JP2002507214A

JP2002507214A - マイクロカプセル封入ガスのエコー源性を増強し、減衰を抑える方法

Info

Publication number: JP2002507214A
Application number: JP50586099A
Authority: JP
Inventors: チャーチ，チャールズ・シー; バーンスタイン，ハワード; ストローブ，ジュリー・アン; ブラッシュ，ヘンリー・ティー
Original assignee: エイカスフィアー・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2002-03-05
Also published as: CA2294199C; DK0996470T3; EP0996470B1; IL133595A; IL133595A0; HK1029273A1; MY122120A; KR20010014300A; NZ501830A; NO996512L; CN1261809A; CN1268397C; DE69836961D1; BR9810371A; WO1999000149A1; ATE352322T1; PT996470E; TW360521B; NO316614B1; ES2280094T3

Abstract

(57)【要約】天然又は合成ポリマーから形成されたより厚い壁を有する微粒子は、より薄い壁を有する微粒子と比較して、有意に向上したエコー源性を有することを発見した。壁厚の効果は、実験を行って、ならびに最適条件を予測するときに用いる式に代入して決定した。好ましい態様では、ポリマーは生分解性ポリマーであり、壁厚は約１００〜６６０nmであるが、約２０nmから５００nm超の壁厚を用いることができる。画像化される標的臓器に適する直径、例えば血管内投与のために０．５〜８ミクロンの直径、及び胃腸管又は他の管状器官を画像化するための経口投与のために０．５〜５mmの直径を有する微粒子が製造される。好ましいポリマーは、ポリヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸−コ−グリコール酸、ポリ乳酸又はポリグリコリド、最も好ましくは、網内系（ＲＥＳ）による取込みを阻害するポリエチレングリコール又は他の物質と抱合させた前記ポリマーである。微小球は、心臓学用途、血液潅流用途ならびに臓器及び末梢静脈の画像化を含む様々な音波画像化用途で用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】マイクロカプセル封入ガスのエコー源性を増強し、減衰を抑える方法発明の背景本発明は、一般的に、診断用画像化剤の領域に関するものであり、詳しくは、増強されたエコー源性と抑制された減衰を、ポリマー膜の厚さの関数として有する微粒子超音波用画像化造影剤に関するものである。超音波を用いてヒト又は動物の内臓器官及び内臓構造の画像を得る場合、超音波、すなわちヒトの耳で認識することができない高い周波数の音響エネルギー波は、身体を通過するときに反射される。身体組織のタイプが異なれば、超音波も異なるように反射され、異なる内部構造から反射してくる超音波によって生成される反射は、検出され、電気的に変換されて視覚表示される。いくつかの医学的状態では、対象の器官又は構造の有用な画像を得ることは特に難しい。なぜならば、コントラスト増強剤が存在していない条件下における、超音波の反射によって生成される超音波画像では、周囲組織から、対象の構造を充分に認識できないからである。ある種の生理学的病理学的状態の検出及び観察は、対象の器官又は他の構造内に薬剤を注射又は注入することによって超音波像におけるコントラストを増強することによって、実質的に向上させることができる。他の場合では、コントラスト増強剤自体の動きを検出することが特に重要である。例えば、特有な心臓血管の異常から生じることが知られている明瞭な血流パターンは、コントラスト増強剤を血流に注入し、血流の動力学を観察することによってのみ認識することができる。超音波造影剤として有用な物質は、超音波が身体を通過し、反射されるときに、超音波に対して影響を与えることによって作用して画像を創り出し、これにより医学的診断が行われる。異なるタイプの物質は、異なる様式で、異なる程度で超音波に影響を与える。更に、コントラスト増強剤によって引き起こされる効果のある種のものは、他の効果に比べて、容易に測定され、観察される。コントラスト増強剤のための理想的な組成を選択する場合、超音波が身体を通過するときに最も劇的な効果を有する物質が好まれる。また、超音波に対する効果は容易に測定されるべきである。超音波画像で認められる２つの効果としては：後方散乱及びビーム減衰がある。後方散乱：身体を通過する超音波が、構造、例えば器官又は他の身体構造に遭遇すると、当該構造は超音波の一部を反射する。身体中の異なる構造は、異なる様式で、異なる強度で超音波エネルギーを反射する。この反射されたエネルギーは、検出され、超音波が通過した構造の画像を創り出すのに用いられる。「後方散乱」とは、超音波エネルギーが、ある種の物理的性質を有する物質によって、超音波発生源に向かって後方に散乱されることを意味している。超音波画像で観察されるコントラストは、大量の後方散乱を引き起こすことが知られている物質が存在することによって増強されることが長い間認められてきた。そのような物質を身体の特定の部分に対して投与すると、身体のこの部分の画像と、当該物質を含んでいない周囲構造の画像との間のコントラストが増強される。それらの物理的性質の故に、異なる物質は様々な程度で後方散乱を引き起こすことが充分に理解される。したがって、コントラスト増強剤に関する研究は、安定且つ無毒であって、最大量の後方散乱を示す物質に焦点が合わせられてきた。超音波エネルギーの後方散乱を引き起こす物質の能力は、物質の特性、例えばその圧縮性能に左右される。種々の物質を試験する場合、「散乱断面積」として知られている後方散乱を引き起こす物質の能力に関して、１つの特有の尺度を比較することは有用である。特定の物質の散乱断面積は、散乱半径に比例し、また超音波エネルギーの波長と物質の他の物理的性質とにも左右される（J.Ophir an d K.J.Parker,Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound,Ultrasound in Medi cine & Biology,vol.IS,n.4,p.319,323(1989)）。超音波コントラスト増強剤としての種々の物質、すなわちガス、液体、又は固体の有用性を評価する場合、どの薬剤がより大きな散乱断面積を有しているはずであるか、したがって、どの薬剤によって超音波画像において最大のコントラストが提供されるはずであるかを計算することができる。固体粒子の圧縮率は周囲媒体の圧縮率に比べてはるかに低く、また当該粒子の密度はより大きいと仮定することができる。この仮定を用いて、固体粒子コントラスト増強剤の散乱断面積は、１．７５と見積もられた（Ophir and Parker,前掲，p.325）。純粋な液体散乱体のためには、散乱体及び周囲媒体の断熱圧縮率及び密度は、ほぼ同じであり、液体の散乱断面積は０となる。しかしながら、液体は、大量の液剤が存在する場合、いくらかの後方散乱を示すかもしれない。