DE69836961T2

DE69836961T2 - Methode zur verstärkung des ultraschallechos und zur verminderung der abschwächung von mikroverkapselten gasen

Info

Publication number: DE69836961T2
Application number: DE69836961T
Authority: DE
Inventors: C. Charles Arlington CHURCH; Howard Cambridge BERNSTEIN; Ann Julie Winchester STRAUB; T. Henry Sommerville BRUSH
Original assignee: Acusphere Inc
Current assignee: Acusphere Inc
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: KR20010014300A; HK1029273A1; AU740728B2; PT996470E; NO316614B1; AU8273198A; IL133595A0; US6045777A; IL133595A; NZ501830A; WO1999000149A1; ZA985705B; KR100637022B1; CA2294199C; ATE352322T1; CN1261809A; MY122120A; CA2294199A1; NO996512D0; ES2280094T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Mittel zur Bilddarstellung bzw. der diagnostischen bildgebenden Mittel und ist insbesondere auf mikroteilchenförmige Ultraschallbilddarstellungs-Kontrastmittel gerichtet, die erhöhte Echogenität und verringerte Attenuierung bzw. Abschwächung als Funktion der Dicke der Polymermembran haben.
Wenn Ultraschall verwendet wird, um ein Bild der inneren Organe und Strukturen eines Menschen oder eines Tieres zu erhalten, werden Ultraschallwellen, Wellen mit Schallenergie bei einer Frequenz über der, die durch das menschliche Ohr erkennbar ist, reflektiert, wenn sie durch den Körper gehen. Verschiedene Typen an Körpergewebe reflektieren die Ultraschallwellen unterschiedlich und die Reflexionen, die durch die Ultraschallwellen erzeugt werden, die von verschiedenen inneren Strukturen reflektiert werden, werden detektiert und elektronisch in eine visuelle Anzeige umgewandelt.
Für einige medizinische Zustände ist der Erhalt eines verwendbaren Bildes des Organs oder der Struktur von Interesse besonders schwierig, da die Details der Struktur von dem umgebenden Gewebe in einem Ultraschallbild, das durch die Reflexion von Ultraschallwellen in Abwesenheit eines Kontrastverstärkungsmittels produziert wird, nicht adäquat erkennbar sind. Detektion und Beobachtung von bestimmten physiologischen und pathologischen Zuständen kann wesentlich verbessert werden, indem der Kontrast in einem Ultraschallbild durch Injizieren oder Infundieren eines Agenzes in ein Organ oder eine andere Struktur von Interesse verbessert wird. In anderen Fällen ist die Detektion der Bewegung des Kontrastverstärkungsmittels selbst besonders wichtig. Beispielsweise kann ein unterschiedliches Blutstrommuster, von dem bekannt ist, daß es aus bestimmten kardiovaskulären Abnormalitäten stammt, nur erkennbar sein, wenn ein Kontrastverstärkungsmittel in den Blutstrom infundiert wird und die Dynamik des Blutstroms beobachtet wird.
Materialien, die als Ultraschallkontrastmittel verwendbar sind, wirken durch einen Effekt auf Ultraschallwellen, wenn sie durch den Körper gehen, und werden unter Erzeugung des Bildes reflektiert, aus dem eine medizinische Diagnose erstellt wird. Verschiedene Typen von Substanzen beeinflussen Ultraschallwellen in verschiedener Weise und zu unterschiedlichen Graden. Darüber hinaus werden bestimmte der durch Kontrastverstärkungsmittel erzeugten Wirkungen einfacher gemessen und beobachtet als andere. Beim Auswählen einer idealen Zusammensetzung für ein Kontrastverstärkungsmittel würde man die Substanz bevorzugen, die die stärkste Wirkung auf die Ultraschallwelle hat, wenn sie durch den Körper geht. Die Wirkung auf die Ultraschallwelle sollte auch leicht gemessen werden. Es gibt zwei Wirkungen, die in einem Ultraschallbild gesehen werden können:
Rückstreuung: Wenn eine Ultraschallwelle, die durch den Körper geht, auf eine Struktur, zum Beispiel ein Organ oder ein anderes Körpergewebe, trifft, reflektiert die Struktur einen Teil der Ultraschallwellen. Verschiedene Strukturen im Körper reflektieren Ultraschallenergie auf verschiedenen Wegen und mit variierenden Stärken. Diese reflektierte Energie wird detektiert und eingesetzt, um ein Bild der Strukturen, durch welche die Ultraschallwelle gegangen ist, zu erzeugen. Der Ausdruck "Rückstreuung" bezeichnet eine Phänomen, bei dem Ultraschallenergie durch eine Substanz mit bestimmten physikalischen Eigenschaften zurück zur Quelle gestreut wird.
Es ist seit langem anerkannt, daß der Kontrast, der in einem Ultraschallbild beobachtet wird, durch das Vorliegen von Substanzen erhöht werden kann, von denen bekannt ist, daß sie eine große Menge an Rückstreuung verursachen. Wenn eine solche Substanz einem getrennten Teil des Körpers verabreicht wird, wird der Kontrast zwischen dem Ultraschallbild dieses Teils des Körpers und der umgebenden Geweben, die die Substanz nicht enthalten, verstärkt. Es ist einzusehen, daß verschiedene Substanzen infolge ihrer physikalischen Eigenschaften eine Rückstreuung in variierenden Graden verursachen. Dementsprechend wurde die Suche nach Kontrastverstärkungsmitteln auf Substanzen fokussiert, die stabil und nicht toxisch sind und die die maximale Menge an Rückstreuung aufweisen.
Die Fähigkeit einer Substanz, eine Rückstreuung von Ultraschallenergie zu bewirken, hängt von Charakteristiken der Substanz ab, so daß ihre Fähigkeit komprimiert werden soll. Bei der Untersuchung verschiedener Substanzen ist es nützlich, eine bestimmte Messung der Fähigkeit einer Substanz, Rückstreuung zu verursachen, bekannt als der "Streuungsquer schnitt" zu vergleichen. Der Streuungsquerschnitt einer bestimmten Substanz ist proportional zum Radius des Streukörpers und hängt auch von der Wellenlänge der Ultraschallenergie und von anderen physikalischen Eigenschaften der Substanz ab; J. Ophir und K.J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, Bd. IS, n. 4, S. 319, 323 (1989).
In der Evaluierung der Nützlichkeit von verschiedenen Substanzen als Ultraschallkontrastmittel, d.h. Gasen, Flüssigkeiten oder Feststoffen, kann man berechnen, welche Mittel den höheren Streuungsquerschnitt haben sollten und entsprechend welche Mittel den größten Kontrast in einem Ultraschallbild liefern sollten. Es kann angenommen werden, daß die Komprimierbarkeit eines festen Partikels viel geringer ist als die des umgebenden Mediums und daß die Dichte des Teilchen größer ist. Unter Verwendung dieser Annahme wurde der Streuungsquerschnitt eines festen Partikels als Kontrastverstärkungsmittel als 1,75 geschätzt (Ophir und Parker, oben, bei 325). Für einen reinen flüssigen Streukörper (scatterer), sind die adiabatische Komprimierbarkeit und Dichte des Streukörpers und des umgebenden Mediums wahrscheinlich annähernd gleich, was das Resultat ergeben würde, daß Flüssigkeiten einen Streuungsquerschnitt von Null hätten. Allerdings können Flüssigkeiten eine gewisse Rückstreuung aufweisen, wenn große Volumina eines flüssigen Agenzes vorliegen. Wenn beispielsweise ein flüssiges Agens aus einem sehr kleinen Gefäß in ein sehr großes übergeht, so daß die Flüssigkeit im wesentlichen das ganze Gefäß besetzt, kann die Flüssigkeit eine meßbare Rückstreuung aufweisen. Dennoch wird es dem Fachmann klar sein, daß reine Flüssigkeiten relativ ineffiziente Streukörper (Scatterer) sind.
Der Streuungsquerschnitt eines Gases unterscheidet sich wesentlich von dem einer Flüssigkeit oder eines Feststoffs und ist größer, teilweise weil eine Gasblase zu einem viel größeren Ausmaß komprimiert werden kann als eine Flüssigkeit oder ein Feststoff. Darüber hinaus weisen freie Gasblasen in einer Flüssigkeit eine oszillatorische Bewegung auf, so daß Gasblasen bei bestimmten Frequenzen bei einer Frequenz nahe der der Ultraschallwellen, die üblicherweise in der medizinischen Bildgebung verwendet werden, in Resonanz geraten werden. Das Resultat ist, daß der Streuungsquerschnitt einer Gasblase über 1000-mal größer sein kann als ihre physikalische Größe.
