NO316614B1 - Fremgangsmåte for å forsterke ekkogeniteten og redusere dempningen i mikroinnkapslede gasser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse ligger hovedsakelig i området for diagnostiske avbildningsmidler og er særlig rettet mot kontrastmidler i form av mikropartikler, til ultralydavbildning der disse har forbedret ekkogenitet og svekket dempning som en funksjon av tykkelsen på polymermembranet.

Ved bruk av ultralyd for å frembringe en avbildning av indre organer og strukturer hos et menneske eller et dyr blir ultralydbølger, lydbølgeenergi med en frekvens over det som kan høres med det menneskelige øre, reflektert idet de passerer gjennom legemet. Forskjellige typer legemsvev reflekterer ultralydbølger forskjellig, og de refleksjoner som frembringes av ultralydbølgene som reflekteres fra forskjellige indre strukturer blir påvist og omformet elektronisk for visuell gjengivelse.

For noen medisinske tilstander er det overordentlig vanskelig å få til et brukbart bilde av det organ eller den struktur som er av interesse fordi detaljene ved strukturen ikke kan skilles tilstrekkelig fra det omgivende vev i et ultralydbilde som dannes ved refleksjon av ultralydbølger, når det ikke benyttes et kontrastforbedrende middel. Påvisning og observasjon av viss fysiologiske og patologiske tilstander kan bli betydelig forbedret ved å øke kontrasten i et ultralydbilde ved injisering eller infusjon av et middel i et organ eller en struktur av interesse. I andre tilfeller er påvisning av bevegelse av det kontrastøkende middel i seg selv særlig viktig. For eksempel kan et tydelig blodstrømmønster som man vet er resultatet av særlige unormale kardiovaskulære tilstander bare kunne oppfattes ved infusjon av et kontrastøkende middel i blodstrømmen for deretter å observere blodstrømmens dynamikk.

Materialer som er hensiktsmessige som ultralydkontrastmidler virker ved at de har en effekt på ultralydbølger idet disse passerer gjennom legemet og blir reflektert for å danne det bildet som en medisinsk diagnose baseres på. Forskjellige typer stoffer påvirker ultralydbølger på forskjellige måter og i forskjellige grader. Videre er visse virkninger som skyldes kontrastøkende midler lettere å måle og observere enn andre midler. Ved valg av en ideell sammensetning for et kontrastøkende middel vil man foretrekke det stoff som har den mest dramatiske effekt på ultralydbølgen idet den passerer gjennom legemet. Også virkningen på ultralydbølgen skulle være lett å måle. Det er to virkninger som kan sees i et ultralydbilde: tilbakespredning og stråledempning.

TILBAKESPREDNING: Når en ultralydbølge som passerer gjennom legemet støter på en struktur som for eksempel et organ eller legemsvev reflekterer strukturen en del av ultralydbølgen. Forskjellige strukturer i legemet reflekterer ultralydenergi på forskjellige måter og med varierende styrker. Denne reflekterte energi påvises og benyttes til å frembringe et bilde av strukturene som ultralydbølgen har passert gjennom. Uttrykket "tilbakespreding" henviser til det fenomen der ultralydenergi blir kastet tilbake mot kilden av et materiale med visse fysiske egenskaper.

Det har lenge vært kjent at den kontrast som sees i et ultralydbilde kan forbedres ved nærvær av stoffer som er kjent for å skape en stor tilbakespredning. Når et stoff av denne type blir gitt til en bestemt del av legemet blir kontrasten mellom ultralydbildet av denne del av legemet og de omgivende vev som ikke inneholder stoffet forbedret. Det er vel forstått at på grunn av deres fysiske egenskaper frembringer forskjellige stoffer tilbakespredning i forskjellige grader. Som følge av dette har leting etter kontrastøkende midler blitt fokusert på stoffer som er stabile og ikke giftige og som fører til maksimal tilbakespreding.

Den mulighet et stoff har til å frembringe tilbakespreding av ultralydenergi avhenger av stoffets egenskaper, som for eksempel evne til å bli komprimert. Ved undersøkelse av forskjellige stoffer er det nyttig å sammenligne et bestemt mål for den evne et stoff har til å frembringe tilbakespreding og som er kjent som "kastetverrsnittet". Kastetverrsnittet for et bestemt stoff er proporsjonalt med radius på den tilbakekastende partikkel og avhenger også av bølgelengden på ultralydenergien og andre fysiske egenskaper ved stoffet, se J. Ophir og K. J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, bind IS, n. 4, side 319, 323 (1989).

Ved vurdering av nytten ved forskjellige stoffer som ultralydkontrastmiddel, dvs.

gasser, væsker eller faste stoffer, kan man beregne hvilket middel som vil ha det høyere kastetverrsnitt og dermed hvilket middel som vil gi den beste kontrast i et ultralydbilde. Det kan antas at sammentrykkbarheten ved en fast partikkel er meget mindre enn for det omgivende medium og at tettheten i partiklene er støne. Ved bruk av denne antagelse er kastetverrsnittet for en fast partikkel benyttet som kontrastøkende middel blitt anslått til 1,75 (Ophir og Parker og flere, side 325). For en tilbakekastende ren væske er den adiabatiske sammentrykkbarhet og tettheten i det tilbakekastende stoff og det omgivende medium sannsynligvis forholdsvis like, noe som gir det resultat at væsken vil ha et kastetverrsnitt på null. Imidlertid kan væsker oppvise noe tilbakespreding hvis store volumer av et flytende middel foreligger. For eksempel hvis et flytende middel passerer fra et meget lite kar til et stort kar slik at væsken oppfyller så godt som hele

karet kan væsken oppvise målbar tilbakespreding. Ikke desto mindre er fagfolk på dette området klar over at rene væsker er forholdsvis lite effektive tilbakespredere.

Kastetverrsnittet for en gass er vesensforskjellig og større enn for en væske eller et fast stoff, delvis fordi en gassboble kan komprimeres i meget høyere grad enn en væske eller et fast stoff. Videre har frie gassbobler i en væske en svingebevegelse slik at ved visse frekvenser vil gassbobler svinge i resonans med en frekvens som er nær opptil frekvensen for de ultralydbølger som i alminnelighet benyttes til medisinsk avbildning. Som et resultat kan kastetverrsnittet for en gassboble være over tusen ganger større enn sin fysiske størrelse.

STRÅLEDEMPNING: En annen effekt som kan observeres fra nærværet av visse kontrastøkende midler er dempningen av ultralydbølgen. Styrken på ultralydbølgen avtar når bølgen passerer gjennom volumet av vev eller blod som inneholder kontrastmiddelet. Reduksjonen i bølgens styrke er resultat både av ultralyd som blir kastet tilbake av middelet så vel som bortledning av bølgen idet den samvirker med kontrastmiddelet. Hvis bølgen blir for dempet vil den energi som returnerer til transduseren fra et område som ligger i avstand fra kontrastmiddelet være lav, noe som fører til en dårlig avbildningsdybde. Bruken av forskjeller i stråledempning i forskjellige vevstyper har vært forsøkt som en bildeforbedrende metode. Bildekontrast er blitt iakttatt ved vanlig bildedannelse på grunn av lokaliserte dempningsforskjeller mellom visse typer vev. KJ. Parker og R.C. Wagg, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images" IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), sidene 431-37 (1983); KJ. Parker, R.C. Wagg og R.M. Lerner, "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characterization," Radiology, 153(3), sidene 785-88 (1984). Det er tenkt at målingene av dempning i et vevsområde som tas før og etter infusjon av et middel kan gi et forbedret bilde. Teknikker som er basert på dempning av kontrast som et middel til å måle kontrastforbedringen av et flytende middel er imidlertid ikke særlig utviklet, og selv om den blir fullt utviklet vil den lide av begrensninger når det gjelder indre organer eller strukturer der denne teknikk kan benyttes. For eksempel er det ikke sannsynlig at et tap av dempning på grunn av flytende kontrastmidler kunne iakttas i bildet av det kardiovaskulære system på grunn av det store volum av flytende kontrastmiddel som nødvendigvis måtte være tilstede i et gitt kar før en betydelig forskjell i dempning kunne måles.

Som oppsummering er diagnostisk ultralyd et kraftig, ikke-inntrengende verktøy som kan benyttes til å skaffe informasjon om de indre organer i legemet. Frembringelsen av gråskala og farge-Doppler-bildedannelse har i høy grad brakt omfanget og oppløsningen med denne teknikk fremover. Selv om teknikkene til utførelse av diagnostiske ultralydundersøkelser er blitt betydelig forbedret, noe som også gjelder fremstilling og bruk av kontrastmidler er det fremdeles et behov for å forbedre oppløsningen av bildedannelsen for kardial per fusjon og kardiale kammere, faste organer, renal perfusjon, per fusjon av faste organer og Doppler-signaler av blodhastighet og strømningsretning ved bildedannelse i sann tid. Utviklingen av ultralydkontrastmidler har fokusert på bruken av bioforenlige gasser, enten som frie gassbobler eller som gasser innkapslet i naturlige eller kunstige skallmaterialer.