例えば、液剤が、極めて細い血管から、極めて太い血管へと流れて、血管の実質的に全てを占める場合、当該液体は、測定可能な後方散乱を示すかもしれない。にもかかわらず、純粋な液体は比較的散乱の効率が悪いことは当業者は理解している。ガスの散乱断面積は、実質的に異なり、液体又は固体の場合に比べて幾分大きい。その理由は、気泡は、液体又は固体に比べてより高度に圧縮することができるからである。更に、液体中にある遊離気泡は、振動性の挙動を示し、ある周波数においては、気泡は、医学的画像化で普通に用いられる超音波の周波数附近で共鳴する。結果として、気泡の散乱断面積は、その物理的大きさの一千倍を超えることがある。ビーム減衰：ある種のコントラスト増強剤の存在下で観察することができる別の効果は、超音波の減衰である。コントラスト増強剤を含む、組織の又は血液の体積を超音波が通過するとき、超音波の強度は低下する。超音波強度の低下は、コントラスト増強剤による後方散乱、並びにコントラスト増強剤と相互作用するときの超音波の散逸の双方によるものである。ビームが減衰し過ぎると、コントラスト増強剤から遠位の領域から変換器に戻って来る出力は低下して、画像化深度は浅くなる。異なる組織タイプにおけるビーム減衰の差を利用することは、画像強調方法として試みられて来た。画像のコントラストは、ある種の組織タイプ間の局所的な減衰差による従来の画像化で観察されて来た。K.J.Parker and R.C .Wagg,"Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected fro m B-Scan Images,"IEEE Trans.Biomed.Enar.BME 30(8),p.431-37(1983);K.J.Par ker,R.C.Wagg,and R.M.Lerner,"Attenuation of Ultrasound Magnitude and Fre quency Dependence for Tissue Characterization,"Radiology,153(3),p.785-88 (1984)。薬剤の注入前及び注入後に取られた組織領域の減衰の測定値から、強調された画像が得られるかもしれないことが仮定された。しかしながら、液剤のコントラスト強調を測定するための手段としての減衰コントラストに基づく技術は、充分には開発されておらず、たとえ完全に開発されたとしても、当該技術は、この技術を用いることができる内臓器官又は内蔵構造に関して限界があるであろう。例えば、液体造影剤による減衰の損失は、減衰における実質的な差が測定できる前に、任意の血管中に存在している必要がある液体造影剤の体積が大きいので、心臓血管系の画像では観察できないと思われる。要約すると、診断用超音波は、身体の内臓器官に関する情報を得るために用いることができる、強力で非侵襲的な手段である。グレースケール及びカラードップラー画像化の出現は、当該技術の範囲及び分解能を大きく進歩させた。造影剤を作り使用する技術が進歩したので、診断用超音波検査を実施する技術は著しく向上したが、心臓の灌流及び心室、実質臓器、腎臓の灌流、実質臓器の灌流、及びリアルタイム画像化中における血流速度及び血流方向のドップラー信号に関する画像化の分解能を向上させる必要が依然として存在している。超音波造影剤の開発は、遊離気泡としての、又は天然もしくは合成シェル材料中に封入されたガスとしての、生物学的適合性ガスの使用に焦点が合わせられてきた。種々の天然及び合成ポリマーが、ガス、例えば空気を、画像化造影剤として利用するためにカプセルに封入するために用いられてきた。Schneider等Invest.Ra dial.,Vol.27,pp.134-139(1992)には、３ミクロンの空気充填ポリマー粒子が記載されている。これらの粒子は、血漿中及び加圧下で安定であると報告された。しかしながら、２．５MHzでは、それらのエコー源性は低かった。封入された微小気泡懸濁液の別のタイプが、超音波処理されたアルブミンから得られた。Fein stein等J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.11,pp.59-65(1988)。Feinsteinは、in vitroで優れた安定性を有する肺内外経路（transpulmonary passage）に合わせて大きさが適当に決められる微小気泡の調製を記載している。しかしながら、これらの微小気泡は、インビボで寿命が短く、およそ二，三秒という半減期（一循環パスにほぼ等しい）を有している。その理由は、当該気泡は、不飽和液体、例えば血液中に素早く溶解するからである。Wible,J.H.等,J.Am.Soc.Echocardiogr.,Vol.9, pp.442-451(1996)。ゼラチンに封入された気泡は、Carroll等（Carroll.B.A.等. ,Invest.Radial.,Vol.15,pp.260-266(1980)及びCarroll,B.A.等,Radiology,Vol. 143,pp.747-750(1982)）によって記載されているが、それらのサイズが大きいので（１２及び８０μm）、肺の毛細血管を通過しそうに無いと考えられる。また、ゼラチンカプセル封入気泡は、Rasor Associates,Inc .によるＰＣＴ／ＵＳ８０／００５０２にも記載されている。これらは、ゼラチンを「癒着（coalescing）」させることによって形成される。ガラクトースの微結晶によって安定化された空気微小気泡(SHLT 454 and SHU 508)も、Fritzsch,T.等,Invest Radiol.Vol.23(補遺1),pp.302-305(1988);及びF ritzsch,T.等,Invest Radiol.Vol.25(補遺1),pp.160-161(1990)によって報告されている。当該微小気泡は、in vitroで最大１５分まで寿命があるが、インビボでは２０秒未満である。Rovai,D.等,J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.10,pp.125-134(19 87);及びSmith,M.等,J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.13,pp.1622-1628(1989)。フッ素含有材料のシェル内に封入されたガス微小気泡は、Molecular Biosystems,Inc. によるＷＯ９６／０４０１８に記載されている。 Schering Aktiengesellschaftによる欧州特許出願第９０９０１９３３．５号では、超音波画像化のための、マイクロカプセルに封入されたガス又は揮発性液体の調製及び使用が開示されており、当該マイクロカプセルは、合成ポリマー又は多糖類から形成される。Sintetica S.A．による欧州特許出願第９１８１０３６６．４号（０４５８７４５Ａ１）では、宿主動物への注射のために、又は経口投与、経直腸投与、もしくは経尿道投与のために、治療目的もしくは診断目的のために、水性担体中に分散させることができる、界面に付着されたポリマー膜によって結合された空気又はガスマイクロバルーンが開示されている。Delta Biotechnology LimitedによるＷＯ９２／１８１６４では、温度、噴霧速度、粒径、及び乾燥条件に関して厳しく制御された条件下でタンパク質水溶液を噴霧乾燥させることによって微粒子を調製し、画像化で使用するための、その中に閉じ込められたガスを有する中空球体の形成が開示されている。