Strahlenabschwächung: Ein anderer Effekt, der durch das Vorliegen bestimmter Kontrastverstärkungsmittel beobachtet werden kann, ist die Abschwächung der Ultraschallwelle. Die Intensität der Ultraschallwelle nimmt ab, wenn die Welle durch das Volumen von Gewebe oder Blut, das das Kontrastmittel enthält, geht. Die Abnahme bei der Wellenintensität ist das Resultat sowohl von Ultraschall, der durch das Mittel rückgestreut wird, als auch einer Dissipation bzw. eines Verlustes der Welle, wenn sie mit dem Kontrastmittel wechselwirkt. Wenn der Strahl zu sehr abgeschwächt ist, wird die Energie, die aus Regionen distal zu dem Kontrastmittel zum Wandler zurückgeführt wird, niedrig sein, was zu einer schlechten Bildtiefe führt. Die Verwendung von Strahlungsabschwächungsdifferenzen in verschiedenen Gewebetypen wurde als Bildverstärkungsverfahren versucht. Ein Bildkontrast wurde bei herkömmlicher Bildgebung infolge von lokalisierten Abschwächungsdifferenzen zwischen bestimmten Gewebetypen beobachtet. K.J. Parker und R.C. Wagg, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images," IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), S. 431–37 (1983); K.J. Parker, R.C. Wagg und R.M. Lerner "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characterization," Radiology, 153(3), S. 785–88 (1984). Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß Messungen der Abschwächung einer Geweberegion, die vor und nach Infusion eines Mittels aufgenommen wurden, zu einem verstärkten Bild führen kann. Allerdings sind Techniken, die auf einem Abschwächungskontrast als Mittel zur Messung der Kontrastverstärkung eines flüssigen Agens basieren, nicht gut entwickelt, und, selbst wenn sie vollständig entwickelt sind, können sie an Beschränkungen bezüglich innerer Organe der Strukturen leiden, mit welchen diese Technik eingesetzt werden kann. Beispielsweise ist es unwahrscheinlich, daß ein Verlust an Abschwächung infolge flüssiger Kontrastmittel im Bild des kardiovaskulären Systems beobachtet werden kann, und zwar wegen des hohen Volumens an flüssigem Kontrastmittel, das in einem gegebenen Gefäß vorliegen müßte, bevor eine wesentliche Differenz bei der Abschwächung gemessen werden könnte.
Zusammengefaßt ausgedrückt, diagnostischer Ultraschall ist ein energievolles, nicht-invasives Werkzeug, das verwendet werden kann, um Informationen über die inneren Organe des Körper zu erhalten. Das Aufkommen von Grausstufen- und Farb-Doppler-Bildgebung hat den Umfang und die Auflösung der Technik weit nach vorn gebracht. Obgleich Techniken zur Durchführung diagnostischer Ultraschalluntersuchungen sich signifikant verbessert haben, was Techniken zur Herstellung und Verwendung von Kontrastmitteln angeht, gibt es noch einen Bedarf, die Auflösung des Bildes für die Herzperfusion und die Herzkammern, die festen Organe, die Nierenperfusion, die Perfusion eines festen Organs und Dopplersignale für Blutgeschwindig keit und Blutflußrichtung während der Echtzeitabbildung zu erhöhen. Die Entwicklung von Ultraschallkontrastmitteln wurde auf die Verwendung von biokompatiblen Gasen, entweder als freie Gasblasen oder als Gase, die in natürlichen oder synthetischen Ummantelungsmaterialien eingeschlossen sind, konzentriert.
Eine Vielzahl von natürlichen und synthetischen Polymeren wurde verwendet, um ein Gas, zum Beispiel Luft, zur Verwendung als bildgebende Kontrastmittel einzukapseln. Schneider et al., Invest. Radiol. Bd. 27, S. 134–139 (1992) beschreibt luftgefüllte polymere Teilchen mit 3 μm. Es wird beschrieben, daß diese Teilchen im Plasma und unter angelegtem Druck stabil sind. Allerdings war ihre Echogenität bei 2,5 MHz niedrig. Ein anderer Typ einer Suspension eingekapselter Gasmikroblasen wurde aus beschalltem Albumin erhalten. Feinstein et al., J. Am. Coll. Cardiol. Bd. 11, S. 59–65 (1988). Feinstein beschreibt die Herstellung von Mikroblasen, die für eine transpulmonale Passage eine geeignete Größe haben und in vitro ausgezeichnete Stabilität haben. Allerdings sind diese Mikroblasen in vivo kurzlebig, haben eine Halbwertszeit in der Größenordnung von wenigen Sekunden (was etwa einem Zirkulationsdurchgang entspricht), da sie sich schnell in untergesättigten Flüssigkeiten, zum Beispiel Blut, lösen. Wible, J.H. et al., J. Am. Soc. Echocardiogr., Bd. 9, S. 442–451 (1996). In Gelatine eingeschlossene bzw. eingekapselte Luftblasen wurden von Carroll et al. beschrieben (Caroll, B.A. et al., Invest. Radiol., Bd. 19, S. 260–266 (1980) und Carrol, B.A. et al., Radiology, Bd. 143, S. 747–750(1982)), aber aufgrund ihrer großen Größen (12 und 80 μm) werden sie nicht leicht durch Lungenkapillaren gehen. In Gelatine eingekapselte Mikroblasen wurden auch in PCT/US80/00502 von Rasor Associates, Inc. beschrieben. Diese werden durch "Koaleszieren" der Gelatine gebildet.
Luftmikroblasen, die durch Galactose-Mikrokristalle stabilisiert werden (SHU 454 und SHU 508), wurden von T. Fritzsch et al., Invest. Radiol. Bd. 23 (Suppl 1), S. 302–305 (1988); und Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol, Bd. 25 (Suppl 1), 160–161 (1990) beschrieben. Die Mikroblasen halten in vitro bis zu 15 Minuten, in vivo aber weniger als 20 Sekunden. Rovai D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Bd. 10, S. 125–134 (1987); und Smith, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Bd. 13, S. 1622–1628 (1989). Gasmikroblasen, die in einer Hülle aus einem fluorhaltigen Material eingeschlossen bzw. eingekapselt sind, werden in WO 96/04018 von Molecular Biosystems, Inc. beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 90901933.5 von Schering Aktiengesellschaft offenbart die Herstellung und Verwendung von mikroverkapseltem Gas oder mikroverkapselten flüchtigen Flüssigkeiten zur Ultraschallbilddarstellung, wobei die Mikrokapseln aus synthetischen Polymeren oder Sacchariden gebildet sind. Die europäische Patentanmeldung Nr. 91810366.4 von Sintetica S.A. (0 458 745 A1) offenbart Luft- oder Gasmikroballons, die durch eine an der Grenzfläche abgeschiedene Polymermembran gebunden sind, die in einem wäßrigen Träger dispergiert werden können, zur Injektion in ein Wirtstier oder zur oralen, rektalen oder urethralen Verabreichung zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken. WO 92/18164 von Delta Biotechnology Limited beschreibt die Herstellung von Mikroteilchen durch Sprühtrocknung unter sehr kontrollierten Bedingungen wie Temperatur, Sprührate, Teilchengröße und Trocknungsbedingungen, einer wäßrigen Proteinlösung unter Bildung hohler Kügelchen, die Gas darin eingeschlossen haben, die zur Verwendung bei der Bilddarstellung bzw. Bildgebung bestimmt sind. WO 93/25242 beschreibt die Synthese von Mikroteilchen zur Ultraschallbilddarstellung, die aus einem Gas bestehen, das in einer Umhüllung aus Polycyanoacrylat oder Polyester enthalten ist. WO 92/21382 offenbart die Herstellung von Mikroteilchenkontrastmitteln, die eine kovalent gebundene Matrix enthalten, die ein Gas enthält, wobei die Matrix ein Kohlenhydrat ist. US-Patent Nrn. 5,334,381, 5,123,414 und 5,352,435 von Unger beschreiben Liposome zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel, die Gase, Gasvorstufen, zum Beispiel einen pH-aktivierten oder Photoaktivierten gasförmigen Vorläufer enthalten, sowie andere flüssige oder feste Kontrastverstärkungsmittel. WO 95/23615 von Nycomed offenbart Mikrokapseln zur Bildgebung, die durch Coacervation einer Lösung, zum Beispiel einer Proteinlösung, die einen Perfluorkohlenstoff enthält, gebildet werden. PCT/US 94/08416 von Massachusetts Institute of Technology offenbart Mikroteilchen, die aus Polyethylenglykol-Poly(lactid-coglycolid)-Blockpolymeren, die bildgebende Mittel darin eingekapselt haben, einschließlich Gase, zum Beispiel Luft und Perfluorkohlenstoffe, gebildet sind.
