CN111419181B - 一种用于小动物长时间活体成像的装置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于小动物长时间活体成像的装置及其使用方法,该装置包括固定装置底座,设于固定装置底座上的加热垫、高度可调的成像平台固定支柱、位置可调的小动物固定支柱,以及通过成像平台固定支柱固定的成像固定平台;所述的成像固定平台包括非脑部成像固定平台和脑部成像固定平台。该装置能针对不同观察位置对动物进行固定,确保成像过程的稳定,并可以对成像的位置进行定位,保证长时间、多时间节点稳定成像,并能根据不同大小的动物进行灵活调整适配。采用该方法进行小动物活体成像,可灵活匹配不同大小的实验动物,且适用于不同成像部位,并可实现精确定位。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于小动物长时间活体成像的装置及其使用方法,主要用于啮齿目(如小鼠、大鼠、豚鼠等)、兔形目(如兔、鼠兔等)、小型灵长类(如狨猴等)等小型实验动物的固定,并用于活体、长时间成像,以研究小型实验动物在清醒或麻醉情况下,体内血流、不同种类细胞、离子的动态变化。
背景技术
在生命科学研究中,活体实验是对体外实验的重要补充和验证,在活体研究中,使用双光子显微镜对动物活体组织进行动态观察是一种重要的研究手段。双光子显微镜结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的优势,利用长波长激发,比短波长对细胞的光毒性小,穿透能力强,且只有在焦平面上的荧光分子才能被激发,所以,双光子显微镜比普通荧光显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞或活体标本。利用双光子显微镜,可以实现对标本的多色、长时间、多时间点的观察。传统方法是通过取局部组织,放置在相应培养液中进行观察,或者利用小动物固定装置对局部进行固定后,在双光子显微镜下观察。由于受动物呼吸、心跳等动态影响、以及部分组织结构柔软等特点的影响,观察标本的固定是双光子显微成像的一大难题。常见的动物固定装置难以适应大部分组织,观察范围有限,也难以实现对同一个位置的长时间、多时间点的动态观察。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的主要目的在于提供一种小动物长时间活体成像固定装置及其使用方法,该装置能够针对小动物不同观察位置(如脑部、腹部、四肢等)进行固定,确保成像过程中的稳定,并可以对成像的位置进行定位,能够保证长时间、多时间节点的稳定成像。并能根据不同大小的动物进行灵活调整适配。
为实现以上目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于小动物长时间活体成像的装置,包括:固定于显微镜平台或防震台上的固定装置底座,设于固定装置底座上的加热垫、高度及位置可调的成像平台固定支柱、位置可调的小动物固定支柱,以及通过成像平台固定支柱固定的成像固定平台;所述的成像固定平台包括非脑部成像固定平台和脑部成像固定平台;所述的加热垫为可温控加热垫;
所述的非脑部成像固定平台中间设有带螺纹的固定孔,用于放置玻璃底皿;所述的玻璃底皿顶端还设有中空固定盖,所述的中空固定盖包括位于外部的中空固定盖螺纹部分和位于中心的固定盖中空部分,所述的固定盖中空部分包括上下两部分,上部开孔的直径小于下部开孔直径;中空固定盖螺纹部分用于固定玻璃底皿;所述的带螺纹的固定孔的螺纹与中空固定盖螺纹部分的外螺纹相配合;
所述的脑部成像固定平台上设有不规则的成像平台开孔,所述的成像平台开孔包括位于中间的成像孔和两个位于边缘的刺激及信号记录孔;所述的成像孔大于刺激及信号记录孔。
上述技术方案中,进一步地,所述的固定装置底座为矩形铝材,其上分布有螺孔阵列。考虑成像平台固定支柱的可调性,固定装置底座上位于边缘的螺孔密度大于其它部分。
更进一步地,所述的固定装置底座上的螺孔尺寸与显微镜平台或防震台上分布的螺孔相匹配,便于将固定装置底座固定于显微镜平台或防震台上。
进一步地,所述的成像平台固定支柱和小动物固定支柱下端均设有螺纹,二者均可直接与固定装置底座上的螺孔配合固定。
进一步地,所述的非脑部成像固定平台两端开有可调固定槽,所述的可调固定槽用于将非脑部成像固定平台固定在成像平台固定支柱上。且所述的可调固定槽做了加宽,可根据成像位置左右调整非脑部成像固定平台的位置;所述的脑部成像固定平台两端开有固定平台固定孔,用于将脑部成像固定平台固定在成像平台固定支柱上。