ＷＯ９３／２５２４２では、ポリシアノアクリレート又はポリエステルのシェル内に含まれたガスから成る超音波画像化のための微粒子の合成が記載されている。ＷＯ９２／２１３８２では、ガスを含む共有結合されたマトリックスを含む微粒子造影剤の二次加工が開示されており、ここで、マトリックスは炭水化物である。Ungerによる米国特許第５，３３４，３８１号、第５，１２３，４１４号及び第５，３５２，４３５号では、超音波造影剤として使用するリポソームが記載されており、当該リポソームは、ガス、ガス前駆物質、例えばｐＨ活性化又は光活性化ガス前駆物質、ならびに他の液体又は固体のコントラスト増強剤を含む。NycomedによるＷＯ９５／２３６１５では、ペルフルオロカーボンを含む溶液、例えばペルフルオロカーボンを含むタンパク質溶液のコアセルベーションによって形成される画像化用マイクロカプセルが開示されている。Massachusetts Institute of TechnologyによるＰＣＴ／ＵＳ９４／０８４１６では、その中に封入された画像化剤（例えば空気及びペルフルオロカーボンのようなガスを含む）を有するポリエチレングリコール− ポリ（ラクチド−コ−グリコシド）ブロックポリマーから形成された微粒子が開示されている。現在までに研究された全ての超音波造影剤、例えば遊離気泡又は封入された気泡は、強力な後方散乱体であるが、これらの薬剤はまた、高度に減衰する。減衰が大きいと、造影剤から遠位にある組織像の画像化深度が浅くなり且つ画像が損なわれる。多くの場合、画像化情報は、有意な濃度の造影剤を有する領域、例えば左心室以外は完全に失われることがある。現在研究中の全ての超音波造影剤は、ある程度同じ問題を有している。造影剤の減衰に伴う問題を最小にするために、研究者は、いくつものアプローチを行った。最もしばしば行われたのは、投与する造影剤の量を少なくして、超音波ビームの殆どを、造影剤を通過させる方法である。減衰は抑えられるが、投与量の減少によって、多くの臨床適応に関して最適のコントラストより低くなる。別法として、超音波造影剤を、連続注入して投与することができる。この方法は、薬剤の局所濃度を実質的に低下させ、投与量の減少について先に説明した問題を有する。連続注入は、長い時間にわたってより多くの総投与量を必要とするという更なる短所を有し、臨床上の設定では実施し難い。少ない投与量を補うために、研究者は、高調波画像化（harmonic imaging）を用いて、信号対雑音比を高めた。しかしながら、高調波画像化は、今現在、標準ではない。重要なことに、これらのアプローチは、既存の超音波造影剤の音響特性による基本的問題の修正に取り組んでいない。すなわち、高度のエコー源性を有する超音波造影剤については、造影剤を含む初期領域を超える深さにおいて、受信変換器（receiving transducer）において、対象領域から高い総戻り出力を導き出す散乱体を創製することが必要である。戻り出力は、造影剤の後方散乱と減衰の双方に左右される。したがって、有意に増強されたエコー源性を有する微粒子を提供することが、本発明の目的である。また、高度の後方散乱と低減衰とを有する超音波造影剤を提供することが本発明の別の目的である。発明の概要天然又は合成ポリマーから形成されたより厚い壁を有する微粒子は、より薄い壁を有する微粒子と比較して、有意に増強されたエコー源性と、より低い減衰とを有することが発見された。壁の厚さの効果は、理論的に決定され、最適な壁の厚さが予想された。これらの厚さを有する微粒子を製造した。好ましい態様では、ポリマーは合成生分解性ポリマーであり、壁厚は、５０〜６６０nmであるが、約３０nmから８００nm超の壁厚を用いることができる。シェルの厚さは、画像化される標的組織に左右され、また血液の体積と標的臓器組織の体積との双方に左右される。微粒子は、画像化されるべき標的組織に適する直径、例えば、血管内投与に適する０．５〜８ミクロンの直径、及び胃腸管又は他の管状器官を画像化するための経口投与に適する０．５〜５mmの直径を有するように製造される。好ましいポリマーは、ポリヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸−コ−グリコール酸、ポリラクチド、ポリグリコリド又はポリラクチド−コ−グリコリドである。これらの物質は、網内系（ＲＥＳ）による取込みを阻害するポリエチレングリコール又は他の物質とコンジュゲートさせることができる。微小球は、心臓学用途、血液潅流用途ならびに臓器及び末梢静脈の画像化を含む様々な超音波画像化用途で用いることができる。図面の簡単な説明図１は、１／１６２０希釈における合成ポリマーマイクロカプセル封入オクタフルオロプロパンの代表粒度分布に関して、単位体積当たりの総散乱断面積に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚１１０nm及び０．００３４％Ｃ₃Ｆ₈（総ガス体積分率）、１６５nm及び０．００３２％Ｃ₃Ｆ₈、２２０nm及び０．００２９％Ｃ₃Ｆ₈、３３０nm及び０．００２５％Ｃ₃Ｆ₈、４４０nm及び０．００２１％Ｃ₃Ｆ₈、６６０nm及び０．００１５％Ｃ₃Ｆ₈、８８０nm及び０．００１０％Ｃ₃Ｆ₈、及び１１００nm及び０．０００７％Ｃ₃Ｆ₈を想定している。図２は、１／１６２０希釈における合成ポリマーマイクロカプセル封入オクタフルオロプロパンの代表粒度分布に関して、音響減衰係数に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚１１０nm及び０．００３４％Ｃ₃Ｆ₈、１６５nm及び０．００３２％Ｃ₃Ｆ₈、２２０nm及び０．００２９％Ｃ₃Ｆ₈、３３０nm及び０．００２５％Ｃ₃Ｆ₈、４４０nm及び０．００２１％Ｃ₃Ｆ₈、６６０nm及び０．００１５％Ｃ₃Ｆ₈、８８０nm及び０．００１０％Ｃ₃ Ｆ₈、及び１１００nm及び０．０００７％Ｃ₃Ｆ₈を想定している。図３は、１／１６２０希釈における合成ポリマーマイクロカプセル封入オクタフルオロプロパンの代表粒度分布に関して、エコー源性（単位体積当たりの総戻り出力）に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚１１０nm及び０．００３４％Ｃ₃Ｆ₈、１６５nm及び０．００３２％Ｃ₃ Ｆ₈、２２０nm及び０．００２９％Ｃ₃Ｆ₈、４４０nm及び０．００２１％Ｃ₃Ｆ₈ 、及び６６０nm及び０．００１５％Ｃ₃Ｆ₈を想定している。図４は、１／１６２０希釈における天然ポリマーマイクロカプセル封入空気の代表粒度分布に関して、単位体積当たりの総散乱断面積に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚４０nm及び０．００２１％空気（総ガス体積分率）、８０nm及び０．００２０％空気、１５０nm及び０．００１９％空気、３００nm及び０．００１７％空気、６００nm及び０．００１３％空気、及び９００nm及び０．００１０％空気を想定している。図５は、１／１６２０希釈における天然ポリマーマイクロカプセル封入空気の代表粒度分布に関し、音響減衰係数に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚４０nm及び０．００２１％空気、８０nm及び０．００２０％空気、１５０nm及び０．