Obgleich alle Ultraschallkontrastmittel, die bis heute untersucht sind, zum Beispiel freie Gasblasen oder eingeschlossene Gasblasen, starke Rückstreukörper sind, haben diese Mittel auch einen hohen Abschwächungsgrad. Eine hohe Abschwächung führt zu einer geringen Abbildungstiefe und zu einem Verlust von Gewebebildern distal zu dem Kontrastmittel. In vielen Fällen kann die Bildinformation hinter den Regionen, die signifikante Konzentrationen des Kontrastmittels haben, zum Beispiel linker Ventrikel, vollständig verlorengehen. Alle Ultraschallkontrastmittel, die derzeit untersucht werden, teilen dieses Problem zu einem gewissen Grad.
Um das Problem, das mit der Abschwächung von Kontrastmitteln verbunden ist, zu minimieren, haben Forscher auf mehrere Ansätze zurückgegriffen. Am häufigsten wird die verabreichte Menge an Kontrastmitteln gesenkt, um den Ultraschallstrahl durch das Kontrastmittel penetrieren zu lassen. Obgleich die Abschwächung geringer ist, führt die Verringerung bei der Dosis für viele klinische Indikationen zu geringerem als optimalem Kontrast. Alternativ können Ultraschallkontrastmittel als kontinuierliche Infusion verabreicht werden. Dies senkt die lokale Konzentration des Mittels wesentlich und hat das Problem, das vorher für die Dosisreduzierung beschrieben wurde. Ein kontinuierliche Infusion hat die zusätzlichen Nachteile, daß eine größere Gesamtdosis über die Zeit erforderlich ist, und ist in einer klinischen Einrichtung nicht einfach durchzuführen. Um die niedrigeren Dosen zu kompensieren, verwendeten Forscher eine harmonische Abbildung, um das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis zu verstärken. Allerdings ist eine harmonische Bilddarstellung bzw. Bildgebung derzeit nicht Standard.
Von Bedeutung ist, daß diese Ansätze sich nicht auf die Lösung des fundamentalen Problems mit den akustischen Eigenschaften von existierenden Ultraschallkontrastmitteln richten. Somit ist es für ein Ultraschallkontrastmittel, um eine hohe Echogenität zu haben, notwendig, einen Streukörper zu schaffen, der zu einer hohen umgekehrten Gesamtleistung bei dem Empfängerwandler aus Regionen von Interesse in Tiefen unterhalb der Anfangsregion, die das Kontrastmittel enthält, führt. Die umgekehrte Energie wird sowohl durch die Rückstreuung als auch die Abschwächung des Mittels gesteuert.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Verfahren zum Maximieren der Echogenität von Mikroteilchen. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Maximierung der Rückstreuung und das Vermindern der Abschwächung.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde entdeckt, daß Mikroteilchen mit dickeren Wänden, die aus natürlichen oder synthetischen Polymeren gebildet sind, eine deutlich höhere Echogenität und eine geringere Abschwächung bzw. Attenvierung als Mikroteilchen mit dünneren Wänden haben. Der Effekt der Wanddicke wurde theoretisch bestimmt und die optimale Wanddicke vorausgesagt. Es wurden Mikroteilchen mit diesen Dicken produziert. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Polymere synthetische biologisch abbaubare Polymere, und die Wanddicke ist zwischen 50 und 660 nm, obgleich Wanddicken von etwa 30 nm bis über 800 nm verwendet werden können. Die Umhüllungsdicke wird von dem Targetgewebe, das abgebildet werden soll, abhängen und wird sowohl vom Blutvolumen als auch vom Gewebevolumen des Targetorgans abhängen. Die Mikroteilchen werden mit einem Durchmesser hergestellt, der für die Abbildung des targetierten Gewebes geeignet ist, zum Beispiel mit einem Durchmesser von zwischen 0,5 und 8 μm für eine intravaskuläre Verabreichung und mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 mm zur oralen Verabreichung für die Abbildung des Gastrointestinaltrakts oder anderer Lumina. Bevozugte Polymere sind Polyhydroxysäuren, zum Beispiel Polymilchsäure-co-glykolsäure, Polylactid, Polyglycolid oder Polylactid-co-glycolid. Diese Materialien können mit Polyethylenglykol oder anderen Materialien kombiniert werden, welche die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES) inhibieren. Die Mikrokügelchen können in einer Vielzahl von Ultraschallbilddarstellungsanwendungen verwendet werden; diese schließen kardiologische Anwendungen, Blutperfusionsanwendungen wie auch Abbildung von Organen und peripheren Venen ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf den gesamten Streuungsquerschnitt pro Einheitsvolumen als Funktion der Schallfrequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in synthetischem Polymer eingekapseltem Octafluorpropan mit einer Verdünnung von 1/1620 unter Annahme von Wanddicken von 110 nm und 0,0034 % C₃F₈ (gesamte Gasvolumenfraktion), 165 nm und 0,0032 % C₃F₈, 220 nm und 0,0029 % C₃F₈, 330 nm und 0,0025 % C₃F₈, 440 nm und 0,0021 % C₃F₈, 660 nm und 0,0015 % C₃F₈, 880 nm und 0,0010 C₃F₈ und 1100 nm und 0,0007 % C₃F₈.
2 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf den akustischen Abschwächungskoeffizienten als eine Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in synthetischem Polymer eingeschlossenem Octafluorpropan bei einer Verdünnung von 1/1620 unter der Annahme einer Wanddicke von 110 nm und 0,0034 % C₃F₈, 165 nm und 0,0032 % C₃F₈, 220 nm und 0,0029 % C₃F₈, 330 nm und 0,0025 % C₃F₈, 440 nm und 0,0021 % C₃F₈, 660 nm und 0,0015 % C₃F₈, 880 nm und 0,0010 % C₃F₈ und 1100 nm und 0,0007 % C₃F₈.
3 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf die Echogenität (gesamte zurückgekommene Energie pro Einheitsvolumen) als eine Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in synthetischem Polymer eingeschlossenem Octafluorpropan bei einer Verdünnung von 1/1620 unter der Annahme von Wanddicken von 110 nm und 0,0034 % C₃F₈, 165 nm und 0,0032 % C₃F₈, 220 nm und 0,0029 % C₃F₈, 440 nm und 0,0021 % C₃F₈, und 660 nm und 0,0015 % C₃F₈.
4 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf den gesamten Streuungsquerschnitt pro Einheitsvolumen als Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in natürlichem Polymer eingeschlossener Luft bei einer Verdünnung von 1/1620 unter der Annahme von Wanddicken von 40 nm und 0,0021 % Luft (gesamte Gasvolumenfraktion), 80 nm und 0,0020 % Luft, 150 nm und 0,0019 % Luft, 300 nm und 0,0017 % Luft, 600 nm und 0,0013 % Luft und 900 nm und 0,0010 % Luft.
5 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf den akustischen Abschwächungskoeffizienten als Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in natürlichem Polymer mikroeingekapselter Luft bei einer Verdünnung von 1/1620 unter der Annahme von Wanddicken von 40 nm und 0,0021 % Luft, 80 nm und 0,0020 % Luft, 150 nm und 0,0019 % Luft, 30 nm und 0,0017 % Luft, 600 nm und 0,0013 % Luft und 900 nm und 0,0010 % Luft.
6 ist ein Graph von Berechnungen des Effekts der Wanddicke auf die Echogenität (gesamte zurückgekehrte Energie pro Einheitsvolumen) als eine Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in natürlichem Polymer mikroeingekapselter Luft bei einer Verdünnung von 1/1620 unter der Annahme von Wanddicken von 40 nm und 0,0021 % Luft, 80 nm und 0,0020 % Luft, 150 nm und 0,0019 % Luft, 300 nm und 0,0017 % Luft, 600 nm und 0,0013 % Luft und 900 nm und 0,0010 % Luft.
7 ist ein Graph von Berechnungen des Effektes der Wanddicke auf die Echogenität als eine Funktion der akustischen Frequenz für eine repräsentative Größenverteilung von in natürlichem Polymer mikroverkapselter Luft bei einer Verdünnung von 1/5400 unter der Annahme von Wanddicken von 15 nm und 0,0006 % Luft, 40 nm und 0,0006 % Luft, 80 nm und 0,0006 %, 150 nm und 0,0006 % Luft und 300 nm und 0,0005 % Luft.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zum Maximieren der Echogenität von natürlichen oder synthetischen Polymermikroteilchen als Funktion der Wanddicke beschrieben. Die Mikroteilchen sind in einer Vielzahl von diagnostischen Ultraschallbilddarstellungsanwendungen, insbesondere bei Ultraschallverfahren, zum Beispiel Blutgefäß-Bilddarstellung und Echokardiographie, einsetzbar. Eine zunehmende Wanddicke erhöht die Echogenität signifikant, wenn man Vergleiche mit denselben natürlichen oder synthetischen Polymermikroteilchen mit dünneren Wänden anstellt.