进一步地,所述的玻璃底皿可选择带刻度的玻璃底皿,根据网格的位置可找到同一位置,便于开展长时间间隔或不同设备间的关联实验。
本发明还提供一种采用上述装置进行小动物活体成像的方法,步骤如下:
将加热垫置于固定装置底座上,调节加热垫温度,保持小动物实验过程中的体温正常;
根据动物大小,调节小动物固定支柱的位置,并对实验动物进行固定;
根据成像部位,选择脑部成像固定平台或非脑部成像固定平台,调节成像固定平台的高度及成像位置,固定成像固定平台;
将固定装置底座固定在显微镜平台或防震台上;
根据实验需求,对特定区域进行活体成像。
本发明的有益效果在于:
1)可灵活匹配不同大小的实验动物,如小鼠、大鼠、豚鼠、鼠兔等;2)可适用于不同成像部位,脑部及其他部位;3)可精确定位,使用带刻度的玻璃底皿,对观察位置进行定位,可以实现长时间、多时间节点的成像,无需将动物和固定台一直放在显微镜下。
附图说明
图1为本发明小动物固定装置示意图-模式一。
图2为本发明小动物固定装置示意图-模式二。
图3为本发明小动物固定装置分解示意图。
图中:1、内六角固定螺丝,共四个,其螺纹部分匹配M6螺孔;2、可调固定槽,左右各一个;3、非脑部成像固定平台;3-1、脑部成像固定平台;4、中空固定盖;4-1、中空固定盖螺纹部分,匹配M39螺孔;4-2、固定盖中空部分,下部开孔直径35mm,开孔高度8mm,上部开孔直径30mm,高2mm;5、玻璃底皿,用于形成成像平面,5-1、玻璃底皿刻度部分;6、带螺纹的固定孔,其螺纹部分规格为M39;7、成像固定平台固定孔,直径6mm;8、成像平台开孔;8-1、成像孔;8-2、刺激及信号记录孔;9、成像平台固定支柱,共三对,左右各一个,高度分别为1cm、2cm、3cm,可根据不同实验需求和标本进行组合,以调整成像固定平台的高度;10、固定装置底座;10-1、底座螺孔阵列,间距规格25mm×25mm,向下固定于显微镜平台,向上用于固定成像平台支柱和小动物固定支柱;10-2、间距较小的螺孔,部分螺孔间距12.5mm,用于适配调整成像平台固定支柱;11、小动物固定支柱,可根据动物大小和形状固定于底板的不同位置,共四个;12、加热垫;12-1、加热垫电源线,USB接口,可匹配不同的电源。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明所涉及的方法作进一步详细说明。
本发明的一种用于小动物活体成像的固定装置,如附图1至图3所示,包括固定装置底座10、成像固定平台、加热垫12、小动物固定支柱11、成像固定平台支柱9等,成像固定平台分为非脑部成像固定平台3和脑部成像固定平台3-1。考虑不同成像部位和不同的小动物,本发明的装置配备了非脑部成像固定平台3和脑部成像固定平台3-1,同时各个固定部件灵活可调,可以实现对不同的部位不同的小动物进行可靠固定,实现稳定的、长时间、多时间点的成像记录。
固定装置底座10为矩形铝材,其上分布有底座螺孔阵列10-1(25mm×25mm间距的M6螺孔),两侧边缘考虑成像平台固定支柱9的可调性,增加了螺孔的密度,如图中10-2为间距较小的螺孔,整体螺孔尺寸与显微镜载物平台或显微镜防震台上的螺孔尺寸相匹配,既可以用于将固定装置底座10固定于显微镜平台或防震台上,也可以用于固定成像平台固定支柱9,并且可以灵活调整和固定小动物固定支柱11的位置;作为进一步的优化,成像平台固定支柱9有三对,高度分别为1cm、2cm、3cm,通过不同支柱的组合,可以实现从1cm到6cm、间隔1cm的不同高度组合,从而适用于不同的成像部位和小动物,成像平台固定支柱9的螺孔部分规格M6;螺纹部分匹配M6螺孔;用于固定小动物固定支柱11螺纹部分匹配固定装置底座10的M6螺孔,可以根据不同的动物大小进行灵活调整;加热垫12可以根据实验条件灵活配备,选用有温控部件的加热垫为佳,加热垫电源线12-1为USB接口。
本发明的固定装置根据不同的成像部位,分两种模式,模式一为非脑部成像模式,模式二为脑部成像模式,分别如图1和图2,主要差异在于成像固定平台,分别对应非脑部成像固定平台3和脑部成像固定平台3-1;图3对两种模式的组件做了分解展示,对于非脑部成像固定平台3,其两侧的可调固定槽2用于将非脑部成像固定平台3固定在成像平台固定支柱9上,考虑成像位置不一定位于小动物的中间,作为优化,两侧的可调固定槽2做了加宽,可以根据成像位置进行左右调整,而且不影响成像固定平台的稳定性。对于脑部成像固定平台3-1,其两端设有成像固定平台固定孔7,用于将与脑部成像固定平台3-1固定在成像平台固定支柱9上。
