CN1993147B

CN1993147B - 超声对比剂剂量组合物

Info

Publication number: CN1993147B
Application number: CN2004800437130A
Authority: CN
Inventors: 理查德·沃勒维奇; 霍华德·伯恩斯坦; 唐纳德·E·柴克林Ⅲ; 茱丽·斯常博
Original assignee: Acusphere Inc
Current assignee: Acusphere Inc
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: IL213897A; JP2008501684A; RU2006147232A; CN1993147A; IL179594A; RU2344833C2; BRPI0418879A; AU2004320514B2; CA2569134C; NO20070070L; IL179594A0; MXPA06014111A; IL213897A0; WO2005120587A1; AU2004320514B8; JP4808214B2; CA2569134A1; AU2004320514A1

Abstract

临床研究已经实施并开发了具体的剂量配方，该剂量配方使用了能够提供显著增强显像且持续时间长的全氟化碳气体，将其并入聚合物的微粒开发而成。剂量配方包括由生物相容聚合物和全氟化碳形成的微粒，其中，聚合物最好混有脂类，全氟化碳在体温下为气体。所述微粒以对增强超声波显像有效的剂量给患者给药，在心室的时间为大于5分钟和/或在心肌中为大于一分钟，剂量范围为0.025到8.0mg微粒/kg体重。剂量范围优选为0.05到4.0mg微粒/kg体重。所述剂量配方一般是装在小瓶内提供。在一个典型的配方中，剂量配方由使用之前需用无菌水重新配制的干粉形成，具体而言：向装有干粉的小瓶或注射器内添加水，然后摇动以产生等渗的或等渗压的微粒悬浮液。

Description

超声对比剂剂量组合物

技术领域

本发明属于一般的诊断显像剂领域，特别涉及一种能够提供增强的图像和持续时间长的图像的超声对比剂(ultrasound contrast agent)剂量配方。

背景技术

当利用超声来获得人或动物内部器官和结构的图像时，当超声波、声能波以一定的频率(当超过该频率时，能被人耳所感知)穿过人体时会被反射。不同类型的身体组织对超声波的反射不同，由反射不同内部结构的超声波所产生的反射可以被检出并通过电子学方法转换为可视图像。

对于一些医疗情况，获得人们感兴趣的器官或结构的有用的图像尤其困难，这是因为在由缺乏对比增强剂的超声波的反射而产生的超声波图像中，上述结构的细节不能充分地从周围的组织中被分辩出来。通过向感兴趣的器官或其他结构中给予超声对比剂来提高超声波图像中的对比度，从而本质上改善对某些生理和病理状况的检测和观察。在有些情况下，对超声对比剂自身运动的检测是非常重要的。例如，由特定的心血管异常引起的独特的血流模式只有通过对血流给予超声对比剂并观察血流或血容量才可以被识别。

当超声波穿过身体并被反射以产生能够据此作出内科诊断的图像时，用作超声对比剂的材料通过影响超声波而发挥作用。

不同类型的物质以不同的方式和不同的程度影响超声波。此外，由对比增强剂所引起某些效果比其它试剂更容易被测量和观察。在选择理想的超声对比剂组合物时，人们通常更喜欢那些当超声波穿过身体时对超声波具有最显著作用的物质。此外，对超声波的作用应该易于测量。气体是用作超声对比剂的较好的介质。气体在使用之前必须固定化，其可以作为表面活性剂固定化气泡或者通过用胶囊包在脂质体或者微粒中。在超声波图像中可以看到三种主要的对比增强效果，即，背反射、射束衰减、和声速差分。

已有多种天然的和合成的聚合物被用于包封例如空气等超声对比剂，这些聚合物有助于制造给药后持续时间较长的超声对比剂。Schneider等在Invest.Radiol.，Vol 27、pp.134-139(1992)中描述了三种微米级的、填充空气的、合成的、聚合物颗粒。据报道这些颗粒在血浆中以及使用压力下稳定。然而，在2.5MHz时它们的回声反射性低。另一种微泡混悬物已从超声处理后的蛋白胚乳中被获得。Feinstein等，J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.11，pp.59-65(1988)。Feinstein描述了具有良好的体外稳定性、大小适合于肺与肺内腔之间通道(transpulmonary passage)的微泡的制备。然而，由于这些微泡在压力下不稳定，它们在体内寿命短暂，半衰期大约为几秒钟(与一个循环过程近似相等)。Gottlieb，S.等，J.Am.Soc.Echo.， Vol.3，pp.328(1990)，摘要；和Shapiro，J.R.等，J.Am.Coll.Cardiol.Vol.16，pp.1603-1607(1990)。

Rasor Associates公司也在WO 80/02365中对明胶包封的微泡进行了描述。所述明胶包封的微泡是通过“聚结”明胶而形成的。分子生物系统公司(Molecular Biosystems，Inc.)在WO96/04018中对包封在含氟材料的壳体内部的气体微泡进行了描述。

Fritzch等报道了用半乳糖微晶(SHU454和SHU508)固定化的微泡。Fritzsch，T.等， Invest.Radiol.Vol.23(Suppl 1)，pp.302-305(1988)；和Fritzsch T.等，Invest.Radiol.，Vol.25(Suppl1)160-161(1990)。该微泡在体外持续15分钟但在体内持续不到20秒。Rovai，D.等， J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.10，pp.125-134(1987)；和Smith，M.等，J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.13，pp.1622-1628(1989)。Schering Aktiengesellschaft在欧洲专利EP 398 935中公开了用于超声波显像的微胶囊密封气体或挥发性液体的制备以及用途，其中，微胶囊由合成聚合物或多糖形成。Sintetica在欧洲专利458745中公开了一种用于治疗或诊断目的的空气或气体微球，该微球被能够分散在含水载体中的界面沉积聚合物薄膜所包缚，用于注射到宿主动物体内或用于口腔、直肠或尿道给药。

Delta生物工程有限公司在WO 92/18164号专利中描述了一种用于成像的微粒的制备方法，该方法通过对蛋白质水溶液进行喷雾干燥形成具有内含气体的空心球体。WO 93/25242号专利描述了用于超声波成像的微粒的合成方法，所述微粒的结构为在聚氰基丙烯酸酯或聚酯的外壳内部含有气体。WO 92/21382公开了一种微粒对比剂的制造，所述微粒对比剂包括含有气体的共价键结合的基质，其中，所述基质为碳水化合物。Unger在美国专利第5,334,381号和5,123,414号以及5,352,435号中描述了用作超声对比剂的脂质体，其包括气体、气体前体例如pH活化或光活化气体前体，以及其他的液体或固体对比增强剂。

