PT996470E - Método para aumentar a ecogenicidade e diminuir a atenuação de gases microencapsulados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA AUMENTAR A ECOGENICIDADE E DIMINUIR A ATENUAÇÃO DE GASES MICROENCAPSULADOS"

Antecedentes da Invenção A presente invenção situa-se genericamente na área de agentes para formação de imagens para diagnóstico, e é especialmente dirigida a agentes de contraste em microparticulas para formação de imagens por ultrassons com ecogenicidade aumentada e atenuação diminuída em função da espessura da membrana de polimero.

Quando se utiliza ultrassons para obtenção de uma imagem dos orgãos internos e estruturas de um ser humano ou animal, as ondas de ultrassons, ondas de energia do som a uma frequência acima da detectável pelo ouvido humano, são reflectidas à medida que passam através do corpo. Os diferentes tipos de tecidos do corpo reflectem as ondas de ultrassons de forma diferente e as reflexões que são produzidas pelas ondas de ultrassons que reflectem diferentes estruturas internas são detectadas e convertidas electronicamente numa apresentação visual.

Para algumas patologias médicas, a obtenção de uma imagem útil de um orgão ou estrutura de interesse é especialmente difícil porque os pormenores da estrutura não são adequadamente distinguíveis do tecido circundante na imagem de ultrassons produzida pela reflexão de ondas de ultrassons, na ausência de um agente de aumento do contraste. A detecção e observação de certos estados fisiológicos e patológicos pode ser substancialmente 1 melhorada por aumento do contraste numa imagem por ultrassons por meio da injecção ou perfusão de um agente num orgão ou noutra estrutura de interesse. Noutros casos, a detecção do movimento do agente de aumento do contraste propriamente dito é especialmente importante. Por exemplo, um padrão de fluxo sanguíneo distinto que se sabe que resulta de anomalias cardiovasculares especificas só pode ser distinguido por perfusão de um agente de aumento do contraste na circulação sanguínea e observação da dinâmica do fluxo sanguíneo.

Os materiais que são úteis como agentes de contraste para ultrassons actuam por terem um efeito sobre as ondas de ultrassons à medida que passam através do corpo e são reflectidas para criar a imagem a partir da qual é feito um diagnóstico médico. Diferentes tipos de substâncias afectam as ondas de ultrassons de modos diferentes e em graus variáveis. Além disso, alguns dos efeitos provocados por agentes de aumento do contraste são mais facilmente determinados e observados do que outros. Na selecção de uma composição ideal para um agente de aumento do contraste, seria de preferir a substância que tem o efeito mais acentuado sobre a onda de ultrassons à medida que passa através do corpo. Além disso, o efeito da onda de ultrassons deve ser facilmente determinado. Estes são dois efeitos que podem ser observados numa imagem de ultrassons: retrodispersão e atenuação do feixe. RETRODISPERSÃO: Quando uma onda de ultrassons que está a passar através do corpo encontra uma estrutura, tal como um orgão ou outro tecido do corpo, a estrutura reflecte uma parte da onda de ultrassons. As diferentes estruturas no seio do corpo reflectem a energia de ultrassons de modos diferentes e com intensidades variáveis. Esta energia reflectida é detectada e utilizada para produzir uma imagem das estruturas através das quais passou a onda de ultrassons. 0 termo "retrodispersão" 2 refere-se ao fenómeno em que a energia dos ultrassons é dispersa de volta para a fonte por uma substância com certas propriedades fisicas. Há muito que se conhece que o contraste observado numa imagem por ultrassons pode ser aumentado pela presença de substâncias que se sabe que causam uma grande quantidade de retrodispersão. Quando uma dessas substâncias é administrada a uma parte distinta do corpo, é aumentado o contraste entre a imagem por ultrassons desta parte do corpo e os tecidos circundantes que não contêm a substância. Está bem esclarecido que, devido às suas propriedades fisicas, diferentes substâncias causam retrodispersão em graus variáveis. Em conformidade, a pesquisa de agentes de aumento do contraste focou-se em substâncias que são estáveis e não tóxicas e que apresentam o máximo de retrodispersão. A aptidão de uma substância para causar retrodispersão de energia de ultrassons depende das caracteristicas da substância tal como da sua aptidão para ser comprimida. Ao examinar diferentes substâncias, é útil comparar uma medida especifica da aptidão de uma substância para causar retrodispersão conhecida como "secção transversal da dispersão". A secção transversal da dispersão de uma substância em particular é proporcional ao raio do dispersor, e também depende do comprimento de onda da energia dos ultrassons e de outras propriedades fisicas da substância, J. Ophir e K. J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, vol. IS, n. 4, p. 319, 323 (1989) .

Na avaliação da utilidade de diferentes substâncias como agentes de contraste para ultrassons, i. e. gases, líquidos ou sólidos, pode calcular-se quais os agentes que devem ter a secção transversal da dispersão mais elevada e, em conformidade, que 3 agentes devem proporcionar o maior contraste numa imagem por ultrassons. Pode considerar-se que a compressibilidade de uma partícula sólida é muito menor do que a do meio circundante e que a densidade da partícula é maior. Partindo deste pressuposto, calculou-se que a secção transversal da dispersão de um agente de aumento de contraste em partículas sólidas foi estimado como 1,75 (Ophir e Parker, supra, na 325). Para um dispersor líquido puro, a compressibilidade adiabática e densidade do dispersor e do meio circundante têm a probabilidade de ser aproximadamente iguais, o que daria o resultado de os líquidos terem uma secção transversal da dispersão igual a zero. Contudo, os líquidos podem apresentar alguma retrodispersão se estiverem presentes grandes volumes de um agente líquido. Por exemplo, se um agente líquido passar de um recipiente muito pequeno para um muito grande, de tal modo que o líquido ocupa substancialmente todo o recipiente, o líquido pode apresentar retrodispersão mensurável. Apesar disso, é considerado pelos especialistas na matéria que os líquidos puros são dispersores relativamente ineficazes. A secção transversal da dispersão de um gás é substancialmente diferente e maior do que a de um líquido ou sólido, em parte porque uma bolha de gás pode ser comprimida em muito maior grau do que um líquido ou sólido. Além disso, bolhas de gás livres num líquido apresentam um movimento oscilatório tal que, a certas frequências, as bolhas de gás vão ressoar a uma frequência próxima da das ondas de ultrassons vulgarmente utilizadas em imagiologia médica. Como resultado, a secção transversal da dispersão de uma bolha de gás pode ser mais de mil vezes maior do que a sua dimensão física. ATENUAÇÃO DO FEIXE: Outro efeito que pode ser observado resultante da presença de certos agentes de aumento do contraste é a atenuação da onda de ultrassons. A intensidade da onda de ultrassons diminui à medida que a onda passa através do volume de 4 tecido ou sangue contendo o agente de contraste. O decréscimo da intensidade da onda é o resultado tanto do ultrassom que é retrodisperso pelo agente como da dissipação da onda à medida que interage com o agente de contraste. Se o feixe for excessivamente atenuado, a energia de retorno ao transdutor de regiões distais do agente de contraste será baixa, conduzindo a fraca profundidade da imagem. A utilização de diferenças de atenuação do feixe em diferentes tipos de tecidos foi tentada como um método de melhoramento de imagens. Observou-se contraste de imagem em imagiologia convencional devido a diferenças de atenuação localizadas entre certos tipos de tecidos. K. J. Parker e R. C. Wagg, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images", IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), p. 431-37 (1983); K. J. Parker, R. C. Wagg e R. M.