I. Berechnung der optimalen Polymerdicke
Um ein größeres Verständnis für die Reaktion von eingekapselten bzw. eingeschlossenen Mikroblasen auf diagnostischen Ultraschall zu ermöglichen, wurde ein mathematisches Modell (C. Church, J. Acoustical Soc. Amer. 97(3:1510–1521, 1995) verwendet, um bedeutende Mengen, zum Beispiel Rückstreuung und Abschwächungskoeffizienten für die Werte physikalischer Parameter, zum Beispiel die Dicke und Starrheit der einkapselnden Umhüllung zu berechnen. Die Umhüllung kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Material sein. Das Modell besteht aus einer (nicht-linearen) Rayleigh-Plesset-arigen Gleichung für den Fall eine sphärischen Gasblase, die durch eine Umhüllung eingekapselt ist, welche sich kollektiv als kontinuierlicher, nicht-komprimierbarer, feuchter elastischer Feststoff verhält. Eine analytische Lösung für diese Gleichung, welche die harmonischen ersten und zweiten Komponenten der untersten Ordnung enthält, wird hier verwendet, um den Effekt der Umhüllungsdicke auf den Streuungsquerschnitt (das Verhältnis der Energie, die durch die eingekapselten Gasblasen gestreut wird, zu der Intensität des einfallenden akustischen Strahls) und den Abschwächungskoeffizienten (die Rate, bei der die Gasblasen akustische Energie aus dem Strahl entfernen) einer Suspension aus eingeschlossenen bzw. eingekapselten Gasblasen abzuschätzen. Diese Quantoren werden dann verwendet, um die gesamte zurückgekehrte bzw. zurückgekommene Energie aus einer Suspension von eingeschlossenen Gasblasen zu dem Ultraschallwandler, der den einfallenden Puls emittiert, abzuschätzen.
Die Rayleith-Plesset-artige Gleichung, die die Reaktion einer eingeschlossenen Gasblase auf einen einfallenden akustischen Druck beschreibt, ist:
worin R₁ der Radius des gasgefüllten Hohlraums ist, U₁ die radiale Geschwindigkeit der Grenzfläche 1 ist (die Grenzfläche zwischen dem gasförmigen Inneren und dem einschließenden Feststoff), R₂ der äußere Radius des einkapselnden bzw. einschließenden Materials ist, ρ_L ist die Dichte der Flüssigkeit, die die Blase umgibt, ρ_L ist die Dichte der einkapselnden Umhüllung, P_G.eq ist der Gleichgewichtsgasdruck innerhalb der Blase, R_ol ist der Anfangsradius des gasgefüllten Hohlraums, P_∞(t) ist der Druck bei Unendlich (einschließlich des akustischen Steuerungsdrucks), σ₁ und σ₂ sind die Grenzflächenspannungen an den Gas-Umhüllungs- und Umhüllungs-Flüssigkeits-Grenzflächen, μ_S und μ_L sind die effektiven Viskositäten der Umhüllung und der umgebenden Flüssigkeit, V_s = R₂ ³-R₁ ³, G_s ist die Rigidität der Umhüllung und R_el ist die spannungsfreie Gleichgewichtsposition der Gas-Umhüllungs-Grenzfläche. Ein Ausdruck für den Streuungsquerschnitt σ_S1 einer nicht-eingeschlossenen Gasblase kann gefunden werden, indem angenommen wird, daß die Pulsationsamplitude R₀₁x(t) klein ist und R₁ = R₀₁(1 + x) und verwandte Ausdrücke in die Gleichung (1) von Church (1995) eingesetzt werden. Die resultierende Gleichung (2) ist:
worin ω die (radiale) Frequenz der einfallenden akustischen Welle ist, ω₀ die Resonanzfrequenz der eingeschlossenen Gasblase ist und δ_d die Dämpfungskonstante für die eingeschlossene Gasblase ist; repräsentative Einheiten für den Querschnitt sind nach der Gleichung in Klammern angegeben.
Gleichung (2) ist für Fälle geeignet, in denen die Antwort einer einzelnen eingeschlossenen bzw. eingekapselten Gasblase von Interesse ist. Im diagnostischen Ultraschall ist es üblicher, an Antworten einer Suspension aus vielen Millionen eingeschlossenen Gasblasen interessiert zu sein. Wenn eine Sammlung von eingekapselten Gasblasen mit einem Größenbereich vorliegt, kann der gesamte Streuungsquerschnitt pro Einheitsvolumen bestimmt werden, indem der Beitrag von jeder eingeschlossenen Gasblase in einem repräsentativen Volumen der Suspension addiert wird: σS1tot/vol = ∫∞0 σS1(R01)f(R01)dR01(cm2/cm3) (3)worin f(R₀₁)dR₀₁ die Anzahl eingeschlossener Gasblasen pro Einheitsvolumen mit Radii zwischen R₀₁ und R₀₁ + dR₀₁ ist. Der Abschwächungskoeffizient der Suspension kann unter Verwendung des Verfahrens bestimmt werden, das von K.W. Commander und A. Prosperetti, "Linear pressure waves in bubbly liquids: Comparsion between theory and experiments", J. Acoust. Soc. Amer. 85(2): 732–746 (1989), beschrieben wird. Indem ein Blasenmedium bezüglich seines durchschnittlichen Drucks, seiner durchschnittlichen Dichte, seiner Geschwindigkeit usw. beschrieben wird, leiten diese Autoren einen Ausdruck für C_m, die Komplexgeschwindigkeit von Schall in der Suspension ab. Für den Fall von eingekapselten bzw. eingeschlossenen Gasblasen
worin der Faktor 8,686 notwendig ist, um von Neper in dB umzuwandeln. Gleichungen (3) und (4) können kombiniert werden, um die folgende Beziehung für zurückgekehrte bzw. zurückgekommene Energie zu erhalten:
worin x jetzt der Unterschied zwischen dem Wandler und dem Probenvolumen ist, und der Faktor G für zusätzliche geometrische Faktoren, einschließlich der Wandleröffnung, dem Abstand zwischen dem Wandler und dem Probenvolumen und dem Raumwinkel, aufgefangen durch die sphärische Welle, die durch jede Blase gestreut wird, am Empfangswandler verantwortlich ist.
Um diese Resultate zu nutzen, ist es notwendig, eine eingeschlossene Gasblasen-Größenverteilung bereitzustellen und Werte für die physikalischen Parameter, die in dem Modell verwendet werden, zu bestimmen. Es werden zwei Fälle betrachtet. Der erste ist für die Synthese von Mikroteilchen, die aus Polyester hergestellt sind, und der zweite ist für Mikroteilchen, die aus Albumin hergestellt sind. Die Größenverteilung für die synthetischen Teilchen, die hier verwendet werden, ist die, die für PLGA-PEG-Mikroteilchen gemessen wird, die durch Sprühtrocknung hergestellt wurden, wie es in US Serial No. 08/681,710, eingereicht am 29. Juli 1996, beschrieben ist. Die Werte der Populationsparameter, die diese Verteilung beschreiben und die durch eine Coulter Multisizer^®-Analyse bestimmt wurden, sind: Gesamtkonzentration: 2,4 × 10⁹ Teilchen/ml, mittlerer Teilchendurchmesser: 2,2 μm, volumengemittelter Durchmesser: 4,6 μm und 6,5 % Gasvolumenfraktion. Die unten gegebenen Berechnungen wurden unter der Annahme einer Verdünnung von 1/1620 durchgeführt. Die entsprechende Konzentration war 4,4 × 10⁶ Teilchen/ml, währen die Gasvolumenfraktion etwa 0,01 % war. Die Werte für die in dem Modell verwendeten Parameter sind: internes Gas: Werte, die für Perfluorpropan geeignet sind, externe Flüssigkeit: Werte, die für Wasser geeignet sind, Umhüllungsdichte: 1,5 g/cm³, Umhüllungsviskosität: 30 Poise, Umhüllungsrigidität: 10 MPa und Umhüllungsdicken: 22, 55, 110, 165, 220, 330, 440, 660, 880 und 1100 nm.
Die Resultate von Berechnungen für den gesamten Streuungsquerschnitt bei der Steuerungsfrequenz sind in 1 für den Bereich von verwendeten PEG-PLGA-Umhüllungsdicken gezeigt. Bei den niedrigsten Frequenzen steigen die Querschnitte, wie die vierte Energie der Frequenz, wie es für kleine, d.h. Rayleigh, Streukörper erwartet wird. Bei höheren biomedizinischen Frequenzen steigt die Gesamtstreuung nur als Frequenz für die Energie 1,5 an. Bei noch höheren Frequenzen gibt es Streuungsfestigkeitsplateus und danach eine Abnahme. Der Effekt der Erhöhung der Umhüllungsdicke besteht in der Verringerung des gesamten Streuungsquerschnitts um eine Menge, die gleich der proportionalen Änderung bei der Dicke oder etwas höher ist. Somit kann der gesamte Streuungsquerschnitt, der von einer Suspension eingeschlossener Gasblasen aufgewiesen wird, durch Veränderung der Umhüllungsdicke kontrolliert werden.