其他人鉴于被包封的气体的效果，也提出了与空气相比增强显像的氟化气体的应用。Quay在美国专利No.5,393,524中公开了包括全氟化碳在内的多种试剂在超声波显像中增强反衬度的应用。上述试剂由经挑选的气体小气泡或微泡组成，其在溶液中显示出较长的寿命，并且足够小以至于能够穿过肺，这使得其能够在心血管系统及其他重要器官的超声波图像中得以应用。Bracco在欧洲专利554213公开了氟化烃气体对预防微泡在曝露于血流压力时的崩解的作用。Nycomed在WO95/23615专利中公开了一种用于显像的微胶囊，该微胶囊由包含全氟化碳的溶液例如蛋白质溶液等凝结而形成。麻省理工学院(Massachusetts Institute ofTechnology)在专利WO95/03357中公开了一种由聚乙二醇-聚(丙交酯-共-乙交酯)块状聚合物形成的微粒，该微粒内包封有显像剂，包含气体例如空气和全氟化碳。如同Sonus药物公司在WO94/16739中所描述的，当固体和液体反射声波达到一个相似的程度，众所周知，气体是用作超声对比剂的更有效且更受欢迎的介质。事实上，如WO 94/16739的实施例12所示，当对小型猪给药时，蛋白质微胶囊由于产生安全问题(以及功效问题)而不予考虑。美国专利6,132,699和5,611,344都描述了在合成聚合物外壳中使用全氟化碳来增强对比度的方法。美国专利5,837,221描述一种生产多孔聚合物微粒的方法，该方法将疏水性试剂合并入聚合物中来增加回声反射性。

有数种超声对比剂在美国和欧洲都获批准，用于很有限的强心剂用药。OPTISON (Amersham，Mallinkrodt)包含含有八氟丙烷气体的热变性人白蛋白微胶囊。每毫升微球体混悬物包含5-8×10⁸个平均直径为2-4.5微米粒度范围和220μg的八氟丙烷。这些微球体还没有被批准用于心肌血流评估，仅仅被批准用于心室增强作用。在较高的丸剂剂量下(5mL混悬物或1100μg八氟丙烷)，心室增强作用持续达5分钟。

DEFINITY

(Bristol Myers医学成像)包含含有脂类微球体的八氟丙烷，其中脂类壳由磷脂DPPA、DPPC、和mPEG-DPPE组成。每毫升混悬物包含1.2×10¹⁰个微粒，该微粒的平均直径在1.1-3.3微米的粒度范围内且具有1100μg八氟丙烷。该试剂仅仅被批准用于心室增强作用，而没有被批准用于心肌血流评估。在700μL的丸剂剂量(用于70kg的人)下或5133μg的气体下，试剂在心室内增强作用的持续时间大约为3.4分钟。

IMAGENT(Photogen公司)包含含有全氟己烷的脂类微球体，其中，脂类外壳由磷脂DMPC组成。每毫升混悬物包含1.4×10⁹个微粒和92μg的全氟己烷，其中，该微粒具有小于3微米的平均直径。该试剂仅仅被批准用于心室增强作用，而没有被批准用于心肌血流评估。在0.43毫升的丸剂剂量(用于70kg的人)下或40μg的气体下，试剂在心室内的增强作用的平均持续时间大约为2.6分钟。

在任何情况下，这些商品试剂仅具有有限的应用，没有被批准用于除心室增强作用之外的其他应用，这些试剂在心室的平均显像增强持续时间为5分钟或更少。仍然缺少能够增强心血管系统特别是心肌和心室的显像且具有较长持续时间的商业超声对比剂。现有技术中描述的试剂，当作为丸剂或短浸剂给药时，产生的心肌图像的持续时间明显小于处理一个完整的心脏测试所需要的时间。一般地，现有技术的药剂所提供的图像其用于心肌时的持续时间不到一分钟。人们希望获得这样的试剂，它能够提供的增强显像持续时间在心肌中为超过一分钟和/或在心室中为大于5分钟。

因此，本发明的目的在于提供一种尤其适用于强心剂的剂量配方，其包含微粒，其中，微粒能够提供增强的图像和持续时间长的图像。

本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，用于在超声波显像方法中包含微粒的剂量配方给药。

发明内容

人们已经开发了具体的剂量配方并已经将其用于临床研究，该剂量配方使用了聚合物微粒，将能够提供显著且持续时间长的增强显像的全氟化碳气体合并入其中。该剂量配方典型地包括一、二或直到五个剂量，最好为一个或两个剂量的微粒，所述微粒由最好含有脂类的生物相容的聚合物形成，其含有在体温时为气体的全氟化碳。所述微粒以对增强超声波显像有效的剂量给患者投药，在心室内的持续时间为大于五分钟和/或在心肌中为大于一分钟，剂量范围从0.025到8.0mg微粒/kg体重。优选给患者给药的剂量范围为从0.05到4.0mg微粒/kg体重。在一个优选方案中，在心室中超声波显像的增强作用持续大于9分钟，和/或在心肌中则为大于2分钟。

剂量配方典型地用小瓶或注射器提供。在一个典型的配方中，剂量配方呈干粉形式，使用之前需用无菌水重新配制，具体而言：向装有干粉的小瓶或注射器内添加水，然后摇动以产生等渗或等压的微粒悬浮液。在这些剂量配方的优选方案中，悬浮液包含1.0-3.5×10⁹微粒/mL，或25-50mg微粒/mL，最优选的浓度是悬浮液包含1.5-2.8×10⁹微粒/mL或30-45mg微粒/mL。在一个优选方案中，微粒的平均粒度小于8微米、最好是平均粒度为1.8-3.0微米。

在最佳方案中，气体是CF₄、C₂F₄、C₂F₆、C₃F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀、或SF₆。在优选方案中，气体是全氟正丁烷(n-perfluorobutane)(C₄F₁₀)，以75-500μg/mL的微粒混悬物的给药量提供；优选全氟正丁烷以100-400μg/mL的微粒混悬物的给药量提供；最好是全氟正丁烷以150-350μg/mL的微粒混悬物的给药量提供；或者气体是八氟正丙烷，以75-375μg/mL的微粒混悬物的给药量提供，最好为以120-300μg/mL的微粒混悬物的给药量提供。

在最佳方案中，微粒由合成聚合物形成，所述合成聚合物例如有聚醇酸，包括聚乳酸、聚羟基乙酸、和聚(乳酸-共-羟基乙酸)，聚乙交酯(polyglycolides)、聚交酯和聚(丙交酯共乙交酯)，聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃(polyalkylenes)，例如聚乙烯和聚丙烯，聚烷撑二醇，例如聚乙二醇，聚氧化烯烃例如聚环氧乙烷，聚乙烯醇、聚戊酸、和聚(丙交酯共己内酯)、衍生物、共聚物及其混合物，以及相对于聚合物重量以0.01-30wt％的比例含有一个疏水化合物的聚合物，最好为以0.01-30wt％(脂类重量/聚合物重量)的比例含有脂类的聚合物。在一个特别优选方案中，脂类为二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholin，DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine，DPDPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine，DLPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine DLGPC)；或磷脂酰乙醇胺。

最好是，微粒中的合成聚合物是聚(丙交酯共乙交酯)，丙交酯对乙交酯的比例为50∶50(即1∶1)，重均分子量在20,000-40,000道尔顿的范围内，微粒中的疏水化合物是DAPC，比例为5∶6.6％(DAPC重量/聚合物重量)。

剂量配方可以以包含微粒干粉的小瓶或注射器形式提供，或者以包含重悬浮微粒溶液的试剂盒形式提供。典型地，干粉的小瓶或注射器中也包含赋形剂例如糖或食盐，使得溶液等渗，或者重新配制后等渗。然后，将此剂量配方作为丸剂或注射剂通过注射给患者给药，在整个30分钟的期间内进行显像。