Lerner, "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characterization", Radiology, 153(3), p. 785-88 (1984) . Colocou-se a hipótese de determinações da atenuação de uma região de tecido feitas antes e depois da perfusão de um agente poderem produzir uma imagem melhorada. Contudo, não estão desenvolvidas técnicas baseadas no contraste da atenuação como meio para determinar o aumento de contraste de um agente liquido e, mesmo que estivessem, podem sofrer de limitações quanto aos orgãos ou estruturas internos com os quais pode ser utilizada esta técnica. Por exemplo, é improvável que uma perda de atenuação devida a agentes de contraste liquidos possa ser observada na imagem de um sistema cardiovascular devido ao grande volume de agente de contraste líquido que seria necessário que estivesse presente num dado recipiente antes que pudesse ser determinada uma diferença substancial da atenuação.

Em resumo, os ultrassons para diagnóstico são uma ferramenta poderosa não invasora que pode ser utilizada para

obtenção de informação sobre os orgãos internos do corpo. O aparecimento da imagiologia Doppler a preto e branco e a cores 5 provocou um grande avanço no âmbito e resolução da técnica. Embora as técnicas de realização de exames de diagnóstico por ultrassons tenham melhorado significativamente, tal como sucedeu com as de produção e utilização de agentes de contraste, há ainda necessidade de aumentar a resolução de imagens para perfusão cardiaca e câmaras cardiacas, orgãos sólidos, perfusão renal, perfusão de orgãos sólidos, e sinais Doppler da velocidade do sangue e da direcção do fluxo durante a imagiologia em tempo real. 0 desenvolvimento de agentes de contraste para ultrassons centrou-se na utilização de gases biocompativeis, quer como bolhas de gás livres quer como gases encapsulados em materiais de invólucro naturais ou sintéticos.

Foi utilizada uma variedade de polímeros naturais e sintéticos para encapsular um gás, tal como ar, para utilização com agentes de contraste em imagiologia. Schneider et ai., Invest. Radiol., Vol. 27, pp. 134-139 (1992) descrevem partículas poliméricas de 3 micrometros cheias com ar. Foi descrito que estas partículas eram estáveis no plasma e sob pressão aplicada. Contudo, a 2,5 MHz, a sua ecogenicidade era baixa. Outro tipo de suspensão de microbolhas de gás encapsuladas foi obtido a partir de albumina sonicada. Feinstein et al., J. Am. Coll. Cardiol., Vol. 11, pp. 59-65 (1988). Feinstein descreve a preparação de microbolhas que são dimensionadas apropriadamente para passagem transpulmonar com excelente estabilidade in vitro. Contudo, estas microbolhas têm curta duração in vivo, com uma semi-vida da ordem de alguns segundos (que é aproximadamente igual a uma passagem da circulação) porque se dissolvem rapidamente em líquidos subsaturados, por exemplo sangue. Wible, J. H. et al., J. Am. Soc. Echocardiogr., Vol. 9, pp. 442-451 (1996). Bolhas de ar encapsuladas em gelatina foram descritas por Carroll et al. (Carroll, B. A. et al., Invest. Radiol., Vol. 15, pp. 260-266 (1980) e Carroll, B. A. et al., Radiology, Vol. 143, pp. 747-750 6 (1982)), mas devido aos seus tamanhos grandes (12 e 80 ym) não teriam probabilidade de passar através dos capilares pulmonares. Também foram descritas microbolhas encapsuladas em gelatina no documento PCT/US80/00502 por Rasor Associates, Inc. Estas são formadas por "coalescência" da gelatina.

Microbolhas de ar estabilizadas por microcristais de galactose (SHU 454 e SHU 508) também foram descritas por Fritzsch, T. et al.r Invest. Radio1. Vol. 23 (Suppl. 1), pp. 302-305 (1988); e Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol., Vol. 25 (Suppl 1), 160-161 (1990). As microbolhas duram até 15 minutos in vitro mas menos de 20 segundos in vivo. Rovai, D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Vol. 10, pp. 125-134 (1987); e Smith, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Vol. 13, pp. 1622-1628 (1989). Microbolhas de gás encapsuladas dentro de um invólucro de um material contendo flúor estão descritas no documento WO 96/04018 por Molecular Biosystems, Inc. 0 Pedido de Patente Europeia N° 90901933.5 de Schering Aktiengesellschaft descreve a preparação e utilização de gás ou líquidos voláteis microencapsulados para imagiologia por ultrassons, em que as microcápsulas são formadas por polímeros sintéticos ou polissacáridos. O Pedido de Patente Europeia N° 91810366.4 de Sintética S.A. (0458745 Al) descreve microbalões de ar ou gás ligados por uma membrana de polímero depositada interfacialmente que podem ser dispersos num veículo aquoso para injecção num animal hospedeiro ou para administração oral, rectal ou uretral, para fins terapêuticos ou de diagnóstico. O documento WO 92/18164 de Delta Biotechnology Limited descreve a preparação de micropartícuias por secagem com atomização em condições muito controladas quanto à temperatura, velocidade de pulverização, tamanho das partículas e condições de secagem, de uma solução aquosa de proteínas para formar esferas ocas com gás nelas 7 retido, para utilização em imagiologia. 0 documento WO 93/25242 descreve a síntese de micropartículas para imagiologia ultrassónica consistindo num gás contido dentro de um invólucro de policianoacrilato ou poliéster. 0 documento WO 92/21382 descreve o fabrico de agentes de contraste em micropartículas que incluem uma matriz ligada covalentemente contendo um gás, em que a matriz é um hidrato de carbono. As patentes U.S. N°s 5334381, 5123414 e 5352435 de Unger descrevem lipossomas para utilização como agentes de contraste para ultrassons, que incluem gases, precursores gasosos, tais como um precursor gasoso activado pelo pH ou foto-activado, bem como outros agentes de aumento de contraste líquidos ou sólidos. 0 documento WO 95/23615 de Nycomed descreve microcápsulas para imagiologia que são formadas por coacervação de uma solução, por exemplo, uma solução de proteínas, contendo um perfluorocarboneto. 0 documento PCT/US94/08416 do Massachusetts Institute of Technology descreve micropartículas formadas por polímeros de blocos de polietilenoglicol-poli(lactido-co-glicolido) com agentes de imagiologia neles encapsulados, incluindo gases, tais como ar e perfluorocarbonetos.

Embora todos os agentes de contraste para ultrassons investigados até à data, tais como bolhas de gás livres ou bolhas de gás encapsuladas sejam retrodispersores potentes, estes agentes também têm um grau elevado de atenuação. A atenuação elevada leva a baixa profundidade das imagens e à perda de imagem de tecidos distais ao agente de contraste. Em muitos casos, a informação da imagem pode ficar completamente perdida para lá de regiões com concentração significativa do agente de contraste, e. g. o ventrículo esquerdo. Todos os agentes de contraste para ultrassons actualmente em investigação partilham em certa medida deste problema.