００１９％空気、３００nm及び０．００１７％空気、６００nm及び０．００１３％空気、及び９００nm及び０．００１０％空気を想定している。図６は、１／１６２０希釈における天然ポリマーマイクロカプセル封入空気の代表粒度分布に関して、エコー源性（単位体積当たりの総戻り出力）に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚４０nm及び０．００２１％空気、８０nm及び０．００２０％空気、１５０nm及び０．００１９％空気、３００nm及び０．００１７％空気、６００nm及び０．００１３％空気、及び９００nm及び０．００１０％空気を想定している。図７は、１／５４００希釈における天然ポリマーマイクロカプセル封入空気の代表粒度分布に関して、エコー源性に関する壁厚効果の計算値を、音響周波数の関数として示したグラフであり、壁厚１５nm及び０．０００６％空気、４０nm及び０．０００６％空気、８０nm及び０．０００６％空気、１５０nm及び０．０００６％空気、１５０nm及び０．０００６％空気、及び３００nm及び０．０００５％空気を想定している。発明の詳細な説明エコー源性を、天然又は合成ポリマー微粒子の壁厚の関数として最大化する方法を説明する。微粒子は、様々な診断用超音波画像化用途において、特に、血管画像化及び超音波心臓検査法のような超音波手順において有用である。より薄い壁を有する同じ天然又は合成ポリマー微粒子と比較した場合、壁厚が増すと、エコー源性は有意に増大する。Ｉ．最適なポリマー厚の計算診断用超音波に対する、カプセルに封入された微小気泡の応答に関してより深く理解するために、数学的モデル（C.Church J.Acoustical Soc.Amer.97(3):151 0-1521,1995）を用いて、例えばカプセル化シェルの厚さ及び剛性のような物理パラメーターの値に対して、例えば後方散乱及び減衰係数のような重要な量を計算した。当該シェルは、天然又は合成物質であることができる。当該モデルは、連続した非圧縮性の減衰された弾性固体として、集団挙動する、シェルによってカプセルに封入された球状気泡の場合、（非線形）レイリー・プレセット型方程式（Rayleigh-Plesset-like equation）から成る。ここでは、この方程式に対する分析的解答（最も低い順に第１および第２の高調波成分を含む）を用いて、散乱断面積（カプセル封入気泡によって散乱された出力の、入射音響ビーム強度に対する割合）と、カプセル封入気泡の懸濁液の減衰係数（気泡がビームから音響エネルギーを除去する割合）とに対するシェル厚の効果を評価する。次に、これらの量記号を用いて、カプセル封入気泡の懸濁液から、入射パルスを放射している超音波変換器への総戻り出力を評価する。入射音響圧力波に対するカプセル封入気泡の応答を記述しているレイリー・プレセット型方程式は：［式中、Ｒ₁はガスで充填された空洞の半径、Ｕ₁は界面１（内部ガスとカプセル固体との間の界面）の半径方向速度、Ｒ₂はカプセル材料の外径、ρ_Lは気泡を取り囲んでいる液体の密度、ρ_Lはカプセルシェルの密度、Ｐ_G,eqは気泡内の平衡ガス圧、Ｒ_o1はガスで充填された空洞の初期半径、Ｐ_∞（ｔ）は無限大での圧力（音響駆動圧を含む）、σ₁及びσ₂はそれぞれガス−シェル界面及びシェル−液体界面における界面張力、μ_s及びμ_Lはそれぞれシェル及び周囲液体の有効粘度、Ｖ_s＝Ｒ₂ ³−Ｒ₁ ³、Ｇ_sはシェルの剛性、及びＲ_e1はガスーシェル界面の無歪平衡位置（unstrained equilibrium position）である］である。カプセルに封入された気泡の散乱断面積δ_S1に関する式は、拍動振幅Ｒ_o1ｘ（ｔ）が小さいと仮定し、Ｒ₁＝Ｒ_o1（１＋ｘ）および関連する式をChurch(1995)の方程式（１）に代入することによって、導き出すことができる。得られた方程式（２）は：［式中、ωは入射音波の（半径方向）周波数、ω₀はカプセル封入気泡の共鳴周波数、及びδ_dはカプセル封入気泡の減衰定数である］であり；断面積の典型的な単位を方程式の後に括弧で示してある。方程式（２）は、一つのカプセル封入気泡の応答が問題になっている場合に適する。診断用超音波では、何百万のカプセル封入気泡から成る懸濁液の応答が問題になることが普通である。ある範囲のサイズを有するカプセル封入気泡の集合が存在している場合、単位体積当たりの総散乱断面積は、懸濁液の典型的な体積中に存在する各カプセル封入気泡の寄与を単純に合計することによって評価することができる：上記式中において、ｆ(Ｒ_o1)ｄＲ_o1は、単位体積当たりのＲ_o1とＲ_o1＋ｄＲ_o1の間の半径を有する、カプセル封入気泡の数である。懸濁液の減衰係数は、K.W.Co mmander及びA.Prosperetti,"Linear pressure waves in bubbly liqulds:Compar ison between theory and expenments,"J.Acoust.Soc.Amer 85(2):732-746(1989 )による方法で評価することができる。平均圧力、密度、速度などに関して気泡媒体を記述することによって、これらの著者は、懸濁液中における音の複合速度ｃ_mに関する式を導いた。カプセル封入気泡の場合は、である。上記式中において、係数８．６８６は、ネーパーをデシベルに変換するのに必要である。方程式（３）及び（４）を組合せて、戻り出力に関する以下の関係：（式中、ｘは、変換器とサンプル体積との間の距離であり、係数Ｇは、変換器口径、変換器とサンプル体積との間の距離、及び受信変換器における各気泡から散乱された球面波によって切り取られた立体角を含む追加の幾何学的係数を表している）を得ることができる。これらの結果を利用するために、カプセル封入気泡粒度分布を提供し、当該モデルで用いられる物理的パラメーターに関する値を評価する必要がある。２つの場合が考えられる。第一は、ポリエステルから製造された合成微粒子に関するものであり、第二は、アルブミンから製造された微粒子に関するものである。ここで用いられる合成粒子に関する粒度分布は、１９９６年７月２９日に出願された米国特許出願第０８／６８１，７１０号（その教示を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されているように、噴霧乾燥によって製造されたＰＬＧＡ− ＰＥＧ微粒子に関して測定されたものである。Coulter Multisizer（登録商標）分析によって測定された、この分布を特徴付ける集団パラメータの値は:総濃度：２．４ｘ１０⁹粒子/mL、数平均直径：２．２μm、体積平均直径：４．６μm及びガス体積分率６．５％である。以下に示した計算は、１／１６２０の希釈率を仮定して行った。対応濃度は４．４ｘ１０⁶粒子/mLであるが、ガス体積分率は約０．０１％であった。当該モデルで用いたパラメーターに関する値は：内部ガス：ペルフルオロプロパンについて適当な値、外部液体：水について適当な値、シェル密度：１．５g/cm³、シェル粘度：３０ポアズ、シェル剛性：１０MPa及びシェル厚：２２，５５，１１０，１６５，２２０，３３０，４４０，６６０，８８０及び１１００nmである。駆動周波数における総散乱断面積に関する計算結果は、用いたＰＥＧ−ＰＬＧＡシェル厚の範囲に関して図１に示してある。最低周波数では、断面積は、小さい散乱体、すなわちレイリー散乱体について予期されるように、おおよそ周波数の４乗で増加する。