DE69732568T2

DE69732568T2 - Druckbeständige protein-mikrosphäre als ultraschallkontrastmittel

Info

Publication number: DE69732568T2
Application number: DE69732568T
Authority: DE
Inventors: G. Edward JABLONSKI
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Current assignee: Molecular Biosystems Inc
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2017-06-06
Also published as: DE69732568D1; EP0907380B1; AU3478097A; JP2000512281A; US5976501A; ES2238724T3; EP0907380A2; ATE289520T1; CA2253734A1; WO1997046264A2; WO1997046264A3

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft das Gebiet von Verfahren zur Durchführung der herkömmlichen Grauskala-Ultraschallabbildung. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Ultraschall-Abbildungsmitteln bzw. -Bildgebungsmitteln, welche Mikrosphären umfassen, die durch eine Hülle aus einem biokompatiblen Protein verkapselte Gaskerne enthalten. Die Mikrosphären werden druckfest und wirksam gemacht durch Einschließen eines Perfluoralkans während der Mikrosphärenbildung. Diese Mikrosphären eignen sich besonders gut für die Verwendung als Ultraschall-Abbildungsmittel, um Gewebe und Organe, wie das Myokard, zu perfundieren, um die Sichtbarmachung in einem Grauskalabild bzw. Grauwertbild zu verbessern.
Hintergrund
Die herkömmliche Ultraschallabbildung basiert auf dem Prinzip, dass Wellen von Schallenergie auf ein Gebiet von Interesse fokussiert werden können und in einer Weise reflektiert werden können, um ein Bild hiervon zu erzeugen. Der eingesetzte Ultraschall-Scanner wird auf eine Körperoberfläche platziert, die über dem abzubildenden Gebiet liegt, und Schallwellen werden auf dieses Gebiet gerichtet. Der Scanner detektiert reflektierte Schallwellen und übersetzt die Daten in Videobilder. Wenn Ultraschallenergie durch eine Substanz hindurch übertragen wird, hängt die Menge an reflektierter Energie von der Geschwindigkeit der Übertragung und den akustischen Eigenschaften der Substanz ab. Veränderungen in den akustischen Eigenschaften der Substanz (z. B. Schwankungen bei der akustischen Impedanz) sind an den Grenzflächen mit verschiedenen akustischen Dichten, wie Flüssig-Fest oder Flüssig-Gas, am auffälligsten. Folglich, wenn Ultraschallenergie durch Gewebe gelenkt wird, erzeugen Organstrukturen Schallreflexionssignale für die Detektion durch den Ultraschallscanner. Diese Signale können durch den richtigen Gebrauch eines Kontrastmittels verstärkt werden.
Ophir und Parker, Ultrasound in Medicine and Biology 15(4): 319–333 (1989), beschreiben verschiedene Typen von gashaltigen Ultraschall-Kontrastmitteln. Eine Hauptklasse von gashaltigen Ultraschall-Konstrastmitteln, die von Ophir und Parker beschrieben werden, besteht aus den verkapselten Gasmikrobläschen oder Mikrosphären. Das Gasbläschen wird von einer Hülle, die aus einem Protein oder anderem biokompatiblen Material aufgebaut ist, umgeben. Ein aktuelles kommerzielles Mikrosphären-Konstrastmittel ist ALBUNEX^® (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA), das aus mit Humanserum-Albumin verkapselten Luftmikrosphären aufgebaut ist. Siehe das US-Patent Nr. 4 572 203 und 4 844 882. Luftmikrosphären verlieren, wie sich jedoch zeigte, rasch ihre Echogenizität, wenn sie an Drücke von 150 mm Hg ausgesetzt werden, wie sie während der Injektion und Zirkulation in vivo anzutreffen wären (deJong, N. et al., Ultrasound Med. Biol. 19: 279–288, 1993).
In einem Versuch, das Druckinstabilitätsproblem zu lösen, konzentrierten sich jüngste Lehren auf die Verbesserung der Hülle, weil man annimmt, dass die Mikrosphärenhüllen oder "Membranen" zu brüchig oder spröde unter Druck sind, was zu einem raschen Zusammenfallen in vivo führt. Giddey (PCT WO 92 105 806) stellte fest, "aufgrund ihrer Starrheit können die Membranen keine plötzlichen Druckschwankungen aushalten, an welche die Mikrosphären ausgesetzt werden können, zum Beispiel auf ihrem Weg durch den Blutstrom, wobei diese Schwankungen oder der Druck auf Herzschläge bzw. -schwingungen zurückzuführen sind". Um die Starrheit der Hülle zu überwinden, schlug er vor, Luft in einer Proteinlösung, die einen hohen Prozentanteil eines Viskosifizierungsmittels enthält (40 % – 80 % Polyole) vorzuemulgieren und sie einer mechanischen Scherung in einem Hochgeschwindigkeitsmischer zu unterwerfen. Bläschen mit der geeigneten Größe werden gesammelt und mit einem geeigneten Tensid überzogen, um sie in einer weichen Hülle zu stabilisieren.
Holmes (PCT WO 92/17213) schlug vor, die In-vivo-Stabilität von Protein-Mikrosphären durch Stärken der Hülle mit bioabbaubaren chemischen Vernetzungsreagenzien zu verbessern.
Bichon et al. (Europäische Patentanmeldung 458 745A1) und Schneider et al. (Inv. Radiol. 27:134–159, 1992) beschreiben die Herstellung von porösen (5 bis 2000 nm Po rengröße) polymeren "Mikroballonen". Sie berichten in der europäischen Patentanmeldung, dass "die mikroporöse Struktur der Hülle der Mikroballone ein Faktor der Elastizität ist, d. h., die Mikrosphären können leicht eine Druckschwankung aufnehmen, ohne zu zerbersten".
Erbel und Zotz (US-Patent Nr. 5 190 982) beschreiben eine vernetzte polymere Mikrokapsel, in welcher Luft eingeschlossen ist.
Andere Bemühungen zur Verbesserung der Mikrosphärenstabilität konzentrierten sich auf das Gas innerhalb der Hülle und befassten sich insbesondere mit der Einbringung unlöslicher Gase. Nach dem Henryschen Gesetz nimmt die Löslichkeit eines bestimmten Gases in Lösung in dem Maße zu, wie der Druck zunimmt. Wenn ein Gasbläschen in Lösung einem Druck ausgesetzt wird, nimmt die Löslichkeit des Gases in der umgebenden Lösung im Verhältnis zu der Druckhöhe zu. Wenn das Gasbläschen von einer Hülle umgeben ist, d. h. in der Form einer Mikrosphäre vorliegt, sind die Wirkungen der Gaslöslichkeit immer noch festzustellen, da die Mikrosphärenhüllen den Kontakt zwischen Gas in der Mikrosphäre und der umgebenden Lösung nicht völlig ausschalten. Somit wird, wenn in Lösung suspendierte Mikrosphären an Druck ausgesetzt werden, das Gas innerhalb der Mikrosphären schließlich in der umgebenden Lösung solubilisiert, was zum Zusammenfallen der Mikrosphären führt. Je unlöslicher das Gas in der umgebenden Lösung ist, umso widerstandsfähiger werden die Mikrosphären gegenüber einem vollständigen solubilisiert sein im Blutsystem oder Geweben.
Die US 5 413 774 weist darauf hin, dass die Druckfestigkeit von Mikrosphären dadurch verbessert werden kann, dass zumindest ein Teil des Gases, das verkapselt ist, ein S_Gas √MW_Gas ≤ 0,0031 aufweist, worin S_Gas die Wasserlöslichkeit des Gases in Litern/Liter ist und MW_Gas das durchschnittliche Molekulargewicht des Gases in Daltons ist. Eingeschlossen in den durch dieses Patent vorgeschlagenen Gasen sind die relativ unlöslichen Perfluoralkane CF₄, C₂F₆ und C₄F₁₀.
Die PCT-Anmeldung WO 95/01187 beschreibt Mikrosphären von Gas, eingekapselt durch ein wärme-insolubilisiertes filmogenes Protein, bei welchem das verkapselte Gas vollständig ein wasserunlösliches Gas ist. Unter den Gasen sind speziell die Perfluoral kane CF₄, C₂F₆, C₃F₈ und C₄F₁₀ genannt. Diese Mikrosphären werden hergestellt durch Unterziehen einer Mischung einer wässrigen Lösung des Proteins und des unlöslichen Gases einer Ultraschall- oder mechanischen Kavitation in Abwesenheit von Sauerstoff durch Beschallen oder Mahlen der Mischung in einer Beschallungsvorrichtung/Mühle, die gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen ist.
Verschiedene andere Beispiele von unlösliches Gas enthaltenden Mikrosphären wurden beschrieben, welche Perfluoralkane mit einem hohen Siedepunkt, wie Perfluorpentan, als das Kernmaterial enthalten. Die PCT WO 95/23615 beschreibt Mikrosphären, die durch Mischen von flüssigem Perfluorpentan mit dem hüllenbildenden Material und anschließendes Umwandeln in ein Gas hergestellt werden. Die PCT WO 96/04018 beschreibt Mikrosphären mit fluorhaltigen Hüllen, die unlösliche Gase, wie Perfluorpentan, verkapseln. Porter et al. (Journal of Amer. College of Cardiology, Abstract No. 955–57, Februar 1995) beschreibt Dextrosealbumin-Mikrosphären, die mit verdampftem Perfluorpentan hergestellt werden.
