在所述设备中可包括一个或多个无菌过滤器以消除或杀死包括传染剂(transmissible agent)的所有形式的微生物生命。

本发明的优选实施方案现在将仅通过举例并参考附图来描述，其中图1示意性表示根据本发明的设备且其可用于制备包含由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物。因此，图1示出了设备1，其中主要组件为混合装置20、进料管道30、用于液态组合物的进料罐40和气罐50。进料罐40包含液态溶液42，诸如可变性的血清白蛋白溶液。向进料罐40中进料构成该溶液的组分41。在一个优选的实施方案中，所述组分为例如以5%溶液提供的血清白蛋白41a、注射用水41b和优选以0.9%溶液的NaCl 41c，它们构成1%人类血清白蛋白溶液42。压缩空气或氮气经无菌过滤器44吹到进料罐40中以对内含物加压。另外温度控制单元47与进料罐40连接。为了提供均质溶液42，在进料罐40中还包括搅拌器46。通过靠近进料罐40的出口的流量控制器62和调节阀64控制并任选调节来自进料罐40的蛋白质溶液的流量。该溶液随后优选穿过无菌过滤器66。另外，在进料罐40和进料管道30之间，使用换热器68将蛋白质溶液流42加热到实现蛋白质的初步变性所必需的温度。在已经加热到所要温度之后，使蛋白质溶液经入口32进入进料管道30。

气罐50提供欲包囊在微泡中的气体52。通过靠近气罐50的出口的流量控制器72和调节阀74控制并任选调节来自气罐50的气体的流量。在进入进料管道30之前，气体52优选穿过无菌过滤器76。该气体随后经与用于蛋白质溶液的入口32隔开的入口34进入进料管道30。在进料管道30中，将存在从蛋白质溶液向气体的温度传递，保证气体在进入混合装置20时不会有任何显著的膨胀。蛋白质溶液42和气体52作为混合的组合物从管道30的出口36流出并经入口24流入混合装置20。进料管道30的出口36和混合装置20的入口24可例如通过夹具连接。混合装置20包括包括转子25和定子26的研磨机22，其中转子25由包括轴承28和任选的冷却系统的用于其的发动机29和驱动机构驱动。所产生的产物80，即优选由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物，从混合装置中，优选在研磨机22的底部取出。产物流80的温度任选使用例如包括换热器的温度控制单元82测量并调节。

图2和图3显示根据本发明的供选进料管道。图2a显示具有提供向第一管道区段33的开口的第一入口32的进料管道30。优选用于进料蛋白质溶液的入口32具有可使用夹具与管或转移线连接的圆周32a。具有圆周34a的第二入口34提供向第二管道区段35的开口，其优选用于进料气体。从外部看，管道区段34和35在组合点37处合并，提供具有隔开两种物流的外部圆柱形壁38和内部纵向壁31的一个管道。管道30从组合点37到纵向壁31在出口36附近的末端的区段提供传热区段。如所示，纵向壁31略微在出口36之前终止。在其他实施方案中，该壁可较靠近出口36或在出口36处终止。管道30的出口36具有可使用例如夹具与混合装置的入口连接的圆周36a。图2b显示具有纵向壁31和外部圆柱形壁38的管道30的传热区段的横截面。图2c显示管道30，从出口36的侧面看去，其具有具有圆周32a的第一入口32和具有圆周34a的第二入口34且具有外部圆柱形壁38。

图3显示供选的进料管道，其中图3a显示具有提供向第一管道区段33的开口的第一入口32。优选用于进料蛋白质溶液的入口32具有圆周32a。具有圆周34a的第二入口34提供向第二管道区段35的开口，其优选用于进料气体。从外部看，管道区段33和35在组合点37处合并，提供具有外部圆柱形壁38且在其内行进的用于气体进料的内部管道31的一个管道。管道30从组合点37到出口36的区段提供传热区段。如所示，内部管道31略微在出口36的外部终止，其具有出口39。在其他实施方案中，该管道在较靠近该出口处或在该出口处或略微在出口36之前终止。管道30的出口36具有可使用例如夹具与混合装置的入口连接的圆周36a。图3b显示具有内部管道31和外部圆柱形壁38的管道30的传热区段的横截面。图3c显示管道30，从出口36看去，其具有具有圆周32a的第一入口32和具有圆周34a的第二入口34且具有外部圆柱形壁38。