より高い生物医学的周波数では、総散乱断面積は、周波数のほんの１．５乗のみしか増加しない。更に高い周波数では、散乱強度は、安定状態に達してから減少する。シェル厚が増加すると、厚さの比例変化とほぼ等しい量又は幾分それを超える量だけ、総散乱断面積が減少する。すなわち、カプセル封入気泡の懸濁液によって示される総散乱断面積は、シェル厚を変化させることによって調節することができる。減衰係数を、異なるシェル厚において、駆動周波数の関数として計算した結果は、図２に示してある。シェル厚が増加すると、厚さの比例変化とほぼ等しい量又は幾分それを超える量だけ、減衰係数が減少する。すなわち、減衰係数は、シェル厚を変化させることで調節することができる。総散乱断面積及び減衰係数の双方が、シェル厚の減少にほぼ比例して増加するという事実は、カプセル封入気泡懸濁液中に音波を放射する変換器へと後方散乱されることが予期される総出力に関して、シェル厚の変化は何らの効果も及ぼさないことを示していると考えられる。しかしながら、方程式５から更に考慮すると、より厚いシェルを有するカプセル封入気泡の懸濁液は、より大きな総戻り出力を示すことは明らかである。それは図３に示してある。その理由は、総後方散乱出力は、総散乱断面積に直接比例するので、減衰係数の指数関数にも比例するからである。したがって、シェル厚が２分の１に減少する場合、総散乱断面積が増加すると、総出力が約２倍増加し、減衰の効果は、約７３％の正味の減少に関して、約exp（−２）＝１／７．４だけ総出力を「増加」させるであろう。総戻り出力は、シェル厚が増加すると、増加する。同様な結果は、図４−６に示してあるように、アルブミンから製造される微粒子に関しても予測される。アルブミンで用いられるパラメータ一は、C.Church,J .Acoustical Soc.Amer.,97(3):1510-1521(1995)で開示されている。合成ポリマー微粒子（図３）及びアルブミン微粒子（図６）に関する総戻り出力は、１／１６２０の微粒子希釈率の場合である。最適なシェル厚（カプセル封入気泡の懸濁液中に２cmの深さで、最大の総戻り出力を与える厚さとして定義される）は、カプセル封入気泡の希釈（すなわち、カプセル封入気泡の濃度）に左右されるであろう。このことは、希釈率１／５４００のアルブミン微粒子に関して図７に示してある。懸濁液を希釈する場合、より薄いシェルを有する微粒子を用いることができる。これは、シェルがより薄くなることによって、「気泡１つ当たり」を基準として、減衰及び散乱強度がより大きくなるからであり、これは、微粒子の数によって充分に相殺されて、より高い総戻り出力を与える。３つの希釈率に関する最適シェル厚は、アルブミン及びＰＥＧ−ＰＬＧＡ微粒子の双方について以下の表に要約してある。粒度分布が、インビボで比較的安定な気泡に関しては、最適シェル厚の選択は、対象となる標的臓器において予期される粒子濃度に基づくと考えられる。シェル厚を選択する方法を説明するために、先に説明した合成微粒子を考える。微粒子が約０．２５mL/kgで投与され、血液量（blood volume）が５０mL/kgであると仮定される場合、微粒子は、静脈注射後に１／２００まで希釈されると考えられる。心筋層では、血液は総区画容積の１０％を構成し、微粒子は、当該区画内で、１０分の１まで更に希釈される。すなわち、最終希釈率は、約１／２０００であると考えられる。この希釈では、最適シェル厚は、表中のデータから外挿することができ、これは２００nmである。すなわち、これらのタイプの微粒子のための心筋潅流剤として用いるのに最適な厚さは、約２００nmである。この情報に基づき、減衰を最小にし、戻り後方散乱出力を最大にして、高投与量の超音波造影剤を最少の減衰で用いることができるように、より厚いシェルを用いて、特定の微粒子カプセル封入ガスの設計を最適化すべきである。適当な壁厚を有する微粒子を製造する方法を開示する。ＩＩ．異なるシェル厚を有する微粒子を製造するための方法及び試薬本明細書で用いるとき、微粒子という用語は、特に断りがない場合は、微小球及びマイクロカプセル、ならびに微粒子を含む。微粒子は、形状は球形であってもよく、あるいは球形でなくてもよい。マイクロカプセルは、別の材料、この場合はガスのコアを取り囲むポリマー外殻を有する微粒子と定義される。微小球は、下記のように画像化目的のためのガスで充填されている、ポリマーを貫通している細孔によって形成されるハニカム構造を有する、又はハニカム構造もしくはマイクロカプセル構造の組合せを有する微粒子である。「壁厚」又は「ポリマー厚」という用語は、微粒子の内部から外部までのポリマーの直径を表す。中空のコアを有するマイクロカプセルの場合では、壁厚は、ポリマー厚に等しい。ポリマー球中に水路又は細孔を有する多孔質微粒子の場合では、壁厚は、微粒子の直径の１／２に等しい。ポリマー非生分解性マトリックス及び生分解性マトリックスの双方を、ガスをマイクロカプセルに封入するために用いることができるが、生分解性マトリックスが特に静脈注射用には好ましい。非食用ポリマーは、経腸的に投与される超音波用途で用いることができる。合成又は天然のポリマーを用いて、微粒子を二次加工することができる。より再現可能な合成及び制御された分解のため、合成ポリマーが好ましい。当該ポリマーは、インビボ安定性に関して要求される時間、別の言い方をすれば、画像化が望まれる部位への分散に要する時間、及び画像化に要する時間に基づいて選択される。代表的な合成ポリマーは：ポリ（ヒドロキシ酸）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、及びポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリラクチド−コ−グリコリドコポリマー及び配合物、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えばポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えばポリ（エチレングリコール）、ポリアルキレンオキシド、例えばポリ（エチレンオキシド）、ポリアルキレンテレフタレート、例えばポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、例えばポリ（ビニルクロリド）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリスチレン、ポリウレタン及びそれらのコポリマー、誘導セルロース、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートプチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、及びセルロース硫酸ナトリウム塩（本明細書では纏めて「合成セルロース」と呼ぶ）、アクリル酸のポリマー、メタクリル酸のポリマー、又はそれらのコポリマーもしくはエステルを含むそれらの誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）（本明細書では纏めて「ポリアクリル酸」と呼ぶ）、ポリ（ブチル酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、それらのコポリマー及びそれらの配合物である。