Andere Patentliteratur beschreibt Ultraschall-Kontrastmittel vom Nicht-Mikrosphären-Typ, welche Perfluoralkane mit einem hohen Siedepunkt einschließen. Das US-Patent Nr. 5 393 524 beschreibt freie Gasmikrobläschen von verschiedenen Gasen, die eine erhöhte Druckfestigkeit im Verhältnis zu freien Luftmikrobläschen zeigen. Perfluorpentan gehört zu den zahlreichen Gasen, die in Tabelle IV dieser Anmeldung genannt sind. Die PCT WO 94/16739 beschreibt Ultraschall-Kontrastmittel, bei denen es sich um Flüssig-Flüssig-Emulsionen handelt, bei welchen die dispergierte Flüssigkeit einen Siedepunkt unterhalb der physiologischen Temperatur besitzt. Wenn die Emulsion verabreicht wird, kocht die dispergierte Flüssigkeit auf. Perfluorpentan ist in der Liste von Verbindungen eingeschlossen, die als die dispergierte Flüssigkeit verwendet werden können.
Die vorausgehende Erläuterung betrifft verschiedene Kontrastmittel, die für die herkömmliche Ultraschall-Abbildung nützlich sind, welche die Bildung von Bildern aus der Menge an reflektiertem Ultraschallsignal beinhaltet. Neuerdings wurde eine andere Technik für die Erzeugung eines Ultraschallbildes beschrieben, welche das Detektieren von Veränderungen in der harmonischen Frequenz des reflektierten Ultraschallsignals infolge der Resonanz des Abbildungsmittels beinhaltet. Diese Technik, die als "harmonische Abbildung" bezeichnet wird, wird von Uhlendorf et al. (US-Patent Nr. 5 410 561) beschrieben. Da relativ feste Objekte weniger bei Anwendung von Ultraschallenergie mitschwingen, sind freie Mikrobläschen besser bei der harmonischen Abbildung als verkapselte Mikrosphären. Die PCT WO 96/09793 beschreibt freie Mikrobläschen, die durch Tenside stabilisiert sind, die verschiedene gasförmige Materialien enthalten, die Volumenveränderungen bei einer Anwendung von Ultraschallenergie erfahren, die zu einer verbesserten harmonischen Abbildung führen.
Obwohl die harmonische Abbildung einige Verbesserungen gegenüber der herkömmlichen Ultraschall-Abbildung für bestimmte Anwendungen vorsehen kann, ist die herkömmliche Abbildung immer noch aus praktischen Gründen bevorzugt, da Vorrichtungen, die zur Durchführung der harmonischen Abbildung fähig sind, nicht in breitem Umfang anwendbar sind. Demzufolge ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Abbildungsverfahren unter Verwendung von Mikrosphären bereitzustellen, die speziell angepasst und nützlich sind für die herkömmliche Ultraschall-Abbildung von Geweben oder Organen.
Die Mikrosphären, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind und die in Gegenwart eines erwärmten Perfluoralkan-Dampfes gebildet werden, enthalten ein lösliches, biokompatibles Gas, wie Luft, in einer Proteinhülle. Das Perfluoralkan steht mit dem Protein während der Bildung in Wechselwirkung, um die Mikrosphärenhülle undurchlässiger gegenüber der wässrigen Umgebung zu machen, und es wird ebenfalls angenommen, dass es eine wichtige Rolle bei der Hüllenbildung spielt, die zu einer verbesserten Abbildungswirksamkeit führt. Durch Einschließen des erwärmten Perfluoralkan-Dampfes während der Mikrosphärenbildung wird ein relativ lösliches Gas, wie Luft, unerwarteterweise vor einer Solubilisierung in der umgebenden wässrigen Umgebung geschützt. Demzufolge zeigen die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung eine Druckfestigkeit, die über die für äquivalente Mikrosphären erwartete hinausgeht, die in Abwesenheit des Perfluoralkans hergestellt werden. Das Ergebnis ist ein extrem langlebiges In-vivo-Produkt, das zu einer anhaltenden Echogenizität unter Anwendung herkömmlicher Ultraschallverfahren fähig ist.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer Suspension von Mikrosphären bei der Herstellung eines Kontrastmittels für die Verwendung in einem Verfahren der herkömmlichen Ultraschall-Bildgebung vor. Die Mikrosphären werden unter Verwendung eines Gases als Kernmaterial hergestellt, welches durch eine wärme-insolubilisierte Proteinhülle, die in Gegenwart eines erwärmten Perfluoralkan-Dampfes gebildet wird, verkapselt wird. Das Gas ist löslich. Der Dampf wird vorzugsweise bei einer Temperatur über dessen Siedepunkt, in der Nähe der Denaturierungstemperatur des Proteins, bereitgestellt, was die Bildung der Mikrosphärenhüllen erleichert und zu einer verbesserten Ultraschallwirksamkeit führt. Die Ultraschall-Abbildung eines Patienten wird begonnen, danach wird die Mikrosphärensuspension an den Patienten verabreicht. Die Mikrosphärensuspension kann entweder als Bolus verabreicht werden oder sie kann kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum verabreicht werden. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass die Mikrosphärensuspension in vorgefüllte Spritzen gepackt werden kann, die gebrauchsfertig sind.
Die Abbildung wird fortgesetzt, während die Mikrosphären die Stelle der Gewebe oder Organe, die untersucht werden, erreichen. Die Abbildung wird allgemein fortgeführt, bis die Bildintensität des Gewebes oder Organs, die untersucht werden, zu der Vorverabreichungsintensität zurückgekehrt ist. Die Ultraschallbilder werden aus der reflektierten Ultraschallenergie erzeugt.
Das Abbildungsverfahren kann für die Untersuchung der vaskulären Perfusion von Geweben und Organen angewandt werden, was eine Bewertung des Blutflusses durch die Gewebe oder Organe liefert. Das Verfahren ist besonders nützlich für die Untersuchung der myokardialen Perfusion. Die Myokard-Abbildung beinhaltet das Abbilden des Myokards vor der Verabreichung der Mikrosphärensuspension, das Verabreichen der Mikrosphärensuspension und das Fortsetzen der Abbildung, wenn die Mikrosphären in die linken ventrikulären Kammern gelangen, das Myokard-Gewebe perfundieren, die ventrikuläre Kammer verlassen und schließlich das Myokard-Gewebe verlassen.
Das Abbildungsverfahren kann unter Einsatz herkömmlicher zweidimensionaler oder mehrdimensionaler (z. B. dreidimensionaler) Ultraschallgerätschaft durchgeführt wer den. Außerdem kann das Verfahren mit entweder kontinuierlich angewandten oder pulsierten Schallwellen durchgeführt werden.
Vorzugsweise enthält die Mikrosphärensuspension Mikrosphären im Bereich von 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ pro ml Suspension. Weiterhin besitzen die Mikrosphären vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 Mikrometer, weiter vorzugsweise von 1 bis 6 Mikrometer, stärker bevorzugt von 2 bis 5 Mikrometer.
Der Mikrosphärenkern kann aus einem beliebigen Gas bestehen, das biokompatibel und löslich ist. Gase wie Luft sind bevorzugt. Der Perfluoralkan-Dampf kann die Dampfform eines linearen, verzweigtkettigen oder cyclischen Perfluoralkans sein, wobei lineare Perfluoralkane wie Perfluorpentan, Perfluorhexan und Perfluorheptan bevorzugt sind. Die Menge an Perfluoralkan-Dampf, die in den Mikrosphären bildenden Prozess abgegeben wird, bezieht sich auf dessen Molekulargewicht, wobei weniger Perfluoralkan-Dampf erforderlich ist, wenn das Molekulargewicht zunimmt. Allerdings sollte die Gasphase (das Gas und der Perfluoralkan-Dampf) aus mindestens 50 % Gas bestehen, um die Erzeugung von weniger wirksamen Mikrosphären mit negativem Auftrieb zu vermeiden.
Das hüllenbildende Protein ist wärme-insolubilisierbar. Vorzugsweise ist das hüllenbildende Protein Albumin, und stärker bevorzugt ist es Humanserum-Albumin. Weiterhin kann die Hülle so modifiziert werden, um Einheiten einzuschließen, welche die Mikrosphären weniger immunogen und/oder gewebe- oder organspezifisch machen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Mikrosphären, welche bei der herkömmlichen Ultraschall-Abbildung nützlich sind, welches das Mischen einer Gasphase, bestehend aus einem Gas und einem erwärmten Perfluoralkan-Dampf, mit einer Lösung von wärme-insolubilisierbarem Protein unter Bedingungen beinhaltet, welche die Mischung kavitieren und das Protein wärmeinsolubilisieren zur Bildung von Mikrosphären, gefolgt von einem Kühlen der Mikrosphären, um zumindest einen Teil des Perfluoralkans in die Hülle zu kondensieren. Dieser Schritt bewirkt, dass das Perfluoralkan sich mit der Hüllenoberfläche und/oder -innenstruktur verbindet unter Erzeugung einer hydrophoben Sperrschicht. Zudem werden die akustischen Eigenschaften der Hülle in dem Verfahren verändert, wodurch eine wirksamere Mikrosphäre gebildet wird.