Para minimizar o problema associado à atenuação de agentes de contraste, os investigadores recorreram a várias abordagens. Mais frequentemente, a quantidade de agente de contraste administrada é reduzida para permitir que maior quantidade do feixe de ultrassons penetre através do agente de contraste. Embora a atenuação seja menor, a diminuição da dose leva a um contraste menos do que óptimo para muitas indicações clinicas. Alternativamente, os agentes de contraste para ultrassons podem ser administrados como uma perfusão continua. Isto essencialmente baixa a concentração local de agente e tem o problema descrito anteriormente para a redução da dose. A infusão continua tem as desvantagens adicionais de requerer uma dose total maior ao longo do tempo e de não ser fácil de realizar em ambiente clinico. Para compensar as doses menores, os investigadores utilizaram imagiologia harmónica para aumentar a razão sinal/ruído. Contudo, a imagiologia harmónica não é corrente nesta altura. 0 que é importante, estas abordagens não se destinam a rectificar o problema fundamental das propriedades acústicas de agentes de contraste para ultrassons já existentes. Assim para que um agente de contraste para ultrassons tenha uma elevada ecogenicidade é necessário criar um dispersor que leve a uma energia de retorno total elevada, no transdutor de recepção, a partir das regiões de interesse a profundidades para lá da região inicial que contém o agente de contraste. A energia de retorno será governada tanto pela retrodispersão como pela atenuação do agente. É portanto um objectivo da presente invenção proporcionar um método para maximização e ecogenicidade de microparticulas. Outro objectivo da invenção é maximizar a retrodispersão e baixar a atenuação. 9

Sumário da Invenção

Constatou-se agora que micropartículas com paredes mais espessas formadas a partir de polímeros naturais ou sintéticos têm ecogenicidade significativamente aumentada e mais baixa atenuação em comparação com micropartículas com paredes mais finas. 0 efeito da espessura das paredes foi determinado teoricamente e prevista a espessura óptima das paredes. Produziu-se micropartículas com essas espessuras. Na forma de realização preferida, os polímeros são polímeros sintéticos biodegradáveis e a espessura das paredes está entre 50 e 660 nm, embora possam ser utilizadas espessuras de parede desde cerca de 30 nm até mais de 800 nm. A espessura do invólucro dependerá do tecido alvo de que se pretende obter imagens e dependerá tanto do volume de sangue como do volume de tecido do orgão alvo. As micropartículas são produzidas com um diâmetro adequado para o tecido alvo do qual se quer obter imagens, por exemplo, com um diâmetro entre 0,5 e 8 micrometros para administração intravascular, e um diâmetro entre 0,5 e 5 mm para administração oral para obtenção de imagens do tracto gastrointestinal ou de outros lúmens. Os polímeros preferidos são poli-hidroxiácidos, tais como ácido poliláctico-co-ácido glicólico, polilactido poliglicolido ou polilactido-co-glicolido. Estes materiais podem ser conjugados com polietilenoglicol ou outros materiais que inibem a absorção pelo sistema reticuloendotelial (RES). As microsferas podem ser utilizadas numa variedade de aplicações de imagiologia por ultrassons incluindo aplicações em cardiologia, aplicações em perfusão de sangue bem como para obtenção de imagens de orgãos e veias periféricas. 10

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre a secção transversal da dispersão por unidade de volume em função da freguência acústica para uma distribuição de tamanhos representativa de octafluoropropano microencapsulado em polímero sintético a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 110 nm e 0,0034% de C3F8 (fracção de gás no volume total), 165 nm e 0,0032% de C3F8, 220 nm e 0,0029% de C3F8, 330 nm e 0,0025% de C3F8, 440 nm e 0,0021% de C3F8, 660 nm e 0,0015% de C3F8, 880 nm e 0,0010% de C3F8, e 1100 nm e 0,0007% de C3F8. A Figura 2 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre o coeficiente de atenuação acústica em função da frequência acústica, para uma distribuição de tamanhos representativa de polímero sintético microencapsulado em octafluoropropano a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 110 nm e 0,0034% de C3F8, 165 nm e 0,0032% de C3F8, 220 nm e 0,0029% de C3F8, 330 nm e 0, 0025% de C3F8, 440 nm e 0,0021% de C3F8, 660 nm e 0,0015% de C3F8, 880 nm e 0,0010% de C3F8, e 1100 nm e 0,0007% de C3F8. A Figura 3 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre a ecogenicidade (energia total devolvida por unidade de volume) em função da frequência acústica, para uma distribuição de tamanhos representativa de octafluoropropano microencapsulado em polímero sintético a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 110 nm e 0, 0034% de C3F8, 165 nm e 0, 0032% de C3F8, 220 nm e 0, 0029% de C3F8, 440 nm e 0,0021% de C3F8, e 660 nm e 0,0015% de C3F8. 11 A Figura 4 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre a secção transversal da dispersão total por unidade de volume em função da frequência acústica para uma distribuição de tamanhos representativa de ar microencapsulado em polímero natural a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 40 nm e 0, 0021% de ar (fracção de gás no volume total), 80 nm e 0,0020% de ar, 150 nm e 0,0019% de ar, 300 nm e 0,0017% de ar, 600 nm e 0,0013% de ar, e 900 nm e 0,0010% de ar. A Figura 5 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre o coeficiente de atenuação acústica em função da frequência acústica para uma distribuição de tamanhos representativa de ar microencapsulado em polímero natural a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 40 nm e 0,0021% de ar, 80 nm e 0,0020% de ar, 150 nm e 0,0019% de ar, 300 nm e 0,0017% de ar, 600 nm e 0,0013% de ar, e 900 nm e 0,0010% de ar. A Figura 6 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre a ecogenicidade (energia total devolvida por unidade de volume) em função da frequência acústica para uma distribuição de tamanhos representativa de ar microencapsulado em polímero natural a uma diluição de 1/1620 considerando espessuras de parede de 40 nm e 0,0021% de ar, 80 nm e 0,0020% de ar, 150 nm e 0,0019% de ar, 300 nm e 0,0017% de ar, 600 nm e 0,0013% de ar, e 900 nm e 0,0010% de ar. A Figura 7 é um gráfico de cálculos do efeito da espessura da parede sobre a ecogenicidade em função da frequência acústica para uma distribuição de tamanhos representativa de ar microencapsulado em polímero natural a uma diluição de 1/5400 considerando espessuras de parede de 15 nm e 0,0006% de ar, 40 nm e 0,0006% de ar, 80 nm e 0,0006% de ar, 150 nm e 0,0006% de ar, e 300 nm and 0,0005% de ar. 12

Descrição Pormenorizada da Invenção

Descreve-se um método para maximizar a ecogenicidade em função da espessura da parede de microparticulas de polímeros naturais ou sintéticos. As microparticulas são úteis numa variedade de aplicações de diagnóstico por imagiologia com ultrassons, particularmente em processos com ultrassons tais como imagiologia de vasos sanguíneos e ecocardiografia. 0 aumento da espessura das paredes aumenta significativamente a ecogenicidade em comparação com as mesmas microparticulas de polímeros naturais ou sintéticos com paredes mais finas. I. Determinação da Espessura Óptima do Polímero