本明細書で用いる場合、「誘導体」は、化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換及び付加を有するポリマー、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって日常的に行われる他の改質を有するポリマーを含む。好ましい非生分解性ポリマーとしては、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ（メト）アクリル酸、ポリアミド、それらのコポリマー及び混合物が挙げられる。好ましい生分解性ポリマーの例としては、乳酸及びグリコール酸のようなヒドロキシ酸のポリマー、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド−コ−グリコリド、及びＰＥＧとのコポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルソ）エステル、ポリウレタン、ポリ（ブチル酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、それらの配合物及びコポリマーが挙げられる。好ましい天然ポリマーの例としては、タンパク質、例えばアルブミン、ヘモグロビン、フィブリノゲン、ポリアミノ酸、セラチン、ラクトグロブリン及びプロラミン、例えばゼイン、及び多糖類、例えばアルギン酸塩、セルロース及びポリヒドロキシアルカノエート、例えばポリヒドロキシブチレートが挙げられる。タンパク質は、例えばグルタルアルデヒドのような薬剤との架橋、又は熱変性によって安定化させることができる。胃腸管のような粘膜表面の画像化で用いる特別の関心が集まっている生体接着剤ポリマーとしては、ポリ無水物、ポリアクリル酸、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）が挙げられる。溶媒本明細書で定義されるように、ポリマー溶媒は、揮発性であるか、又は比較的低い沸点を有するか、又は真空下で除去できる溶媒であり、また極微量でヒトに投与するのに許容できる溶媒であって、例えばメチレンクロリド、水、エチルアセテート、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、又はそれらの組合せである。一般的に、ポリマーを、溶媒中に溶かして、重量対体積比（ｗ／ｖ）で０．１％〜６０％、更に好ましくは０．２５％〜３０％の濃度を有するポリマー溶液を調製する。ガス任意の生物学的適合性ガス又は薬理学的に許容できるガスを、微粒子の中に入れることができる。ガスという用語は、画像化が行われる温度で、ガスであるか、又はガスを形成することができる任意の化合物を指している。当該ガスは、酸素、窒素、キセノン、アルゴン、窒素、フッ化ガスのような単一化合物、又は空気のような化合物の混合物から構成することができる。好ましくはフッ化ガスである。フッ化ガスとしては、例えばＣＦ₄，Ｃ₂Ｆ₆，Ｃ₃Ｆ₈，Ｃ₄Ｆ₈，ＳＦ₆，Ｃ₂ Ｆ₄及びＣ₃Ｆ₆が挙げられる。ペルフルオロプロパンは、薬理学的に許容できるので特に好ましい。典型的には、中空空気充填微粒子は、開示した方法で製造され、微粒子内にある空気は、開示した生物学的適合性ガスの任意のガスと交換することができる。当該ガスは、典型的には、微粒子に真空下に置いて空気を除去し、次に、特定の温度及び圧力で生物学的適合性ガスの雰囲気を施用することによって交換される。交換されるガスの温度及び圧力は、微粒子の特性に左右される。増孔剤増孔剤（pore forming agent）をマイクロカプセル封入して、内部空隙を導入することができる。増孔剤は、マイクロカプセル封入中に除去することができるか、又は微粒子を形成した後に真空乾燥もしくは凍結乾燥を用いることによって除去することができる、液体の又は揮発性の又は昇華性の塩であることができる。増孔剤の除去後に、目的とするガスで充填できる内部空隙が創製される。２種類以上の増孔剤を用いても良い。増孔剤(一種又は複数種)は、体積対重量比で０．０１％〜９０％の量でポリマー溶液中に含ませて、細孔形成を増加させることができる。例えば、噴霧乾燥、すなわち溶媒蒸発では、揮発性塩のような増孔剤、例えば重炭酸塩アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は安息香酸アンモニウム、又は他の凍結乾燥可能な塩を、固体粒子として又は溶液として、カプセルに封入することができる。増孔剤を溶液としてカプセルに封入する場合、増孔剤を含む溶液を、ポリマー溶液と一緒に乳化させて、ポリマー中に増孔剤の液滴を創製する。次に、増孔剤の粒子を含むポリマー溶液、又はポリマー中の増孔剤溶液の乳濁液を、噴霧乾燥させるか又は溶媒蒸発／抽出法によって取り出す。ポリマーが沈殿したら、硬化した微粒子を凍結及び凍結乾燥させて、残留増孔剤を除去しても良く、又は硬化した微粒子を真空乾燥させて、増孔剤を除去しても良い。カプセル封入されたガスを安定化する添加剤脂質一般的に、微粒子の製造中に、疎水性である化合物を、微粒子による水の浸透及び／又は取込みを制限するのに有効な量で混和することは、その中に封入されたガス、特にペルフルオロカーボンのようなフッ化ガスを有するポリマー微粒子のエコー源性を安定化するのに有効である。ポリマー微粒子の内側にあるガスを安定化するのに用いることができる脂質としては、限定するものではないが、次に示す種類の脂質：すなわち、脂肪酸及び誘導体、モノ−、ジ及びトリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール及びステロイド誘導体、テルペン及びビタミンが挙げられる。脂肪酸及びそれらの誘導体としては、飽和及び不飽和脂肪酸、奇数及び偶数脂肪酸、シス及びトランス異性体、及びアルコール、エステル、無水物を含む脂肪酸誘導体、ヒドロキシ脂肪酸及びプロスタグランジンが挙げられるが、これらに限定されない。用いることができる飽和及び不飽和脂肪酸としては、線状又は枝分れ形態の１２〜２２個の炭素原子を有する分子が挙げられるが、これらに限定されない。用いることができる飽和脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。用いることができる不飽和脂肪酸としては、例えばラウリン酸、フィセテレイン酸（physeteric acids）、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸（petroselinic acids）、及びオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。用いることができる枝分れ脂肪酸としては、イソラウリル酸、イソミリスチル酸、イソパルミチン酸、及びイソステアリン酸及びイソプレノイドが挙げられるが、これらに限定されない。脂肪酸誘導体としては、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ］オクタデカノイル）−２ −アミノパルミチン酸、Ｎ−スクシニル−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びパルミトイル−ホモシステイン；及び／又はそれらの組合せが挙げられる。