Die Mikrosphären können durch Kavitation unter Anwendung von Ultraschallenergie oder mechanischer Kräfte, wie sie in einer Kolloidmühle erzeugt werden, gebildet werden.
Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung sind Zusammensetzungen, die für die herkömmliche Abbildung nützlich sind, bestehend aus Mikrosphären mit Gaskernen, die durch ein wärme-insolubilisiertes Protein verkapselt sind, welche in Gegenwart von erhitzten Perfluoralkan-Dämpfen gebildet werden. Die Mikrosphären zeigen eine erhöhte Druckfestigkeit, wie Festigkeit gegenüber einem Druck von 68,95 kPa (10 psi). Andere Merkmale der Mikrosphärenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind in der vorausgehenden Erläuterung beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Mikrosphären mit 100 % Luft als Gasphase.
Die 2 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Mikrosphären mit 100 % Perfluorpropan als Gasphase.
Die 3 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Mikrosphären mit 50 % Luft und 50 % Perfluorpropan als Gasphase.
Die 4 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Albumin-Mikrosphären mit 50 % Luft und 50 % Perfluorpentan-Dampf als Gasphase.
Die 5 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Albumin-Mikrosphären mit 66,6 % Luft und 33,3 % Perfluorpentan-Dampf als Gasphase.
Die 6 veranschaulicht die Veränderung der optischen Dichte bei 600 nm nach Anwendung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) einer Suspension von Albumin-Mikrosphären, die mit variablen Mengen an Luft und Perfluorpentan-Dampf als Gasphase hergestellt wurden.
Modi für die Durchführung der Erfindung
Die Mikrosphären, die bei der Ultraschall-Abbildung von Nutzen sind, bestehen aus Gaskernen, die durch wärme-insolubilisiertes Protein verkapselt sind, und werden in Gegenwart von erwärmten Perfluoralkan-Dämpfen gebildet. Sie haben eine für die transpulmonale Passage geeignete Größe, mit einem mittleren nominalen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 μm, vorzugsweise 2 bis 6 μm, wie mit einem Coulter Multisizer II-Teilchenzähler/Sichter (Coulter Electronics, Hialeah, FL) gemessen.
Das Äußere der Mikrosphäre ist durch eine dünne Proteinhülle definiert. Das Proteinhüllenmaterial schließt sowohl natürlich vorkommende filmogene Proteine, durch rekombinante DNA-Methodiken gebildete Proteine und synthetische Aminosäurepolymere ein, auf die hierin unter dem Sammelbegriff "Proteine" zusammengefasst Bezug genommen wird. Das Protein muss zur Bildung einer Hülle oder eines Films um das Kernmaterial fähig sein, wenn das Protein insolubilisiert ist. Geeignete natürlich vorkommende Proteine schließen Albumin, gamma-Globulin (Human), Apotransferrin (Human), J-Lactoglobulin, Urease und Lysozym ein. Besonders gut geeignet für die vorliegende Erfindung ist Albumin, und insbesondere Human-Albumin.
Hüllenbildende Materialien, die für die Verwendung bei der Bildung der Mikrosphären geeignet sind, oder die resultierenden Mikrosphären können chemisch für den Zweck der Organ/Gewebe-Targetierung oder des Quenchens bzw. Dämpfens der immunogenen Aktivität (z. B. die Modifizierung mit Antikörpern oder Polyethylenglykol) modifiziert werden.
Gase, die für die Verwendung bei der Bildung der Mikrosphären innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind löslich und pharmakologisch annehmbar, d. h. biokompatibel und minimal toxisch für den Menschen. Der Ausdruck "biokompatibel" bedeutet die Fähigkeit des Gases, ohne die Bildung von toxischen Nebenprodukten metabolisiert zu werden. Das Gas kann aus einer einzelnen Verbindung oder einer Mischung von Verbindungen aufgebaut sein. Beispiele für Gase, die für die Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Luft, O₂, N₂, H₂, CO₂, N₂O; Edelgase, wie Argon, Helium, Xenon; und Kohlenwasserstoffgase, wie Methan, Ethan, Propan, n-Butan, Isobutan und Pentan. Der Ausdruck "löslich" bedeutet ein Gas mit einer Löslichkeit von höher als 0,01 ml Gas pro ml Wasser bei 101,325 kPa (Atmosphärendruck) und einer Temperatur von 25°C. Unlösliche Gase sind ebenfalls für die Verwendung geeignet und schließen ohne Einschränkung Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan und Perfluorisobutan sowie Mischungen von löslichen Gasen und/oder unlöslichen Gasen ein.
Die Mikrosphären, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind weiter dadurch gekennzeichnet, dass sie in Gegenwart eines erwärmten Perfluoralkan-Dampfes gebildet werden. Der Ausdruck "Perfluoralkan" bezieht sich auf einen linearen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoff, welcher teilweise oder vollständig Fluor-substituiert ist und wahlweise andere Substituenten, wie O, OH, S, NO und dergleichen enthalten kann. Das Perfluoralkan besitzt vorzugsweise einen relativ hohen Siedepunkt, d. h. von über 20°C bei Standarddruck. Perfluorpropan, Perfluorhexan und Perfluorheptan sind bevorzugt. Der Ausdruck "Dampf" bezieht sich auf die gasförmige Phase einer Flüssigkeit, die durch Erhöhen der Temperatur der Flüssigkeit auf oberhalb deren Siedepunkt gebildet wird. Der erwärmte Perfluoralkan-Dampf tritt mit dem hüllenbildenden Protein während der Bildung und dem anschließenden Abkühlen in Wechselwirkung, um die resultierende Mikrosphärenhülle weniger durchlässig für das wässerige Äußere zu machen. Dies hilft, den Kontakt zwischen dem inneren Gaskern und der umgebenden wässrigen Umgebung zu verhindern, was das Gas davor schützt, in der wässrigen Umgebung solubilisiert zu werden, insbesondere wenn der Gaskern ein lösliches Gas umfasst. Die Wirkungen des Verlusts des Gaskerns infolge der Solubilisierung ist als Druckinstabilität zu beobachten. Die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung zeigen eine Druckfestigkeit, die über die für eine äquivalente Mikrosphäre erwartete hinaus geht, welche nicht in Gegenwart eines erwärmten Perfluoralkan-Dampfes gebildet wird. Andere Kohlenwasserstoffe mit ähnlichen Eigenschaften wie die für Perfluoralkane beschriebenen (d. h. Siedepunkt, Wärmekapazität, Dampfdichte und Molekulargewicht) liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Mikrosphären werden zunächst durch Mischen des Gases und des erwärmten Perfluoralkan-Dampfes gebildet (hierin mit dem Sammelbegriff "Gasphase" bezeichnet). Diese Mischung wird danach auf einer erhöhten Temperatur, vorzugsweise oberhalb des Siedepunkts des Perfluoralkans, und vorzugsweise in der Nähe der thermischen Denaturierungstemperatur des hüllenbildenden Proteins, gehalten, bis sie mit der Proteinlösung in einer geeigneten Mikrosphären bildenden Vorrichtung (in der Regel einer Beschallungskammer oder einer Kolloidmühle) in Kontakt gebracht wird. Alternativ können das Gas und der erwärmte Perfluoralkan-Dampf getrennt eingeführt werden. "Siedepunkt" bezeichnet die Temperatur, bei welcher das Perfluoralkan von der flüssigen Phase in die Dampfphase bei einem bestimmten Druck übergeht. Wenn das Perfluoralkan auf erhöhten Drücken gehalten wird, ist dieser Siedepunkt notwendigerweise höher als er es bei 1 atm wäre. Wenn nichts anderes angegeben ist, bezeichnet der Ausdruck "Siedepunkt", wie hierin verwendet, den Siedepunkt bei 1 atm.
Mikrosphären werden durch Kavitation bei einer ausreichend hohen Temperatur gebildet, um das hüllenbildende Protein ausreichend zu erwärmen und zu insolubilisieren unter Verkapselung der Gasphase. Es ist ebenfalls wichtig, dass die Temperatur während der Mikrosphärenbildung über der Temperatur liegt, bei welcher der Perfluoralkan-Dampf kondensieren würde. Nachdem sich die Mikrosphären gebildet haben, kondensiert eine nachfolgende Abkühlung auf unterhalb des Siedepunktes des Perfluoralkan-Dampfes (29°C für Perfluorpentan, 60°C für Perfluorhexan und 80°C für Perfluorheptan) nach der Mikrosphärenbildung zumindest einen Teil des Dampfes in das Hüllenprotein, um als hydrophobe Sperrschicht zu fungieren. Diese Sperrschicht kann auch eine flüssige Einzelschicht von Perfluoralkan an der Gas-Hülle-Grenzfläche einschließen.
Zusätzlich zu der Bildung einer hydrophoben Sperrschicht sind die Perfluoralkan-Moleküle allgemein groß im Verhältnis zu Gasmolekülen, insbesondere Molekülen von löslichen Gasen mit niedrigem Molekulargewicht und haben die Wirkung der weiteren Isolierung des Kerns von der außen liegenden wässrigen Umgebung durch Einnehmen des Raums innerhalb der Hülle und indem sie als eine physische Sperrschicht gegenüber einer Gasdiffusion wirken.
