ES2280094T3 - Metodo para aumentar la ecogenicidad y disminuir la atenuacion de gases microencapsulados. - Google Patents

Abstract

Se ha descubierto que las microcápsulas formadas a partir de polímeros naturales y o sintéticos con paredes más gruesas han incrementado significativamente la ecogenicidad comparadas con las micropartículas que tienen paredes más delgadas. El efecto del espesor de las paredes se ha determinado experimentalmente así como se ha introducido este efecto en una fórmula para uso en la predicción de condiciones óptimas. En la realización preferida, los polímeros utilizados son polímeros biodegradables sintéticos y el espesor de las paredes está entre aproximadamente 100 y 660 nm, aunque puede utilizarse en espesor de pared de aproximadamente 20 nm a más de 500 nm. Las micropartículas se fabrican con un diámetro que permite representar la imagen del tejido objetivo, por ejemplo, con un diámetro entre 0,5 y 8 micras para administración intravascular y diámetro entre 0,5 y 5 nm para administración por vía oral para representar la imagen del tracto gastrointestinal o de otros lúmenes. Los polímeros preferidos son ácidos polihidroxi, tales como ácido poliláctico-co-ácido glicólico, el polilactido o poliglicolido, preferentemente conjugados a a polietilen glicol o a otros materiales que inhiben la asimilación por el sistema reticuloendotelial (RES). Las microesferas pueden utilizarse en una gran variedad de aplicaciones de representación de imágenes por ultrasonidos incluyendo aplicaciones cardiológicas, aplicaciones de perfusión sanguínea así como para representación de imágenes de órganos y venas periféricas.

Description

Método para aumentar la ecogenicidad y disminuir la atenuación de gases microencapsulados.

Antecedentes de la invención

La presente invención se encuentra generalmente en el área de agentes de obtención de imágenes de diagnóstico, y se refiere particularmente a agentes de contraste de obtención de imágenes por ultrasonidos de micropartículas que tienen ecogenicidad aumentada y atenuación disminuida como una función del espesor de la membrana polimérica.

Cuando se usan ultrasonidos para obtener una imagen de estructuras y órganos internos de un ser humano o animal, las ondas de ultrasonidos, ondas de energía de sonido a una frecuencia superior a la discernible por el odio humano, se reflejan a medida que pasan por el cuerpo. Distintos tipos de tejidos corporales reflejan las ondas de ultrasonidos de manera distinta y las reflexiones que se producen por ondas de ultrasonidos que se reflejan en distintas estructuras internas se detectan y se convierten electrónicamente en una representación visual.

Para algunos estados médicos, obtener una imagen útil del órgano o estructura de interés es especialmente difícil porque los detalles de la estructura no son discernibles adecuadamente del tejido circundante en una imagen por ultrasonidos producida mediante reflexión de ondas de ultrasonidos ausentes de agente de intensificación de contraste. La detección y observación de ciertos estados fisiológicos y patológicos pueden mejorarse sustancialmente intensificando el contraste en una imagen por ultrasonidos mediante la inyección o infusión de un agente en un órgano u otra estructura de interés. En otros casos, la detección del movimiento del propio agente de intensificación de contraste es particularmente importante. Por ejemplo, un patrón definido de flujo sanguíneo que se sabe que resulta de anomalías cardiovasculares particulares, solo puede discernirse mediante la infusión de un agente de intensificación de contraste al torrente circulatorio y observando la dinámica del flujo sanguíneo.

Los materiales que son útiles como agentes de contraste para ultrasonidos funcionan teniendo un efecto sobre las ondas de ultrasonidos a medida que pasan a través del cuerpo y se reflejan para crear la imagen a partir de la cual se realiza el diagnóstico médico. Distintos tipos de sustancias afectan a las ondas de ultrasonidos de distinta manera y en grados variables. Es más, algunos de los efectos provocados por agentes de intensificación de contraste pueden medirse y observarse más fácilmente que otros. Seleccionando una composición ideal para un agente de intensificación de contraste, se preferiría una sustancia que tenga el efecto más drástico sobre la onda de ultrasonidos a medida que pasa a través del cuerpo. También, el efecto sobre la onda de ultrasonidos debe medirse fácilmente. Hay dos efectos que pueden verse en una imagen por ultrasonidos: retrodispersión y atenuación del haz.

Retrodispersión: Cuando una onda de ultrasonidos que está pasando a través del cuerpo encuentra una estructura, tal como un órgano u otro tejido corporal, la estructura refleja una parte de la onda de ultrasonidos. Distintas estructuras dentro del cuerpo reflejan la energía de ultrasonidos de distintas maneras y con fuerza variable. Esta energía reflejada se detecta y se usa para generar una imagen de las estructuras a través de las que ha pasado la onda de ultrasonidos. El término "retrodispersión" se refiere al fenómeno en el que se dispersa energía de ultrasonidos de vuelta a la fuente mediante una sustancia con ciertas propiedades físicas.