用いることができるモノ、ジ及びトリグリセリド又はそれらの誘導体としては、脂肪酸を有する分子、又は６〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸の混合物、ジガラクトシルジグリセリド、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；及び１，３− ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。用いることができるリン脂質としては、ホスファチジン酸、飽和及び不飽和脂質を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジル誘導体、カルジオリピン、及びβ−アシル−ｙ−アルキルリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の例としては、ホスファチジルコリン、例えばジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリンジラウロリルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジビヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）；及びホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン又は１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。不斉アシル鎖（例えば、６個の炭素原子から成る１つのアシル鎖、及び１２個の炭素原子から成るもう１つのアシル鎖）を有する合成リン脂質を用いることもできる。用いることができるスフィンゴ脂質としては、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、ガングリオシド、スルファチド及びリソスルファチドが挙げられる。スフィンゴ脂質としては、例えばガングリオシドＧＭ１及びＧＭ２が挙げられるが、これらに限定されない。用いることができるステロイドとしては、コレステロール、コレステロールスルフェート、コレステロールヘミスクシネート、６−（５−コレステロール−３ β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−チロキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド及びコレステリー）４’−トリメチル３５アンモニオ）ブタノエートが挙げられるが、これらに限定されない。用いることができる更なる脂質化合物としては、トコフェロール及び誘導体、及びオイル、例えばステアリルアミンのような誘導化オイルが挙げられる。様々なカチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＴＡＰ、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン；及びＤＯＴＢ、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎグリセロールを用いることができる。最も好ましい脂質は、リン脂質であり、好ましくはＤＰＰＣ，ＤＡＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＴＰＣ，ＤＢＰＣ，ＤＬＰＣであり、最も好ましくはＤＰＰＣ，ＤＡＰＣ及びＤＢＰＣである。脂質含量は、０．０１〜３０（脂質重量／ポリマー重量）であり；最も好ましくは０．１〜１２（脂質重量／ポリマー重量）である。脂質は、微粒子の形成前に、ポリマー溶液に対して加えることができる。他の疎水性化合物他の好ましい疎水性化合物としては、例えばトリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン及びバリンのようなアミノ酸、例えばアルキルパラベンのような芳香族化合物、例えばメチルパラベン及び安息香酸が挙げられる。微粒子及びそれらを製造する方法最も好ましい態様では、微粒子は、噴霧乾燥によって製造される。ポリマー及び増孔剤を、ノズルから噴霧化し、ポリマー溶媒を、加熱された乾燥ガスによって除去する。例えば溶媒抽出、ホットメルトカプセル封入、及び溶媒蒸発のような他の技術を用いて、エコー源性を最適化する適当な直径の壁厚を有する微粒子を製造することができる。典型的には、増孔剤を用いて、内部空隙を創り出す。増孔剤は、マイクロカプセルに封入し、凍結乾燥又は真空乾燥による微粒子の形成後に、除去する。溶媒蒸発は、E.Mathlowitz等,JScannin Microsco,4,329(199 0);L.R.Beck等,Fertil.Steril.,31,545(1979);及びS.Benita等,J.Pharm.Sci.,73 ，1721(1984)に記載されている。ホットメルトマイクロカプセル封入は、E.Math iowitz等,Reactive Polmers,6,275(1987)に記載されている。微粒子の合成中に、様々な界面活性剤を加えても良い。用いることができる( ０．１重量％〜５重量％)典型的な乳化剤又は界面活性剤としては、最も生理学的に許容できる乳化剤が挙げられる。例としては、アミノ酸と抱合している及び抱合していない胆汁酸塩又は胆汁酸の天然又は合成形態、例えばタウロデオキシコレート、及びコール酸が挙げられる。微粒子サイズ肺毛細管床（pulmonary capillary bed）を通過できる注射可能な微粒子を調製する好ましい態様では、当該微粒子は、約１〜１０ミクロンの直径を有しているべきである。それよりも直径が大きくなると、肺床を閉塞し、逆に小さくなると、充分なエコー源性を提供しないかもしれない。より大きい微粒子は、注射以外の経路、例えば経口（胃腸管を評価するため）、他の粘膜表面（直腸、腟、口、鼻）に対する施用、又は吸入法によって投与するのに有用である。経口投与に好ましい粒径は約０．５ミクロン〜５mmである。粒径分析は、光学顕微鏡法、走査型型電子顕微鏡法、又は透過型電子顕微鏡法によって、クールター計数器（Co ulter counter）を用いて行うことができる。壁厚の調節壁厚は、好ましくは２０nm超であり、更に好ましくは１６０〜２２０nm、最大約７００nmまでであり、７００nmを超えると、壁厚が増加することによって得られる利点は少なくなっていく。上記したマイクロカプセル封入技術のそれぞれに関して、ポリマー微粒子の最終シェル厚を調節することができる幾つもの方法がある。ポリマー濃度ポリマーシェルの最終厚は、カプセル封入プロセス中に、ポリマー相の濃度を増加させることによって厚くすることができる。この方法は、タンパク質又は多糖類のような合成ポリマー又は天然ポリマーに対して施用することができる。任意のポリマー液滴サイズに関して、より濃縮されたポリマー溶液を用いると、液滴の単位体積当たりのポリマー濃度が増加するので、より厚いシェルが得られる。任意のシェル厚を得るためのポリマー濃度は、主として、ポリマータイプ、ポリマー溶媒、溶媒システムにおけるポリマーの溶解度、カプセル封入が行われる温度に左右される。０．１％〜６０％のポリマー濃度を用いることができる。好ましいポリマー濃度は０．５％〜３０％である。上記したように、揮発性の塩又は昇華可能な塩のような増孔剤を用いて、内部空隙を有する微粒子を製造することができる。