Weiterhin besitzt der Dampf eines hochsiedenden Perfluoralkans auch eine hohe Wärmekapazität im Verhältnis zu weniger dichten Gasen, wie Luft. Diese Eigenschaft ermöglicht, dass zusätzliche Wärme in den Kavitationsprozess durch den Dampf eingetragen wird, wodurch die thermische Denaturierung des umgebenden Proteins erhöht wird. Demzufolge werden mehr Proteinmoleküle in die Hülle während des hüllenbildenden Verfahrens infolge des höheren Grades der lokalen Proteindenaturierung eingebunden, welcher dem Vorhandensein des erwärmten Perfluoralkan-Dampfes zuzuschreiben ist. Diese dickeren oder dichteren Proteinhüllen führen zu überlegenen Eigenschaften in Bezug auf die Echogenizität und In-vivo-Stabilität und dienen auch weiter der Beschränkung des Ausgesetztseins des Gaskerns an das umgebende Medium.
Weiterhin nimmt man an, dass die hydrophobe Natur des Perfluoralkan-Dampfes sowie die von diesem gelieferte Wärme ebenfalls die Bildung von Hüllenmaterial mit neuen externen Eigenschaften ermöglicht durch Richten der Einwärtsorientierung von hydrophoben Gruppen und der Auswärtsorientierung von hydrophilen Gruppen, wenn die Proteinkette eine thermische Denaturierung und Hüllenbildung erfährt. Dies erzeugt Protein-mikrosphären mit der unerwarteten und definierenden Eigenschaft der Wechselwirkung mit den Wänden der zirkulatorischen Gefäße des Myokards und anderer Organe. Gasbefüllte Proteinmikrosphären, die in Gegenwart des erhitzten Dampfes der hochsiedenden Perfluoralkane hergestellt werden, bestehen im Myokard lange nach dem Spülen durch die Herzkammer bei einem In-vivo-Test fort. Lediglich mit Gasen hergestellte Proteinmikrosphären bestehen im Myokardgewebe nicht fort, nachdem sie aus dem linken Ventrikel durch kardialen Output eliminiert wurden.
Die Einführung von zu viel Perfluoralkan-Additiv erhöht die Dichte der einzelnen Mikrosphären, was zu Teilchen mit negativem Auftrieb führt, welche sich aus der Suspension in 1 % Albumin in mehreren Stunden absondern. Diese Teilchen mit negativem Auftrieb enthalten eine überschüssige Menge an flüssigem Perfluoralkan. Das Vorhandensein von zu viel flüssigem Perfluoralkan kann zu Mikrosphären von instabiler, unbestimmter und unregelmäßiger Größe führen. Solche Präparate von Mikrosphären mit negativem Auftrieb durchqueren die Lungen nicht wirksam, welche Teilchen über 10 μm Durchmesser herausfiltern. Material, das die Lungen nicht durchqueren kann, ist als intravenöses Ultraschall-Kontrastmittel unwirksam. Demzufolge muss die Menge des in dem Verfahren verwendeten Perfluoralkan-Dampfes ausreichend sein, um die Druckstabilität zu verbessern, ohne zu einem negativen Auftrieb zu führen.
Die Menge des einzuführenden Perfluoralkans hängt von dessen Molekulargewicht ab. Je höher das Molekulargewicht, umso weniger Perfluoralkan kann eingeführt werden, ohne Mikrosphären mit negativem Auftrieb zu bilden. Geeignete Mengen können als Volumen pro Volumen (v/v) Prozentanteil der "Gasphase", die eingeführt wird, d. h. die Gesamtmenge an Gas plus Perfluoralkan-Dampf, ausgedrückt werden. Für Perfluorpentan ist diese Menge ungefähr 20 – 50 %; für Perfluorhexan beträgt sie ungefähr 10 – 20 %; und für Perfluorheptan beträgt sie ungefähr 7 – 15 %. Geeignete Mengen für andere Perfluoralkane können leicht auf Basis des Auftriebs und der Druckfestigkeit festgelegt werden. Es versteht sich ebenfalls, dass die Menge, die erforderlich ist, von dem gewählten Kerngas relativ unabhängig ist.
Die Mikrosphären der Erfindung zeigen eine unerwartet erhöhte Druckfestigkeit, wenn der Kern ein lösliches Gas ist. Wenn Mikrosphären mit 50 % Luft und 50 % von entweder Perfluorpropangas oder Perfluorpentan-Dampf (v/v) als Gasphase hergestellt werden, wäre zu erwarten, dass diese Mikrosphären die gleiche Festigkeit bei einem Druck von 68,95 kPa (10 psi) für äquivalente Proben von ungefähr 1 × 10⁷ Mikrosphären pro ml zeigen. Dies liegt daran, dass nicht zu erwarten wäre, dass die Löslichkeit von Luft im Kern oder die Diffusion durch die Hülle durch das Vorliegen des Perfluoralkans vermindert wird. Demzufolge wäre zu erwarten, dass Mikrosphären, die mit der gleichen Menge an Luft gebildet werden, den Luftanteil verlieren, nachdem sie an ausreichend Druck ausgesetzt wurden, um nur den Luftanteil zu solubilisieren, und teilweise zerstört werden. Allerdings zeigen die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung eine unerwartete Druckfestigkeit. Entgegen den Erwartungen zeigen Mikrosphären, die mit 50 % Luft und 50 % Perfluorpentan-Dampf (v/v) gebildet wurden, eine nahezu vollständige Beständigkeit gegenüber einem Druck von 68,95 kPa (10 psi). Demgegenüber fallen Mikrosphären, die mit 50 % Luft und 50 % Perfluorpropan hergestellt wurden, teilweise zusammen infolge des Verlusts des Luftanteils. Mit Perfluorpropan hergestellte Mikro sammen infolge des Verlusts des Luftanteils. Mit Perfluorpropan hergestellte Mikrosphären sind gegenüber 68,95 kPa (10 psi) beständig. Siehe Beispiel 2.
Die Mikrosphären werden in der Form einer Suspension in einem sterilen, wässrigen, injizierbaren Vehikel verwendet. Solche Vehikel sind im Fachbereich pharmazeutischer Formulierungen wohlbekannt. Die Konzentration von Mikrosphären in der Suspension liegt normalerweise im Bereich von 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰, noch üblicher von 1 × 10⁸ bis 1 × 10⁹ pro ml Suspendiermedium. 1 Prozent Humanserum-Albumin in Kochsalzlösung ist ein bevorzugtes Vehikel. Wenn in Suspension, werden die Mikrosphären monodispers und koaleszieren nicht. Die Suspensionen werden vorzugsweise bei 4° – 23°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Natürlich können die Mikrosphären in konzentrierteren oder stärker verdünnten Suspensionen als oben stehend spezifiziert aufbewahrt und danach für die Injektion neu formuliert werden.
Die Mikrosphären werden durch Unterwerfen einer Mischung einer wässrigen Lösung eines wärme-insolubilisierbaren Proteins und der Gasphase an Ultraschall- oder mechanische Kavitation bei erhöhten Temperaturen gebildet, um zu bewirken, dass das Protein gleichzeitig denaturiert und die Gasphase verkapselt, gefolgt von einem Kühlen des Produkts auf 15 – 18°C. Die Konzentration von Protein in der Lösung liegt im Bereich von etwa 0,1 bis 10 % w/v, vorzugsweise etwa 1 bis 5 % w/v, und am meisten bevorzugt etwa 1 % w/v. Die mechanische Kavitation ist bevorzugt, wie sie in einer Kolloidmühle erfolgt. Alternativ kann die mechanische Kavitation bewirkt werden, indem entweder die Gasphase oder die Proteinlösung durch Öffnungen mit einer Größe gepresst wird, die zur Bildung von Mikrosphären innerhalb eines nützlichen Größenbereichs geeignet ist. Unter Anwendung der mechanischen Kavitation in einer Kolloidmühle wird die wässrige Lösung des wärme-insolubilisierbaren Proteins der Mühle bei einer Temperatur zugeführt, die erforderlich ist, um die anfängliche Denaturierungstemperatur während der nachfolgenden mechanischen Kavitation der Lösung zu erreichen. Die Denaturierungstemperatur des Proteins in Lösung liegt normalerweise im Bereich von 50 bis 100°C. Sie kann aus Tabellen der thermischen Proteindenaturierung in der Literatur erhalten werden, oder experimentell durch irgendeine bekannte Methode. Zum Beispiel kann zur experimentellen Bestimmung der Denaturierungstemperatur eine Proteinlösung in einem Wasserbad unter Rühren erwärmt werden. Die Denaturierungstem peratur ist die Temperatur, bei welcher unlösliches Material zuerst festgestellt wird. Zu beachten ist, dass die Denaturierungstemperatur durch die Natur, Reinheit und Quelle des Proteins, die Konzentration von Protein in der Lösung, den pH-Wert, Puffer, die Ionenstärke, das Vorhandensein von Stabilisatoren und das Vorhandensein von chemischen Denaturanzien oder Detergenzien beeinflusst wird. Daher ist es erforderlich, die Denaturierungstemperatur des Proteins in der Umgebung zu bestimmen, in welcher es zur Bildung von Mikrosphären eingesetzt wird. Falls gewünscht, können Additive wie Detergenzien oder polare Lösungsmittel zur Veränderung der Temperatur, bei welcher die Denaturierung erfolgt, eingesetzt werden.