De forma a permitir um maior entendimento da resposta de microbolhas encapsuladas a ultrassons de diagnóstico, utilizou-se um modelo matemático (C. Church, J. Acoustical Soc. Amer. 97(3) :1510-1521, 1995) para calcular quantidades importantes tais como retrodispersão e coeficientes de atenuação para os valores de parâmetros físicos tais como a espessura e a rigidez do invólucro encapsulante. O invólucro pode ser de um material natural ou sintético. O modelo consiste numa equação do tipo Rayleigh-Plesset (não linear) para o caso de uma bolha de gás esférica encapsulada por um invólucro que se comporta colectivamente como um sólido elástico contínuo, não compressível, amortecido. Uma solução analítica para esta equação, que inclui os componentes harmónicos mais baixos de primeira e segunda ordem, é aqui utilizada para fazer a estimativa do efeito da espessura do invólucro sobre a secção transversal da dispersão (a razão entre a energia dispersa pelas 13 bolhas de gás encapsuladas e a intensidade do feixe acústico incidente) e o coeficiente de atenuação (a velocidade à qual as bolhas de gás retiram energia acústica do feixe) de uma suspensão de bolhas de gás encapsuladas. Estes quantificadores são então utilizados para fazer a estimativa da energia total de retorno de uma suspensão de bolhas de gás encapsuladas para o transdutor de ultrassons que emite o impulso incidente. A equação do tipo Rayleigh-Plesset que descreve a resposta de uma bolha de gás encapsulada a uma onda de pressão acústica incidente é: O)

em que fij é o raio da cavidade cheia de gás, ϋχ é a velocidade radial de interface 1 (a interface entre o interior gasoso e o sólido encapsulante), R2 é o raio exterior do material encapsulante, pL é a densidade do liquido que circunda a bolha, pL é a densidade do invólucro encapsulante, Pc.eg é a pressão do gás dentro da bolha no equilíbrio, Rol é o raio inicial da cavidade cheia de gás, P°°(t) é a pressão ao infinito (incluindo a pressão acústica motora), σι e G2 são as tensões interfaciais nas interfaces gas-invólucro e invólucro-líquido, respectivamente, ps e μι, são as viscosidades efectivas do invólucro e do líquido circundante, respectivamente, Vs=R2^~Pl^ r Gs é a rigidez do invólucro e Rei é a posição de equilíbrio sem 14 tensão da interface gás-invólucro. Pode obter-se uma expressão para a secção transversal da dispersão asi, de uma bolha de gás encapsulada pode ser encontrada admitindo que a amplitude de pulsação Rol^(t) é pequena e substituindo R± = Ρ0ι(1+%) e

expressões relacionadas na equação (1) de Church (1995) . A equação (2) resultante é: (2)

411^©* p* l+f p*”ps] 2 [{tío-«a)2+aji«ai 1 l ps J (an2) em que ω é a frequência (radial) da onda acústica incidente, G)o é a frequência de ressonância da bolha de gás encapsulada e δ<3 é a constante de amortecimento da bolha de gás encapsulada; as unidades representativas da secção transversal estão apresentadas entre parêntesis a seguir à equação. A equação (2) é apropriada para casos em que tem interesse a resposta de uma única bolha de gás encapsulada, No diagnóstico por ultrassons, é mais vulgar estar-se interessado nas resposta de uma suspensão de muitos milhões de bolhas de gás encapsuladas. Quando está presente um conjunto de bolhas de gás encapsuladas com uma gama de tamanhos, a secção transversal da dispersão total por unidade de volume pode ser calculada somando simplesmente a contribuição de cada bolha de gás encapsulada num volume representativo da suspensão: 15 asmt/vai*f*°si ÍJ^oi í f <%) dff0i <cm*/c®3) em que f(Rol)dRol é o número de bolhas de gás encapsuladas por unidade de volume com raios entre Rol e Rol + dR0l· 0 coeficiente de atenuação da suspensão pode ser calculado utilizando o método descrito por K. W. Commander e A. Prosperetti, "Linear pressure waves in bubbly liquids: Comparison between theory and experiments", J. Acoust. Soc. Amer. 85(2): 732-746 (1989). Descrevendo um meio com bolhas em termos da sua pressão média, densidade, velocidade, etc., estes autores deduziram uma expressão para cm, a complexa velocidade do som na suspensão. Para o caso de bolhas de gás encapsuladas, (4) A=8.686p^j{dJS/COT) em que o factor 8,686 é necessário para converter neper em dB. As equações (3) e (4) podem ser combianads para dar a seguinte relação para a energia de retorno: (5) P I0QS1 tpt/VpjGPJCíj g ggg (W/Cfií em que x é agora a distância entre o transdutor e o volume da amostra e o factor G é responsável por factores geométricos adicionais incluindo a abertura do transdutor, a distância entre 16 o transdutor e o volume da amostra e o ângulo sólido interceptado pela onda esférica dispersada a partir de cada bolha no transdutor de recepção.

Para se poder utilizar estes resultados, é necessário proporcionar uma distribuição de tamanhos de bolhas de gás encapsuladas e determinar os valores dos parâmetros físicos utilizados no modelo. São considerados dois casos. 0 primeiro é para micropartículas sintéticas produzidas a partir de poliésteres e o segundo é para micropartículas produzidas a partir de albumina. A distribuição de tamanhos das partículas sintéticas aqui utilizada é a determinada para micropartículas de PLGA-PEG produzidas por secagem por atomização, como descrito no documento U.S. N° de série 08/681710 apresentado em 29 de Julho de 1996. Os valores dos parâmetros populacionais que caracterizam esta distribuição, determinados por análise com um Multisizer®

Coulter, são: concentração total: 2,4 x 10^ partículas/mL, diâmetro médio em número: 2,2 ym, diâmetro médio em volume: 4,6 ym e 6,5% de fracção de volume de gás. Os cálculos apresentados adiante foram produzidos admitindo uma diluição de 1/1620. A concentração correspondente era 4,4 x 10^ partículas/mL enquanto que a fracção de volume de gás era de aproximadamente 0,01%. Os valores dos parâmetros utilizados no modelo são: gás interno: valores apropriados para perfluoropropano, líquido externo: valores apropriados para água, densidade do invólucro: 1,5 g/cm^, viscosidade do invólucro: 30 poise, rigidez do invólucro: 10 MPa e espessuras do invólucro: 22, 55, 110, 165, 220, 330, 440, 660, 880 e 1100 nm.

Os resultados dos cálculos da secção transversal da dispersão total à frequência de transmissão estão apresentados na Figura 1 para a gama de espessuras do invólucro de PEG-PLGA utilizadas. Às frequências mais baixas, as secções transversais 17 aumentam aproximadamente de uma potência de quatro da frequência, como é de esperar para dispersores pequenos, i. e., Rayleigh. A frequências biomédicas, mais altas, a dispersão total aumenta só como frequência elevada à potência de 1,5. A frequências ainda mais elevadas, a intensidade de dispersão atinge patamares e depois diminui. 0 efeito do aumento da espessura do invólucro é fazer diminuir a secção transversal da dispersão total de uma quantidade aproximadamente igual ou ligeiramente superior à alteração proporcional de espessura. Assim a secção transversal da dispersão total apresentada por uma suspensão de bolhas de gás encapsuladas pode ser controlada por variação da espessura do invólucro.