作为进一步优化,非脑部成像固定平台3的中间设有带螺纹的固定孔6,其螺纹部分规格为M39,此处用于放置玻璃底皿5,玻璃底皿5还配有中空固定盖4,中空固定盖4包括中空固定盖螺纹部分4-1和固定盖中空部分4-2,固定盖中空部分4-2下部开孔直径35mm,开孔高度8mm,与玻璃底皿5的尺寸匹配,上部开孔直径30mm,高2mm,用于让显微镜镜头直接深入玻璃底皿5中成像,中空固定盖螺纹部分4-1的规格匹配带螺纹的固定孔6的螺纹部分的M39螺孔,可以旋入带螺纹的固定孔6中,用于固定玻璃底皿5,中空固定盖4可以将玻璃底皿5固定在成像固定平台上,同时通过一定的压力,实现平整的成像平面,解决了大部分活体成像中样品表面不平整的问题,同时也解决了柔软部位无法固定成像的问题;作为进一步优化,为了实现长时间间隔的同一位置的成像或实现不同设备间的关联等实验,此处选用带刻度的玻璃底皿5,根据玻璃底皿刻度部分5-1中网格的位置,找到同一位置,无需将动物一直放置在显微镜下,也能实现长时间观察,节约显微镜资源,也方便开展如光学显微镜和电子显微镜等不同设备间的关联实验。
进一步的,高质量的活体成像多采用介质水的专用镜头,成像过程需要在镜头和标本之间加入介质水,长时间的观察难以维持镜头和标本之间的水,需要不断加入,从而影响实验过程,利用玻璃底皿可加入足量的介质水,可以确保介质水的长时间保留,无需在实验过程中担心镜头介质流失的问题。一般镜头和样本间的介质水只有一滴水,也就是0.05毫升,一个小时左右就会干,玻璃底皿中可以加入几毫升,可以维持很长时间。
脑部成像固定平台3-1,用于小动物脑部成像,作为优化,中间的成像平台开孔8为不规则,由位于中间较大的成像孔8-1和位于边缘的两个刺激及信号记录孔8-2组成,其中成像孔8-1用于脑部成像,记录细胞、钙信号、血流等动态信息,同时可以在刺激及信号记录孔8-2实现同步电刺激、给药,同步电信号记录等实验,很好的满足不同实验的需求。
为了让本发明的特征、优点能更加易懂,下面以小鼠脑部成像和大鼠腹部皮肤成像作为具体实施例进行说明:
实施例1:小鼠脑部成像
1)将转基因荧光小鼠麻醉,用眼科剪将头皮剪开,暴露成像区域和刺激给药区域的头骨,用双氧水或氯化铁溶液处理头骨表面,去除筋膜;用牙科水泥(玻璃离子体水门汀)将头骨固定在脑部成像固定平台3-1上,将小鼠脑部需要成像区域和刺激及信号记录区域对准放在平台的成像孔8-1和刺激及信号记录孔8-2处;
2)将加热垫12放置在固定装置底座10上,调节温度为37摄氏度,维持实验过程中小鼠的体温;
3)待牙科水泥完全固化后,根据小鼠头部的高度,选用2cm高度的成像平台固定支柱9,固定在固定装置底座10上的第三排两侧的间距较小的螺孔10-2上(螺孔间距12.5mm),用内六角固定螺丝1将脑部成像固定平台3-1及小鼠一起固定在成像平台固定支柱9上;
4)用骨钻分别在成像区域和刺激及信号记录区域开孔,先用大号钻头去除头骨表面的牙科水泥,并将头骨磨薄,然后用小号钻头,沿着成像孔8-1钻一圈小孔,注意避开血管,打磨期间不断用棉花蘸取生理盐水,敷在头骨表面,用于降温和洗去头骨碎屑;
5)成像孔8-1周围的一圈小孔钻完后,用镊子小心将成像区域的头骨取下;在刺激及信号记录孔8-2一侧用钻头开孔;
6)用生理盐水对开孔区域进行清洗,用显微镊将成像区的脑膜小心撕下,配制低熔点琼脂溶液,用手背试琼脂溶液的温度,不烫手即可将琼脂敷在成像孔8-1处,并迅速盖上一片盖玻片。
7)将小鼠连同固定装置一起放置到双光子显微镜下,用螺丝将固定装置底座10固定好,完成成像动物的准备工作;
8)成像推荐用双光子显微镜,如奥林巴斯双光子显微镜(型号FVMPE-RS),镜头选用25倍双光子专用镜头(型号XLPLN25XWMP2),在成像区域滴加纯净水,找到感兴趣区域,根据实验需求,调节光路和拍摄参数,进行活体成像;
9)如需进行同步给药刺激或记录电生理信号,也可以在刺激及信号记录孔8-2处实施,同时进行活体成像。
实施例2:大鼠腹部皮肤成像
1)将大鼠麻醉,设置加热垫12稳定至37摄氏度,将大鼠仰卧,调整小动物固定支柱11位置,固定四肢及头部;
2)用脱毛剂对腹部成像区域进行涂抹脱毛,脱毛区域稍大于成像区域;