Die folgende Tabelle gibt die Denaturierungstemperaturen mehrerer natürlich vorkommender Proteine an, die experimentell wie oben stehend beschrieben ermittelt wurden:
Tabelle 2

*TRIS = 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
**MES = 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure
***DTT = Dithiothreitol

Jede Vorrichtung, die zur Kavitation der Proteinlösung/Kernmaterial-Mischung eingesetzt wird, bewirkt ein bestimmtes Maß an zusätzlicher Erwärmung der Proteinlösung infolge der auf die Lösung ausgeübten mechanischen Scherkräfte. Diese Wärme muss ausreichend sein, um eine lokale Denaturierung des Proteins an einer Gasphasengrenzfläche zu bewirken. Es ist somit wichtig, den durch die Vorrichtung bewirkten Grad des Temperaturanstiegs zu bestimmen, sodass die Temperatur, bei welcher die Proteinlösung in die Vorrichtung eingeführt wird, eingestellt werden kann, um eine solche lokale thermische Denaturierung zu erzielen. Insbesondere muss die Massentemperatur der Flüssigkeit bzw. in der Masse der Flüssigkeit in der Vorrichtung mit der anfänglichen Denaturierungstemperatur unmittelbar vor der Kavitation zusammenfallen. Der Kavitationsvorgang erzeugt die zusätzliche Wärme, die erforderlich ist, um das Protein lokal zu denaturieren. Die anfängliche Denaturierungstemperatur ist als die Temperatur definiert, bei welcher das Protein kurz vor der Denaturierung steht, doch die Lösung enthält kein denaturiertes Protein. Diese Temperatur liegt knapp unter, typischerweise 1 bis 5°C unterhalb der Denaturierungstemperatur. Falls erforderlich, kann die Ausgangsproteinlösung, bevor sie in die Vorrichtung eingeführt wird, auf eine Temperatur vorerwärmt werden, die das Erreichen der anfänglichen Denaturierungstemperatur ermöglicht.
Nachdem die geeignete Ausgangstemperatur der Proteinlösung erreicht wurde, wird die Lösung mit der Gasphase zusammengebracht, zum Beispiel durch Einführen der Gasphase in die Proteinlösung vor der oder direkt in das Kavitationsverfahren in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis im Bereich von etwa 1 : 20 bis 2 : 1 von Gasphase : Flüssigkeit, vorzugsweise etwa 1 : 5 bis 1 : 1. Das geeignete Gasphase : Flüssigkeit-Verhältnis hängt von der Geometrie der Vorrichtung ab und kann zur Optimierung des Output eingestellt werden.
Die Gasphase und Proteinlösung werden zusammengebracht und einer Kavitation unter Bedingungen unterworfen, die Mikrosphären erzeugen. Dies wird mit Hilfe einer Vorrichtung erreicht, in welcher ein mechanisches Scheren und eine hydrodynamische Kavitation erzeugt werden können, wie Hochgeschwindigkeitsmischer, Mühlen, Wirbelschichtanlagen und dergleichen. Eine bevorzugte Vorrichtung ist eine Kolloidmühle.
Beispiele für spezifische Mühlenvorrichtungen, die eingesetzt werden können, sind die Folgenden:
Modell #2 1/2 (Bematek, Beverly, MA)
Modell W250V (Greerco, Hudson, NH)
Modell 2F (APV Gaulin, Everett, MA)
Modell L4R (Silverson, Chesham, UK)
Modell Polytron PT3000 (Kinematica, Littaw, Schweiz)
Bei Verwendung einer Kolloidmühle sind die Rotorgeschwindigkeit, die Zwischenraum- bzw. Spaltgröße und das Gasphase : Flüssigkeit-Verhältnis die Hauptverfahrensparameter, welche sich auf die Charakteristika (mittlere Größe, Größenverteilung und Konzentration von Mikrosphären) des Produkts auswirken. Diese Parameter werden empirisch eingestellt, um ein Produkt mit den gewünschten Charakteristika bereitzustellen.
Nach dem Durchlaufen der Mühle wird das Produkt gekühlt, typischerweise auf 15 – 18°C. Der Kühlungsschritt führt zur Kondensation eines Teils des Perfluoralkan-Dampfes in die Mikrosphärenhülle. Die resultierenden Mikrosphären können mit Hilfe eines Teilchenzählers, wie eines Coulter Multisizer II-Teilchenzählers, klassiert werden.
Die Mikroteilchenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für herkömmliche Ultraschallabbildung von Körpergeweben oder Organen, wie Herz, Leber, Niere und Gehirn, nützlich. Insbesondere ist sie für die Abbildung von Geweben oder Organen, wie des Myokard-Gewebes, mittels vaskulärer Perfusion der Mikrosphären nützlich. Für die Myokard-Abbildung (sowie die Organ-Perfusion im Allgemeinen) wird die Ultraschalluntersuchung vor der Verabreichung der Mikrosphärensuspensionen eingeleitet und während und nach der Verabreichung fortgeführt und zwar bis die Bildintensität in dem Myokard-Gewebe zu der "Basislinien"-Intensität vor der Verabreichung zurückkehrt. Der Zeitraum, während welchem die Bildintensität des Gewebes zunimmt, wird manchmal als "Wash-in bzw. Einwaschen" bezeichnet, und der Zeitraum, ab wann die Bildintensität des Gewebes einen Peak erreicht hat bis zu einem Zeitpunkt, an dem sie zur Basislinie zurückkehrt, wird als "Wash-out bzw. Auswaschen" bezeichnet. Die Charakteristika der Ultraschallabbildung während des Einwaschens und Auswaschens (wie der Peakintensität-Level und die Zeit, die zur Erreichung der Peakintensität erforderlich ist) können mit den pathologischen Bedingungen in den untersuchten Geweben und Organen in Beziehung gesetzt werden.
Für die Verwendung bei der herkömmlichen Ultraschallabbildung wird die Suspension von Mikrosphären in eine periphere Vene injiziert, entweder als Bolus oder kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum, wie 1 bis 10 Minuten, mit etwa 0,005 bis 0,1 cm³ pro kg Körpergewicht infundiert. Die Ultraschallenergie wird entweder kontinuierlich oder mit Unterbrechungen (d. h. pulsiert) auf das abzubildende Gewebe/Organ angewandt und reflektierte Energie wird gesammelt und in ein Bild mit Hilfe herkömmlicher, kommerziell verfügbarer Ultraschall-Abbildungsgerätschaft übertragen.
Zweidimensionale (2-D) oder mehrdimensionale (z. B. dreidimensionale (3-D))-Echokardiographie-Gerätschaft und -Verfahrensweisen können für den Erhalt des Bildes eingesetzt werden. Solche Verfahrensweisen und Gerätschaft sind die herkömmlichen. Drei Techniken, die für den Erhalt von 3-D-Bildern angewandt werden, sind wie folgt: Bei der ersten wird ein Standard-Transducer verwendet, um tomographische Bilder aufzunehmen. Der Transducer ist an einer Spur bzw. Bahn montiert und fängt Bilder ein, während er sich entlang der Bahn bewegt. Die Bewegungsgeschwindigkeit entlang der Bahn ist so definiert, dass der Abstand zwischen tomographischen Bildern bekannt ist. Die Sammlung von Slices bzw. Schnitten wird danach kombiniert unter Erhalt eines 3-D-Bildes. Bei der Zweiten wird ein Standard-Transducer auch zum Aufnehmen von tomographischen Bildern eingesetzt. Mit dem Transducer verbunden ist ein Sensor, welcher die räumliche Position des Transducers wiedergeben kann, sodass die relative Ausrichtung verschiedener Bilder bekannt ist und die Bilder kombiniert werden können unter Erzeugung eines 3-D-Bildes. Bei der Dritten besteht der Transducer aus einer zweidimensionalen Anordnung von Elementen. Eine eindimensionale Anordnung von Elementen ist zum Erhalt eines tomographischen Bildes in der Lage; die zusätzliche Dimension erlaubt ein Scannen in der dritten Dimension.
Das Abbildungsverfahren wurde in Tiermodellen durchgeführt. In diesen Tests lieferten die in dem Abbildungsverfahren verwendeten Mikrosphären ein ausgezeichnetes Backscatter bzw. Rückstreuung, verminderte Abschwächung und zeigten eine längere Dauer von Kontrasteffekten als irgendeine der gasbefüllten Mikrosphären, die untersucht wurden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sollen nicht die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Mikrosphären
Das Mahlen in einer Kolloidmühle erzeugt Albumin-Mikrosphären durch das Verfahren der mechanischen Kavitation. Die Gaulin-Mühle verwendet ein flache 50,8-mm-(2'')-Scheibe, die sich mit 20.000 U/min dreht. Der Zwischenraum zwischen dem Rotor und Stator ist auf 0,0432 mm (0,0017'') festgelegt. Eine 5 %ige Humanserum-Albuminlösung für die Injektion wird auf 1 % mit USP-Kochsalzlösung für die Injektion verdünnt und mit 300 ml/min durch eine 6,35-mm-(1/4'')-Spirale aus rostfreiem Stahl gepumpt, die in ein thermostat-reguliertes Wasserbad von 60°C eingetaucht ist. Die erwärmte Albuminlösung tritt in den Mühlenkopf durch einen eigens dafür bestimmten Einlass ein.