微粒在多种诊断显像程序中都很有用，包括超声波显像、磁共振成像、荧光检查、X射线和计算机化层析检查。在用于心脏病学应用例如心肌血流评估和心室增强作用的临床试验中对微粒进行了检验。

具体实施方式

这里，对改进后的方法、微粒、试剂盒、和用于超声波显像的剂量配方进行描述。微粒在各种诊断超声波显像的应用中非常有用，特别在超声程序中例如血管显像和超声波心动描记法例如心肌血流评估、心肌血容量评估和心室增强作用中非常有用。

I.定义

除非另作说明，和通常所使用的一样，术语″微粒″包括″微球体″和″微胶囊″，以及其他的微粒。微粒在形状上可以是球形的或非球形的。

这里″微胶囊″一般被定义为具有一个包围着气体核心的外部聚合物壳的微粒。“微球体”被定义为可以是固体球形，或者由遍及充满气体的聚合物的气孔所形成的蜂窝状构造或海绵样结构的多孔球形。一些微球体可以包含由遍及聚合物外壳的充满气体的气孔所形成的具有蜂窝状构造或海绵样结构的外部聚合物外壳。对于这类微球体，该外部聚合物外壳包围内部的气体核心。

和通常所使用的一样，术语″剂量(dosage)″和″药量(dose)″是同义词，表示一次给予的物质量，或产生预期诊断或对比效果所需的物质量。

这里所使用的术语″剂量配方″，是指小瓶或其他容器例如注射器，其包含一个或多个剂量的要求产生预期诊断或对比效果的物质。

与常规一样，这里″患者的部位″是指患者身上的一个特定的区域或部分。在有些情况下，″患者的部位″是指遍及患者全身的部位。这种部位的例子有肺部、胃肠部、心血管部位(包括心肌组织或心肌(例如心脏肌肉)、心室的室、围鳃腔、瓣膜功能)、肾部位以及身体的其他部位、组织、器官等等、包括脉管组织和循环系统、以及有病的组织、包括癌组织。″患者的部位″例如包括将要被诊断图像显像的部位。尽管患者的部位″也″可能是体外的，但是最好在体内。

与习惯一样，这里″脉管组织″表示血管(包括动脉、静脉、毛细血管等)。

与习惯一样，这里″胃肠部位″包括食管、胃、小肠和大肠以及直肠所定义的部位。

与习惯一样，这里″肾部位″是指肾和直接连接肾的脉管组织，包括腹主动脉。

与习惯一样，这里″目标部位″和″目标区″交叉使用，均表示希望药剂到达的患者部位。

与习惯一样，这里″欲显像部位″和″显像部位″交叉使用，均表示患者的预期显像部位。

与习惯一样，这里″心室血流或心室增强作用″是指血流以一个或多个心脏循环穿过心脏的心室。

与习惯一样，这里″心房血流″是指血流以一个或多个循环穿过心脏的心房。

与习惯一样，这里″心肌血流″是指血液以一个或多个循环数在心脏肌肉或心肌的脉管组织中(包括在心脏的血管中)的流动。

与习惯一样，这里″心肌血容量″是指在心脏肌肉或心肌的脉管组织中的血液的量。

与习惯一样，这里″心动周期″是指心脏的一个完整的收缩周期，包括心脏的舒张周期和收缩周期。

与习惯一样，这里″增加的亮度″是指与没有超声对比剂而获得的图像相比，图像在亮度上的增加。

与习惯一样，这里″增强的显像″是指与没有超声对比剂而获得图像相比，亮度相对增加了的图像。

与习惯一样，这里″持续时间″是指显像的增加亮度可以被检出的总时间。

与习惯一样，这里″冠状动脉血管扩张剂″是指生理活性物质例如双嘧哌胺醇(dipyridamole)或腺苷，当这些药物被患者服用时，能够引起心血管部位脉管组织的扩张。

II.微粒

在优选方案中，微粒包含聚合物、脂类和全氟化碳气体。微粒可以既包含微球体也包含微胶囊，或只包含微球体或微胶囊。

聚合物

在优选方案中，微粒由合成聚合物形成。合成聚合物产生生物相容且无生物材料污染的微粒。

另外，优选合成聚合物，是因为合成聚合物在体外和体内可再生合成和降解。根据体内稳定性所需要的时间选择聚合物，该例如时间是分布到欲显像的部位所需要的时间，以及显像所需要的时间。合成聚合物可以被修饰以产生性质不同的微粒(例如，改变分子量和/或功能基团)。

典型的合成聚合物有：聚醇酸例如聚乳酸、聚羟基乙酸、和聚(乳酸共羟基乙酸)、聚乙交酯(polyglycolides)、聚交酯、聚(丙交酯共乙交酯)及其混合物、聚酐、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃，例如聚乙烯和聚丙烯、聚二醇例如聚乙二醇、氧化聚烯烃例如聚环氧乙烷聚乙烯醇、聚戊酸、和聚(丙交酯共己内酯)、及其衍生物、共聚物和混合物。这里“衍生物”包括化学基团经取代、加成的聚合物，例如本领域技术人员通常使用的烷基、烷撑、羟基化、氧化及其他修饰。

优选的可生物降解的聚合物的具体例子包括：醇酸例如乳酸和羟基乙酸的聚合物、聚交酯、聚乙交酯(polyorthoesters)、聚(丙交酯共乙交酯)、与PEG的共聚物、聚酐、聚(邻)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯共己内酯)及其共聚物。最佳优选聚合物是聚(丙交酯共乙交酯)，其中丙交酯对乙交酯的比例为50∶50(即1∶1)且聚合物的重均分子量在20,000-40,000道尔顿范围内。重均分子量(Mw)是基于单个聚合物链分布内具有给定分子量的分子质量而计算出的平均分子量。Mw可以用凝胶渗透色谱法(GPC)来测定。

疏水化合物

在一个优选方案中，如美国专利No.5,837,221所描述的，聚合物包括一种疏水化合物。通常，例如脂类，它是疏水性的且在聚合物内部的量是一个有效剂量，结合这样的化合物会通过微粒限制水的渗透和/或吸收，也因此限制了微粒中气体的损失。

这会有效增加由包含脂类、合成聚合物和包封有气体尤其是氟化气体例如全氟化碳的微粒所提供的增强显像的持续时间。

能够用来固定聚合物微粒内部气体的脂类包括但不局限于下列种类的脂类：脂肪酸及其衍生物、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂、鞘脂类、胆固醇和类固醇衍生物、萜烯和维生素。