Die Resultate von Berechnungen für den Abschwächungskoeffizienten als Funktion der Steuerungsfrequenz bei verschiedenen Umhüllungsdicken sind in 2 gezeigt. Der Effekt der Erhöhung der Umhüllungsdicke besteht in der Verringerung des Abschwächungskoeffizienten um eine Menge, die gleich der proportionalen Änderung der Dicke ist oder etwas kleiner ist. Demnach kann der Abschwächungskoeffizient durch Variieren der Umhüllungsdicke kontrolliert werden.
Die Tatsache, daß sowohl der Streuungsquerschnitt als auch der Abschwächungskoeffizient etwa im Verhältnis zur Abnahme der Umhüllungsdicke zunehmen, kann den Anschein erwecken, daß die Variation bei der Umhüllungs dicke ein Hinweis auf die Wirkung auf die Gesamtenergie ist, von der erwartet wird, daß sie zu einem Wandler, der eine akustische Welle in eine Suspension eingeschlossener Gasblasen emittiert, zurückgestreut wird. Bei weiterer Betrachtung wird aus Gleichung 5 jedoch klar, daß Suspensionen von eingeschlossenen Gasblasen, die dickere Umhüllungen besitzen, eine größere gesamte zurückgekehrte Energie aufweisen. Dies ist in 3 gezeigt. Der Grund dafür ist, daß, während die gesamte rückgestrahlte Energie direkt proportional zum gesamten Streuungsquerschnitt ist, sie auch proportional der Exponentialgröße des Abschwächungskoeffizienten ist. Wenn daher die Umhüllungsdicke durch einen Faktor von zwei verringert wird, wird der Effekt der Zunahme beim gesamten Streuungsquerschnitt die gesamte Energie um etwa 2 erhöhen, während der Effekt der Abschwächung die gesamte Energie um einen Faktor von etwa exp(–2) = 1/7,4 "erhöhen wird", was eine Nettoabnahme von etwa 73 % bedeutet. Diese zurückgekommene Energie wird erhöht, wenn die Umhüllungsdicke erhöht wird.
Ähnliche Resultate werden für Mikroteilchen vorausgesagt, die aus Albumin hergestellt sind, wie es in den 4 bis 6 gezeigt wird. Die für Albumin verwendeten Parameter sind wie beschrieben C. Church, J. Acoustical Soc. Amer., 97(3):1510–1521 (1995), offenbart.
Die gesamte zurückgekehrte Energie für die synthetischen Polymermikroteilchen (3) und für die Albumin-Mikroteilchen (5) ist für einen Mikroteilchenverdünnungsfaktor von 1/1620 angegeben. Die optimale Umhüllungsdicke (definiert als die Dicke, die ein Maximum bei der gesamten zurückgekehrten Energie bei einer Tiefe von 2 cm in einem Suspension der eingeschlossenen Gasblasen bereitstellt) wird von der Verdünnung der eingeschlossenen Gasblasen (d.h. Konzentration an eingeschlossenen Gasblasen) abhängen. Dies ist in 7 für Albumin-Mikroteilchen bei einer Verdünnung von 1/5400 angegeben. Da die Suspension verdünnt wird, ist es möglich, Mikroteilchen mit dünneren Umhüllungen zu verwenden. Dies erfolgt, da, obgleich dünnere Umhüllungen zu einer größeren Abschwächung und zu einer größeren Streuungsfestigkeit auf einer "pro Blase"-Basis führen, wie es durch die Anzahl von Mikroteilchen ausreichend ausgeglichen wird, um höhere gesamte zurückgekehrte Energie zu erhalten.
Die optimalen Umhüllungsdicken für drei Verdünnungen sind in der folgenden Tabelle sowohl für Albumin- als auch für PEG-PLGA-Mikroteilchen zusammengefaßt.
Für Blasen, deren Größenverteilung in vivo relativ stabil ist, würde die Wahl einer optimalen Umhüllungsdicke auf der erwarteten Teilchenkonzentration in dem Targetorgan von Interesse basieren. Um zu veranschaulichen, wie eine Umhüllungsdicke ausgewählt werden kann, werden die vorher beschriebenen synthetischen Mikroteilchen betrachtet. Wenn die Mikroteilchen mit etwa 0,25 ml/kg dosiert werden, und das Blutvolumen mit 50 ml/kg angenommen wird, werden die Mikroteilchen nach intravenöser Injektion auf 1/200 verdünnt. Im Myokardium bildet das Blut 10 % des gesamten Kompartementvolumens und die Mikroteilchen werden in dem Kompartiment um einen Faktor von 10 weiter verdünnt. Demnach wäre die Endverdünnung etwa 1/2000. Bei dieser Verdünnung kann die optimale Umhüllungsdicke aus den Daten in der Tabelle extrapoliert werden und ist 200 nm. Somit ist die optimale Dicke zur Verwendung als myokardiales Perfusionsmittel für diese Typen von Mikroteilchen etwa 200 nm.
Basierend auf dieser Information sollten dickere Umhüllungen verwendet werden, um das Konzept eines bestimmten Mikroteilchen-Einkapselungsgases zu optimieren, die Abschwächung zu minimieren und die zurückgekehrte rückgestreute Energie zu maximieren, was es ermöglicht, daß hohe Dosen an Ultraschallkontrastmittel mit minimaler Abschwächung verwendet werden können. Verfahren zur Herstellung von Mikroteilchen mit der geeigneten Banddicke werden offenbart.
II. Verfahren und Reagenzien zur Herstellung von Mikroteilchen mit unterschiedlichen Umhüllungsdicken
Der Ausdruck Mikroteilchen, wie er hierin verwendet wird, umfaßt Mikrokügelchen und Mikrokapseln sowie Mikroteilchen, wenn er nicht anders spezifiziert ist. Mikroteilchen können eine sphärische bzw. kugelige Gestalt haben. Mikrokapseln sind als Mikrokapseln definiert, die eine äußere Polymerumhüllung haben, die einen Kern aus anderem Material, in diesem Fall ein Gas, umgibt. Mikrokügelchen sind Mikroteilchen mit einer Honigwabenstruktur, gebildet durch Poren durch das Polymer hindurch, oder Kombinationen von Honigwaben- oder Mikrokapselstrukturen, die zu Abbildungszwecken bzw. Bilddarstellungszwecken mit einem Gas gefüllt sind, wie es unten beschrieben wird. Der Ausdruck "Wanddicke" oder "Polymerdicke" bezieht sich auf den Durchmesser des Polymers vom Inneren des Mikroteilchens zu der Außenseite. Im Fall einer Mikrokapsel mit einem hohlen Kern wird die Wanddicke gleich der Polymerdicke sein. Im Fall eines porösen Mikroteilchens mit Lamellen oder Poren in einer Polymerkugel kann die Wanddicke gleich des Durchmessers des Mikroteilchens oder die Hälfte des Durchmessers des Mikroteilchens sein.
Polymere
Sowohl nicht-biologisch abbaubare als auch biologisch abbaubare Matrizes können für die Mikroverkapselung von Gasen verwendet werden, obgleich biologisch abbaubare Matrizes insbesondere zur intravenösen Injektion bevorzugt sind. Nicht-erodierbare Polymere können für enteral verabreichte Ultraschallanwendungen verwendet werden. Synthetische oder natürliche Polymere können eingesetzt werden, um die Mikroteilchen herzustellen. Synthetische Polymere sind aufgrund ihrer reproduzierbareren Synthese und eines kontrollierten Abbaus bevorzugt. Das Polymer wird auf der Basis der Zeit, die für eine in vivo-Stabilität erforderlich ist, ausgewählt, mit anderen Worten auf Basis der Zeit, die für eine Verteilung an die Stelle, an der eine Bildgebung gewünscht ist, und die Zeit, die für die Bilddarstellung bzw. Bildgebung erforderlich ist.