Os resultados dos cálculos do coeficiente de atenuação em função da frequência de transmissão a diferentes espessuras do invólucro estão apresentados na Figura 2. 0 efeito do aumento da espessura do invólucro é fazer diminuir o coeficiente de atenuação de uma quantidade aproximadamente igual ou um tanto inferior à alteração proporcional de espessura. Assim o coeficiente de atenuação pode ser controlada por variação da espessura do invólucro. 0 facto de tanto a secção transversal da dispersão total como o coeficiente de atenuação aumentarem aproximadamente de forma proporcional à diminuição da espessura do invólucro poderia parecer indicar que a variação de espessura do invólucro não teria efeito sobre a energia total que se esperaria fosse retrodispersa para um transdutor emitindo uma onda acústica numa suspensão de bolhas de gás encapsuladas. Contudo, da análise adicional da equação 5, é evidente que suspensões de bolhas de gás encapsuladas possuindo invólucros mais espessos apresentarão maior energia de retorno total. Isto está ilustrado na Figura 3. A razão para isto é que enquanto a energia retrodispersa total é directamente proporcional à secção transversal da dispersão 18 total, também é proporcional ao exponencial do coeficiente de atenuação. Portanto, se a espessura do invólucro for diminuída de um factor de dois o efeito do aumento na secção transversal da dispersão total será o de aumentar a energia total em aproximadamente dois enquanto que o efeito de atenuação será "aumentar" a energia total de um factor de aproximadamente exp (-2)=1/7,4, para uma redução real de aproximadamente 73%. A energia de retorno total é aumentada à medida que é aumentada a espessura do invólucro.

Prevê-se resultados semelhantes para micropartículas produzidas a partir de albumina como apresentado nas Figuras 4-6. Os parâmetros utilizados para a albumina são como descrito em C. Church, J. Acoustical Soc. Amer., 97(3):1510-1521 (1995). A energia total de retorno para as micropartículas de polímero sintéticas (Figura 3) e para as micropartículas de albumina (Figura 6) são para um factor de diluição das micropartículas de 1/1620. A espessura do invólucro óptima (definida como a espessura que proporciona um máximo de energia total de retorno a uma profundidade de 2 cm numa suspensão das bolhas de gás encapsuladas) vai depender da diluição das bolhas de gás encapsuladas (i. e. concentração de bolhas de gás encapsuladas). Isto está ilustrado na Figura 7 para micropartículas de albumina a uma diluição de 1/5400. À medida que a suspensão é diluída, é possível utilizar micropartículas com invólucros mais finos. Isto sucede porque embora os invólucros mais finos levem a maior atenuação e maior intensidade de dispersão numa base "por bolha", isto é suficientemente compensado pelo número de micropartículas para dar uma energia total de retorno mais eivada. 19

As espessuras do invólucro óptimas para três diluições estão sumariadas na tabela seguinte tanto para microparticulas de albumina como de PEG-PLGA.

Diluição Espessura do Invólucro Óptima (nm) Microparticulas de albumina Microparticulas de PEG-PLGA 1/540 300-600 660 1/1620 150-300 220 1/5400 40-80 55-110

Para bolhas cuja distribuição de tamanhos é relativamente estável in vivo, a escolha da espessura óptima do invólucro basear-se-ia na concentração de partículas esperada no orgão alvo de interesse. Para ilustrar como se pode seleccionar uma espessura do invólucro, considere-se as microparticulas sintéticas descritas anteriormente. Se as microparticulas forem administradas a aproximadamente 0,25 mL/kg e o volume do sangue fosse considerado como sendo 50 mL/kg, as microparticulas ficariam diluídas 1/200 pós injecção intravenosa. No miocárdio, o sangue constitui 10% do volume total do compartimento e as microparticulas são adicionalmente diluídas no compartimento por um factor de 10. Assim a diluição final seria de aproximadamente 1/2000. A esta diluição, a espessura óptima do invólucro pode ser extrapolada a partir dos dados da tabela e é de 200 nm. Assim a espessura óptima para utilização como um agente de perfusão no miocárdio para estes tipos de microparticulas é de aproximadamente 200 nm.

Com base nesta informação, os invólucros mais espessos deviam ser utilizados para optimizar a concepção de microparticulas específicas para encapsulação de gases, minimizando a atenuação e maximizando a energia de retorno da 20 retrodispersão, permitindo que sejam utilizadas doses maiores de agentes de contraste para ultrassons com atenuação mínima. São descritos métodos para a produção de micropartículas com a espessura da parede apropriada. II. Processos e Reagentes para a Produção de

Micropartículas com Diferentes Espessuras do Invólucro

Tal como aqui utilizado, o termo micropartícula inclui microsferas e microcápsulas, bem como micropartículas salvo indicação em contrário. As micropartículas podem ou não ter forma esférica. As microcápsulas são definidas como micropartículas com um invólucro de polímero externo que rodeia um núcleo de outro material, neste caso um gás. As microsferas são micropartículas com uma estrutura em colmeia formada por poros através do polímero ou combinações de estruturas em colmeia ou em microcápsulas que estão cheias com um gás para efeitos de obtenção de imagens, como descrito adiante. 0 termo "espessura da parede" ou "espessura do polímero" refere-se ao diâmetro do polímero do interior da micropartícula para o exterior. No caso de uma microcápsula com um núcleo oco, a espessura da parede será igual à espessura do polímero. No caso de uma micropartícula porosa com canais ou poros numa esfera de polímero, a espessura da parede pode ser igual a metade do diâmetro da micropartícula.

Polímeros

Pode utilizar-se matrizes não biodegradáveis e biodegradáveis para a microencapsulação de gases, embora sejam preferidas as matrizes biodegradáveis, particularmente para injecção intravenosa. Os polímeros não erodíveis podem ser utilizados para aplicações de ultrassons com administração 21 entérica. Os polímeros sintéticos ou naturais podem ser utilizados para produzir as micropartículas. São preferidos os polímeros sintéticos devido à síntese mais reprodutível e à degradação controlada. 0 polímero é seleccionado com base no tempo necessário para estabilidade ín vivo, por outras palavras, o tempo necessário para distribuição ao sítio onde se deseja obter a imagem, e o tempo necessário para a obtenção da imagem.

Os polímeros sintéticos representativos são: poli(hidroxi ácidos) tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) e poli (ácido láctico-co-ácido glicólico), poliglicolidos, polilactidos, copolímeros e misturas de polilactido co-glicolido, polianidridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos tais como polietileno e polipropileno, polialcileno glicóis tais com poli (etilenoglicol) , óxidos de polialquilenos tais como poli(óxido de etileno), polialcileno tereftalatos tais como poli (etileno tereftalato), álcoois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, halogenetos de polivinilo tais como poli(cloreto de vinilo), polivinilpirrolidona, polissiloxanos, poli(álcoois vinílicos), poli(acetato de vinilo), polistireno, poliuretanos e os seus copolímeros, celuloses derivatizadas tais como alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, metil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxi-propil metil celulose, hidroxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, acetato butirato de celulose, acetato ftalato de celulose, carboxiletil celulose, triacetato de celulose, e sal de sódio de sulfato de celulose (conjuntamente aqui referidos como "celuloses sintéticas"), polímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico ou os seus copolímeros ou derivados incluindo ésteres, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), 22 poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) e poli(acrilato de octadecilo) (conjuntamente aqui referidos como "ácidos poliacrilicos"), poli(ácido butirico), poli(ácido valérico) e poli(lactido-co-caprolactona), os seus copolimeros e misturas. Tal como aqui utilizado, "derivados" incluem polímeros com substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquilo, alcileno, hidroxilações, oxidações e outras modificações feitas em rotina pelos especialistas na matéria.