脂肪酸及其衍生物可以包括(但不局限于)饱和和不饱和脂肪酸、奇数和偶数的脂肪酸、顺反异构体、以及脂肪酸衍生物包括乙醇、酯、酸酐、羟基脂肪酸和前列腺素。可以使用的饱和和不饱和脂肪酸包括但不局限于：具有12-22个碳原子的直链或支链分子。可以使用的饱和脂肪酸的例子包括但是不局限于：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。可以使用的不饱和脂肪酸的例子包括但是不局限于：月桂酸、抹香鲸酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、岩芹酸和油酸。可以使用的支链脂肪酸的例子包括但是不局限于：异月桂酸、异肉豆蔻酸、异棕榈酸、异硬脂酸和异戊二烯类。脂肪酸衍生物包括12-(((7′-二乙氨基香豆素-3-)羰基)甲氨基)-硬脂酸；N-[12-(((7′二乙氨基香豆素-3-)羰基)甲基氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸、N-丁二酰-二油酰磷脂酰基乙醇胺和棕榈酰-高半胱氨酸；和/或它们的组合物。可以使用的甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯及其衍生物包括但是不局限于：分子的碳原子数为6-24之间的脂肪酸或脂肪酸的混合物，二半乳糖基二甘油酯、1，2-二油酰基-sn-甘油；1，2-二棕榈酰基-sn-3-丁二酰基甘油；和1，3-二棕榈酰基-2-丁二酰基甘油。

能够使用的磷脂包括但是不局限于：磷脂酸、带有饱和与不饱和脂类的卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心磷脂、和β-酰基烷基磷脂。磷脂的例子包括但是不局限于：二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine，DPDPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine，DLPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱 (dilignoceroylphatidylcholine DLPC)；和磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰基乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)或1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷酸乙醇胺。也可以使用带有不对称的酰基链(例如带有一个6碳原子的酰基链和另一个12碳原子的酰基链)的合成磷脂。

可以使用的鞘脂类包括神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂类、神经节苷脂、脑硫脂和溶血脑硫脂。神经鞘脂的例子包括但是不局限于：神经节苷脂GM和GM2。

可以使用的类固醇包括但是不局限于：胆固醇、胆固醇硫酸酯、胆固醇半琥珀酸酯、6-(5-胆固醇-3β-氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-α-D-乳糖吡喃糖苷、6-(5-胆甾烯-3β-氧)己基6-氨基6-脱氧-1-硫代-α-D-甘露吡喃糖苷以及(胆甾烯基-4′-三甲基-35-胺基)丁酸酯。

可以使用的其他的脂类化合物包括生育酚及其衍生物，以及油和衍生油，例如硬脂酰胺。

许多阳离子脂类都可以使用，例如DOTMA，N-[1-(2，3-二氧化油酰基)丙基-N，N，N-三甲基氯化物；DOTAP、1，2-二氧化油酰基-3-(三甲氨基)丙烷；和DOTB、1，2-二油酰基-3-(4′-三甲基)丁酰基-sn-甘油。

最优选的脂类是磷脂，最好为DPPC、DAPC、DSPC、DTPC、DBPC、DLPC，最好为DPPC、DSPC、DAPC和DBPC。

脂类的含量范围为0.01-30％(脂类重量/聚合物重量)；最好为0.1-20％(脂类重量/聚合物重量)，最优选为1-12％(脂类重量/聚合物重量)。

当微粒由本发明所述的方法形成时，其大小可以得到良好的重现。这里，除非另作说明，术语颗粒的″大小″或″直径″是指数均粒子大小。下面列举一个可用于定义数均粒子大小(Xn)的等式的例子。

X_{n} = \frac{Σ_{i = 1}^{\infty} n_{i} d_{i}}{Σ_{i = 1}^{\infty} n_{i}}

这里，ni＝一个给定直径(di)的粉粒数目

这里，术语″体积平均直径″是指体积重量直径平均。下面列举一个可用于定义体积平均直径(Xv)的等式的例子：

X_{v} = {[\frac{Σ_{i = 1}^{\infty} n_{i} {d_{i}}^{3}}{Σ_{i = 1}^{\infty} n_{i}}]}^{1 / 3}

这里，ni＝一个给定直径(di)的颗粒数目。

粒度分析可以使用库尔特悬浮物测定仪，通过光学显微术、扫描电子显微术、透光度电镜检术、激光衍射法例如使用Malvern Mastersizer、光散射法或传播时间间隔法而进行。这里″库尔特方法″是指：将粉末分散在电解液中，然后用配备有一个50μm口径的管子的CoulterMultisizer II对得到的悬浮液进行分析。该方法能够提供大小测量和颗粒浓度。

在用于制备能穿过肺毛细血管床的可注射微粒的优选方案中，微粒直径小于8微米。大的微粒可能阻塞肺床，小的微粒可能不能提供充分的对比效果。用于静脉给药的超声对比剂，其微粒的大小优选在0.75～5微米之间，最好为1.8～3.0微米之间。

在优选方案中，微粒具有蜂窝状构造或海绵样结构，由遍及聚合物的气孔形成，或者微粒具有带有蜂房或海绵样多孔结构的聚合物外壳。在这两种情况下，气孔都是充满气体。这些微粒是通过包含造孔剂例如如下所述碳酸铵的聚合物溶液喷雾干燥而形成的。

超声对比剂

氟化气体的例子包括CF₄、C₂F₄、C₂F₆、C₃F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀和SF₆。优选全氟正丁烷(C₄F₁₀)，因为它能提供在使用温度下不会凝聚的不可溶气体，并且是药学上可接受的。

含有微粒的气体的量取决于气体的种类，但一般给药量是75-500μg/mL微粒悬浮液。对于全氟正丁烷，优选的气体含量是给药量为100-400μg/mL微粒悬浮液，最好是给药量为150-350μg/mL微粒悬浮液。对于八氟正丙烷，优选的气体含量是给药量为75-375μg/mL微粒悬浮液，最好是给药量为120-300μg/mL微粒悬浮液。

III制造微粒的方法

微粒可以通过许多方法制造，优选用喷雾干燥制造。主要的标准是，在形成微粒前，聚合物必须溶解或熔化于疏水化合物或脂类。

溶剂

在形成期间，聚合物通常溶于溶剂中。这里，聚合物溶剂是指挥发性有机溶剂或具有相对低的沸点或可以在真空下除去，并且在对人进行痕量给药时是可以可接受的，例如二氯甲烷。也可以使用其他的溶剂，例如乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、甲酰胺、乙酸、二甲基亚砜(DMSO)和氯仿，或其混合物。通常，聚合物溶于溶剂以形成浓度为0.1～60％(重量对体积(w/v))的聚合物溶液，更好的是在0.25～30％(w/v)之间，最好为0.5-10％(w/v)之间。

喷雾干燥

微粒最好用喷雾干燥来生产，将生物相容的聚合物和脂类溶解在一个适当的溶剂中，将造孔剂作为固体或溶液分散到聚合物溶液中，然后将聚合物溶液和造孔剂喷雾干燥，形成微粒。这里，聚合物溶液和造孔剂的″喷雾干燥″的过程是指对聚合物溶液和造孔剂进行雾化以使其形成薄雾，以及与热载气直接接触从而使其干燥的过程。利用本领域常用的喷雾干燥器，聚合物溶液和造孔剂在喷雾干燥器的进气口被雾化，通过至少一个干燥室，然后以粉末状被收集。温度根据所使用的气体或聚合物不同而可以改变。可以通过控制入口和出口的温度来产生所希望的产品。