En rekke naturlige og kunstige polymerer er blitt benyttet til innkapsling av en gass som for eksempel luft, til bruk som bildedannende kontrastmidler.

Schneider m.fl, Invest. Radiol.. bind 27, sidene 134-139 (1992) beskriver 3 mikron store, luftfylte polymerpartikler. Disse partikler ble angitt å være stabile i plasma og under utøvet trykk. Imidlertid, ved 2,5 MHz var deres ekkogenitet lav. En annen type suspensjon av innkapslede gassmikrobobler er blitt fremstilt av sonikert albumin. Feinstein m.fl., J. Am. Coll. Cardiol.; bind 11, sidene 59-65 (1988). Feinstein beskriver prepareringen av mikrobobler som har hensiktsmessig størrelse for transpolmonær passasje med god stabilitet in vitro. Disse mikrobobler har imidlertid kort levetid in vivo med halveringstid av størrelsesordenen noen fa sekunder (som tilnærmet svarer til et sirkulasjonsløp) fordi de meget hurtig løses opp i undermettede væsker, for eksempel blod. Wible, J.H. m.fl. J. Am. Soc. Echocardioer., bind. 9, sidene 442-451 (1996). Gelatin-innkapslede luftbobler er beskrevet av Carroll m.fl. (Carroll, B.A. m.fl., Invest. Radiol. bind 15, sidene 260-266 (1980), og Carroll, B.A. m.fl. Radioloev. bind 143, sidene 747-750 (1982), men på grunn av deres store størrelse (12 og 80 um) ville de ikke enkelt passere gjennom de pulmonære kapillarier. Gelatin-innkapslede mikrobobler er også beskrevet i PCTYUS80(00502 av Rasor Associates, Inc. Disse er dannet ved "coalisering" av gelatinet.

Luftmikrobobler som er stabilisert med mikrokrystaller av galaktose (SHU 454 og SHU 508) er også blitt omhandlet av Fritzsch, T. m.fl., Invest. Radiol., bind 23 ( Suppl W sidene 302- 305 ( 1988): og Fritzsch, T. m.fl., Invest. Radiol.. bind 25 (Suppl 1), 160-161

(1990). Mikroboblene varer opptil 15 minutter in vitro, men mindre enn 20 sekunder in vivo. Rovai, D. m.fl., J. Am. Coll. Cardiol. bind 10, sidene 125-134 (1987); og Smith, M. m.fl., J. Am. Coll. Cardiol.. bind 13, sidene 1622-1628 (1989). Gass mikrobobler innkapslet med et skall av fluorholdig materiale er beskrevet i WO 96/04018 av Molecular Biosystems, Inc.

Europeisk patentsøknad nr. 90901933.5 tilhørende Schering Aktiengesellschaft beskriver preparering og bruk av mikroinnkapslet gass eller flyktige væsker for ultralyd bildedannelse der mikrokapslene er dannet av syntetiske polymerer eller polysakkarider. Europeisk patentsøknad nr. 91810366.4 tilhørende Sintetica S.A. (0 458 745 Al) beskriver luft eller gass mikroballonger omgitt av et omgivende avsatt polymermembran som kan dispergeres i en vandig bærer for injisering i et vertsvesen eller for oral, rektal eller uretral tilførsel for terapeutiske eller diagnostiske formål. WO 92/18164 tilhørende Delta Biotechnology Limited beskriver preparering av mikropartikler ved forstøvningstørking under meget kontrollerte omgivelser når det gjelder temperatur, forstøvningsmengde, partikkelstørrelse og tørkebetingelser og av en vandig proteinløsning for å danne hule kuler med innesluttet gass for bruk ved bildedannelse. WO 93/25242 beskriver syntese av mikropartikler for ultralyd bildedannelse bestående av en gass med et skall av polycyanoakrylat eller polyester. WO 92/21382 beskriver fremstilling av mikropartikkel kontrastmiddel som omfatter en kovalent bundet matrise inneholdende en gass der matrisen er et karbohydrat. US patent nr. 5 334 381,5 123 414 og 5 352 435 tilhørende Unger beskriver liposomer til bruk som ultralydkontrastmidler og som omfatter gasser, gassprekursorer så som pH-aktivert eller foto-aktivert gassformet prekursor så vel som andre flytende eller faste kontrastforbedrende midler. WO 95/23615 tilhørende Nycomed beskriver mikrokapsler for bildedannelse dannet ved koaservasjon av en løsning, for eksempel en proteinløsning inneholdende et perfluorkarbon. PCT/US94/08416 tilhørende Massachusetts Institute of Technology beskriver mikropartikler laget av polyetylen glykol-poly(laktid-ko-glykolid) blokkpolymerer med innkapslede bildedannende midler innbefattende gasser som luft og perfluorkarboner.

Europeisk patentsøknad nr. EP 0 458 745 til Sintetica S.A., beskriver gass- eller luftfylte polymermikroballonger som kan anvendes som suspensjoner i væskebærer for ultralydekkografi. De luft- eller gassfylte mikroballongene er avgrenset av en grenseflatedeponert polymermebran som kan dispergeres i vannholdige bærevæsker som skal injiseres i levende organismer eller administreres oralt, rektalt eller ureatalt for terapeutiske eller diagnostiske formål (ekkografi). Egenskapene til mikroballongenes polymermembran (elastisitet, permeabilitet, bionedbrytbarhet) kan styres etter ønske avhengig av det valgte polymer, grenseflatedeponeringsbetingelsene, og polymeradditivene.

Selv om alle ultralyd kontrastmidler som er undersøkt til i dag, som for eksempel frie gassbobler eller innkapslede gassbobler er potente tilbakespredere, har disse midler også en høy grad av dempning. Høy dempning fører til liten bildedybde og tap av vevsbilder som ligger i avstand fra kontrastmiddelet. I mange tilfeller kan bildeinformasjonen gå fullstendig tapt utenfor områder som har betydelige konsentrasjoner av kontrastmiddelet, for eksempel den venstre ventrikkel. Alle ultralyd kontrastmidler som for tiden er under undersøkelse deler dette problem i en viss utstrekning.

For å redusere det problem som er knyttet til dempning av kontrastmidler har fagfolk måttet bruke flere løsninger. Oftest blir mengden av kontrastmiddel som tilføres redusert for å la mer av ultralydstrålen trenge gjennom til kontrastmiddelet. Selv om dempningen er lavere vil reduksjonen i dose føre til mindre enn optimal kontrast for mange kliniske indikasjoner. Som et alternativ kan ultralydkontrastmidler tilføres som en kontinuerlig infusjon. Dette vil i høy grad senke den lokale konsentrasjon av middelet og har det problem som er beskrevet tidligere når det gjelder dosereduksjon. Kontinuerlig infusjon har de ytterligere ulemper ved at de krever en stor samlet dose over tid og er ikke lett å utføre under kliniske forhold. For å kompensere for mindre doser har fagfolk benyttet harmonisk bildedannelse for å forbedre signal/støyforholdet. Imidlertid er harmonisk bildedannelse ikke standard på dette tidspunkt.

Det er viktig at disse forsøk ikke går ut på å rette på det fundamentale problem med akustiske egenskaper hos eksisterende ultralyd kontrastmidler. For at et ultralyd kontrastmiddel skal ha høy ekkogenitet er det således nødvendig å frembringe en tilbakekaster som fører til en høy total returnert energi ved den mottakende transduser fra områder av interesse i dybder utenfor utgangsområdet inneholdende kontrastmiddelet. Den returnerte energi vil bli styrt både ved tilbakespreding og dempning av middelet.

Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å komme frem til mikropartikler med betydelig øket ekkogenitet. En annen hensikt med oppfinnelsen er å komme frem til et ultralydmiddel med høy tilbakespreding og lav dempning.

En fremgangsmåte til økning av ekkogeniteten for mikropartikler med innkapslet gass til bruk ved ultralydavbildning, i samsvar med oppfinnelsen, er kjennetegnet ved at den omfatter: bestemmelse av det området av veggtykkelser for mikropartiklene som resulterer i de største mengder total returnert energi som en funksjon av det materiale som danner mikropartiklene og den gass som skal innkapsles, og

fremstilling av mikropartikler med en veggtykkelse i det området som resulterer i de høyeste nivåer for samlet returnert energi.