Repräsentative synthetische Polymere sind: Poly(hydroxysäuren) zum Beispiel Poly(milchsäure), Poly(glykolsäure) und Poly milchsäure-co-glycolsäure), Polyglycolide, Polylactide, Polylactid-co-glycolid-Copolymere und Mischungen, Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polycarbonate, Polyalkylene, zum Beispiel Polyethylen und Polypropylen, Polyalkylenglykole, zum Beispiel Poly(ethylenglykol), Polyalkylenoxide, zum Beispiel Po1y(ethylenoxid), Polyalkylenterephthalate, zum Beispiel Poly(ethylenterephthalat), Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, zum Beispiel Poly(vinylchlorid), Polyvinylpyrrolidon, Polysiloxane, Poly(vinylalkohole), Poly(vinylacetat), Polystyrol, Polyurethane und Copolymere davon, derivatisierte Cellulosen, zum Beispiel Alkylcellulose, Hydroxyalkylcellulosen, Celluloseether, Celluloseester, Nitrocellulosen, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxybutylmethylcellulose, Celluloseacetat, Cellulosepropionat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatphthalat, Carboxyethylcellulose, Cellulosetriacetat und Cellulosesulfatnatriumsalz (hierin zusammengefaßt als "synthetische Cellulosen" bezeichnet), Polymere aus Acrylsäure, Methacrylsäure und Copolymere oder Derivate davon, einschließlich Ester, Poly(methylmethacrylat), Poly(ethylmethacrylat), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat), Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat), Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat) (hierin zusammengefaßt als "Polyacrylsäuren" bezeichnet), Poly(buttersäure), Poly(valeriansäure) und Poly(lactid-co-caprolacton), Copolymere und Mischungen davon. Der Ausdruck "Derivate", wie er hierin verwendet wird, beinhaltet Polymere, die Substitutionen, Additonen chemischer Gruppen, zum Beispiel Alkyl, Alkylen, Hydroxylierungen, Oxidationen und andere Modifikationen haben, die routinemäßig von Fachleuten durchgeführt werden.
Beispiele für bevorzugte nicht-biologisch abbaubare Polymere umfassen Ethylenvinylacetat, Poly(meth)acrylsäure, Polyamide, Copolymere und Gemische davon.
Beispiele für bevorzugte biologisch abbaubare Polymere umfassen Polymere von Hydroxysäuren, zum Beispiel Milchsäure und Glykolsäure, Polylactid, Polyglycolid, Polylactid-co-glycolid und Copolymere mit PEG, Polyanhydride, Poly(ortho)ester, Polyurethane, Poly(buttersäure), Poly(valeriansäure), Poly(lactid-co-caprolacton), Mischungen und Copolymere davon.
Beispiele für bevorzugte natürliche Polymere umfassen Proteine, zum Beispiel Albumin, Hämoglobin, Fibrinogen, Polyaminosäuren, Gelatine, Lactoglobulin und Prolamine, zum Beispiel Zein, und Polysaccharide zum Beispiel Alginat, Cellulose und Polyhydroxyalkanoate, zum Beispiel Polyhydroxybutyrat. Proteine können durch Vernetzung mit einem Mittel, zum Beispiel Glutaraldehyd, oder durch Hitzedenaturierung stabilisiert werden.
Bioadhäsive Polymere von besonderem Interesse für eine Verwendung bei der Bilddarstellung von mukosalen Oberflächen wie im Gastrointestinaltrakt umfassen Polyanhydride, Polyacrylsäure, Poly(methylmethacrylate), Poly(ethylmethacrylate), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat), Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat), Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat).
Lösungsmittel
Wie hierin definiert ist das Polymer-Lösungsmittel ein Lösungsmittel, das flüchtig ist oder einen relativ niedrigen Siedepunkt hat oder unter Vakuum entfernt werden kann und das für eine Verabreichung an Menschen in Spurenmengen akzeptabel ist, zum Beispiel Methylenchlorid, Wasser, Ethylacetat, Ethanol, Methanol, Dimethylformamid (DMF), Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF), Essigsäure und Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Kombinationen davon. Im allgemeinen wird das Polymer in dem Lösungsmittel unter Bildung einer Polymerlösung gelöst, die eine Konzentration zwischen 0,1 und 60 % Gewicht zu Volumen (G/V), bevorzugter zwischen 0,25 und 30 %, hat.
Gase
In die Mikropartikel kann ein beliebiges biokompatibles oder pharmakologisch annehmbares Gas eingearbeitet werden. Der Ausdruck Gas bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, die ein Gas ist oder fähig ist, bei der Temperatur, bei der die Bilddarstellung durchgeführt wird, ein Gas zu bilden. Das Gas kann aus einer einfachen Verbindung, zum Beispiel Sauerstoff-, Stickstoff-, Xenon-, Argon-, Stickstoffgas, fluorierte Gase oder ein Gemisch von Verbindungen, zum Beispiel Luft, bestehen. Fluorierte Gase sind bevorzugt. Beispiele für fluorierte Gase umfassen CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄ und C₃F₆. Perfluorpropan ist besonders bevorzugt, da es pharmakologisch annehmbar ist. Typischerweise werden hohle, luftgefüllte Mikroteilchen durch die offenbarten Verfahren produziert und die Luft in den Mikroteilchen kann mit einem beliebigen der biokompatiblen Gase, die offenbart sind, ausgetauscht werden. Das Gas wird typischerweise ausgetauscht, indem ein Vakuum an die Mikroteilchen angelegt wird, um die Luft zu entfernen, und dann eine Atmosphäre des biokompatiblen Gases bei einer besonderen Temperatur und einem besonderen Druck angelegt wird. Die Temperatur und der Druck des Gases, das ausgetauscht werden soll, wird von den Eigenschaften der Mikroteilchen abhängen.
Porenbildende Mittel
Porenbildende Mittel können mikroverkapselt werden oder mikroeingeschlossen werden, um innere Poren einzuführen. Das porenbildende Mittel kann eine Flüssigkeit oder ein flüchtiges oder sublimierbares Salz sein, das während der Mikroeinkapselung entfernt werden kann, oder das durch Verwendung von Vakuumtrocknung oder Lyophilisierung entfernt werden kann, nachdem die Mikroteilchen gebildet sind. Nach der Entfernung des porenbildenden Mittels werden innere Poren erzeugt, die mit dem Gas von Interesse gefüllt werden können. Es kann mehr als ein porenbildendes Mittel eingesetzt werden. Das porenbildende Mittel oder die porenbildenden Mittel können in einer Menge von 0,01 % bis 90 % Gewicht zu Volumen in der Polymerlösung enthalten sein, um eine Porenbildung zu verstärken. Beispielsweise kann beim Sprühtrocknen, bei der Lösungsmittelverdampfung ein porenbildendes Mittel, zum Beispiel ein flüchtiges Salz wie Ammonium bicarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbenzoat oder ein anderes lyophilisierbares Salz als feste Partikel oder als Lösung eingekapselt bzw. eingeschlossen werden. Wenn das porenbildende Mittel als Lösung eingeschlossen wird, wird die Lösung, die das porenbildende Mittel enthält, mit der Polymerlösung emulgiert, um Tröpfchen des porenbildenden Mittels in dem Polymer zu bilden. Die Polymerlösung, die die Teilchen des porenbildenden Mittels enthält, oder die Emulsion der Lösung des porenbildenden Mittels in dem Polymer wird dann sprühgetrocknet oder durch ein Lösungsmittelverdampfungs/-extraktionsverfahren erhalten. Nachdem das Polymer ausgefällt ist, können die gehärteten Mikroteilchen gefroren und lyophilisiert werden, um das restliche porenbildende Mittel zu entfernen, oder die gehärteten Mikroteilchen können vakuumgetrocknet werden, um das porenbildende Mittel zu entfernen.
Additive, um eingeschlossenes bzw. eingekapseltes Gas zu stabilisieren
Lipide
Im allgemeinen ist eine Einarbeitung von Verbindungen während der Produktion der Mikroteilchen, die hydrophob sind, in einer wirksamen Menge, wodurch eine Penetration und/oder Aufnahme von Wasser durch die Mikroteilchen begrenzt wird, bei der Stabilisation der Echogenität von polymeren Mikroteilchen, die Gas darin eingeschlossen haben, speziell fluorierte Gase, zum Beispiel Perfluorkohlenstoffe, wirksam. Lipide, die verwendet werden können, um Gas im Inneren der polymeren Mikroteilchen zu stabilisieren, umfassen die folgenden Lipidklassen: Fettsäuren und Derivate, Mono-, Di- und Triglyceride, Phospholipide, Sphingolipide, Cholesterin und Steroid-Derivate, Terpene und Vitamine. Fettsäuren und Derivate davon können gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, einige und sogar mehrere Fettsäuren, cis- und trans-Isomere und Fettsäure-Derivate, einschließlich Alkoholen, Estern, Anhydriden Hydroxyfettsäuren und Prostaglandinen, umfassen. Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen Moleküle, die zwischen 12 Kohlenstoffatome und 22 Kohlenstoffatome in linearer oder verzweigter Form haben. Beispiele für gesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure. Beispiele für ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen Laurinsäure, Physeterinsäure, Myristoleinsäure, Palmitoleinsäure, Petroselinsäure und Ölsäuren. Beispiele für verzweigte Fettsäuren, die eingesetzt werden können, umfassen Isolaurinsäure, Isomyristinsäure, Isopalmitinsäure und Isostearinsäure und Isoprenoide. Fettsäure-Derivate umfassen 12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbnonyl)methylamino)octadecansäure; N-[12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure, N-Succinyl-dioleylphosphatidylethanolamin und Palmitoyl-homocystein und/oder Kombinationen davon. Mono-, Di- und Triglyceride und Derivate davon, die verwendet werden können, umfassen Moleküle mit Fettsäuren oder Gemischen von Fettsäuren mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen, Digalactosyldiglycerid, 1,2-Dioleyl-sn-glycerin(1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerin und 1,3-Dipalmitolyl-2-succinylglycerin haben.