在喷雾干燥过程中所形成的微粒的尺寸和形态受以下因素影响：用于对聚合物溶液和造孔剂进行喷雾的喷嘴功能、喷嘴的压力、带有造孔剂的聚合物溶液的流速、所使用的聚合物、溶液中聚合物的浓度、聚合物溶剂的种类、造孔剂的类型和量、喷雾温度(入口和出口温度)和聚合物的分子量。通常，假定聚合物溶液浓度一样，那么聚合物分子量越高，颗粒尺寸越大。

喷雾干燥的一般工艺参数如下：入口温度＝30-200℃、出口温度＝5-100℃、聚合物流速＝10-5,000ml/min。

可以在喷雾干燥前使聚合物溶液和造孔剂与气体一起乳化，从而使气态诊断剂包封。或者，可以在喷雾干燥步骤产生充气微粒，接着通过对微粒施加全氟化碳气体，将空气替换为所希望的气体，或者对微粒抽真空来除去包封的空气，然后充满所希望的全氟化碳气体。如果采用抽真空步骤来交换气体，可以使用冷冻干燥器或真空箱。

促进微粒化形成的添加剂

在微粒的形成过程中，可以添加各种表面活性剂。可以使用的乳化剂或表面活性剂(0.1-15％w/w聚合物)的例子包括生物学上最可接受的乳化剂。其例子包括天然和合成的与氨基酸相结合的胆汁盐或胆汁酸，以及非结合的去氧牛黄胆酸和胆酸。

相对于聚合物溶液的体积，造孔剂以0.01％～90wt％的量包含在聚合物溶液中，以增加孔的形成。例如，在喷雾干燥中，可以以固体形式或者溶解于溶剂例如水中的溶液形式使用造孔剂，所述造孔剂可以列举挥发性盐例如重碳酸铵、乙酸铵、碳酸铵、氯化铵或苯甲酸铵或其他的挥发性盐。然后，将固体造孔剂或包含造孔剂的溶液与聚合物溶液一起乳化，以产生造孔剂在聚合物中的分散体或微滴。然后将这些分散体或乳剂喷雾干燥来除去聚合物溶剂和造孔剂。聚合物沉淀后，可以将硬化的微粒冷冻和冻干以除去所有在聚合物沉淀步骤中没有被除去的造孔剂。

优选利用聚合物形成微粒，例如丙交酯对乙交酯的比例为50∶50且重均分子量在20,000-40,000道尔顿范围内的聚(丙交酯共乙交酯)，以及磷脂，5-6.6％(DAPC重量/聚合物重量)的二花生酰磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine)((1，2-二花生酰基-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DAPC))((1，2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。微粒在甘露醇和吐温80中进一步配制加工以产生在冷冻干燥器上用全氟正丁烷再充气的微粒干粉。干粉在使用前用5ml无菌水重新配制，向干粉的小瓶中添加水然后振摇以产生在等渗的甘露醇中的微粒悬浮液。优选悬浮液的性质为：每一个给药量微粒悬浮液含有气体含量为150-350μg/ml的全氟正丁烷，微粒悬浮液的给药量为1.5-2.8×10⁹个微粒/毫升，微粒悬浮液的给药量为30-45mg微粒/毫升，平均粒度在1.8-3.0微米的范围内。

IV微粒的应用

1.给患者给药的配方

微粒可以用赋形剂进一步加工以产生干粉。在给患者给药前用药学可接受的载体进行重新配制时，赋形剂提供张力或渗透性或减轻微粒的悬浮性。适合于提供渗透性或张力的赋形剂有糖和盐，糖包括而不限于甘露醇、右旋糖(dextrose)或葡萄糖，盐包括而不限于氯化钠或磷酸钠。适合于提供减轻微球体悬浮性的赋形剂包括任何药学可接受的润湿剂或表面活性剂，包括而不限于聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨酸酯20(吐温20)、普卢兰尼克(Pluronic)或聚乙二醇。作为参考，这里描述一些适合于提供渗透性或张力或能被用作润湿剂的赋形剂，例如《药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》(第四版，大不列颠皇家药物协会，科学与实践出版社)或《雷明顿：药学科学与实践》(第十九版，Mack出版公司)。微粒和赋形剂的干粉通过在赋形剂的溶液中悬浮微粒而产生。如果需要的话，可以进一步使用尺寸分级分离步骤。赋形剂溶液中的微粒被装入小瓶或注射器中，冷冻、冻干、产生干粉配方。在冻干步骤结束时，通过用全氟化碳气体回充冷冻干燥器使微粒充满全氟化碳气体。然后将小瓶或注射器用塞子塞住或盖上盖子，是小瓶的情况下，将塞子边缘卷曲翻下。这导致在小瓶或注射器的顶部空间充满全氟化碳。

或者，可以用药物赋形剂与微粒干法混合，然后装入小瓶或注射器。将小瓶注射器放在冷冻干燥器上或真空箱中抽真空，然后让微粒充满全氟化碳气体。然后将小瓶或注射器用塞子塞住或盖上盖子，是小瓶的情况下，将塞子边缘卷曲翻下。这导致在小瓶或注射器的顶部空间充满全氟化碳。

2.剂量单位

可以使用不同尺寸剂量单位的微粒。例如一个小剂量单位可以包含25-75mg的微粒。一个中剂量单位可以包含75-150mg。一个大的剂量单位可以包含150-250mg的微粒。一个特大的剂量单位可以包含150-1000mg的微粒。

当在重新配制后形成微粒悬浮液时，悬浮液中微球体的质量浓度一般在20～60mg/mL范围内变动。悬浮液中微球体的质量浓度优选25-50mg/mL，悬浮液中微球体的质量浓度最优选为30-45mg/mL。悬浮液中微粒的浓度优选1.0-3.5×10⁹微粒/mL，悬浮液中微粒的浓度最优选为1.5-2.8×10⁹微粒/毫升。优选微粒具有小于8微米的平均粒度，最好在1.8-3.0微米的范围内。

药学可接受的载体包括注射用水、无菌水、盐水、含有甘油的盐水、含有吐温

20的盐水、含有吐温

80的盐水、等渗的葡萄糖(5％)、1/2等渗的右旋糖(2.5％)、等渗的甘露醇(5％)、1/2等渗的甘露醇(2.5％)、含有吐温20的等渗甘露醇、含有吐温

80的等渗甘露醇。

3.试剂盒

能够提供用于包含全氟化碳气体的微粒肠胃外给药的试剂盒。该试剂盒包含至少两个组分。一个成分包含小瓶或注射器中的一个剂量单位的干粉对比剂，另一个成分包含小瓶或注射器中的药学可接受的载体。在对患者给药之前，药学可接受的载体被添加至干粉对比剂的剂量单位内，形成充有气体的微粒悬浮液，所述微粒悬浮液在任何给药途径的诊断显像中可用作超声波显像对比剂。