Ytterligere aspekter ved fremgangsmåten til økning av ekkogeniteten er kjennetegnet ved at mikropartiklene er laget av syntetisk polymer, at mikropartiklenes veggtykkelse er mellom 50 og 660 nm, at mikropartiklene er laget av en naturlig polymer, at den naturlige polymeren er en protein og at veggtykkelsen på mikropartiklene er mellom 20 og 660 nm, og/eller at den videre omfatter reduksjon av dempningen ved økning av veggtykkelsen på mikropartiklene.

En fremgangsmåte i samsvar med oppfinnelsen, til ultralydavbildning, er kjennetegnet ved at den omfatter tilførsel til et subjekt som skal avbildes av en blanding med polymeriske mikropartikler som innkapsler en gass der mikropartiklene er laget av ikke-proteinholdig polymer og hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler som har et bredere område av veggtykkelser der ekkogeniteten for delpopulasjon av mikropartiklene er større enn ekkogeniteten for populasjonen av mikropartikler hvorav delpopulasjonen er utledet.

Ytterligere aspekter ved den forannevnte fremgangsmåten til ultralydavbildning er kjennetegnet ved at den innbefatter at mikropartiklene er laget av syntetisk polymer, at veggtykkelsen på delpopulasjonen av mikropartikler er mellom 50 og 660 nm, at mikropartiklene er laget av en naturlig polymer, at gassen er en fluorinert gass, og/eller at den videre omfatter økning av ekkogeniteten ved bestemmelse av veggtykkelsen på mikropartiklene ved en særlig fortynningsgrad av de mikropartikler som skal gis til et subjekt.

En fremgangsmåte til ultralydavbildning i samsvar med oppfinnelsen er kjennetegnet ved at den omfatter tilførsel til et subjekt som skal avbildes av en blanding med polymeriske mikropartikler som innkapsler en gass der mikropartiklene er laget av de mikropartikler som hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler som har et bredere område for veggtykkelser mellom 20 og 600 nm, der ekkogeniteten for delpopulasjonen av mikropartikler er større enn ekkogeniteten for populasjonen av mikropartikler som delpopulasjonen er utledet fra.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den sist nevnte fremgangsmåte til ultralydavbildning er kjennetegnet ved at gassen er en fluorinert gass.

En blanding i samsvar med oppfinnelsen er kjennetegnet ved at den omfatter polymeriske mikropartikler som innkapsler en ekkogenisk mengde av bioforentig gass der mikropartiklene hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler basert på polymerveggtykkelse der ekkogeniteten for delpopulasjonen av mikropartikler er større enn ekkogeniteten for den populasjon som delpopulasjonen er utledet fra.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den sist nevnte blandingen er k jennetegnet ved at polymeren er en syntetisk polymer forskjellig fra en blokk-kopolymer av polyetylenglykol og poly(laktid-ko-glykolid), at de polymeriske mikropartikler er laget av en polymer som er valgt fra gruppen bestående av poly(hydroksysyre), polyanhydrider, polyortoestere, polyamider, polykarbonater, polyalkylener, polyvinylalkoholer, polyvinyletere, polyvinylestere, polyvinylhalider, polyvinylpyrrolidon, polysiloksaner, poly(vinylalkoholer), poly(vinylacetat), polystyren, polyuretaner, syntetiske celluloser, polyakrylsyrer, poly(butyrisk syre), poly(valerisk syre) og poly(lactid-ko-kaprolakton), polysakkarider, polyhydroksyalkanoater, kopolymerer og blandinger av disse, at gassen er valgt fra gruppen som består av oksygen, nitrogen, xenon, argon, nitrogen, fluorinerte gasser og luft, at gassen er en fluorinert gass som er valgt fra gruppen bestående av CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SFe, C2F4 og CjFc at den hovedsakelig består av mikropartikler med veggtykkelse på mellom 110 og 1100 nm, og/eller ved at mikropartiklene har en veggtykkelse på mellom 110 og 330 nm.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte til økning av ekkogeniteten for mikropartikler med innkapslet gass til bruk ved ultralydavbildning, kjennetegnet ved de trekk som fremgår av det vedfølgende selvstendige patentkrav 1.

Ytterligere fordelaktige trekk ved fremgangsmåten til økning av ekkogeniteten for mikropartikler med innkapslet gass til bruk ved ultralydavbildning er gjengitt i de vedfølgende uselvstendige patentkravene 2 til og med 6.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte til ultralydavbildning kjennetegnet ved de trekk som fremgår av det vedfølgende selvstendige patentkrav 7.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den forannevnte fremgangsmåte til ultralydavbildning er kjennetegnet ved de trekk som fremgår av de vedfølgende uselvstendige patentkravene 8 til og med 12.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte til ultralydavbildning kjennetegnet ved de trekk som fremgår av det vedfølgende selvstendige patentkrav 13.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den forannevnte fremgangsmåte til ultralydavbildning som angitt i krav 13 er gjengitt i det vedfølgende uselvstendige patentkrav 14.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en blanding for fremstilling av et middel for tilførsel til et subjekt som skal avbildes ved hjelp av ultralyd kjennetegnet ved de trekk som fremgår av det vedfølgende selvstendige patentkrav 15.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den blanding som er angitt i patentkrav 15 er gjengitt i de vedfølgende uselvstendige patentkravene 16 til og med 21.

Det har blitt påvist at mikropartikler med tykkere vegger laget av naturlige eller syntetiske polymerer har en betydelig forbedret ekkogenitet og lavere dempning sammenlignet med mikropartikler som har tynnere vegger. Virkningen av veggtykkelse har blitt bestemt teoretisk og de optimale veggtykkelser forutsagt. Mikropartikler som har disse tykkelser ble fremstilt. I den foretrukne utførelse er polymerene syntetiske bionedbrytbare polymerer, og veggtykkelsene er mellom 50 og 660 nm, selv om veggtykkelsene fra omtrent 30 nm til mer enn 800 nm kan benyttes. Skalltykkelsen vil avhenge av det vev som er målet som skal avbildes og vil avhenge av både blodvolum og vevsvolum i det organ som skal undersøkes. Mikropartiklene er fremstilt med diameter som er egnet for det vev som skal avbildes, for eksempel med en diameter på mellom 0,5 og 8 mikroner for intravaskulær tilførsel og en diameter på mellom 0.5 og 5 med mer når de skal gis oralt for bildedannelse av fordøyelseskanaler eller andre lumen. Foretrukne polymerer er polyhydroksysyrer, som for eksempel polylaktik syre-ko-glykolik syre, polylaktid polyglykolid eller polylaktid ko-glykolid. Disse stoffer kan konjugeres til polyetylenglykol eller andre stoffer som hindrer opptak i det retikuloendoteliale system (RES). Mikrokulene kan benyttes på flere områder for ultralydbildedannelse, innbefattende kardiologi, blodperfusjonsanvendelser så vel som for organer og avbildning av perifere vener. Figur ler en graf over beregninger av virkningen av veggtykkelser på samlet tilbakespredingstverrsnitt pr. volumenhet som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av syntetisk polymer mikroinnkapslet oktafluoropropan med en fortynning på 1/1620 under forutsetning av veggtykkelse på 110 nm og 0,0034% C3F8 (total gassvolumandel), 165 nm og 0,0032% C3F8, 220 nm og 0,0029% C3F8, 330 nm og 0,0025% C3Fg, 440 nm og 0,0021% C3Fg, 660 nm og 0,0015% C3F8, 880 nm og 0,0010% C3F8 og 1100 nm og 0,0007% C3F8. Figur 2 er en graf over beregninger av virkningene av veggtykkelse på den akustiske dempningskoeffisient som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av syntetisk polymer mikroinnkapslet oktofluoropropan med en fortynning på 1/1620 med forutsatt veggtykkelse på 110 nm og 0,0034 % C3F8,165 nm 0,0032% C3F8,220 nm og 0,0029% C3F8,330 nm og 0,0025% C3F8,440 nm og 0,0021% C3F8,660 nm og 0,0015% C3F8, 880 nm og 0,0010% C3F8 og 1100 nm og 0,0007% C3F8. Figur 3 er en graf over beregninger av virkningen av veggtykkelse på ekkogenitet (samlet returnert energi pr. volumenhet) som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av syntetisk polymer mikroinnkapslet oktafluoropropan med en fortynning på 1/1620 under forutsetning av veggtykkelser på 110 nm og 0,0034 % C3F8,165 nm 0,0032% C3F8,220 nm og 0,0029% C3F8,440 nm og 0,0021% C3F8, 660 nm og 0,0015% C3F8. Figur 4 er en graf over beregninger av virkningen av veggtykkelse på samlet tilbakespredningstverrsnitt pr. volumenhet som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av naturlig polymermikroinnkapslet luft med en fortynning på 1/1620 under forutsetning av veggtykkelser på 40 nm og 0,0021% luft (total gassvolumandel), 80 nm og 0,0020% luft, 150 nm og 0,0019% luft, 300 nm og 0,0017% luft, 600 nm og 0,0013% luft, og 900 nm og 0,0010% luft. Figur 5 er en graf over beregninger of virkningen av veggtykkelse på akustisk dempningskoeffisient som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av naturlig polymermikroinnkapslet luft med en fortynning på 1/1620 under forutsetning av veggtykkelser på 40 nm og 0,0021% luft (total gassvolumandel), 80 nm og 0,0020% luft, 150 nm og 0,0019% luft, 300 nm og 0,0017% luft, 600 nm og 0,0013% luft, og 900 nm og 0,0010% luft. Figur 6 er en graf over beregninger av virkningen av veggtykkelse på ekkogenitet (samlet returnert energi pr. volumenhet) som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av naturlig polymermikroinnkapslet luft med en fortynning på 1/1620 under forutsetning av veggtykkelse på 40 nm og 0,0021% luft, 80 nm og 0,0020% luft, 150 nm og 0,0019% luft, 300 nm og 0,0017% luft, 600 nm og 0,0013% luft, og 900 nm og 0,0010% luft. Figur 7 er en graf over beregninger av virkningen av veggtykkelse på ekkogenitet som en funksjon av akustisk frekvens for en representativ størrelsefordeling av naturlig polymermikroinnkapslet luft med en fortynning på 1/5400 under forutsetning av veggtykkelse på 15 nm og 0,0006% luft, 40 nm og 0,0006% luft, 80 nm og 0,0006% luft, 150 nm og 0,0006% luft, og 300 nm og 0,0005% luft.