Exemplos de polímeros não biodegradáveis preferidos incluem etileno acetato de vinilo, poli(ácido (met)acrílico), poliamidas, e os seus copolimeros e misturas.

Exemplos de polímeros biodegradáveis preferidos incluem polímeros de hidroxiácidos, tais como ácido láctico e ácido glicólico, polilactido, poliglicolido, polilactido-co-glicolido, e copolimeros com PEG, polianidridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butirico), poli(ácido valérico), poli(lactido-co-caprolactona), e as suas misturas e copolimeros.

Exemplos de polímeros naturais preferidos incluem proteínas tais como albumina, hemoglobina, fibrinogénio, poliaminoácidos, gelatina, lactoglobulina e prolaminas, por exemplo, zeína, e polissacáridos, tais como alginato, celulose e poli-hidroxialcanoatos, por exemplo, poli-hidroxibutirato. As proteínas podem ser estabilizadas por reticulação com um agente tal como glutaraldeído ou desnaturação pelo calor.

Os polímeros bioadesivos de interesse especial para utilização na obtenção de imagens de superfícies mucosas, como no tracto gastrointestinal, incluem polianidridos, ácido poliacrílico, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de 23 etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) e poli(acrilato de octadecilo).

Solventes

Tal como aqui definido, o solvente do polimero é um solvente que é volátil ou tem um ponto de ebulição relativamente baixo ou pode ser removido em vácuo e que é aceitável para administração a humanos em quantidades vestigiais, tal como cloreto de metileno, água, acetato de etilo, etanol, metanol, dimetil formamida (DMF), acetona, acetonitrilo, tetra-hidrofurano (THF), ácido acético e sulfóxido de dimetilo (DMSO), ou as suas combinações. Em geral, o polimero é dissolvido no solvente para formar uma solução de polimero com uma concentração entre 0,1 e 60% em peso para volume (p/v) , de um modo mais preferido entre 0,25 e 30%.

Gases

Qualquer gás biocompativel ou farmacologicamente aceitável pode ser incorporado nas microparticulas. O termo gás refere-se a qualquer composto que é um gás ou é capaz de formar um gás à temperatura à qual é realizada a imagiologia. O gás pode ser constituído por um só composto, tal como oxigénio, azoto, xénon, árgon, azoto, gases fluorados, ou uma mistura de compostos, tal como o ar. São preferidos os gases fluorados. Exemplos de gases fluorados incluem CF4, C2Fg, C3F8, C4F8, SFg, C2F4 e C3F6. O perfluoropropano é particularmente preferido porque é farmacologicamente aceitável. Tipicamente microparticulas ocas 24 cheias de ar são produzidas pelos métodos descritos e o ar dentro das microparticulas pode ser permutado com qualquer dos gases biocompativeis descritos. 0 gás é tipicamente permutado por aplicação de vácuo às microparticulas para retirar o ar e depois aplicação de uma atmosfera do gás biocompativel a uma temperatura e pressão especificas. A temperatura e pressão do gás a ser permutado dependerá das propriedades das microparticulas.

Agentes de formação de poros

Os agentes de formação de poros podem ser microencapsulados para introduzir vazios internos. 0 agente de formação de poros pode ser um liquido ou um volátil ou sal sublimável que pode ser removido durante a microencapsulação ou pode ser removido depois de as microparticulas serem formadas por utilização de secagem em vácuo ou liofilização. Após a remoção do agente de formação de poros, são criados vazios internos que podem ser cheios com o gás de interesse. Pode utilizar-se mais do que um agente de formação de poros. 0 agente ou agentes de formação de poros podem ser incluídos na solução do polímero numa quantidade entre 0,01% e 90% em peso por volume, para aumentar a formação de poros. Por exemplo, em secagem por atomização, evaporação de solvente, um agente de formação de poros tal como um sal volátil, por exemplo, bicarbonato de amónio, acetato de amónio, cloreto de amónio ou benzoato de amónio ou outro sal liofilizável pode ser encapsulado como partículas sólidas ou como uma solução. Se o agente de formação de poros for encapsulado como uma solução, a solução contendo o agente de formação de poros é emulsionada com a solução de polímero para criar gotículas do agente de formação de poros no polímero. A solução de polímero contendo as partículas do agente de formação de poros ou a emulsão da solução do agente de formação de poros no polímero é então seca por atomização ou submetida a um processo de evaporação do solvente/extracção. 25

Depois de o polímero ser precipitado, as micropartículas endurecidas podem ser congeladas e liofilizadas para remover o agente de formação de poros residual ou as micropartículas endurecidas podem ser secas em vácuo para remover o agente de formação de poros.

Aditivos para Estabilizar Gás Encapsulado Lípidos

Em geral, a incorporação de compostos durante a produção das micropartículas que são hidrófobas e, numa quantidade eficaz, que limita assim a penetração e/ou absorção de água pelas micropartículas, é eficaz na estabilização da ecogenicidade de micropartículas poliméricas com gases nelas encapsulado, especialmente gases fluorados tais como perfluorocarbonetos. Os lípidos que podem ser utilizados para estabilizar gás dentro das micropartículas poliméricas incluem as seguintes classes de lípidos: ácidos gordos e derivados, mono-, di e triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol e derivados de esteróides, terpenos e vitaminas. Os ácidos gordos e os seus derivados podem incluir ácidos gordos saturados e insaturados, ácidos gordos com número ímpar e par, isómeros cis e trans, e derivados de ácidos gordos incluindo álcoois, ésteres, anidridos, hidroxiácidos gordos e prostaglandinas. Os ácidos gordos saturados e insaturados que podem ser utilizados incluem moléculas que têm entre 12 átomos de carbono e 22 átomos de carbono em forma linear ou ramificada. Exemplos de ácidos gordos saturados que podem ser utilizados incluem os ácidos láurico, mirístico, palmítico e esteárico. Exemplos de ácidos gordos insaturados que podem ser utilizados incluem os ácidos laúrico, fisetérico, miristoleico, palmitoleico, petroselínico e oleico. Exemplos de ácidos gordos ramificados que podem ser utilizados 26 incluem os ácidos isoláurico, isomirístico, isopalmitico e isosteárico e isoprenóides. Os derivados de ácidos gordos incluem ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanóico; ácido N-[12-(((7'dietilaminocumarin-3-il)-carbonil)metil-amino)octadecanoil]-2-aminopalmítico, N-succinil-dioleoílfosfatidiletanol amina e palmitoíl-homocisteína; e/ou as suas combinações. Mono, di e triglicéridos que podem ser utilizados incluem moléculas que têm ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos entre 6 e 24 átomos de carbono, digalactosil-diglicérido, 1,2-dioleoíl-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoíl-sn-3-succinilglicerol; e 1,3-dipalmitoíl-2-succinilglicerol.

Os fosfolipidos que podem ser utilizados incluem ácidos fosfatidicos, fosfatidil colinas com lipidos quer saturados quer insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceróis, fosfatidilserinas, fosfatidilinositóis, derivados lisofosfatidilo, cardiolipina e β-acil-y-alquil fosfolipidos. Exemplos de fosfolipidos incluem fosfatidilcolinas tais como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipentadecanoilfosfatidilcolina dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibeenoilfosfatidilcolina (DBPC), ditricosanoilfosfatidilcolina (DTPC) , dilenhoceroilfatidilcolina (DLPC) ; e fosfatidiletanolaminas tais como dioleoilfosfatidiletanolamina ou l-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. Também podem ser utilizados fosfolipidos sintéticos com cadeias acilo assimétricas (e. g., com uma cadeia acilo de 6 carbonos e outra cadeia acilo de 12 carbonos) .