増孔剤は、固体として、もしくは水溶液としてマイクロカプセル封入しても良く、又はポリマー溶液中に一緒に溶かすことができる。固体増孔剤の場合、固体粒子のサイズ及びカプセル封入された固体薬剤の量によって、最終のポリマーシェル厚は支配される。固体増孔粒子の直径がポリマー液滴相と比較して増加すると、又は固体増孔剤の重量がポリマー液滴相と比較して増加すると、マイクロカプセル封入シェルはより薄くなる。固体増孔微粒子の直径は、ポリマー液滴相の直径の１％〜９５％である。ジェットミルのような標準的な技術を用いて、固体増孔剤の直径を調整して、適当な直径にすることができる。カプセル封入される固体増孔剤の重量は１％〜５０％（ｗ／ｗポリマー）である。ポリマー溶媒中に溶解される増孔剤の場合、シェル濃度は、カプセル封入される増孔剤の量に支配される。増孔剤の総量が増加すると、最終シェル厚は薄くなる。水溶液としてマイクロカプセルに封入された増孔剤の場合は、最終ポリマーシェル厚は、ポリマー相に対するカプセル封入された増孔溶液の体積、マイクロカプセルに封入された増孔剤の重量、及びポリマー液滴サイズに対する増孔剤溶液の液滴サイズによって支配される。増孔溶液の体積比がポリマー相に対して増加すると、最終ポリマーシェル厚は薄くなる。細孔形成溶液のポリマー相に対する体積比は、０．００２〜０．５であり、好ましくは０．０１〜０．１である。増孔剤の任意の体積比に関して、カプセル封入される増孔溶液における増孔剤の濃度が増加すると、ポリマーシェル厚は薄くなる。カプセル封入される増孔剤の重量は、１％〜５０％（ｗ／ｗポリマー）である。ポリマー溶液に対する、カプセル封入される増孔溶液の液滴サイズが小さくなると、最終微粒子のシェル厚は厚くなる。増孔溶液の液滴サイズは、当該液滴を創製するのに用いられる方法によって調節することができる。増孔溶液液滴の直径は、ポリマー液滴相の直径の１％〜９５％である。均質化を用いて増孔液滴を創製する場合、均質化の速度（５００〜２０，０００回転／分）、均質化の時間（０．１〜１０分）、均質化の温度（４℃〜５０℃）及び用いるブレードのタイプ（すなわち、スロッテッドヘッド（slotted head）、スクウェアヘッド（square head）、サーキュラーヘッド（circular head））全てによって、最終増孔溶液液滴サイズが支配される。均質化条件を調整して、所望の液滴サイズを創製する。音波処理を用いてポリマー液滴中に液体増孔溶液の液滴を創り出す場合、音波処理プローブのタイプ、音波処理の時間（０．１〜１０分）、音波処理の温度（４℃〜４０℃）、プローブ周波数（probe frequency）及び音波処理出力の全てを用いて、液滴サイズを変えることができる。ＩＩＩ．診断用途典型的には、微粒子を、薬学的に許容できる担体、例えば燐酸塩緩衝生理食塩水又は生理食塩水又はマンニトールと混合し、次に、検出するのに有効な量を適当な経路によって、典型的には血管への注射（i.v.）もしくは経口によって患者に投与する。カプセルに封入された画像化剤を含む微粒子は、血管の画像化で、ならびに肝臓疾患及び腎臓疾患を検出する用途で、心臓病学用途で、腫瘍重量及び腫瘍組織を検出し特性決定する場合に、末梢血管の血流速度を測定する場合に用いることができる。また、当該微粒子は、組織の癒着を最少にするリガンド、又は上記したようにインビボで身体の特定領域へと微粒子を標的化するリガンドと結合することもできる。以下に本発明を制限するものではない実施例を掲げて、上記の方法及び組成物を更に説明する。実施例１：向上したエコー源性を有するポリマー微粒子の製造メチレンクロリド４８０ml中に、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（７５：２５）（ＩＶ＝０．７５dL/g）を３．２ｇ、ＰＬＧＡ（５０：５０）（ＩＶ＝０．４dL/g）を６．４ｇ及びジアラキドイルホスファチジルコリンを３８４mg溶かした。そのポリマー溶液に、重炭酸アンモニウム０．１８ｇ/ml溶液２０mlを加え、そのポリマー／塩混合物を、Virtisホモジナイザーを用いて２分間１０，０００回転／分で均質化させた。その溶液を２０ml/分の流量でポンプで吸い上げ、Buchi Labの噴霧乾燥器を用いて噴霧乾燥させた。入口温度は４０℃であり、出口温度は２０℃〜２２℃であった。クールター計数器で寸法分類すると、粒径は１〜１０ミクロンの範囲であり、数平均は２．０ミクロンであった。走査型型電子顕微鏡法によると、得られた粒子は、滑らかな表面及び時に表面に小鈍鋸歯状の凸凹（crenulat ions）を有する概ね球状の粒子であることが認められた。微小球は、ＬＲ白色樹脂中に埋封し、紫外線下で重合することによって、透過型電子顕微鏡法のために調製した。ガラスナイフを用いるＬＫＢウルトラミクロトームで切って薄い切片とし、６０kvにおいてZeiss EM-10 TEMで観察した。微粒子のシェル厚は２００〜２４０nmである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ストローブ，ジュリー・アンアメリカ合衆国マサチューセッツ州01890, ウィンチェスター，プラト・テラス 16 (72)発明者ブラッシュ，ヘンリー・ティーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02144, サマービル，ブロードウェイ 911

Claims

【特許請求の範囲】１．超音波画像化で用いるための、ガスをカプセル封入した微粒子のエコー源性を増加させる方法であって、当該微粒子を形成している物質及びカプセル封入されるガスの関数として、総後方散乱出力の最大量が得られる微粒子の壁厚範囲を決定する工程、及び最大レベルの総後方散乱出力が得られる範囲の壁厚を有する微粒子を製造する工程を含む前記方法。２．微粒子が合成ポリマーから形成される請求項１記載の方法。３．微粒子の厚さが、５０〜６６０nmである請求項２記載の方法。４．微粒子が天然ポリマーから形成される請求項１記載の方法。５．天然ポリマーがタンパク質であり、微粒子の厚さが２０〜６００nmである請求項４記載の方法。６．ガスをカプセル封入したポリマー微粒子を、画像化される被験者に投与する工程を含む超音波画像化法であって、当該微粒子が、同じ組成及びサイズの微粒子に関して最大レベルの総後方散乱出力が得られる範囲のポリマー壁厚を有する前記方法。７．微粒子が合成ポリマーから形成される請求項６記載の方法。８．微粒子の厚さが５０〜６６０nmであり、微粒子が合成ポリマーから形成される請求項７記載の方法。９．微粒子が天然ポリマーから形成される請求項６記載の方法。１０．天然ポリマーがタンパク質であり、微粒子の厚さが２０〜６００nmである請求項９記載の方法。１１．ガスが、フッ化ガスである請求項６記載の方法。１２．エコー源性量の生物学的適合性ガスをカプセル封入したポリマー微粒子を含む超音波組成物であって、当該微粒子が、最大エコー源性及び最少減衰を有する微粒子のポリマー壁厚に基づいて微粒子の集団から選択されることを特徴とする前記超音波組成物。１３．ポリマーが、ポリエチレングリコールとポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とのブロックコポリマー以外の他の合成ポリマーである請求項１２記載の組成物。１４．天然ポリマーから形成され、ポリマー壁厚が２０nmを超える微粒子を含む超音波組成物。１５．ポリマーが、アルブミンである請求項１４記載の組成物。