En fremgangsmåte til maksimering av ekkogenitet som en funksjon av veggtykkelse for naturlige eller syntetiske polymeriske mikropartikler er beskrevet. Mikropartiklene er hensiktsmessig for anvendelse til forskjellig diagnostisk ultralydavbildning, særlig i ultralydprosedyrer som bildedannelse av blodkar og ekkokardiografi. Økende veggtykkelse vil føre til betydelig økning av ekkogeniteten sammenlignet med de samme naturlige eller syntetiske polymeriske mikropartikler med tynnere vegger.

I Beregning av optimal polymertykkelse

For å få en bedre forståelse av virkningen av innkapslede mikrobobler overfor diagnostisk ultralyd ble en matematisk modell (C. Church J. Acoustical Soc. Amer. 97(3): 1510-1521,1995) benyttet til å beregne viktige verdier så som tilbakespredning og dempekoeffisienter for verdiene av fysiske parametre som for eksempel tykkelse og stivhet i det innkapslende skall. Skallet kan være enten et naturlig eller et syntetisk materiale. Modellen består av en (ikke-lineær) Rayleigh-Plesset-aktig ligning for eksempelet med en sfærisk gassboble innkapslet med et skall som opptrer samlet som et kontinuerlig ikke-sammentrykkbart dempet elastisk fast materiale. En analyttisk løsning av denne ligning som innbefatter den laveste orden av første og andre harmoniske komponenter blir her benyttet for å anslå virkningen av skalltykkelse på tilbakespredningstverrsnittet (forholdet mellom den energi som kastes tilbake av de innkapslede gassbobler og styrken på den innfallende akustiske stråle) og dempekoefifsienten (den hastighet hvormed gassboblene fjerner akustisk energi fra strålen) for en suspensjon av innkapslede gassbobler. Disse verdier blir så benyttet til å anslå den totale returnerte energi fra en suspensjon av innkapslede gassbobler til den ultralydtransduser som sendte ut den innfallende puls.

Den Rayleigh-Plesset-aktige ligning som beskriver reaksjonen for en innkapslet gassboble på en innfallende akustisk trykkbølge er: hvor Ri er radien på det gassfylte hulrom, Ui er den radielle hastighet på grensesnittet 1 (grensesnittet mellom det gassformede indre og det innkapslede faste stoff), R2 er den utvendige radius på det innkapslede materiale, pt er tettheten på den væske som omgir boblen, ps er tettheten i det innkapslende skall, Pc.eq er likevektsgasstrykket i boblen, Roi er den opprinnelige radius for det gassfylte hulrom, P- (t) er trykket ved det uendelige (innbefattende det akustiske drivtrykk), ai og 02 er grensesnittspenningene ved henholdsvis gass-skall og gass-væskegrensesnittene, us og u^er de effektive viskositeter ved henholdsvis skallet og den omgivende væske, Vs = R2 - Ri , Gs er stivheten i skallet og Rei er den avlastede likevektsstilling for gass-skallgrensesnittet. Et uttrykk for tilbakespredningstverrsnittet as| for en innkapslet gassboble kan finnes ved å anta at pulseringsamplituden Roix(t) er liten og ved å substituere Ri = Roi(l+x) og beslektede uttrykk i ligning (1) fra Church (1995) blir den resulterende ligning (2):

hvor m er den (radiale) frekvens for den innfallende akustiske bølge, er 0 er resonansfrekvensen for den innkapslede gassboble og en 8d er dempekonstanten for den innkapslede gassboble; representative enheter for tverrsnittet er gitt i det parentetiske som følger ligningen.

Ligning (2) passer der reaksjonen fra en enkel innkapslet gassboble er av interesse. I diagnostisk ultralyd er det mer vanlig å være interessert i reaksjonene fra en suspensjon med mange millioner innkapslede gassbobler. Når en samling av innkapslede gassbobler med et område av størrelser foreligger kan det samlede tilbakespredningstverrsnitt pr. volumenhet anslås ved enkel summering av bidraget fra hver enkelt innkapslet gassboble i et representativt volum av suspensjonen:

hvor/fRoOdRoi er antall innkapslede gassbobler pr. volumenhet med radier mellom Roi og Roi + dRoi. Dempekoeffisienten for suspensjonen kan anslås ved å bruke fremgangsmåten som er gitt av K. W. Commander og A. Prosperetti, "Linear pressure waves in bubbly liquids: Comparison between theory and Experiments, " J. Acoust. Soc. Amer. 85(2): 732-746 (1989). Ved å beskrive et bobleholdig medium uttrykt med dets gjennomsnittstrykk, tetthet, hastighet etc. kom disse forfattere frem til et uttrykk for Cm, den komplekse lydhastighet i suspensjonen. Når det gjelder innkapslede gassbobler er der faktoren 8,686 er nødvendig til å omforme fra neper til dB. Ligningene (3) og (4) kan kombineres for å gi det følgende forhold for returnert energi:

der x nå er avstanden mellom transduseren og prøvevolumet og faktaoren G tar hensyn til ytterligere geometriske faktorer innbefattende transduserapertur, avstand mellom transduser og prøvevolumet og romvinkelen som skjæres av den kuleformede bølge som kastes tilbake fra hver boble ved den mottakende transduser. For å gjøre bruk av disse resultater er det nødvendig å komme frem til en størrelsesfordeling for de innkapslede gassbobler og anslå verdier for de fysiske parametere som benyttes i

modellen. To forhold blir tatt i betraktning. Det første gjelder syntetiske mikropartikler som fremstilles av polyestere og det andre for mikropartikler produsert av albumin. Størrelsesfordelingen for de syntetiske partikler som her ble benyttet er det som måles for PLGA-PEG mikropartikler fremstilt ved forstøvningstørking som beskrevet i US-patentsøknad 08/681,710 innlevert 29. juli 1996, som det her vises til som referanse. De verdier for populasjonsparametrene som kjennetegner denne fordeling, slik det er bestemt med Coulter Multisizer® analyse er: total konsentrasjon: 2,4 x IO<9> partikler/ml, gjennomsnittlig diameter: 2,2 nm, volumets gjennomsnittlige diameter: 4,6 p.m og 6,5% gassvolumandel. Beregningene som er gjengitt nedenfor fremkom under forutsetning av en fortynning på 1/1620. Den tilsvarende konsentrasjon var 4,4 x IO<6 >partikler/ml, mens gassvolumandelen var omtrent 0,01%. Verdiene for parametrene som ble benyttet i denne modellen er: intern gass: verdier som passer for perfluorpropan, ekstern væske: verdier som passer for vann, skalldensitet: 1,5 g/cm<3>, skallviskositet: 30 poise, skallstivhet: 10 Mpa og skalltykkelser: 22, 55, 110,165, 220,330,440,660,880 og 1100 nm.