Os esfingolipidos que podem ser utilizados incluem ceramidas, esfingomielinas, cerebrosidos, gangliosidos, 27 sulfatidos e lisossulfatidos. Exemplos de esfingolípidos incluem os gangliosidos GMl e GM2.

Os esteróides que podem ser utilizados incluem colesterol, sulfato de colesterol, hemissuccinato de colesterol, 6-(5-colesterol 3β-ί1οχί) hexil-6-amino-6-desoxi-l-tio-a-D-galactopiranosido, 6-(5-colesten-3P-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-l-tio-a-D-manopiranosido e butanoato de colesteril)4'-trimetil 35 amónio).

Compostos lipídicos adicionais que podem ser utilizados incluem tocoferol e derivados, e óleos e óleos derivatizados tais como estearilamina.

Pode utilizar-se uma variedade de lipidos catiónicos tais como DOTMA, cloreto de N-[1-(2,3-dioleoíloxi)propil-N,N,N-trimetilamónio; DOTAP, 1,2-dioleoíloxi-3-(trimetilamónio) propano; e DOTB, 1,2-dioleoí1-3-(4'-trimetil-amónio) butanoil-sn glicerol.

Os lipidos muito preferidos são fosfolipidos, de um modo preferido DPPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC e de um modo muito preferido DPPC, DAPC e DBPC. 0 teor de lipidos varia desde 0,01-30 (p de lipido/p de polímero); de um modo muito preferido entre 0,1-12 (p de lípido/p de polímero). Os lipidos podem ser adicionados à solução de polímero antes da formação das micropartículas.

Outros Compostos Hidrófobos 28

Outros compostos hidrófobos preferidos incluem aminoácidos tais como triptofano, tirosina, isoleucina, leucina e valina, compostos aromáticos tais como um alquilparabeno, por exemplo, metilparabeno, e ácido benzóico.

Microparticulas e Métodos para a sua Produção

Na forma de realização muito preferida, as microparticulas são produzidas por secagem por atomização. 0 polimero e o agente de formação de poros são atomizados através de um bocal e o solvente do polimero é removido por evaporação com um gás de secagem aquecido. Podem ser utilizadas outras técnicas, tais como extracção com solventes, encapsulação por fusão a quente, e evaporação de solvente, para produzir microparticulas com uma espessura da parede com o diâmetro apropriado para optimizar a ecogenicidade. Os agentes de formação de poros são tipicamente utilizados para criar os vazios internos. Os agentes de formação de poros são microencapsulados e removidos depois da formação das microparticulas por liofilização ou secagem em vácuo. A evaporação do solvente está descrita por E. Mathiowitz et al., J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L. R. Beck et al., Fértil. Steril., 31, 545 (1979); e S. Benita et al., J. Pharm. Sei., 73, 1721 (1984). A microencapsulação com fusão a quente está descrita por E. Mathiowitz et al., Reactive Polymers, 6, 275 (1987).

Pode adicionar-se uma variedade de tensoactivos durante a sintese das microparticulas. Emulsionantes ou tensoactivos exemplificativos que podem ser utilizados (0,1-5% em peso) incluem a maior parte dos emulsionantes fisiologicamente aceitáveis. Exemplos incluem formas naturais e sintéticas de sais biliares ou ácidos biliares, quer conjugados com aminoácidos quer não conjugados tais como taurodesoxicolato, e ácido célico. 29

Tamanho das Micropartículas

Numa forma de realização preferida para a preparação de micropartículas injectáveis capazes de passar através do leito capilar pulmonar, as micropartículas devem ter um diâmetro entre aproximadamente um e dez micrones. As micropartículas maiores podem obstruir o leito pulmonar e as micropartículas mais pequenas podem não proporcionar ecogenicidade suficiente. As micropartículas maiores são úteis para administração por vias que não a injecção, por exemplo oral (para avaliação do tracto gastrointestinal) , aplicação noutras superfícies mucosas (rectal, vaginal, oral, nasal) ou por inalação. 0 tamanho de partículas preferido para administração oral está entre cerca de 0,5 micrones e 5 mm. A análise do tamanho das partículas pode ser realizada num contador Coulter, por microscopia de luz, microscopia electrónica de varrimento ou microscopia electrónica de transmitância.

Controlo da Espessura de Parede A espessura de parede preferida é superior a 20 nm, de um modo mais preferido está na gama entre 160 e 220 nm até cerca de 700 nm, ponto em que a vantagem derivada do aumento da espessura da parede começa a diminuir gradualmente. Para cada uma das técnicas de microencapsulação anteriormente descritas, há várias formas em que a espessura final do invólucro da micropartícula de polímero pode ser controlada.

Concentração do Polímero 30 A espessura final do invólucro de polímero pode ser aumentada por aumento da concentração da fase de polímero durante o processo de encapsulação. Isto é aplicável a polímeros sintéticos ou a polímeros naturais, tais como proteínas ou polissacáridos. Para um dado tamanho de gotícula de polímero, a utilização de uma solução de polímero mais concentrada vai resultar em mais polímero por unidade de volume da gotícula e assim num invólucro mais espesso. A concentração de polímero para se obter uma dada espessura do invólucro vai depender principalmente do tipo de polímero, do solvente do polímero, da solubilidade do polímero no sistema solvente e da temperatura à qual é realizada a encapsulação. Pode utilizar-se concentrações de polímero na gama entre 0,1 e 60%. As concentrações de polímero preferidas estão na gama entre 0,5 e 30%.

Tal como descrito anteriormente, pode utilizar-se agentes de formação de poros tais como sais voláteis ou sublimáveis para produzir micropartículas com vácuos internos. O agente de formação de poros pode ser microencapsulado como sólidos ou como uma solução aquosa ou pode ser codissolvido na solução de polímero. Para o caso de agentes de formação de poros sólidos, o tamanho das partículas sólidas e a quantidade do agente sólido encapsulado vão determinar a espessura final do invólucro de polímero. Resultarão invólucros de micropartículas mais finos à medida que aumenta o diâmetro das partículas de formação de poros sólidas em relação à fase de gotículas de polímero ou à medida que aumenta o peso de agente de formação de poros sólido em relação à fase de gotículas do polímero o diâmetro das micropartículas sólidas de formação de poros está entre 1 e 95% do diâmetro da fase de gotículas do polímero. O diâmetro do agente de formação de poros sólido pode ser ajustado ao diâmetro apropriado utilizando técnicas correntes tais como moagem a jacto. O peso de agente de formação de poros sólido a ser encapsulado está entre um e 50% (p/p de polímero). 31

Para o caso de um agente de formação de poros que é dissolvido no solvente do polimero, a concentração do invólucro será determinada pela quantidade do agente de formação de poros encapsulado. À medida que aumenta a quantidade total de agente de formação de poros, vai diminuir a espessura final do invólucro.