现将参考以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例

实施例1：制备Optison™

已在可变性(variability)和可预测性方面评价根据本发明的方法制造的Optison™批料并将其与第三方的方法相比较。目的在于比较两种制造方法的可预测性以了解产品品质的未来可预测性。

材料和方法

已在可变性(variability)和可预测性方面评价并比较了制备根据本申请要求保护的方法由GE Healthcare制造的Optison™批料的25个实验与制备由第三方方法制造的Optison™批料的19个实验。

该GE方法包括使用如在图1中所示的设备，其包括进料管道，在其中将热从蛋白质溶液(人类血清白蛋白)传递到气体(全氟丙烷= OFP)且其中将蛋白质溶液和气体刚好在分散步骤之前使用研磨机混合。使用加压的进料罐来将蛋白质溶液传送到研磨机。

第三方的方法包括如下设备，其中将加热的蛋白质溶液(人类血清白蛋白)与未加热的气体(OFP)在进入研磨机之前距约1米的距离处混合。使用蠕动泵来将蛋白质溶液传送到研磨机。

结果

原始数据提供在表1和表2中，提供在这两种方法中使用的参数。确定平均粒度和所获得的浓度。

表1. 来自第三方方法的数据-用于比较

表2. 来自GE方法的数据

得到所获得的粒度和浓度的标准偏差(SD)(~校正均方根误差RMSEC)：

第三方方法：

平均粒度：0.33μm的SD

浓度：1.19 x 10⁸个微泡/毫升的SD；

本发明方法：

粒度：0.22µm的SD

浓度：0.55 x 10⁸个微泡/毫升的SD

该标准偏差表示，通过采用本发明的新型的改进方法，制造重现性增加，由此产品品质的可预测性增加。

Claims (10)

1.用于制备包含包囊的气体微泡的组合物的方法，其包括以下序贯的步骤：

i) 提供处于实现初步变性所必需的温度的加热的可热变性蛋白质水溶液，其中所述温度为50-100℃；

ii) 通过使用来自所述加热的可热变性蛋白质水溶液的热来加热气体，其中将所述气体加热到比所述加热的可热变性蛋白质水溶液的温度低不超过20℃的温度；

iii) 混合来自步骤(ii)的加热的气体与来自步骤(i)的加热的可热变性蛋白质水溶液以获得加热的气/液混合物；

iv) 通过使来自步骤(iii)的所述加热的气/液混合物经受机械剪切力而将所述加热的气体分散到所述可热变性蛋白质水溶液中以形成由变性蛋白质包囊的气体微泡的组合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(iii)的混合在用于提供步骤(iv)的机械剪切力的混合装置的入口处或接近该入口处进行。

3.权利要求1或2的方法，其中所述可热变性蛋白质水溶液在稳定的进料压力下提供。

4.权利要求1或2的方法，其中所述气体微泡具有标准偏差小于平均粒度的20%的粒度。

5.权利要求1或2的方法，其中所述可热变性蛋白质为人类血清白蛋白。

6.权利要求5的方法，其中所述加热的可热变性蛋白质水溶液的温度为60-80℃。

7.适用于进行权利要求1-6中任一项的方法的设备，所述设备包括：

i) 产生高机械剪切力且具有入口和出口的混合装置；

ii) 进料管道，其包括：

提供两个路径的相应开口的第一入口和第二入口，

包括隔开这两个路径的纵向壁的传热区段，

一个与所述混合装置的入口连接的出口；

iii) 与所述进料管道的第一入口连接的供液态组合物用的进料罐；

iv) 与所述进料管道的第二入口连接的气罐。

8.权利要求7的设备，其中所述纵向壁存在于所述进料管道的管道区段上，且其中所述纵向壁横越所述管道区段的直径以产生所述两个路径。

9.权利要求7或8的设备，其中所述纵向壁存在于所述进料管道的管道区段上，且其中所述管道区段包括具有外部圆柱形壁的外部管道，和内部管道，其中所述内部管道在所述外部管道内行进。

10.权利要求7-9中任一项的设备用于制备如权利要求1中所定义的包含包囊的气体微泡的组合物的用途。