Resultatene av beregningene for det samlede tilbakespredingstverrsnitt ved den drivende frekvens er vist på figur 1 for det området av PEG-PLGA skalltykkelser som anvendes. Ved de laveste frekvenser øker tverrsnittene tilnærmet som fjerde potens av frekvensen slik det er forventet for små, dvs. Rayleigh tilbakespredere. Ved høyere biomedisinske frekvenser øker den samlede tilbakespredning bare som frekvens til energi 1,5. Ved enda høyere frekvenser flater tilbakespredningsstyrken ut og avtar deretter. Virkningen av økningen av skalltykkelse er å redusere det samlede tilbakespredningstverrsnitt med en verdi tilnærmet lik eller noe større enn den proporsjonale endring i tykkelse. Dermed kan det totale spredningstverrsnitt som oppvises av en suspensjon av innkapslede gassbobler styres ved å variere skalltykkelsen.

Resultatene av beregningene for dempningskoeffisienten som en funksjon av den drivende frekvens ved forskjellige skalltykkelser er vist på figur 2. Virkningen av økning i skalltykkelse er å redusere dempningskoeffisienten med en verdi som er tilnærmet lik eller noe mindre enn den proporsjonale endring i tykkelse. På denne måte kan dempningskoeffisienten styres ved å variere skalltykkelsen.

Det faktum at både det totale spredningstverrsnitt og dempningskoeffisienten øker tilnærmet i forhold til reduksjonen i skalltykkelse synes å vise at variasjonen i skalltykkelse ikke vil ha noen virkning på den totale energi som forventes å bli tilbakespredt til en transduser som sender ut en akustisk bølge i en suspensjon av innkapslede gassbobler. Ved ytterligere betraktninger fra ligning 5 fremgår det imidlertid at suspensjonen av innkapslede gassbobler som har tykkere skall vil oppvise større samlet returnert energi. Dette er vist på figur 3. Årsaken til dette er at mens samlet tilbakespredt energi er direkte proporsjonal med totalt spredningstverrsnitt er den også proporsjonal med det eksponensiale av dempningskoeffisienten. Hvis derfor skalltykkelsen reduseres med en faktor på to vil økningen i samlet spredningstverrsnitt være å øke den samlede energi med tilnærmet to, mens virkningen på dempningen vil være å "øke" den samlede energi med en faktor på eksp(-2) = 1/7,4 for en netto reduksjon på tilnærmet 73%. Den samlede returnerte energi øker når skalltykkelsen økes.

Tilsvarende resultater er forutsagt for mikropartikler som er fremstilt av albumin, som vist på figurene 4-6. De parametre som benyttes for albumin er som beskrevet hos C. Church, J. Acoustical Soc. Amer.. 97(3): 1510-1521 (1995).

Den totale returnerte energi for syntetiske polymermikropartikler (fig. 3) og for albuminmikropartiklene (fig. 6) er for en mikropartikkel fortynningsfaktor på 1/1620. Den optimale skalltykkelse (definert som den tykkelse som skaper et maksimum i total returnert energi ved en dybde på 2 cm inn i en suspensjon av innkapslede gassbobler)vil avhenge av fortynningsgraden for innkapslede gassbobler (dvs. konsentrasjonen av innkapslede gassbobler). Dette er vist på figur 7 for albumin mikropartikler ved en fortynning på 1/5400. Etter hvert som suspensjonen blir fortynnet er det mulig å benytte mikropartikler med tynnere skall. Dette er mulig fordi selv om tynnere skall fører til en større dempning og større spredningsstyrke på en "per boble"-basis vil dette bli opphevet tilstrekkelig ved antallet av partikler til å gi en høyere total returnert energi.

De optimale skalltykkelser for tre fortynningsgrader er oppsummert i den følgende tabell for både albumin og PEG-PLGA mikropartikler.

For bobler hvis størrelses fordeling er forholdsvis stabil in vivo vil valget av optimal skalltykkelse bli basert på den forventede partikkelkonsentrasjon i det målorgan som er av interesse. For å vise hvorledes en skalltykkelse kan velges skal de syntetiske mikropartikler som tidligere er beskrevet behandles. Hvis mikropartiklene blir dosert ved omtrent 0,25 ml/kg og blodvolumet antas å være 50 ml/kg vil mikropartiklene bli fortynnet til 1/200 etter intravenøs injeksjon. I myokardium (hjertemuskulaturen) blir blodbestanddelene 10% av det samlede romvolum og mikropartiklene blir videre fortynnet i rommet med en faktor på 10. På denne måte vil den endelige fortynning være tilnærmet 1/2000. Ved denne fortynning kan den optimale skalltykkelse ekstra-poleres fra de data som er gjengitt i tabellen, og er 200 nm. Dermed vil den optimale tykkelse for bruk som et myokardialt perfusjonsmiddel for disse typer mikropartikler være tilnærmet 200 nm.

Basert på denne informasjon bør tykkere skall benyttes for å optimalisere utformningen av en bestemt mikropartikkelinnkapslende gass, for å redusere dempning og for å maksimere returnert tilbakespredt energi, noe som tillater bruk av høye doser av ultralyd kontrastmidler med minimal dempning. Fremgangsmåte til fremstilling av mikropartikler med den rette veggtykkelse er beskrevet.

II Prosesser og reagenser for fremstilling av mikropartikler med forskjellige skalltykkelser

Slik det benyttes her omfatter uttrykket mikropartikkel mikrokuler og mikrokapsler så vel som mikropartikler hvis det ikke sies noe annet. Mikropartikler kan, men behøver ikke, være kuleformet. Mikrokapsler er definert som mikropartikler med et ytre polymert skall som omgir en kjerne av annet materiale, i dette tilfelle en gass. Mikrokuler er mikropartikler med en bikakestruktur dannet av porer gjennom polymeren eller kombinasjoner av bikakestrukturer eller mikrokapselstrukturer som er fylt med en gass for avbildingsformål som beskrevet nedenfor. Uttrykket "veggtykkelse" eller "polymertykkelse" viser til diameteren for polymeren fra det indre av mikropartikkelen til dens utside. Når det gjelder en mikrokapsel med en hul kjerne vil veggtykkelsen være lik polymertykkelsen. Når det gjelder porøse mikropartikler som har kanaler eller porer i en polymerkule kan veggtykkelsen bli lik halvparten av mikropartikkelens diameter.

Polymerer

Både ikke-bionedbrytbare og bionedbrytbare matriser kan benyttes for mikroinnkapsling av gasser selv om bionedbrytbare matriser er å foretrekke, særlig for intravenøs injeksjon. Ikke-eroderbare polymerer kan benyttes for enteral innføring ved ultralydundersøkelser. Syntetiske eller naturlige polymerer kan anvendes til fremstilling av mikropartiklene. Syntetiske polymerer er å foretrekke på grunn av mer reproduserbar syntese og kontrollert degradering. Polymeren velges basert på den tid som kreves for in vivo stabilitet, med andre ord den tid som kreves for fordeling til det området der

avbildning er ønsket og den tid som kreves for avbildningen.

Representative syntetiske polymerer er: poly(hydroksysyrer) slik som poly(laktisk syre), poly(glykolsyre) og poly(laktisk syre-ko-glykolsyre), polyglykolider, polylaktider, polylaktid ko-glykolid kopolymerer og blandinger, polyanhydrider, polyortoestere, polyamider, polykarbonater, polyalkylener slik som polyetylen og polypropylen, polyalkylenglykoler slik som poly(etylenglykol), polyalkylenoksyder slik som poly(etylenoksyd), polyalkylen-tereftalater slik som poly(etylen-tereftalat), polyvinyl-alkoholer, polyvinyletere, polyvinylestere, polyvinylhalider slik som poly(vinylklorid), polyvinylpyrrolidon, polysiloksan, poly(vinylalkoholer), poly(vinylacetat), polystyren, polyurethaner og ko-polymerer derav, derivatiserte celluloser slik som alkylcellulose, hydroksyalkylcelluloser, celluloseethere, celluloseestere, nitrocelluloser, metylcellulose, etylcellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksy-propylmetylcellulose, hydroksybutylmetylcellulose, celluloseacetat, cellulosepropionat, celluloseacetatbutyrat, celluloseacetatftalat, karboksyletylcellulose, cellulosetriacetat og cellulosesulfatnatriumsalt (samlet betegnet som "syntetiske celluloser"), polymerer av akrylsyre, metaakrylsyre eller kopolymerer eller derivater derav innbefattende estere, poly(metylmetakrylat), poly(etylmetakrylat), poly(butylmetakrylat), poly(isobutylmetakrylat), poly(heksylmetakrylat), poly(isodecylmetakrylat), poly(laurylmetakrylat), poly(fenylmetakrylat), poly(metylakrylat), poly(isopropylakrylat), poly(isobutylakrylat) og poly(oktadecylakrylat) (samlet betegnet her som "polyakrylsyrer"), poly(butyrisk syre), poly(valerisk syre) og poly(laktid-ko-kaprolakton), kopolymerer og blandinger derav. Som benyttet her omfatter "derivater" polymerer med substitusjoner, tilføyelser av kjemiske grupper, for eksempel alkyl, alkylen, hydroksylasjoner, oksydasjoner og andre modifikasjoner som rutinemessig utføres av fagfolk på området.