Para um agente de formação de poros microencapsulado como uma solução aquosa, a espessura final do invólucro de polimero será determinada pelo volume de solução formação de poros encapsulada em relação à fase de polimero, o peso do agente de formação de poros microencapsulado e do tamanho das goticulas da solução de agente de formação de poros em relação ao tamanho das goticulas do polimero. A espessura final do invólucro de polimero vai diminuir à medida que aumenta a proporção em volume da solução formação de poros em relação à fase de polimero. A proporção em volume da solução de formação de poros em relação à fase de polimero está entre 0,002 e 0,5 com proporções preferidas na gama de 0,01 a 0,1. Para uma dada proporção em volume de agente de formação de poros, a espessura do invólucro de polimero vai diminuir à medida que aumenta a concentração do agente de formação de poros na solução de formação de poros a ser encapsulada. 0 peso de agente de formação de poros a ser encapsulado está entre um e 50% (p/p de polimero) . À medida que diminui o tamanho das goticulas da solução de formação de poros a ser encapsulada em relação à solução de polimero, vai aumentar a espessura do invólucro da microparticula final. O tamanho das goticulas da solução de formação de poros pode ser controlado pelo processo utilizado para criar as goticulas. O diâmetro das goticulas de solução de formação de poros está na gama entre um e 95% do diâmetro da fase de goticulas de polimero. Se se utilizar homogeneização para criar as goticulas de formação de poros, a velocidade de homogeneização (500-20.000 rpm), o tempo de homogeneização (0,1-10 minutos), a temperatura da homogeneização 32 (4-50 °C) e o tipo de lâmina utilizada (i. e. cabeça fendida, cabeça quadrada, cabeça circular) vão todos eles determinar o tamanho final das goticulas de solução de formação de poros. As condições de homogeneização são ajustadas para criar o tamanho de goticula de interesse. Se se utilizar sonicação para criar as goticulas da solução de formação de poros liquida na goticula de polímero, o tipo da sonda de sonicação, o tempo de sonicação (0,1-10 minutos), a temperatura de sonicação (4-40 °C), a frequência da sonda e a potência de sonicação podem ser utilizados para alterar o tamanho das goticulas. III. Aplicações em Diagnóstico

As micropartícuias são tipicamente combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável, tais como soro fisiológico tamponado com fosfato, soro fisiológico ou manitol, e em seguida uma quantidade eficaz para detecção é administrada a um doente utilizando uma via apropriada, tipicamente por injecção num vaso sanguíneo (i.v.) ou oralmente. As micropartículas contendo um agente de imagiologia encapsulado podem ser utilizadas em imagiologia vascular, bem como em aplicações para detectar doenças hepáticas e renais, em aplicações de cardiologia, na detecção e caracterização de massas e tecidos tumorais, e na medição da velocidade do sangue periférico. As micropartículas também podem ser ligadas a ligandos que minimizam a adesão a tecidos ou que direccionam as micropartículas para regiões específicas do corpo in vivo tal como descrito acima.

Os métodos e composições descritos acima serão adicionalmente compreendidos com referência aos exemplos seguintes. 33

Exemplo 1: Produção de microparticulas poliméricas com ecogenicidade aumentada. 3,2 gramas de PEG-PLGA (75:25) (IV=0,75 dL/g), 6,4 g de PLGA (50:50) (IV=0,4 dL/g) e 384 mg de diaraquidoílfosfatidilcolina foram dissolvidos em 480 mL de cloreto de metileno. Adicionou-se 20 mL de uma solução de bicarbonato de amónio a 0,18 g/mL à solução do polímero e a mistura de polímero/sal foi homogeneizada a 10.000 rpm durante 2 minutos utilizando um homogeneizador Virtis. A solução foi bombeada a um caudal de 20 mL/min e seca por atomização num secador por atomização Buchi Lab. A temperatura à entrada era de 40 °C e a temperatura à saída era de 20-22 °C. Os diâmetros de partícula variaram de 1-10 micrones quando determinados num contador Coulter com uma média em número de 2,0 micrones. A microscopia electrónica de varrimento demonstrou que as partículas eram genericamente esféricas com superfícies uniformes e crenulações superficiais ocasionais. As microsferas foram preparadas para microscopia electrónica de transmissão embebendo em resina LR White seguida por polimerização sob radiação UV. Foram cortadas secções finas num ultramicrótomo LKB utilizando uma faca de vidro e observadas num Zeiss EM-10 TEM a 60 kv. A espessura do invólucro das microparticulas está na gama entre 200 e 240 nm.

Lisboa, 1 de Março de 2007 34

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para maximização da ecogenicidade de microparticulas de polímero encapsulando um gás, para utilização em imagiologia com ultrassons, compreendendo os passos de: determinação teórica da energia total de retorno em função do material do polímero, do gás, da distribuição de tamanhos das bolhas de gás encapsulado e da diluição, e variação da espessura das paredes das microparticulas de modo a estabelecer a gama de espessuras de parede que resultam nas maiores quantidades de energia total de retorno.
2. 2. Método de preparação de microparticulas, em que a espessura da parede é determinada como na reivindicação 1.
3. 3. Método da Reivindicação 2 em que as microparticulas são formadas por um polímero sintético.
4. 4. Método da Reivindicação 3 em que o polímero sintético é um polímero sintético que não um copolímero de blocos de polietilenoglicol e poli(lactido-co-glicolido).
5. 5. Método da Reivindicação 2 em que as microparticulas poliméricas são formadas por um polímero seleccionado do grupo consistindo em poli (hidroxiácidos), polianidridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, 1 polialquilenos, álcoois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, halogenetos de polivinilo, polivinilpirrolidona, polissiloxanos, poli (álcoois vinílicos), poli (acetato de vinilo), polistireno, poliuretanos, celuloses sintéticas, ácidos poliacrílicos, ácidos poli (butíricos), ácido poli(ácido valérico), e poli (lactido-co-caprolactona), polissacáridos, poli-hidroxialcanoatos, os seus copolímeros e misturas.
6. 6. Método da Reivindicação 2 em que as micropartículas são formadas por um polímero não proteináceo.
7. 7. Método da Reivindicação 2 em que as micropartículas são formadas por um polímero natural.
8. 8. Método da Reivindicação 3 em que a espessura da parede das micropartículas está entre 50 e 600 nm.
9. 9. Método da Reivindicação 7 em que o polímero natural é uma proteína e a espessura da parede das micropartículas está entre 20 e 660 nm. 2
10. 10. Método de qualquer uma das Reivindicações 2 a 9 em que o gás é um gás biocompativel e está presente numa quantidade ecogénica.
11. 11. Método de qualquer uma das Reivindicações 2 a 9 em que o gás é um gás fluorado.
12. 12. Método da Reivindicação 11 em que o gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo em CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SFg, C2F4 e C3F6.
13. 13. Método de qualquer uma das Reivindicações 2 a 9 em que o gás é seleccionado do grupo consistindo em oxigénio, azoto, xénon, árgon, gases fluorados e ar.
14. 14. Método de qualquer uma das Reivindicações 2 a 13, compreendendo ainda a diminuição da atenuação por aumento da espessura da parede das microparticulas.
15. 15. Método de qualquer uma das Reivindicações 2 a 13 compreendendo ainda o aumento da ecogenicidade por determinação da espessura da parede das microparticulas a uma dada diluição das microparticulas. Lisboa, 1 de Março de 2007 3