4.用于微粒的小瓶或容器

对于试剂盒，不需要特殊的小瓶或注射器或接管，普通的小瓶、注射器和接管即可用于微粒。对小瓶的唯一要求就是在塞子和容器之间有良好的密封。因此，封口的质量就成为主要关心的问题，任何封口完整性的下降都将导致不希望的物质进入小瓶或气体外泄。除了保证无菌之外，对于在减压下塞住的产品而言为保证安全正确的重新配制，真空度的保持是必不可少的。关于塞子，可以是以弹性体为基础的单个化合物或多组分的配方，例如聚(异丁烯)或“丁基橡胶”，而且必须不能让所使用的气体透过。根据小瓶内干粉的总剂量选择小瓶的尺寸。小瓶的尺寸优选5mL、10mL、20mL和30mL。根据注射器内干粉的总剂量选择注射器的尺寸。注射器的尺寸优选5mL、10mL、20mL和50mL。

5.诊断应用

微粒组合物可用于许多不同的诊断应用中，包括超声波显像、磁共振成像、荧光检查、X射线和计算机化层析检查。

在优选方案中，微粒被用于超声程序，例如血管显像和超声波心动描记法，包括而不限于心室显像、心肌血流评估、心肌血容量评估、冠状动脉疾病的诊断和射血分数评估。

微粒可用于血管显像、用于检测肝和肾疾病，用于检测和表征肿瘤块和组织、和测量外周血液速度。微粒也可以和配位体连结在一起，所述配位体将组织的粘附力最小化或者使颗粒靶向体内的具体部位。

获得图像的一般方法

干粉微粒在使用前用药学可接受的载体重新配制，然后采用适当的途径如注射入血管(例如静脉内(i.v)或动脉内(i.a))或口服，对患者给药一个有效的量，用于检测。微粒组合物可以以推注或短输液(小于30分钟)的方式对患者静脉内给药。优选注射控制在15秒至20分钟的时间内，最好为30秒至15分钟。一般地，对于患者，通常每次静脉注射控制在从0.025到8mg/kg体重的剂量范围内，最好为0.05到4mg/kg的剂量范围。

对于诊断超声应用，至少对患者身体的一部分施加能量以使目标组织显像。然后获得患者体内部位的可见图像，由此可以确定存在或不存在有病的组织。包括二次谐波成像和门控成像(gated imaging)在内的超声成像技术在本领域内都已为大家所熟知，并且也有一些描述，例如Uhlendorf，IEEE Transactions on Ultrasonics，Ferroelectrics，and Frequency Control，14(1)：70-79(1994)；和Sutherland等，Journal of the American Society of Echocardiography，7(5)：441-458(1994)，在此，将其全部并入本文引为参考。

可以用传感器来施加超声波。如果希望的话，超声可以是脉冲的或者可以是连续的。因此，诊断超声通常包括回波的应用，随后，在一个监听周期内，超声传感器接收反射信号。可以使用谐波、高谐波或次谐波。可以有效使用接受2x频率的第二谐波方式，这里x是非主要的频率。这可以用来减少来自背景物质的信号，利用显像剂增强来自传感器的信号该显像剂靶向希望的位置，例如血块。其他的谐波信号，例如奇数谐波信号、例如3x或5x，也可以同样地用这种方法接收。次谐波信号例如x/2和x/3，也可以同时被接收并处理以形成图像。

另外，可以施加功率多普勒(Power Doppler)或彩色多普勒(Color Doppler)。在功率多普勒的情况下，功率多普勒的相对较高的能量可以让气孔共振。这可以产生在次谐波或高次谐波等范围内的声波辐射，与施加的超声频率相同。

具体的显像应用

这里所描述的微粒可被用于心脏病学和放射学用途。对于心脏病学的应用，对患者给药微粒组合物，用超声仪扫描患者来获得心血管部位的可视图像。作为选择，微粒组合物可以与药物学的应激物或物理的应激物联合给药。适宜的药物学应激物包括双嘧哌胺醇或腺苷等冠状动脉的血管扩张剂，多巴酚丁胺等影响收缩力的药剂(例如增强心脏收缩力)，或多巴酚丁胺等心肌变速剂(例如增强收缩频率)。适宜的物理应激物包括体育锻炼，例如使用踏车或固定自行车。

对于放射学的应用，对患者给药微粒组合物，用超声仪扫描患者来获得患者的欲检查部位的可视图像。

微粒可用于评定心血管系统的功能以及评定心肌血流或心肌血容量或诊断冠心病(冠状动脉病)。例如，微粒可以增强心室显像，因此可以通过血管壁运动分析帮助进行局部的心脏功能分析，通过射血分数测量有助于综合心脏功能分析。该微粒还可以用来评价心肌血流以将功能性心脏组织与局部缺血(血流不足)心脏组织或梗塞(死的)心脏组织区别开来。在心肌中检测到的对比度信号可以用作心肌血容量的估算，因为超声对比剂经静脉给药后驻留在血管内。一段时间内，在一个特定的心肌部位反衬强度或图像亮度的缺失或减少是血流减少(也就是不足)的表征。

一般的，除非患者有严重的冠心病，如同例如用超声对比的方法所评价的一样，心脏各个部位的血流量应该表现为正常。为了检测没有严重心脏病的病人的血流异常，或检测较小的心肌血流不足，必须通过诱发应激反应来增加血流对心脏的需求。可以通过让患者锻炼或给药药物化合物例如血管扩张剂、影响收缩力的药剂或心肌变速剂来诱发应激反应。在锻炼或药物应激反应期间，可以更容易地检测到血流不足，这是因为，在由带有狭窄症的冠状动脉供血的部位，增加血流的能力降低了。在超声对比剂给药后的心肌超声波图像对照可以在预应激状态之前(即安静状态)和应激状态下制成。在应激反应显像期间发现不需增强亮度的心肌部位而在安静显像期间却没有发现上述部位，这就是缺血的征兆。在应激反应显像期间和安静显像期间都发现不需增强亮度的心肌部位，则是梗塞的征兆。

在一个实施方式中，心肌血流可以通过以下步骤来测定：(1)对患者进行首次注射，给药微粒组合物，(2)用超声仪扫描患者进行成像以获得心血管部位的可视图像，(3)用药物应激物或锻炼诱发患者应激状态，(4)第二次注射给药微粒组合物并继续扫描，以及(5)通过用肉眼直接观察或者用定量图像分析对在步骤(2)和(4)中得到的图像差异进行评价。

对于放射学应用，微粒可以用来改进用于放射学指征的超声波显像的能力，包括肾、肝和末梢血管疾病的显像，增加血流和血流模式的可视度，并且改进对身体内部深处的细微病变或结构的检测。微粒能被用于大血管(macrovascular)和微细血管(microvascular)的指示。在大血管的指示中(身体主动脉和静脉的疾病状态和条件的诊断)，通过目测颅内血管，微粒可以有助于检测中风和预中风的情况，通过评价颈动脉狭窄的程度、血管接枝不闭合和末梢血管血栓形成，微粒可以有助于检测在大的血管内(例如颈动脉)的动脉粥样硬化。对于微细血管指征(疾病状态和通过分析微细血管血流模式的诊断)，微粒可以有助于识别肝脏内的病变、肿瘤或其他的疾病(例如腺瘤或血管瘤)，和肾、脾内的病变、肿瘤或其他的疾病(例如脾动脉的动脉瘤)，以及胸部、卵巢、其他的组织和器官的病变、肿瘤或其他的疾病。