Eksempler på foretrukne ikke-bionedbrytbare polymerer omfatter etylenvinylacetat, poly(met)akrylsyre, polyamider, kopolymerer og blandinger av disse.

Eksempler på foretrukne bionedbrytbare polymerer omfatter polymerer av hydroksysyrer så som laktisk syre og glykolsyre, polylaktid, polyglykolid, polylaktid-ko-glykolid og kopolymerer med PEG, polyglykolid, poly(orto)estere, polyuretaner, poly(butyrisk syre), poly(valerisk syre), poly(laktisk-ko-kaprolakton), blandinger og kopolymerer av disse.

Eksempler på foretrukne naturlige polymerer omfatter proteiner som for eksempel albumin, hemoglobin, fibrinogen, polyaminosyrer, gelatin, laktoglobulin og prolaminer, for eksempel zein og polysakkarider så som alginat, cellulose og polyhydroksyalkanoater, for eksempel polyhydroksybutyrat. Proteiner kan stabiliseres ved kryssbinding med et middel som for eksempel glutaraldehyd eller vaimedenaturering.

Bioadhesive polymerer av særlig interesse til bruk ved bildedannelse av mukosale flater som i fordøyelsessystemet omfatter polyanhydrider, polyakrylsyre, poly(metylmetakrylater), poly(etylmetakrylater), poly(butylmetakrylat), poly(isobutylmetakrylat), poly(heksylmetakrylat), poly(isodecylmetakrylat), poly(laurylmetakrylat), poly(fenylmetakrylat), poly(metylakrylat), poly(isopropylakrylat) poly(isobutylakrylat) og poly(oktadecylakrylat).

Løsningsmidler

Som definert her er polymerløsningsmiddelet et løsningsmiddel som er flyktig eller har forholdsvis lavt kokepunkt og kan fjernes under vakuum og som er akseptabelt for det menneskelige legemet i spormengder, som for eksempel metylklorid, vann, etylacetat, etanol, metanol, dimetylformamid (DMF), aceton, acetonitril, tetrahydrofuran (THF), eddiksyre og dimetylsulfoksyd (DMSO) eller kombinasjoner av disse. Som regel blir polymeren løst opp i løsningsmiddelet for å danne en polymerløsning med en konsentrasjon på mellom 0,1 og 60% vekt av volumet (v/v), særlig mellom 0,25 og 30%.

Gasser

Enhver bioforenlig eller farmakologisk godtagbar gass kan legges i mikropartiklene. Uttrykket gass viser til enhver forbindelse som er en gass eller er i stand til å danne en gass ved en temperatur da bildedannelsen utføres. Gassen kan bestå av en enkel forbindelse som for eksempel oksygen, nitrogen, xenon, argon, fluorinerte gasser, eller en blanding av forbindelser som for eksempel luft. Fluorinerte gasser er å foretrekke. Eksempler på fluorinerte gasser innbefatter CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SF6, C2F4 og C3F6. Perfluorpropan er særlig å foretrekke siden den er farmakologisk godtagbar. Som regel blir hule luftfylte mikropartikler fremstilt ved de fremgangsmåter som er beskrevet, og luften i mikropartiklene kan byttes ut med enhver av de bioforenlige gasser som er angitt. Gassen blir som regel utvekslet ved å trekke et vakuum på mikropartiklene for å fjerne luften og deretter tilføre en atmosfære av den bioforenlige gass ved bestemt temperatur og trykk. Temperaturen og trykket på gassen som skal utveksles vil avhenge av egenskapene ved mikropartiklene.

Poredannende midler

Poredannende midler kan mikroinnkapsles for å skape innvendige hulrom. Det poredannende middel kan være en væske eller et flyktig eller sublimerbart salt som kan fjernes under mikroinnkapslingen eller kan fjernes etter at mikropartiklene er dannet ved bruk av vakuumtørking eller lyofilisering. Etter at det poredannende middel er fjernet oppstår det innvendig hulrom som kan fylles med den gass som er av interesse. Mer enn ett poredannende middel kan benyttes. Det eller de poredannende midler kan inkluderes i polymeroppløsningen i en mengde på mellom 0,01 og 90 vekt-% for å øke poredannelsen. Ved for eksempel forstøvningstørking kan et poredannende middel som et flyktig salt, for eksempel ammoniumbikarbonat, ammoniumacetat, ammoniumklorid eller ammoniumbenzoat eller annet lyofiliserbart salt innkapsles som faste partikler eller som en oppløsning. Hvis det poredannende middel blir kapslet inn som en oppløsning kan oppløsningen som inneholder det poredannende middel emulsiferes med polymeroppløsningen for å skape små dråper av det poredannende middel i polymeren. Polymeroppløsningen som inneholder partiklene av det poredannende middel eller emulsjonen av oppløsningen av poredannende middel i polymeren blir så forstøvningstørket eller ført gjennom en fordampnings/ekstraheringsprosess for løsningsmiddelet. Etter at polymeren er felt ut kan de herdede mikropartikler fryses og lyofiliseres for å fjerne resten av det poredannende middel eller de herdede mikropartikler kan vakuumtørkes for å fjerne det poredannende middel.

Tilsetnin<g>er for å stabilisere innkapslet gass

Lipider

I alminnelighet er innføring av forbindelser under produksjonen av mikropartiklene, som er hydrofobe og i en effektiv mengde for dermed å begrense inntrengning og/eller opptak av vann av mikropartiklene, effektivt for stabilisering av ekkogeniteten for polymeriske mikropartikler som har innkapslet gass, særlig fluorinerte gasser som perfluorkarboner. Lipider som kan benyttes til å stabilisere gass i polymere mikropartikler omfatter, men er ikke begrenset til de følgende klasser av lipider: fettsyrer og derivater, mono-, di- og triglycerider, fosfolipider, sfingolipider, kolesterol og steroidderivater, terpener og vitaminer. Fettsyrer og derivater av disse kan omfatte, men er ikke begrenset til mettede og umettede fettsyrer, ulikt og likt nummererte fettsyrer, cis- og transisomerer, og fettsyrederivater omfattende alkoholer, estere, anhydrider, hydroksyfettsyrer og prostaglandiner. Mettede og umettede fettsyrer som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til molekyler som har mellom 12 karbonatomer og 22 karbonatomer enten i lineær eller grenet form. Eksempler på mettede fettsyrer som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til lauriske, myristiske, palmitiske og steariske syrer. Eksempler på umettede fettsyrer som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til lauriske, fyseteriske, myristoleiske, palmitoleiske, petroseliniske og oleiske syrer. Eksempler på grenede fettsyrer som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til isolauriske, isomyristiske, isopalmitiske og isosteariske syrer og isoprenoider. Fettsyrederivater inkluderer 12-(((7'-dietylaminokumarin-3-yl)karbonyl)metylamino)-oktadekanoisk syre; N-[ 12-(((7'-dietylaminokumarin-3-yl)karbonyl)metyl-amino)oktadekanoyl]-2-aminopalmitisk syre, N-succinyl-dioleoylfosfatidyletanolamin og palmitoyl-homocystein; og/eller kombinasjoner av dette. Mono, di og triglycerider og derivater av disse som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til molekyler som har fettsyrer og blandinger av fettsyrer mellom 6 og 24 karbonatomer, digalaktosyldiglycerid, 1,2-dioleoyl-sn-glyserol; l,2-dipalmitoyl-sn-3-succinylglyserol; og l,3-dipalmitoyl-2-succinylglyserol.