Alle Gas- und Dampfzuleitungen sind aus thermoreguliertem rostfreiem Stahl. Reine Luft (oder ein anderes geeignetes Gas) aus einem Hochdruckzylinder wird der Mühle durch einen für diesen Zweck bestimmten Port zugeführt. Luft wird auf 206,8 kPa (30 psi) mit einer Strömungsrate von 100 cm³/min einreguliert, die durch einen kalibrierten Massenstrommesser überwacht wird. Flüssiges Perfluorpentan (300 ml) wird in einen mit einem Ventil ausgerüsteten kleinen Stahlzylinder gefüllt und in ein heißes Wasserbad (92°C) gegeben. Perfluorpentan-Dampf wird auf 206,8 kPa (30 psi) einreguliert und durch einen zweiten kalibrierten Massenstrommesser mit 100 cm³/min (1 g/min) geleitet. Perfluorpentan-Dampf vereinigt sich mit dem Luftstrom bei einem "T". Der Dampf und die Luft werden durch Leiten durch einen thermoregulierten statischen 9"-Gasmischer direkt stromaufwärts des Mühlenkopfes gemischt. Ein Thermoelement überwacht die Temperatur der Gas/Dampf-Mischung, die auf 70 – 90°C gehalten wird.
Die Flüssig- und Gasphasen vereinigen sich in der Mühle bei einer Prozesstemperatur von 76,5 ± 1 °C. Mikrosphären werden durch mechanische Kavitation in einer Suspensi on von 1 %iger Albuminlösung gebildet. Das Produkt wird unmittelbar durch Leiten durch einen In-line-Kühler auf 15° – 18°C gekühlt. Das Produkt kommt aus dem Kühler in ein Glasgefäß oder einen Sammelbeutel. Die flüssige Massensuspension wird über Nacht unter Gefrieren aufbewahrt, erneut durch Bewegung suspendiert und in einzelne Glaskolben oder Spritzen gefüllt. Das Produkt sondert sich nach dem Stehen lassen in eine dichte weiße flotierende Schicht und einen klaren Unterstand ab. Gemäß diesem Verfahren hergestellte Mikrosphären haben eine Konzentration von 4–9 × 10⁸/ml mit einer mittleren Größe von 4 – 7 μm und einem Gesamtgasvolumen von 70 – 200 ml/ml Suspension. Die Gaschromatographiedaten zeigen einen Perfluorpentan-Gehalt von ungefähr 0,5 mg/ml an.
Beispiel 2: Druckstabilität von Mikrosphären
Mikrosphären von 10 getrennten Chargen, die gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Perfluorpentan-Dampf und Luft als Gasphase über einen Bereich unterschiedlicher Verhältnisse hergestellt wurden, wurden in belüftete Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um eine Suspension mit einer optischen Dichte von 1 bei 600 nm zu ergeben. Dies entspricht ungefähr 1 × 10⁷ Mikrosphären/ml. Die Suspension wurde in eine Druckküvette gegeben, und die optische Dichte wurde als eine Funktion der Zeit während 1 Minute überwacht. Umgebungsdruck wurde während der ersten 15 Sekunden angewandt, gefolgt von 10 psi für die nächsten 15 Sekunden. Druck wurde entspannt und für die letzten 30 Sekunden auf Umgebungsdruck zurückgeführt.
Die Anwendung von Druck bewirkt eine Zunahme der Löslichkeit des Gaskerns nach dem Henryschen Gesetz. Luft, die viel löslicher als Perfluorpentan ist, wird wesentlich wirksamer durch die Anwendung von Druck in Lösung getrieben. 100 % luftgefüllte Mikrosphären (ALBUNEX^®, Molecular Biosystems, Inc., San Diego, Kalifornien) werden beispielsweise bei 1 × 10⁷/ml durch 68,95 kPa (10 psi) vollständig zerstört (1). Mit 100 % Perfluorpropan gefüllte Mikrosphären zeigen bei Anwendung von 68,95 kPa (10 psi) eine Kompression, erlangen aber die ursprüngliche optische Dichte bei Freisetzung von Druck wieder (2). Mit 50 % Luft und 50 % Perfluorpropan als Gasphase hergestellte Mikrosphären zeigen eine Kompression und unvollständige Rückverformung nach der Freisetzung von Druck (3). Der Luftanteil löst sich leicht in die umgebende Lösung auf und tritt bei Freisetzung von Druck nicht wieder ein. Der Grad der Rückver formung dieser Mikrosphären ist umgekehrt proportional zu dem Anteil der vorhandenen Luft.
Gemäß Beispiel 1 hergestellte Mikrosphären mit 50 % Perfluorpentan-Dampf und 50 Luft als Gasphase und die Druckfestigkeit wurden wie oben stehend beschrieben bestimmt. Diese Mikrosphären zeigten unerwarteter Weise eine nahezu vollständige Rückverformung, nachdem sie an 68,95 kPa (10 psi) ausgesetzt wurden (4). Präparate mit höheren Prozentanteilen an Luft zeigen ebenfalls Druckfestigkeit in einem höheren Grade als erwartet. Die 5 zeigt die Wirkung von 68,95 kPa (10 psi) auf eine Probe von Luft:Perfluorpentan-Dampf-Mikrosphären, die mit 66 % Luft in der Gasphase hergestellt wurden. Diese Mikrosphärenpräparate zeigen eine nahezu völlige Druckfestigkeit. Mit zunehmendem Luftanteil nimmt die Druckfestigkeit ab, doch das Vorliegen von mehr als 20 % Perfluorpentan-Dampf erhöht die Druckfestigkeit über die Erwartungen hinaus. Die 6 zeigt die Wirkung des Drucks auf eine Bandbreite von Präparaten: 0 %, 10 %, 25 %, 34 %, 50 %, 80 % und 100 % Perfluorpentan-Dampf. Mit 100 % Perfluorpentan-Dampf hergestellte Mikrosphären besitzen einen negativen Auftrieb und werden durch die Anwendung oder die Entspannung eines Drucks von 68,95 kPa (10 psi) nicht beeinflusst, d. h. die optische Dichte bleibt unverändert. Dies wäre für einen Flüssigkern zu erwarten, da Flüssigkeiten größtenteils nicht komprimierbar sind.
Beispiel 3: In-vivo-Verwendung von Mikrosphären für die linke ventrikuläre Opakifikation
1 ml einer Mikrosphärensuspension, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde (50 % Perfluorpentan-Dampf und 50 % Luft als Gasphase) wurde in einen 23 kg wiegenden männlichen Mischkreuzungshund, der für einen bestimmten Zweck gezüchtet wurde, injiziert. Die Injektion erfolgte durch einen Femoralvenen-Katheter, gefolgt von einer 4–6-ml-Kochsalzspülung. Das Mittel verursachte eine komplette Opakifikation der linken ventrikulären Kammer mit einer Peakveränderung der Bildhelligkeit von 15,8 dB. Dieses Mittel verstärkte auch das Septum und das Myokard der hinteren Wand mit einer Peakver-änderung von der Basislinie von 1,0 bzw. 0,8 dB. Bei 2 Minuten nach der Injektion blieb die linke ventrikuläre Kammer 1,7 dB über der Basislinie und zu 100 gefüllt. Das Myokard der hinteren Wand war 0,8 dB über der Basislinie, und im Septum 3,9 dB über der Basislinie. Bis 4 Minuten waren sowohl die Kammer- als auch die Septumbildintensitäten zur Basislinie zurückgekehrt, doch die hintere Wand blieb bei 0,2 dB über der Basislinie. Diese Dosis des Mittels bewirkte keine signifikante Veränderung der Hämodynamik. Es gab keine Veränderung beim mittleren Arteriendruck und keine Veränderung bei der Herzrate. Es gab auch keine signifikanten Veränderungen bei den Arterienblutgasen oder beim pH-Wert. Die Opakifikation des linken Ventrikels war mindestens 4 Minuten lang nach der Injektion festzustellen. Bei 1,5 Minuten nach der Injektion blieb das Myokard opakifiziert, obwohl der Opakifikationsgrad in der Herzkammer zur Basislinie zurückgekehrt war.