Phospholipide, die verwendet werden können, umfassen Phosphatidsäuren, Phosphatidylcholine sowohl mit gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylglycerine, Phosphatidylserine, Phosphatidylinositole, Lysophosphatididyl-Derivate, Cardiolipin und β-Acyl-y-alkylphospholipide. Beispiele für Phospholipide umfassen Phosphatidylcholine, zum Beispiel Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipentadecanoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC); Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Diarachidoylphosphatidylcholin (DAPC), Dibehenoylphosphatidylcholin (DBPC), Ditricosanoylphosphatidylcholin (DTPC), Dilignoceroylphosphatidylcholin (DLPC), und Phosphatdylethanolamine, zum Beispiel Dioleoylphosphatidylethanolamin oder 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin. Synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acyl-Ketten (z.B. mit einer Acyl-Kette mit 6 Kohlenstoffatomen und einer anderen Acyl-Kette mit 12 Kohlenstoffatomen) können ebenfalls verwendet werden.
Sphingolipide, die verwendet werden können, umfassen Ceramide, Sphingomyeline, Cerebroside, Ganglioside, Sulfatide und Lysosulfatide. Beispiele für Sphingolipide umfassen die Ganglioside GM1 und GM2.
Steroide, die verwendet werden können, umfassen Cholesterin, Cholesterinsulfat, Choleserinhemisuccinat, 6-(5-Cholesterin-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thia-α-D-galactopyranosid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid und Cholesteril-4'-trimethyl-35-ammonio)butanoat.
Weitere Lipid-Verbindungen, die verwendet werden können, umfassen Tocopherol-Derivate und Öle und derivatisierte Öle, zum Beispiel Stearylamin.
Es kann eine Vielzahl von kationischen Lipiden, zum DOTMA, N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; DOTAP, 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propan; und DOTB, 1,2-Dioleyl-3-(4'-trimethylammonium)butanoyl-sn-glycerin verwendet werden.
Die bevorzugtesten Lipide sind Phospholipide, vorzugsweise DPPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC und bevorzugtesten DPPC, DAC und DBPC.
Der Lipidgehalt liegt im Bereich von 0,01 bis 30 (G Lipid/G Polymer); am bevorzugtesten zwischen 0,1 und 12 (G Lipid/G Polymer). Die Lipide können der Polymerlösung vor der Bildung der Mikroteilchen zugesetzt werden.
Andere hydrophobe Verbindungen
Andere bevorzugte hydrophobe Verbindungen umfassen Aminosäuren, zum Beispiel Tryptophan, Tyrosin, Isoleucin, Leucin und Valin, aromatische Verbindungen wie zum Beispiel ein Alkylparaben, zum Beispiel Methylparaben, und Benzoesäure.
Mikroteilchen und Verfahren zur Herstellung derselben
In der bevorzugtesten Ausführungsform werden die Mikroteilchen durch Sprühtrocknung produziert. Das Polymer und das porenbildende Mittel werden durch eine Düse atomisiert und das Polymer-Lösungsmittel wird durch ein erhitztes Trocknungsgas verdampft. Es können andere Techniken verwendet werden, zum Beispiel Lösungsmittelextraktion, Heißschmelzeinkapselung und Lösungsmittelverdampfung, um Mikroteilchen mit einer Wanddicke des geeigneten Durchmessers zu produzieren, um die Echogenität zu optimieren. Porenbildungsmittel werden typischerweise verwendet, um die inneren Poren zu erzeugen. Die porenbildenden Mittel werden mikroeingekapselt und nach der Mikroteilchenbildung durch Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung entfernt. Lösungsmittelverdampfung wird von E. Mathiowitz et al., J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L.R. Beck et al., Fertil. Steril., 31, 545 (1979); und S. Benita et al., J. Pharm. Sci., 73, 1721 (1984) beschrieben. Die Heißschmelzmikroeinkapselung wird von E. Mathiowitz et al., Reacitve Polymers 6, 275 (1987) beschrieben.
Während der Synthese der Mikroteilchen kann eine Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln zugesetzt werden. Beispiele für Emulgatoren oder oberflächenaktive Mittel, die verwendet werden können (0,1–5 Gew.%), umfassen die meisten physiologisch annehmbaren Emulgatoren. Beispiele umfassen natürliche und synthetische Formen der Gallensalze oder Gallensäuren, beide konjugiert mit Aminosäuren und unkonjugiert, zum Beispiel Taurodesoxycholat und Cholinsäure.
Mikroteilchengröße
In einer bevorzugten Ausführungsform für die Herstellung von injizierbaren Mikroteilchen, die fähig sind, durch das pulmonale Kapillarenbett zu gehen, sollten die Mikroteilchen einen Durchmesser von zwischen etwa 1 und 10 μm haben. Größere Mikroteilchen können das pulmonale Bett verstopfen und kleinere Mikroteilchen können keine ausreichende Echogenität liefern. Größere Mikroteilchen sind zur Verabreichung auf anderen Wegen als durch Injektion, zum Beispiel oral (zur Evaluierung des Gastrointestinaltrakts), zur Anwendung auf andere mukosale Oberflächen (rektal, vaginal, oral, nasal) oder durch Inhalation verwendbar. Die bevorzugte Teilchengröße für eine orale Verabreichung liegt zwischen etwa 0,5 μm und 5 mm. Eine Teilchengrößenanalyse kann mit einem Coulter-Zählgerät, durch Lichtmikroskopie, Scanningelektronenmikroskopie oder Durchlässigkeitselektkronenmikroskopie durchgeführt werden.
Kontrolle der Wanddicke
Die bevorzugte Wanddicke ist größer als 20 nm, liegt bevorzugter im Bereich zwischen 160 und 220 nm bis zu etwa 700 nm, bei der der Vorteil, der sich aus der Erhöhung der Wanddicke ableitet, beginnt, abzunehmen. Für jede der Mikroeinkapselungstechniken, die vorstehend beschrieben wurden, gibt es mehrere Wege, auf denen die endgültige Umhüllungsdicke des Polymermikroteilchens kontrolliert werden kann.
Polymerkonzentration
Die Enddicke der Polymerumhüllung kann erhöht werden, indem die Konzentration der Polymerphase während des Einkapselungsverfahrens erhöht wird. Dies ist auf synthetische Polymere oder natürliche Polymere, zum Beispiel Proteine oder Polysaccharide, anwendbar. Für eine gegebene Polymertröpfchengröße wird die Verwendung einer konzentrierteren Polymerlösung in mehr Polymer pro Tröpfcheneinheitsvolumen und somit in einer dickeren Umhüllung resultieren. Die Polymerkonzentration zur Erreichung einer gegebenen Umhüllungsdicke wird in erster Linie vom Polymertyp, dem Polymerlösungsmittel, der Löslichkeit des Polymers im Lösungsmittelsystem und der Temperatur, bei der die Einkapselung durchgeführt wird, abhängen. Polymerkonzentrationen im Bereich zwischen 0,1 und 60 % können verwendet werden. Bevorzugte Polymerkonzentrationen liegen im Bereich zwischen 0,5 und 30 %.
Wie vorher beschrieben wurde, können porenbildende Mittel, zum Beispiel flüchtige oder sublimierbare Salze, verwendet werden, um Mikroteilchen mit inneren Poren zu produzieren. Das porenbildende Mittel kann als Feststoff oder als wäßrige Lösung mikroeingekapselt werden oder kann in der Polymerlösung co-gelöst werden. Für den Fall von festen porenbildenden Mitteln wird die Größe der festen Teilchen und die Menge des festen Mittels, das eingekapselt wird, die endgültige Polymerumhüllungsdicke steuern. Dünnere Mikroteilchenumhüllungen werden resultieren, wenn der Durchmesser der festen porenbildenden Teilchen relativ zu der Polymertröpfchenpase ansteigt, oder wenn das Gewicht des festen porenbildenden Mittels relativ zu der Polymertröpfchenphase erhöht ist. Der Durchmesser der festen porenbildenden Mikroteilchen beträgt 1 bis 95 % des Durchmessers der Polymertröpfchenphase. Der Durchmesser des festen porenbildenden Mittels kann unter Verwendung von Standardtechniken, zum Beispiel Strahlmahlen, auf den geeigneten Durchmesser eingestellt werden. Das Gewicht des festen porenbildenden Mittels, das eingekapselt werden soll, liegt zwischen 1 und 50 % (G/G Polymer).