Fosfolipider som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til fosfatidiske syrer, fosfatidylkoliner med både mettede og umettede lipider, fosfatidyletanolaminer, fosfatidylglyseroler, fosfatidylseriner, fosfatidylinositoler, lysofosfatidylderivater, kardiolipin, og B-acyl-y-alkylfosfolipider. Eksempler på fosfolipider omfatter, men er ikke begrenset til fosfatidylkoliner slik som dioleoylfosfatidylkolin. dimyristoylfosfatidylkolin, dipentadekanoylfosfatidylkolindilauroylfosfatidylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin (DPPC), distearoylfosfatidylkolin (DSPC), diarakioylfosfatidylkolin (DAPC), dibehenoylfosfatidylkolin (DBPC), ditrikosanoylfosfatidylkolin (DTPC), dilignoseroylfosfatidylkloin (DLPC); og fosfatidyletanolaminer slik som dioleoylfosfatidyletanolamin eller l-heksadecyl-2-palmitoylglyserofosfoetanolamin. Syntetiske fosfolipider med asymmetriske acylkjeder

(for eksempel med en acylkjede på 6 karboner og en annen acylkjede på 12 karboner)

kan også benyttes.

Sfingolipider som kan benyttes er ceramider, sfingomyeliner, cerebrosider, gangliosider, sulfatider og lysosulfatider. Eksempler på sfingolipider omfatter, men er ikke begrenset til gangliosidene GM1 og GM2.

Steroider som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til kolesterol, kolesterolsulfat, kolesterolhemisuccinat, 6-(5-kolesterol-3B-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksy-1 -tio-a-D-galaktopyranosid, 6-(5-kolesten-3-B-tloksy)heksyl-6-amino-6-deoksyl-l-tio-ct-D mannopyranosid og kolesteryl(4'-trimetyl 35 ammonio)butanoat.

Ytterligere lipidforbindelser som kan benyttes innbefatter tokoferol og derivater og oljer og derivatiserte oljer slik som stearylamin.

En rekke kationiske lipider som DOTMA, N-[l-(2,3-dioleoyloksy)propyl-N,N,N-trimetylammoniumklorid; DOT AP, l,2-dioleoyloksy-3-(tirmetylammonio)propan; og DOTB, l,2-dioleoyl-3-(4'-trimetyl-ammonio)butanoyl-sn-glyserol kan benyttes.

De mest foretrukne lipider er fosfolipiderm fortrinnsvis DPPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC og særlig DPPC, DAPC og DBPC.

Lipidinnholdet ligger fra ,01-30 (w lipid/w polymer); særlig mellom 0,1-12 (vektforhold lipid/polymer). Lipidene kan tilsettes polymeroppløsningen før dannelsen av mikropartiklene.

Andre hydrofobe forbindelser

Andre foretrukne hydrofobe forbindelser innbefatter aminosyrer som for eksempel tryptofan, tyrosin, isoleucin, leucin og valin, aromatiske forbindelser som et alkylparaben, for eksempel metylparaben og fenolkarbonsyre.

Mikropartikler og fremgangsmåter til fremstillin<g> av disse

I den mest foretrukne utførelse blir mikropartiklene produsert ved forstøvningstørking. Polymeren og det poredannende middel blir atomisert gjennom en dyse og polymerens oppløsningsmidler blir avdampet med en oppvarmet tørkegass. Andre teknikker kan benyttes, som for eksempel ekstrahering av løsningsmiddel, <y>armsmelteinnkapsling og fordampning av løsningsmiddel for å frembringe mikropartikler med en veggtykkelse som har den rette diameter for å optimalisere ekkogenitet. Poredannende midler blir som regel benyttet for å skape de innvendige hulrom. De poredannende midler blir mikroinnkapslet og fjernet etter dannelsen av mikropartikkelen ved lyofilisering eller vakuumtørking. Fordampning av løsningsmiddel er beskrevet av E. Mathiowitz m.fl., J. Scannin<g> Microsco<p>v. 4, 329 (1190); L.R. Beck m.fl., Fertil. Steril.. 31, 545 (1979); og S. Benitam.fl., J. Pharm. Sei.. 73, 1721 (1984). Varm-smelte-mikroinnkapsling er beskrevet av E. Mathiowitz m.fl., Reactive Polvmers. 6,275 (1987).

En rekke overflatemidler kan tilsettes under syntesen av mikropartiklene. Eksempler på emulsifikatorer og overflatemidler som kan benyttes (0,1-5 vekt-%) omfatter de fleste fysiologisk akseptable emulsifikatorer. Eksempler innbefatter naturlige og syntetiske former for gallesure salter eller gallesyrer, både konjugert med aminosyrer og ukonjugerte som taurodeoksykolat og kolsyre.

Mikropartikkelstørrelse

I en foretrukket utførelse for preparering av injiserbare mikropartikler som kan passere gjennom hårrørskarene i lungene bør mikropartiklene ha en diameter på omtrent mellom 1 og 10 mikron. Større mikropartikler kan tilstoppe hårrørskarene i lungene og mindre mikropartikler kan muligens ikke gi tilstrekkelig ekkogenitet. Større mikropartikler er nyttige for medikamenttilførsel på andre måter enn ved injeksjon, for eksempel oralt (for vurdering av fordøyelsessystemet), anvendelse på andre mukosale flater (rektal, vaginal, oral, nasal) eller ved inhalering. Den foretrukne partikkelstørrelse for oral medikamentering er mellom 0,5 mikron og 5 mm. Partikkelstørrelseanalyse kan utføres på en Coulter-teller, ved lysmikroskopi, avsøkende elektronmikroskopi eller transmittans elektronmikroskopi.

Kontroll av veggtykkelse

Den foretrukne veggtykkelse er større enn 20 nm, fortrinnsvis i området mellom 160 og 220 nm opp til omtrent 700 nm. Ved dette punkt begynner fordelen som oppnås ved økende veggtykkelse å falle av. For hver av de mikroinnkapslingsteknikker som tidligere er beskrevet finnes det flere måter hvormed den endelige skalltykkelse for den polymere mikropartikkel kan kontrolleres.

Polvmerkonsentrasjon

Den endelige tykkelse på polymerskallet kan økes ved å øke konsentrasjonen av den polymere fase under innkapslingsprosessen. Dette kan anvendes på syntetiske polymerer eller naturlige polymerer, så som proteiner eller polysakkaridet For en gitt størrelse på små polymerdråper vil bruk av mer konsentrerte polymerløsninger resultere i mer polymer pr. volumenhet av de små dråper og dermed et tykkere skall. Konsentrasjonen av polymer for å oppnå en gitt skalltykkelse vil avhenge først og fremst av polymertypen, polymerløsningsmiddelet, løsbarheten av polymeren i løsningssystemet og den temperatur hvormed innkapslingen utføres. Polymerkonsentrasjoner i området mellom 0,1 og 60% kan benyttes. Foretrukne polymerkonsentrasjoner ligger i området mellom 0,5 og 30%.

Som tidligere beskrevet kan poredannende midler som flyktige eller sublimerbare salter benyttes til produksjon av mikropartikler med innvendige hulrom. Det poredannende middel kan mikroinnkapsles som faste stoffer eller som en vandig oppløsning eller kan være kooppløst i polymeroppløsningen. Når det gjelder faste, poredannende midler vil størrelsen på de faste partikler og mengden av det faste middel som innkapsles bestemme den endelige polymere skalltykkelse. Tynnere skall på mikropartikler vil være resultatet når diameteren på de faste poredannende partikler øker i forhold til polymerens dråpefase eller når vekten av det faste poredannende middel i forhold til polymerens dråpefase økes. Diameteren på de faste poredannende mikropartikler er mellom 1 og 95% av diameteren av polymerens dråpefase. Diameteren på det faste poredannende middel kan justeres til den rette diameter ved bruk av standardteknikker som strålemaling. Vekten av det faste poredannende middel som skal kapsles inn er mellom 1 og 50% (vektforhold til polymer).

Når det gjelder et poredannende middel som løses opp i polymeroppløsningen vil skallkonsentrasjonen bli bestemt av den mengde poredannende middel som kapsles inn. Når den samlede mengde av poredannende middel øker vil den endelige skalltykkelse avta.

For et poredannende middel som blir mikroinnkapslet som en vandig oppløsning vil den endelige polymerskalltykkelse bli bestemt av volumet av poredannende oppløsning som kapsles inn i forhold til polymerfasen, vekten av poredannende middel som er mikroinnkapslet og størrelsen på små dråper av oppløsningen med poredannende middel i forhold til størrelsen på små dråper av polymeren. Den endelige polymerskalltykkelse vil avta når volumforholdet for den poredannende oppløsning økes i forhold til polymerfasen. Volumforholdet for poredannende oppløsning i forhold til polymerfasen er mellom 0,002 og 0,5 med foretrukne forhold i området 0,01 til 0,1. For et gitt volumforhold for det poredannende middel vil polymerens skalltykkelse avta når konsentrasjonen av det poredannende middel i den poredannende oppløsning som skal kapsles inn øker. Vekten av poredannende middel som skal kapsles inn er mellom 1 og 50% (vektforhold til polymer).