可以通过给患者给药微粒组合物然后用超声波扫描患者进行显像，以获得患者身上任何病变组织的可视图像，从而对患者的病变组织进行诊断。病变组织可以表现为某个亮度增强的部位或者没有显示出亮度增强的部位。

用微粒组合物获得的增强图像

微粒在给药后产生增强图像。增强图像可以通过与没有服用超声对比剂时相比图像亮度的增大、或者通过图像中人工图像的基本消除得以表现。因此，与心血管部位包括心脏组织和相连的脉管组织的超声波显像相关联，增强图像可以通过例如心血管部位图像亮度的增加和/或心血管部位图像中出现的人工图像的基本消除而得以表现。单个药剂给药后图像持续10秒至60分钟。图像优选持续20秒至30分钟，最好持续30秒至20分钟。在一个优选方案中，在心室中超声波显像增强持续大于5分钟，和/或在心肌中则为大于1分钟。

可以通过肉眼裸视观察或使用定量显像分析来对图像亮度的增大进行评价。用特定的灰度(大约从0到大约255VDUs或色标)作为参考作如上鉴别，优选亮度增大水平至少有大约10VDUs(灰度)。更优选亮度增大水平大于大约10VDUs，例如大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100VDUs。在一些实施方式中，亮度增加大于大约100VDUs，例如，大约105、110、115、120、125、130、135、140、145、或150VDUs。在其他的实施方式中，亮度增加大于大约150VDUs，例如，大约155、160、165、170、175、180、185、190、195、或200VDUs。或者，亮度增大大于大约200VDUs、例如，大约205、210、215、220、225、230、235、240、245、250或255VDUs。

通过结合下述非限制性的实施例可以进一步理解上述方法和组合物。

实施例

材料

醋酸、重碳酸铵、甘露醇USP、和聚山梨醇酯80(没有源自动物的成分)购自Spectrum Chemicals公司(Gardena、CA)。聚合物(聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)(50∶50))和二花生酰磷脂酰胆碱(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DAPC))分别购自勃林格殷格翰公司(Ingelheim，德国)和Avanti公司(Alabaster，AL)。二氯甲烷购自EM Science公司(EMDChemicals，Gibbstown，NJ)。小瓶(30毫升管状小瓶)和塞子(20毫米、灰色、单排气口，Fluro-Tec公司)来自West Pharmaceutical Services公司(Lionville，PA)。全氟正丁烷(DFB)气体购自F2化学品有限公司(Lancashire，英国)。

分析方法

微粒质量浓度的定量分析

小瓶内微粒的质量浓度采用ICP-MS法(感偶等离子质谱法)进行定量。微粒中聚合物的数量通过用ICP-MS法对锡进行分析而测定。存在于微粒中的聚合物的数量，是根据存在于微粒中的锡的数量与存在于用来制造微粒的特定份额的聚合物中锡的数量相比较而测定的。微粒中磷脂的数量通过用ICP-MS对磷进行分析而测定。存在于微粒中的磷的数量是根据存在于微粒中的磷的数量与存在于磷脂本身的磷的数量进行比较而测定的。每毫升悬浮液中微粒的质量是这样计算的：将每小瓶中聚合物和磷脂的数量加起来，然后除以重新配制的体积(5mL)。

粒度分析

将重新配制的微粒样品添加到电解质溶液中，用装有50μm口管的Coulter Multisizer II对得到的悬浮液的颗粒大小和微粒浓度进行分析。

微粒的气体含量

将干粉小瓶用5mL水重新配制，振摇产生微粒悬浮液。用针和注射器穿过塞子取出一组0.3毫升等分试样，对得到的悬浮液中的DFB含量进行分析。将这些等分试样注入密封口的顶空小瓶。顶空小瓶在室温下平衡至少10小时。然后将样品加热到45℃，在顶空采样器恒温箱中保持20分钟。采用气相色谱法，用吹气包裹的进口和火焰离子检测器对悬浮液上面的顶空气体进行分析。采用面积单点校准法进行定量。

气相色谱法系统参数和温度程序列于表1和表2。

表1：GC系统参数

样品：	顶空，1mL进样环
		检测器	FID
色谱柱	Supelco 60/80 Carbopack B 5％Fluorocol
		进样口温度	150℃

[0134]

检测器温度	325℃
		载气	氦气(25mL/min)
FID气体	氢气(60mL/min)
			空气(350mL/min)
	氮气(5mL/min)

表2：GC温度程序

	初始温度	速率	最终温度	保持时间
					初始条件	40℃	N/A	N/A	2.0min
第一梯度	40℃	5℃/min	65℃	0.0min
					第二梯度	65℃	10℃/min	130℃	0.0min
第三梯度	130℃	50℃/min	200℃	0.0min
					最终条件	200℃	N/A	N/A	3.1min

实施例1：用作超声对比剂的微粒制造

25℃下将176g的PLGA、10.6g的二花生酰磷脂酰胆碱(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC))、和2.26g的醋酸溶解在5.88L二氯甲烷中，配制成有机溶液。将由68.5g的重碳酸铵溶于338ml注射用水中形成的水溶液添加至上述有机溶液中，用转子定子乳化混合器在10L匀浆槽中以4310RPM的转速匀浆10分钟。

用氮气作为雾化气体和干燥气体对产生的乳化液进行喷雾干燥。乳剂在工作台顶端被喷雾干燥，喷雾干燥器采用购自Spraying Systems公司(Wheaton，IL)的空气喷雾喷嘴和购自Buchi公司(Brinkmann，Westbury，NY)的玻璃干燥室/旋风分离装置。喷雾干燥条件如下：乳剂流速为40ml/min，雾化气体流速为30L/min，干燥气体流速为46kg/hr，出口温度为12℃。

通过分散、冷冻、和冻干步骤对喷雾干燥后的产品进一步加工。在5.0L水中溶解140g甘露醇和4.10g聚山梨醇酯80，配制含水介质。将喷雾干燥后的微粒以25mg/ml的浓度分散在上述介质中。用购自Misonix公司(Farmingdale、纽约)的不锈钢、800级、流动池超声波仪对分散体进行解凝聚并使其过筛直径10″的振动筛子(RBF-10)(购自Vorti-Siv公司(Salem，OH))。超声波仪用4℃的夹套保护，防止分散体发热。分散体以150mL/min的速度依次过筛25μm和20μm的筛子。将过筛后的分散体装入小瓶(10ml分散体装入30ml的小瓶)，局部塞上塞子，浸入液氮中冷冻。

冷冻后，将小瓶冻干。冻干完成后，隔离容器，将全氟正丁烷(DFB)再充气到小瓶中，以使加塞前的压力达到5千帕。

干粉在使用前用5ml无菌水重新配制，向干粉的小瓶中添加水然后振摇，以得到微粒悬于等渗的甘露醇中的悬浮液。悬浮液包含2.2×10⁹微粒/mL，37mg微粒/mL，微粒的平均粒度为2.2微米。

实施例2：微粒的气体泄漏速率

用气相色谱法(GC)对根据实施例1的方法生产的两批微粒(批1和批2)各自的气体泄漏速率进行评价，详见上述分析方法一节。第三批微球体(批3)以类似实施例1的方法生产，只是在生产微粒过程中省去磷脂、二花生酰磷酸脂胆碱(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DAPC))。