Se ha reconocido desde hace tiempo que el contraste observado en una imagen de ultrasonidos puede intensificarse mediante la presencia de sustancias que se sabe provocan una gran cantidad de retrodispersión. Cuando una sustancia de este tipo se administra a una parte definida del cuerpo, aumenta el contraste entre la imagen de ultrasonidos de esta parte del cuerpo y los tejidos circundantes que no contienen la sustancia. Está claro que, debido a sus propiedades físicas, distintas sustancias provocan una retrodispersión en grados variables. Por consiguiente, la búsqueda de agentes de intensificación de contraste se ha centrado en sustancias que son estables y no tóxicas y que muestran la máxima cantidad de retrodispersión.

La capacidad de una sustancia para provocar retrodispersión de energía de ultrasonidos depende de las características de la sustancia, tales como su habilidad para comprimirse. Examinando distintas sustancias resulta útil comparar una medida particular de la habilidad de una sustancia para provocar retrodispersión conocida como "sección eficaz de dispersión". La sección eficaz de dispersión de una sustancia particular es proporcional al radio del dispersor, y también depende de la longitud de onda de la energía de ultrasonidos y de otras propiedades físicas de la sustancia, J. Ophir y K.J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, vol. IS, nº 4, págs. 319, 323 (1989).

Evaluando la utilidad de distintas sustancias como agentes de contraste de ultrasonidos, es decir, gases, líquidos, o sólidos, puede calcularse qué agentes tendrán la mayor sección eficaz de dispersión y por consiguiente, que agentes proporcionarán el mayor contraste en una imagen por ultrasonidos. Puede asumirse que la compresibilidad de una partícula sólida es mucho menor que la del medio circundante y que la densidad de la partícula es mayor. Usando esta suposición, se ha estimado la sección eficaz de dispersión de un agente de intensificación de contraste de partícula sólida como 1,75 (Ophir y Parker, citado anteriormente, en 325). Para un dispersor líquido puro, la compresibilidad adiabática y la densidad del dispersor y el medio circundante es más probable que sea aproximadamente igual, lo que daría como resultado que los líquidos tuvieran una sección eficaz de dispersión igual a cero. Sin embargo, los líquidos pueden mostrar algo de retrodispersión si hay presentes grandes volúmenes de líquido. Por ejemplo, si un agente líquido pasa de un vaso muy pequeño a uno muy grande, de tal modo que el líquido ocupa sustancialmente todo el vaso, el líquido puede mostrar una retrodispersión medible. No obstante, se apreciará por los expertos en la técnica que los líquidos puros son dispersores relativamente ineficaces.

La sección eficaz de absorción de un gas es sustancialmente diferente y mayor que la de un líquido o sólido, en parte, porque una burbuja de gas puede comprimirse hasta un grado mucho mayor que un líquido o sólido. Es más, las burbujas de gas libres en líquido muestran un movimiento oscilatorio de tal modo que, a determinadas frecuencias, las burbujas de gas resonarán a una frecuencia próxima a la de las ondas de ultrasonidos comúnmente usadas en la obtención de imágenes médicas. Como resultado, la sección eficaz de dispersión de una burbuja de gas puede ser aproximadamente unas mil veces mayor que su tamaño físico.

Atenuación del haz: Otro efecto que puede observarse por la presencia de ciertos agentes de intensificación de contraste es la atenuación de la onda de ultrasonidos. La intensidad de la onda de ultrasonidos disminuye a medida que la onda pasa a través del volumen de tejido o sangre que contiene el agente de contraste. La disminución de la intensidad de la onda es el resultado de tanto el ultrasonido que se retrodispersa por el agente así como la disipación de la onda a medida que interacciona con el agente de contraste. Si el haz está demasiado atenuado, la potencia devuelta al transductor de las regiones distales al agente de contraste será baja dando lugar a una profundidad pobre de obtención de imágenes. El uso de las diferencias de atenuación de haz en distintos tipos de tejidos se ha tratado como un método de intensificación de imagen. Se ha observado contraste de imagen en la obtención de imágenes convencional debido a las diferencias de atenuación localizadas entre ciertos tipos de tejidos. K.J. Parker y R.C. Wagg, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images", IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), págs. 431-37 (1983); K.J. Parker, R.C. Wagg y R.M. Lerner, "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frecuency Dependence for Tissue Characterization", Radiology, 153(3), págs. 785-88 (1984). Se ha planteado la hipótesis de que medidas de atenuación de una región de tejido realizadas antes y después de la infusión de un agente pueden dar una imagen intensificada. Sin embargo, las técnicas basadas en el contraste de atenuación como medio para medir la intensificación de contraste de un agente líquido, no están muy desarrolladas e, incluso si lo estuvieran, pueden sufrir limitaciones para los órganos internos o estructuras con los que puede usarse esta técnica. Por ejemplo, no es muy probable que una pérdida de atenuación debido a agentes de contraste líquidos pueda observarse en la imagen del sistema cardiovascular debido al alto volumen de agente de contraste líquido que puede ser necesario que esté presente en un vaso dado antes de que pueda medirse una diferencia sustancial en la atenuación.