Når størrelsen på de små dråper av den poredannende oppløsning som skal innkapsles avtar i forhold til polymeroppløsningen vil skalltykkelsen på den endelige mikropartikkel øke. Størrelsen på de små dråper av den poredannende oppløsning kan styres av den prosess som benyttes til fremstilling av de små dråper. Diameteren på de små dråper av poredannende oppløsning ligger i området mellom 1 og 95% av diameteren på polymeren i dråpefase. Hvis homogenisering benyttes til å frembringe de poredannende små dråper vil hastigheten på homogeniseringen (500-20 000 rpm), tiden for homogeniseringen (0,1-10 minutter), temperaturen på homogeniseringen (4-50°C) og typen på blad (dvs. spaltet hode, kvadratisk hode, sirkulært hode) blir benyttet til å bestemme den endelige størrelse på de små dråper av den poredannende oppløsning. Homogeniseringsbetingelsene justeres for å skape den størrelse som er av interesse for de små dråper. Hvis sonisering benyttes til å frembringe de små dråper av den flytende poredannende oppløsning i de små polymerdråper kan soniseringsprobetypen, tiden på soniseringen (0,1-10 minutter), temperaturen på soniseringen (4-40°C), probefrekvens og probeenergi benyttes til å endre størrelsen på de små dråper.

III Diagnoseanvendelser

Mikropartikler blir som regel kombinert med en farmasøytisk akseptabel bærer som for eksempel fosfat bufret saltholdig stoff eller salt .eller mannitol og deretter blir en tilpasset mengde for påvisning tilført en pasient ved bruk av en hensiktsmessig rute, som regel ved injeksjon i et blodkar (i.v.) eller oralt. Mikropartikler som inneholder et innkapslet bildedannende middel kan benyttes til vaskulær avbildning så vel som på områder for å påvise leversykdommer og nyresykdommer, i kardiologi, til påvisning og karakterisering av tumormasser og vev og ved måling av periferisk blodhastighet. Mikropartiklene kan også knyttes til ligander som reduserer addisjon til vev eller som kan målstyre mikropartiklene til bestemte områder i legemet in vivo som beskrevet ovenfor.

De fremgangsmåter og sammensetninger som er beskrevet ovenfor vil forstås videre med henvisning til de følgende ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1: Produksjon av polymeriske mikropartikler med forbedret ekkogenitet

3,2 g PEG-PLGA (75:25) (IV=0,75 dl/g), 6,4 g PLGA (50:50) (IV=0,4 dl/g) og 384 mg diarakioylfosfatidylkolin ble løst opp i 480 ml metylenklorid. 20 ml av en 0,18 g/ml ammoniumbikarbonatoppløsning ble tilsatt den polymere oppløsning og polymer/saltblandingen ble homogenisert ved 10 000 rpm i 2 minutter ved hjelp av en Virtis homogenisator. Oppløsningen ble pumpet med en strømningshastighet på 20 ml pr. minutt og forstøvningstørket ved bruk av en Buchi Lab forstøvningstørker. Inngangstemperaturen var 40°C og utgangstemperaturen var 20-22°C. Partikkeldiameteren var fra 1-10 mikron ved størrelsesbestemmelse på en Coulter teller med et gjennomsnittlig antall på 2,0 mikron. Avsøkende elektronmikroskopi viste at partiklene var hovedsakelig kuleformet med glatte overflater og fra tid til annen med rundtakket overflate. Mikrokulene ble preparert for transmisjonselektronmikroskopi ved innleiring i LR hvit harpiks fulgt av polymerisering under UV lys. Tynne seksjoner ble skåret på en LKB ultramikrotom ved bruk av en glasskniv og betraktet på et Zeiss EM-10 TEM ved 60kv. Skalltykkelsen på mikropartiklene ligger i området mellom 200 bg 240 nm.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte til økning av ekkogeniteten for mikropartikler med innkapslet gass til bruk ved ultralydavbildning, karakterisert ved at den omfatter: bestemmelse av det området av veggtykkelser for mikropartiklene som resulterer i de største mengder total returnert energi som en funksjon av det materiale som danner mikropartiklene og den gass som skal innkapsles, og fremstilling av mikropartikler med en veggtykkelse i det området som resulterer i de høyeste nivåer for samlet returnert energi.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at mikropartiklene er dannet av en syntetisk polymer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at mikropartiklenes veggtykkelse er mellom 50 og 660 nm.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at mikropartiklene er dannet av en naturlig polymer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den naturlige polymer er et protein og at mikropartiklenes veggtykkelse er mellom 20 og 600 nm.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter reduksjon av dempningen ved økning av mikropartiklenes veggtykkelse.

7. Anvendelse av polymeriske mikropartikler som innkapsler en gass der mikropartiklene er laget av ikke-proteinholdig polymer og hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler som har et bredere område av veggtykkelser der ekkogeniteten for delpopulasjon av mikropartiklene er større enn ekkogeniteten for populasjonen av mikropartikler hvorav delpopulasjonen er utledet, for femstilling av et middel egnet for tilførsel til et subjekt som skal avbildes ved ultralyd.

8. Anvendelse som angitt i krav 7, hvor mikropartiklene er laget av en syntetisk polymer.

9. Anvendelse som angitt i krav 7, hvor mikropartiklene i delpopulasjonen av mikropartikler har veggtykkelse mellom 50 og 660 nm.

10. Anvendelse som angitt i krav 7, hvor mikropartiklene er dannet av en naturlig polymer.

11. Anvendelse som angitt i krav 7, hvor gassen er en fluorinert gass.

12. Anvendelse som angitt i krav 7, hvor den videre omfatter økning av ekkogeniteten ved bestemmelse av mikropartiklenes veggtykkelse ved en særlig fortynningsgrad av de mikropartikler som skal gis til et subjekt.

13. Anvendelse av en blanding av polymeriske mikropartikler som innkapsler en gass der mikropartiklene er laget av de mikropartikler som hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler som har et bredere område for veggtykkelser mellom 20 og 600 nm, der ekkogeniteten for delpopulasjonen av mikropartikler er større enn ekkogeniteten for populasjonen av mikropartikler som delpopulasjonen er utledet fra, for femstilling av et middel egnet for tilførsel til et subjekt som skal avbildes ved ultralyd.

14. Anvendelse som angitt i krav 13, hvor gassen er en fluorinert gass.

15. Blanding til middel egnet for tilførsel til et subjekt som skal avbildes ved hjelp av ultralyd, karakterisert ved at blandingen innbefatter polymeriske mikropartikler som innkapsler en ekkogenisk mengde av bioforenlig gass der mikropartiklene hovedsakelig består av en delpopulasjon av mikropartikler valgt fra en populasjon av mikropartikler som har et bredere område av veggtykkelser der ekkogeniteten for delpopulasjon av mikropartiklene er større enn ekkogeniteten for populasjonen av mikropartikler hvorav delpopulasjonen er utledet.

16. Blanding som angitt i krav 15, karakterisert ved at polymeren er en syntetisk polymer forskjellig fira en blokk-kopolymer av polyetylenglykol og poly(laktid-ko-glykolid).

17. Blanding som angitt i krav 15, karakterisert ved at de polymeriske mikropartikler er laget av en polymer som er valgt fra gruppen bestående av poly(hydroksysyre), polyanhydrider, polyortoestere, polyamider, polykarbonater, polyalkylener, polyvinylalkoholer, polyvinyletere, polyvinylestere, polyvinylhalider, polyvinylpyrrolidon, polysiloksaner, poly(vinylalkoholer), poly(vinylacetat), polystyren, polyuretaner, syntetiske celluloser, polyakrylsyrer, poly(butyrisk syre), poly(valerisk syre) og poly(lactid-ko-kaprolakton), polysakkarider, polyhydroksyalkanoater, kopolymerer og blandinger av disse.

18. Blanding som angitt i krav 15, karakterisert ved at gassen er valgt fra gruppen som består av oksygen, nitrogen, xenon, argon, nitrogen, fluorinerte gasser og luft.

19. Blanding som angitt i krav 18, karakterisert ved at gassen er en fluorinert gass som er valgt fra gruppen bestående av CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SF6, C2F4 ogC3F6.

20. Blanding som angitt i krav 15, karakterisert ved at den hovedsakelig består av mikropartikler med veggtykkelse på mellom 110 og 1100 nm.

21. Blanding som angitt i krav 20, karakterisert ved at mikropartiklene har en veggtykkelse på mellom 110 og 330 nm.