Für den Fall eines porenbildenden Mittels, das im Polymerlösungsmittel gelöst wird, wird die Umhüllungskonzentration durch die Menge an porenbildenden Mittel, das eingekapselt wird, gesteuert. wenn die Gesamtmenge an porenbildenden Mittel erhöht wird, wird die endgültige Umhüllungsdicke abnehmen.
Für ein porenbildendes Mittel, das als eine wäßrige Lösung mikroeingekapselt wird, wird die endgültige Polymerumhüllungsdicke durch das Volumen der porenbildenden Lösung, die eingekapselt wird, relativ zu der Polymerphase, das Gewicht des porenbildenden Mittels, das mikroeingekapselt ist, und die Tröpfchengröße der Lösung des porenbildenden Mittels relativ zu der Polymertröpfchengröße gesteuert. Die endgültige Polymerumhüllungsdicke wird abnehmen, wenn das Volumenverhältnis der porenbildenden Lösung relativ zur der Polymerphase ansteigt. Das Volumenverhältnis von porenbildender Lösung relativ zur Polymerphase liegt zwischen 0,002 und 0,5 mit bevorzugten Verhältnissen im Bereich von 0,01 bis 0,1. Für einen gegebenen Volumenverhältnisanteil an porenbildenden Mittel wird die Polymerumhüllungsdicke abnehmen, wenn die Konzentration des porenbildenden Mittels in der porenbildenden Lösung, die einzukapseln ist, ansteigt. Das Gewicht von einzukapselndem porenbildenden Mittel liegt zwischen 1 und 50 % (G/G Polymer). Wenn die Tröpfchengröße der porenbildenden Lösung, die eingekapselt werden soll, relativ zu der Polymerlösung abnimmt, wird die Umhüllungsdicke des fertigen Mikroteilchens ansteigen. Die Tröpfchengröße der porenbildenden Lösung kann dann durch das zur Erzeugung der Tröpfchen verwendete Verfahren kontrolliert werden. Der Durchmesser der porenbil denden Lösungströpfchen liegt im Bereich zwischen 1 und 95 % des Durchmessers der Polymertröpfchenphase. Wenn eine Homogenisierung verwendet wird, um die porenbildenden Tröpfchen zu erzeugen, werden die Geschwindigkeit der Homogenisierung (500 bis 20 000 Upm), die Homogenisierungszeit (0,1 bis 10 Minuten), die Homogenisierungstemperatur (4 bis 50°C) und der verwendete Blatttyp (d.h. Schlitzkopf, Quadratkopf, kreisförmiger Kopf) alle die endgültige Tröpfchenlösung der porenbildenden Lösung steuern. Die Homogenisierungsbedingungen werden so eingestellt, daß sie die interessierende Tröpfchengröße schaffen. Wenn eine Ultrabeschallung verwendet wird, um die Tröpfchen der flüssigen porenbildenden Lösung in dem Polymertröpfchen zu erzeugen, können der Typ der Beschallungssonde, die Beschallungszeit (0,1 bis 10 Minuten), die Beschallungstemperatur (4–40°C), die Sondenfrequenz und die Beschallungsenergie eingesetzt werden, um die Tröpfchengröße zu verändern.
III. Diagnostische Anwendungen
Mikroteilchen werden typischerweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, zum Beispiel phosphatgepufferter Salzlösung oder Salzlösung oder Mannit kombiniert, dann wird eine zur Detektion wirksame Menge einem Patienten verabreicht, und zwar unter Verwendung eines geeigneten Wegs, typischerweise durch Injektion in ein Blutgefäß (i.v.) oder oral. Mikropartikel, die ein eingekapseltes bildgebendes Mittel enthalten, können bei der vaskulären Bilddarstellung wie auch in Anwendungen, um Leber- und Nierenkrankheiten zu detektieren, in kardiologischen Anwendungen, beim Detektieren und Charakterisieren von Tumormassen und -geweben und beim Messen der peripheren Blutgeschwindigkeit eingesetzt werden. Die Mikroteilchen können auch mit Liganden verknüpft sein, welche die Gewebeadhäsion minimieren oder die die Mikroteilchen zu spezifischen Regionen des Körpers in vivo targetieren, wie es oben beschrieben wurde.
Die oben beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen werden anhand der folgenden Beispiele besser verstanden.
Beispiel 1: Herstellung von polymeren Mikroteilchen mit verstärkter Echogenität
3,2 g PEG-PLGA (75:25) (IV = 0,75 dl/g), 6,4 g PLGA (50:50) (IV = 0,4 dl/g) und 384 mg Diarachidoylphosphatidylcholin wurden in 480 ml Methylenchlorid gelöst. 20 ml einer 0,18 g/ml Ammoniumbicarbonat-Lösung wurde zu der Polymerlösung gegeben und das Polymer/Salz-Gemisch wurde mit 10 000 Upm für 2 Minuten unter Verwendung eines Virtis-Homogenisators homogenisiert. Die Lösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min gepumpt und unter Verwendung eines Buchi Lab-Sprühtrockners sprühgetrocknet. Die Einlaßtemperatur war 40°C und die Auslaßtemperatur war 20 bis 22°C. Die Teilchendurchmesser lagen im Bereich von 1 bis 10 μm, wenn eine Klassierung mit einem Coulter-Counter durchgeführt wurde, wobei der zahlenmittlere Mittelwert 2,0 μm war. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte, daß die Partikel im allgemeinen sphärisch mit glatten Oberflächen und gelegentlichen Furchen sind. Die Mikrokügelchen wurden für die Transmissionselektronenmikroskopie vorbereitet, indem sie in weißem LR-Harz eingebettet wurden, anschließend unter UV-Licht polymerisiert wurden. An einem LKB-Ultramikrotom wurden dünne Schnitte unter Verwendung eines Glasmessers geschnitten und mit einem Zeiss EM-10 TEM bei 60 kv betrachtet. Die Umhüllungsdicke der Mikroteilchen liegen im Bereich von 200 bis 240 nm.

Claims

Verfahren zum Maximieren der Echogenität von Polymermikroteilchen, die ein Gas einschließen, zur Verwendung bei der Ultraschallbilddarstellung, umfassend die Schritte: theoretische Bestimmung der gesamten zurückgekommenen Energie als Funktion des Polymermaterials, des Gases, der eingeschlossenen Gasblasengrößenverteilung und der Verdünnung, und Verändern der Wanddicke der Mikroteilchen, um den Bereich der Wanddicke, die in der größten Menge der gesamten zurückgekommenen Energie resultiert, zu ermitteln.
Verfahren zur Herstellung von Mikroteilchen, worin die Wanddicke wie in Anspruch 1 ausgeführt bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Mikroteilchen aus einem künstlichen Polymer gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das künstliche Polymer ein anderes künstliches Polymer als ein Blockcopolymer von Polyethylenglycol und Poly(lactid-co-glycolid) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die polymeren Mikroteilchen aus einem Polymer gebildet werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Poly(hydroxysäuren), Polyanhydriden, Polyorthoestern, Polyamiden, Polycarbonaten, Polyalkylenen, Polyvinylalkoholen, Polyvinylethern, Polyvinylestern, Polyvinylhalogeniden, Polyvinylpyrrolidon, Polysiloxanen, Poly(vinylalkoholen), Poly(vinylacetat), Polystyrol, Polyurethanen, synthetischen Zellulosen, Polyacrylsäuren, Poly(buttersäuren), Poly(valeriansäuren), und Poly(lactid-co-caprolacton), Polysacchariden, Polyhydroxyalkanoaten, Copolymeren und Mischungen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Mikroteilchen aus nicht-proteinösen Polymeren gebildet sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Mikroteilchen aus einem natürlichen Polymer gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Wanddicke der Mikroteilchen zwischen 50 und 660 nm ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das natürliche Polymer ein Protein und die Wanddicke der Mikroteilchen zwischen 20 und 600 nm ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, worin das Gas ein biokompatibles Gas ist und in einer echogenen Menge vorhanden ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, worin das Gas ein fluoriertes Gas ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin das fluorierte Gas ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, S₂F₄ und C₃F₆.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, worin das Gas ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Xenum, Argon, Stickstoff, fluorierten Gasen und Luft.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 13, das ferner das Vermindern der Abschwächung durch Erhöhen der Wanddicke der Mikroteilchen umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 13, das ferner das Erhöhen der Echogenität durch Bestimmen der Wanddicke der Mikroteilchen bei einer bestimmten Verdünnung der Mikroteilchen umfasst.