Beispiel 4: In-vivo-Abbildungswirkungen des Myokards
Gemäß Beispiel 1 hergestellte Mikrosphärensuspensionen zeigen einen starken und anhaltenden Ultraschallkontrast in vivo bei einer Beobachtung durch eine Standard-B-Modus-(fundamentale)-Abbildung des Herzens. Es kann jedwede kardiale Ultraschallansicht angewandt werden, doch die parasternale Kurzachsenansicht ermöglicht grob eine Mittelpunkt-Querschnitts-Betrachtungsebene. Vor der Verabreichung erscheint die linke ventrikuläre Kammer als eine dunkelgraue, in etwa kreisförmige Struktur und die rechte ventrikuläre Kammer ist eine dunkle halbmondförmige Struktur. Nach der intravenösen Injektion von 0,5 cm³ einer gemäß Beispiel 1 hergestellten Mikrosphärensuspension (50 % Luft und 50 % Perfluorpentan-Dampf als Gasphase, mit einem mittleren Durchmesser von 5 μm) in einen anästhetisierten Hund, erscheinen die Mikrosphären zuerst (innerhalb einiger Sekunden) in der rechten ventrikulären Kammer des Herzens. Das Bild der rechten ventrikulären Kammer erscheint hellweiß, gefolgt von einem diffusen schwarzen Schatten (Abschwächung), mit Ausnahme eines hellweißen Randes an der Oberseite der halbmondförmigen Gestalt, die proximal zu der Ultraschallquelle liegt. Innerhalb mehrerer Herzschläge scheint weißes Material in die linke ventrikuläre Kammer zu wirbeln und diese vollständig auszufüllen und erzeugt danach eine größere Abschattung im unteren Teil des Herzbildes. Die Mikrosphären hellen die graue Farbe des Myokards weiter beträchtlich auf, während sie das myokardiale Gefäßsystem von den Koronararterien ausfüllen. Die erhöhte Helligkeit ist nur in dieser Stufe in den Bereichen des Herzgewebes zu sehen, die proximal zu der Ultraschallquelle liegen, aufgrund der fortgesetzten Abschwächung (Abschattung) von der ventrikulären Kammer. Die Abschattung von der Kammer dauert mehrere Sekunden und belässt das Ventrikel sehr hellgrau. In diesem Stadium sind beim Myokard eine ähnliche Intensität und eine viel hellere Schattierung von Grau festzustellen als bei dem Vorinjektionsbild.
Die Mikrosphären leeren sich zuerst von der rechten ventrikulären Kammer, dann der linken ventrikulären Kammer, und führen die ventrikulären Kammern rechtzeitig wieder auf die Basislinien-Bildintensität zurück. Ungefähr 3 bis 5 Minuten nach der Injektion erscheint die linke ventrikuläre Kammer als ein dunkelgrauer Kreis, umgeben von einem hellgrauen "doughnutförmigen" Myokard, was auf das Fortbestehen von Mikrosphären im Gefäßsystem des Herzgewebes hinweist. Das aufgehellte Myokard schwächt sich mit der Zeit langsam ab und kehrt zur Basislinienintensität in ungefähr 20 bis 30 Minuten zurück. Wiederholte Injektionen liefern die gleichen Resultate ohne beobachtete nachteilige Auswirkungen auf die Herzrate, den systemischen Blutdruck und die arteriellen Blutgaswerte.
Beispiel 5: in-vivo-Organperfusion
Mit Hilfe eines 5-MHz-Stufen-Array-Transducers auf einem Hewlett Packard Sonos 1500-Instrument wurden transthorakale parasternale Kurzachsenansichten des Herzen bei 3 Ratten, 1 Kaninchen und 2 Hunden visuell mit Hilfe einer herkömmlichen Ultrasonographie nach der intravenösen Injektion von Mikrosphärensuspensionen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, bewertet. Diese Suspensionen lieferten eine verlängerte Aufhellung des Kaninchen- und Ratten-Myokards (0,01 bis 0,1 ml), des Hund-Myokards (0,5 ml), der Hundeniere und -leber (3,0 ml), worauf 1–3 Herzschläge einer Fernfeld-Schallabschwächung folgten. Bei einer Bewertung durch Schalldensitometrie zeigte die Peakaufhellung des Myokards Veränderungen bei der Intensität von 7 bis 8 dB beim Hunde-Myokard, 2,6 dB beim Kaninchen- und 5 bis 6,4 beim Ratten-Myokard. Die myokardiale Aufhellung hielt an, nachdem die ventrikulären Kammern sich geleert hatten. Dieses Bild kann mit demjenigen eines Doughnut verglichen werden, wobei die ausgespülte linke Kammer im Zentrum vom aufgehellten Myokard umgeben ist. Diese optische Aufhellung des Myokards hielt für ungefähr 20 bis 30 Minuten nach den Injektionen bei den anästhetisierten Hunden an, verglichen mit 0,5 bis 2,0 Minuten unter Verwendung von mit Perfluorpropan gefüllten Albumin-Mikrosphären, die gemäß dem US-Patent Nr. 4 957 656 gebildet wurden.
Die physiologischen Parameter, die beim In-vivo-Screening der Testmikrosphärensuspensionen gemessen wurden, waren die Herzrate und der mittlere Arteriendruck. Es gab keine physiologisch relevanten Veränderungen (nicht mehr als 5 Schläge/min oder 666,6 Pa (5 mmHg) nach der Verabreichung der Mikrosphärensuspensionen an die Versuchstiere. Keine Änderungen bei der Herzrate oder beim mittleren Arteriendruck und auch keine Veränderungen bei der Arterienblut-Sauerstoffanreicherung, wie durch ein klinisches peripheres Oximeter gemessen, wurden unter Verwendung dieser Mikrosphärensuspensionen festgestellt.
Beispiel 6: Akustische Eigenschaften
Kontrastmittel vom Mikrobläschen-Typ sehen eine akustische Rückstreuung bzw. Backscatter und Abschwächung aufgrund der Komprimierbarkeit von Gas vor. Diese Eigenschaften werden jedoch durch das Vorhandensein einer das Gas verkapselnden festen Hülle modifiziert. Unterschiede beim Gas im Innern der Mikrosphäre sollten nur wenig Auswirkung auf die akustischen Eigenschaften haben, weil es einen geringen Unterschied in der Komprimierbarkeit verschiedener Gase gibt. Um zu bestimmen, ob das Vorhandensein von Perfluorpropan-Dampf während der Mikrosphärenbildung die physikalischen Eigenschaften der Mikrosphärenhülle beeinflusste, wurde die akustische Rückstreuung und Abschwächung einer wie in Beispiel 1 hergestellten Mikrosphärensuspension ("Test"-Mikrosphären) gemessen und mit mit Perfluorpropan befüllten Albumin-Mikrosphären, die gemäß dem US-Patent Nr. 4 957 656 hergestellt wurden ("Kontroll"-Mikrosphären) und mit ALBUNEX^® (luftgefüllte Albumin-Mikrosphären, Molecular Biosystems, Inc., San Diego, Kalifornien) verglichen.
Eine kleine Menge einer Probe, 13 μl – 25 μl, wurde in eine zylindrische Probenkammer, die mit 62 ml Isoton^® II gefüllt war, hinzugegeben. Die Probenkammer wurde in ein temperaturreguliertes Wasserbad gestellt und mit 25 U/min rotieren gelassen, um die Mikrosphärensuspension homogen zu halten. Einer von zwei Panametrics-Ultraschall-Transducern (Zentrumsfrequenz = 2,25 MHz oder 5,0 MHz) wurde durch einen Panametrics-Modell 5800-101-Impulsgeber/Empfänger angeregt, um einen Ultraschall-Burst auszusenden. Der rückgestreute Ultraschall wurde von dem Transducer empfangen, durch den Impulsgeber/Empfänger detektiert und durch ein Hewlett Packard-Modell-54505B-Digitaloszilloskop digitalisiert. Das Datengewinnungsverfahren wurde durch einen PC gesteuert. Ungefähr 50 Rückstreuungsmessungen wurden mit jeder Probe durchgeführt, und es wurden mehrere Proben aus jeder Charge untersucht.
Die Datenanalyse schloss das Berechnen des Logarithmus der integrierten rückgestreuten Leistung als einer Funktion der Tiefe innerhalb der Probenkammer ein. Eine lineare Regression wurde mit den Daten bei jeder Frequenz durchgeführt, wobei der y-Achsenabschnitt proportional zu der Streuungsstärke ist und die Größe der Neigung proportional zu der Abschwächung für die Testmikrosphären ist. Der Korrelationskoeffzient war 0,998 bei 2,5 MHz und 0,994 bei 5,0 MHz.
Die akustische Rückstreuung und Abschwächung der Test- und Kontrollmikrosphärensuspensionen wurden berechnet. Diese Berechnungen beinhalteten die Größenverteilung und -konzentration der Mikrosphärensuspensionen, sodass Vergleiche der akustischen Eigenschaften vorgenommen werden können, die von der Mikrosphärengröße und der Konzentration unabhängig sind. Die Berechnungen erfolgten mit Hilfe der von C. Church beschriebenen Theorie (J. Acoust. Soc. Amer., 97(3) 1510–1521 (1995)). Die Berechnungen basierten auf den einfallenden Ultraschallfrequenzen, der Temperatur des Wasserbades, der Verdünnung und den Größenverteilungen und Konzentrationen der Mikrosphärensuspensionen, die mit Hilfe eines Coulter^®-Multisizer-Teilchenanalysengeräts gemessen wurden.