3)根据腹部的高度,此例中选用3cm高的成像平台固定支柱9,固定在固定装置底座10第四排两侧的间距较小的螺孔10-2上,可以根据动物大小和成像部位做适当调整,将非脑部成像固定平台3固定在成像平台固定支柱9上,水平移动非脑部成像固定平台3的位置,确保成像区域完全处于带螺纹的固定孔6中,成像平台固定支柱9的高度应确保腹部略凸出带螺纹的固定孔6底部,且不影响大鼠的呼吸;
4)在带螺纹的固定孔6中装入玻璃底皿5,并旋入中空固定盖4,玻璃底皿5与腹部完全贴合,且有一定的挤压力,从而形成成像平面,且该平面不受呼吸影响(这部分皮肤组织突出来会有一定的压力,加上玻璃底皿5后并旋紧中空固定盖4,压力会使皮肤组织紧贴玻璃底皿的底部,从而使小鼠的呼吸和心跳不易对该平面有影响);
5)成像推荐用双光子显微镜,如奥林巴斯双光子显微镜(型号FVMPE-RS),镜头选用25倍双光子专用镜头(型号XLPLN25XWMP2),在玻璃底皿5中添加1mL纯净水,找到感兴趣区域,根据实验需求,调节光路和拍摄参数,进行活体成像,如此例中可利用皮肤自发荧光进行观察。
6)如需对某个位置进行长时间观察,玻璃底皿5可选用带刻度网格的玻璃底皿,根据网格位置进行精确定位。
Claims (7)
1.一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,包括:固定于显微镜平台或防震台上的固定装置底座,设于固定装置底座上的加热垫、高度及位置可调的成像平台固定支柱、位置可调的小动物固定支柱,以及通过成像平台固定支柱固定的成像固定平台;所述的成像固定平台包括非脑部成像固定平台和脑部成像固定平台;所述的加热垫为可温控加热垫;
所述的非脑部成像固定平台中间设有带螺纹的固定孔,用于放置玻璃底皿;所述的玻璃底皿顶端还设有中空固定盖,所述的中空固定盖包括位于外部的中空固定盖螺纹部分和位于中心的固定盖中空部分,所述的固定盖中空部分包括上下两部分,上部开孔的直径小于下部开孔直径;中空固定盖螺纹部分用于固定玻璃底皿;所述的带螺纹的固定孔的螺纹与中空固定盖螺纹部分的外螺纹相配合;
所述的脑部成像固定平台上设有不规则的成像平台开孔,所述的成像平台开孔包括位于中间的成像孔和两个位于边缘的刺激及信号记录孔;所述的成像孔大于刺激及信号记录孔。
2.根据权利要求1所述的一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,所述的固定装置底座为矩形铝材,其上分布有螺孔阵列,位于固定装置底座边缘的螺孔密度大于其他部分的螺孔密度,便于增加平台固定支柱的位置可调性。
3.根据权利要求2所述的一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,所述的固定装置底座上的螺孔尺寸与显微镜平台或防震台上分布的螺孔相匹配,便于将固定装置底座固定于显微镜平台或防震台上。
4.根据权利要求2所述的一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,所述的成像平台固定支柱和小动物固定支柱下端均设有螺纹,二者均直接与固定装置底座上的螺孔配合固定。
5.根据权利要求1所述的一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,所述的非脑部成像固定平台两端开有可调固定槽,所述的可调固定槽用于将非脑部成像固定平台固定在成像平台固定支柱上,可根据成像位置左右调整非脑部成像固定平台的位置;所述的脑部成像固定平台两端开有固定平台固定孔,用于将脑部成像固定平台固定在成像平台固定支柱上。
6.根据权利要求1所述的一种用于小动物长时间活体成像的装置,其特征在于,所述的玻璃底皿为底部带刻度的玻璃底皿,可根据网格的位置找到同一位置。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的用于小动物长时间活体成像的装置的使用方法,其特征在于,步骤如下:
将加热垫置于固定装置底座上,调节加热垫的温度,保持小动物在实验过程中的体温正常;
根据动物大小,调节小动物固定支柱的位置,并对实验动物进行固定;
根据成像部位,选择脑部成像固定平台或非脑部成像固定平台,调节成像固定平台的高度及成像位置,固定成像固定平台;
将固定装置底座固定在显微镜平台或防震台上;
根据实验需求,对特定区域进行活体成像。
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