表3：微粒的气体含量和气体泄漏速率

	气体含量 (μg/mL悬浮物) 小瓶重新配制后立即	气体含量 (μg/mL悬浮物) 小瓶重新配制后70分钟	％ 70分钟后丢失的体含量
				批1	341	312	9％
批2	259	232	10％
				批3	139	18	87％

包含DAPC的微粒在70分钟后丢失了大约10％的起始气体含量，而不含DAPC的微粒丢失了87％的起始气体含量。另外，包含DAPC的微粒相对于没有DAPC的微粒具有一个较高的初始气体含量。这表明包含DAPC对于在喷雾干燥过程中微粒内部多孔结构的形成以及保持微粒内部的气体是很重要的。

对患者给药后，希望使用的超声对比剂总持续时间根据所应用的心脏病学或放射学超声检验的种类不同而不同，通常大约是30秒到60分钟。因此，如果超过超声检验的周期，那么对包含脂类DAPC的微粒气体损失的测定就没有意义了。

实施例3：作为微粒剂量功能的心脏图像增强

在健康成年人身上对根据实施例1所述方法生产的微粒进行研究。干粉在使用前重新配制，向小瓶中添加5mL无菌水并振摇小瓶10次。在产生的悬浮液中的微球体的最终浓度大约是37mg/mL。受试者接收0.5mg/kg、2.0mg/kg或者4.0mg/kg体重的单个剂量。受试者用连续谐波显像(帧频15Hz，传感器频率2.1/4.2MHz)进行经胸廓的超声波成像。对图像进行增强作用强度和持续时间的视觉评价。

在2mg/kg和4mg/kg的剂量下，心室增强作用持续时间都超过9分钟。在这两个剂量下，当受试者在30分钟后被再次成像时，15人中有13人仍然可见到对比效果，这表明微粒提供了长时间的增强作用。

心室增强作用的持续时间概括于表4。

表4：左心室图像增强的持续时间

剂量(mg/kg体重)	心室增强作用的平均持续时间(分钟)
		0.5	2.6
2.0	＞9.6
		4.0	＞9.6

实施例4：微粒和商品在评价心脏图像中的比较

对两个体重和心脏功能相匹配的成年人进行心脏超声波显像的比较研究。对第一个受试者给予实施例1的方法所生产的微粒单一制剂。干粉在使用前重新配制，即向小瓶中添加5ml无菌水然后振摇小瓶10次。所产生的悬浮液中微球体的最终浓度大约是37mg/mL，悬浮液的气体含量大约是250g/mL。第一个受试者接受4mg微粒/kg的剂量，这个剂量相当于27g/kg体重的气体剂量。第二个受试者接受单一剂量的市售超声对比剂OPTISON

(AmershamHealth)，其含有包含蛋白胚乳微球体的全氟丙烷。两个受试者接受的是相同总量的气体(27μg/kg体重)，所述气体是声波活性组分。两个受试者用连续谐波显像(帧频15Hz，传感器频率2.1/4.2MHz)进行经胸廓的超声波成像。对图像进行增强作用强度和持续时间的视觉评价。

心室增强作用和心肌增强作用的持续时间概括于表5。

表5：不同超声对比剂图像增强的持续时间

对比剂和气体给药的剂量 (μg/kg)	心室增强作用的持续时间 (min)	心肌增强作用的持续时间 (秒)
			实施例1微粒(27μg/kg体重)	＞9	160
OPTISON	1	10

[0156] 用实施例1所述的方法生产的微粒在心室和心肌中均能提供增强的图像，所述增强的图像的持续时间显著长于OPTISON

，对于用超声实施一个完整的心脏测试具有适当的持续时间。

实施例5：用微粒配方对心肌血流进行评估来评价局部缺血

对一个被诊断为冠心病的受试者给药用实施例1的方法生产的微粒。受试者在60分钟内接受了两次微粒注射。首次微粒注射(“安静注射”，1.7mg/kg)用来评价安静状态下的心肌。进行第二次微粒注射前，用血管扩张剂双嘧哌胺醇(0.56mg/kg)使受试者产生药理学的应激反应。应激反应诱导后，受试者接受第二次微粒注射(“应激反应注射”，1.3mg/kg)，来评价处于应激状态下的心肌。

对受试者给药微粒后的安静和应激状态图像进行比较，显示出图像增强的增加最小的心肌部位，并且这个部位在应激诱导后面积变大。这表明心肌组织的区域既有梗塞也有缺血性部分。局部缺血的检测用另一个诊断技术-核显像得以证实。给药99Tc(MIBI)后进行安静和应激反应的核灌注(nulear perfusion)，用市售的γ粒子计数管对受试者成像。在安静和应激反应的超声图像上记录下来的损伤在安静和应激反应的核灌注图像中得以确认。

Claims

1.微球体用于制备静脉给药组合物的应用，该组合物用于对患者的心肌血流进行评估，

其中该组合物是使用之前通过用药学可接受的载体进行重新配制以产生等渗悬浮液而由干粉制成的等渗悬浮液，该悬浮液中的微球体浓度为1.0×10⁹到3.5×10⁹微球体/mL悬浮液或微球体质量浓度为25～50mg微球体/mL悬浮液，

其中所述微球体含有聚醇酸共聚物、以及疏水化合物，并包封有在体温下为气体的全氟化碳气体，其中所述微球体是具有蜂窝状构造或海绵样结构的多孔球形，

其中组合物中所述微球体的剂量范围为0.5～4.0mg微球体/kg体重，从而适合于在心肌中提供与没有服用对比剂时相比大于一分钟的增强超声波图像，

其中，所述聚醇酸共聚物是聚(丙交酯共乙交酯)，所述疏水化合物是二花生酰基磷脂酰胆碱，并且所述全氟化碳气体是全氟正丁烷。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物适合于与用于对患者的心血管系统施压和对患者再次成像的药剂相结合。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述悬浮液中的微球体浓度范围为1.5×10⁹到2.8×10⁹微球体/mL的悬浮液或微球体质量浓度为30到45mg微球体/mL的悬浮液。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微球体具有小于8微米的平均粒度。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述微球体具有1.9～2.6微米的平均粒度。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述剂量从0.5mg微球体/kg体重、2.0mg微球体/kg体重和4.0mg微球体/kg体重中选择。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，以75～500μg/mL给药量的微球体悬浮液提供全氟正丁烷。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以100～400μg/mL给药量的微球体悬浮液提供全氟正丁烷。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，以150～350μg/nL给药量的微球体悬浮液提供全氟正丁烷。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疏水化合物与所述聚醇酸共聚物以0.01～30％(疏水化合物重量/聚醇酸共聚物重量)的比例混合。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述聚(丙交酯共乙交酯)的丙交酯与乙交酯的比例为1∶1、重均分子量为20～40kDa，所述二花生酰基磷脂酰胆碱以5～6.6％(二花生酰基磷脂酰胆碱重量/聚醇酸共聚物重量)的比例与所述聚醇酸共聚物混合。

12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述悬浮液进一步含有一种或多种选自糖、盐和表面活性剂的赋形剂。