Für die Abschwächung und Rückstreuung bei den zwei Ultraschallfrequenzen lag der Korrelationskoeffizient der Messungen und der Berechnungen für mehrere Chargen von Kontrollmikrosphärensuspensionen im Bereich von 0,79 bis 0,98. Diese lineare Beziehung zeigte die Richtigkeit der Theorie. Das 95-%-Voraussageintervall dieser Linie wurde für die Abschwächung und Rückstreuung bei 2,25 MHz und 5,0 MHz bestimmt. Die Datenpunkte für die Berechnungen und Messungen der Rückstreuung der Testmikrosphärensuspensionen liegen außerhalb des Voraussageintervalls bei beiden Ultraschallfrequenzen. Die Datenpunkte für die Berechnungen und Messungen der Abschwächung bei 2,25 MHz der Testmikrosphärensuspensionen liegen ebenfalls außerhalb des Voraussageintervalls. Die Streustärke und Abschwächung dieser Formulierung ist statistisch sügnifikant geringer als diejenige der Kontrollmikrosphären mit einer äquivalenten Größenverteilung.
Daher sind die festgestellten Unterschiede in den akustischen Eigenschaften der Testmikrosphären, die mit denjenigen der Kontrollmikrosphären verglichen wurden, den Un terschieden in den Eigenschaften der Hülle, wie Dicke, Viskosität und/oder Starrheit, zuzuschreiben.
Beispiel 7: Vergleich der herkömmlichen Abbildung gegenüber der harmonischen Abbildung
Suspensionen von Mikrosphären, die gemäß Beispiel 1 mit 50 % Perfluorpentan-Dampf und 50 % Luft als Gasphase ("Test"-Mikrosphären) hergestellt wurden, wurden mit Suspensionen von mit Perfluorpropan gefüllten Albumin-Mikrosphären, die gemäß dem US-Patent Nr. 4 957 656 hergestellt wurden ("Kontroll"-Mikrosphären) mit Hilfe sowohl der herkömmlichen Ultraschall-Abbildung als auch der harmonischen Abbildung verglichen.
Ein Myokard eines Hundes wurde wie in Beispiel 3 beschrieben nach der Injektion von äquivalenten Dosen von Testmikrosphären mit der herkömmlichen Ultraschall-Abbildung und mit der harmonischen Abbildung abgebildet. Bilder wurden vor und nach der Verabreichung der Testmikrosphärensuspension erhalten. Eine Region von Interesse ("ROI") innerhalb des Myokards wurde ausgewählt, und es wurde die Bildintensität innerhalb dieses ROI bestimmt. Die Bildintensität nach der Verabreichung in der ROI nach der Subtraktion der Basislinien-Intensität vor der Verabreichung war 29 Grauskalaeinheiten, was ein Hinweis darauf ist, dass das herkömmliche Bild nach der Verabreichung der Testmikrosphärensuspension verbessert wurde. Dieses Experiment wurde mit Hilfe der harmonischen Abbildung wiederholt. Es wurde keine Verbesserung der Bildintensität nach der Verabreichung der Testmikrosphärensuspension festgestellt, d. h. die Bildintensität nahm nicht über die Basislinien-Intensität vor der Verabreichung zu.
Dieses Experiment zeigt, dass die Testmikrosphären keine Resonanzeigenschaften zeigen, die mit Hilfe der harmonischen Abbildung ausgewertet werden können. Im Vergleich zeigten die Kontrollmikrosphärensuspensionen, wie berichtet, eine Bildverbesserung unter Anwendung der harmonischen Abbildung. Siehe zum Beispiel Dittrich et al. (Zusammenfassung, die dem 'American College of Cardiology' auf der 45. Jährlichen Wissenschaftlichen Sitzung von 1996 vorgelegt wurde), die berichteten, dass mit Perfluorpropan gefüllte Albumin-Mikrosphären harmonische Bilder des Myokards verbesserten.

Claims

Zusammensetzung zur Verwendung als Ultraschall-Abbildungsmittel, umfassend eine Suspension von Mikrosphären, wobei die Mikrosphären einen Gaskern umfassen, umfassend Gas mit einer Löslichkeit von höher als oder gleich 0,01 ml Gas pro ml Wasser bei 25°C bei 101,325 kPa (1 Atmosphärendruck), wobei der Kern durch eine Proteinhülle verkapselt ist, wobei die Mikrosphären durch ein Verfahren erhältlich sind, umfassend: (a) Mischen einer Gasphase, umfassend ein Gas und Perfluoralkan-Dampf, welcher auf eine Temperatur über dessen Siedepunkt und nahe der Denaturierungstemperatur des Proteins erwärmt wurde, mit einer Lösung eines wärmeinsolubilisierbaren Proteins; (b) Kavitation der Mischung unter Bedingungen, welche die Bildung von Mikrosphären durch Wärme-Insolubilisierung des Proteins ermöglichen; und (c) Kühlen der Mikrosphären bis zum Kondensieren zumindest eines Teils des Perfluoralkans in die Hülle.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gas Luft ist.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein Albumin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Albumin Humanserum-Albumin ist.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Perfluoralkan-Dampf Perfluorpentan-, Perfluorhexan- oder Perfluorheptan-Dampf ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Perfluorpentan-Dampf zwischen 20 % bis 50 % (v/v) der Gasphase beträgt und/oder der Perfluorhexan-Dampf zwischen 10 % bis 20 % (v/v) der Gasphase beträgt und/oder der Perfluorheptan-Dampf zwischen 7 % bis 15 % der Gasphase beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Perfluorpentan-Dampf etwa 50 % der Gasphase beträgt.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrosphären Druckfestigkeit bei 68,95 kPa (10 psi) zeigen.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrosphären einen mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 μm aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Mikrosphären einen mittleren Durchmesser im Bereich von 1 bis 6 μm aufweisen.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrosphären in der Suspension in einer Konzentration von 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Mikrosphären/ml Suspension vorliegen.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hülle modifiziert ist, um einen Anteil einzuschließen, welcher ein spezifisches Gewebe oder Organ targetiert.
Zusammensetzung für die Verwendung als Ultraschall-Abbildungsmittel, umfassend eine Suspension von Mikrosphären, wobei die Mikrosphären eine Gasphase von 50 % eines Gases mit einer Löslichkeit von größer als oder gleich 0,01 ml Gas pro ml Wasser bei 25°C bei 101,325 kPa (1 Atmosphärendruck) und 50 % Perfluorpentan (v/v), verkapselt durch eine Hülle eines Wärme-insolubilisierten Proteins, umfassen.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Gas Luft ist.
Zusammensetzung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, welche intravenös verabreichbar ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend Mikrosphären, die als Ultraschall-Abbildungsmittel nützlich sind, umfassend einen Gaskern, verkapselt durch eine Hülle eines Wärme-insolubilisierten Proteins, wobei der Gaskern Gas mit einer Löslichkeit von höher als oder gleich 0,01 ml Gas pro ml Wasser bei 25°C bei 101,325 kPa (1 Atmosphärendruck) umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Mischen einer Gasphase, umfassend ein Gas und Perfluoralkan-Dampf, welcher auf eine Temperatur über dessen Siedepunkt und nahe der Denaturierungstemperatur des Proteins erwärmt wurde, mit einer Lösung eines wärmeinsolubilisierbaren Proteins; (b) Kavitation der Mischung unter Bedingungen, welche die Bildung von Mikrosphären durch Wärme-Insolubilisierung des Proteins ermöglichen; und (c) Kühlen der Mikrosphären, um zumindest einen Teil des Perfluoralkans in die Hülle zu kondensieren.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei Albumin in der Proteinlösung in einer Konzentration von 1 bis einschließlich 5 Gew.-% vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Kavitation durch Anwenden von Ultraschall- oder mechanischer Energie erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, welches eine Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 15 erzeugt.
Zusammensetzung, umfassend Mikrosphären, die durch ein Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 19 hergestellt werden.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Ultraschall-Abbildungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Suspension von Mikrosphären nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 umfasst, zur Abbildung eines Gewebes oder Organs eines Versuchsobjektes in einem Verfahren, umfassend: (i) Abwarten für eine ausreichende Zeit, bis die Mikrosphären das Gewebe oder Organ erreichen und dieses perfundieren, nach der Verabreichung der Zusammensetzung an das Versuchsobjekt; (ii) Anwenden von Ultraschallenergie bei dem Versuchsobjekt; und (iii) Erzeugen eines Ultraschallbildes aus der von dem Gewebe oder Organ reflektierten Ultraschallenergie.
Anwendung nach Anspruch 21, wobei das Gewebe oder das Organ Herzgewebe oder ein Herz mit einem Myokard und einer linken und rechten ventrikulären Kammer ist und der Schritt (ii) weiter das Abwarten für eine ausreichende Zeitdauer, bis die Mikrosphären das Herz erreichen, die linke ventrikuläre Kammer füllen, das Myokard perfundieren, die linke ventrikuläre Kammer verlassen und das Myokard verlassen.
Anwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Zusammensetzung intravenös als Bolus-Injektion verabreicht wird.
Anwendung nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Zusammensetzung intravenös über einen Zeitraum von mindestens 1 Minute verabreicht wird.
Anwendung nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei der Schritt (iii) das Erzeugen eines zwei- oder dreidimensionalen Ultraschallbildes umfasst.
Anwendung nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei der Schritt (ii) das Anwenden einer kontinuierlichen oder gepulsten Ultraschallenergie umfasst.
Anwendung nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der Schritt (i) die Verabreichung der Zusammensetzung über eine vorgefüllte Spritze umfasst.