En resumen, el diagnóstico por ultrasonidos es una herramienta no invasiva potente que puede usarse para obtener información sobre los órganos internos del cuerpo. La llegada de la obtención de imágenes Doppler en escala de grises y en color ha permitido avanzar enormemente el alcance y la resolución de la técnica. Aunque las técnicas para llevar a cabo exámenes de ultrasonidos para el diagnóstico han mejorado significativamente, tal como lo han hecho aquellas para hacer y usar agentes de contraste, aún hay una necesidad para aumentar la resolución de la obtención de imágenes para la perfusión cardíaca y las cavidades cardíacas, órganos sólidos, perfusión renal, perfusión de órganos sólidos y señales Doppler de la velocidad y dirección del flujo sanguíneo durante la obtención de imágenes en tiempo real. El desarrollo de agentes de contraste para ultrasonidos se ha centrado en el uso de gases biocompatibles, o bien como burbujas de gas libre o bien como gases encapsulados en materiales de revestimiento naturales o sintéticos.

Se han usado una variedad de polímeros naturales y sintéticos para encapsular un gas, tal como aire, para su uso como agentes de contraste en la obtención de imágenes. Schneider et al., Invest. Radiol., vol. 27, págs. 134-139 (1992) describe partículas poliméricas rellenas de aire de 3 micras. Se informó que estas partículas eran estables en plasma y en condiciones de presión aplicada. Sin embargo, a 2,5 MHz, su ecogenicidad era baja. Otro tipo de suspensión de microburbujas de gas encapsuladas se ha obtenido de albúmina sonicada. Feinstein et al., J. Am. Coll. Cardiol,. vol. 11, págs. 59-65 (1988). Feinstein describe la preparación de microburbujas que son de tamaño adecuado para el paso transpulmonar con excelente estabilidad in vitro. Sin embargo, estas mircoburbujas son de vida corta in vivo, teniendo una semivida del orden de unos pocos segundos (que es aproximadamente igual a un paso de circulación) porque se disuelven rápidamente en líquidos subsaturados, por ejemplo, sangre. Wibble, J.H. et al., J. Am. Soc. Echocardiogr., vol. 9, págs. 442-451 (1996). Carrol et al. han descrito burbujas de aire encapsuladas en gelatina (Carroll, B.A. et al., Invest. Radiol., vol. 15, págs. 260-266 (1980) y Carroll, B.A. et al., Radiology, vol. 143, págs. 747-750 (1982)), pero debido a sus grandes tamaños (12 y 80 \mum) no es probable que pasasen a través de los capilares pulmonares. También se han descrito microburbujas encapsuladas en gelatina en el documento PCT/US80/00502 por Rasor Associates, Inc. Éstas se forman mediante "coalescencia" de la gelatina.

También se ha informado de microburbujas de aire estabilizadas por microcristales de galactosa (SHU 454 y SHU 508) por Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol. vol. 23 (supl. 1), págs. 302-305 (1998); y Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol., vol. 25 (supl. 1), 160-161 (1990). Las microburbujas duran hasta 15 minutos in vitro pero menos de 20 segundos in vivo. Rovai, D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., vol. 10, págs. 125-134 (1987); y Smith, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., vol. 13, págs. 1622-1628 (1989). Se describen microburbujas de gas encapsuladas dentro de un revestimiento de un material que contiene flúor en el documento WO 96/04018 por Molecular Biosystems, Inc.

La solicitud de patente europea nº 90901933.5 por Schering Aktiengesellschaft describe la preparación y uso de gas o líquidos volátiles microencapsulados para la obtención de imágenes por ultrasonidos, en los que las microcápsulas están formadas por polisacáridos o polímeros sintéticos. La solicitud de patente europea nº 91810366.4 por Sintetica S.A. (0 458 745 A1) describe microglobos de aire o gas unidos mediante una membrana polimérica depositada interfacialmente que puede dispersarse en un vehículo acuoso para una inyección en un animal huésped o para administración oral, rectal o uretral, con fines diagnósticos o terapéuticos. El documento WO 92/18164 de Delta Biotechnology Limited describe la preparación de micropartículas mediante secado por pulverización en condiciones muy controladas en cuanto a temperatura, velocidad de pulverización, tamaño de partícula y condiciones de secado, de una disolución acuosa de proteína para formar esferas huecas que tienen gas atrapado en ellas, para usar en la obtención de imágenes. El documento WO 93/25242 describe la síntesis de micropartículas para la obtención de imágenes ultrasónicas que consiste en un gas contenido dentro de un revestimiento de policianoacrilato o poliéster. El documento WO 92/21382 describe la fabricación de agentes de contraste en micropartícula que incluyen una matriz unida covalentemente que contiene un gas, en el que la matriz es un hidrato de carbono. Las patentes de los EE.UU. nº 5.334.381, 5.123.414 y 5.352.435 concedidas a Unger describen liposomas para su uso como agentes de contraste para ultrasonidos, que incluyen gases, precursores de gas, tal como un precursor gaseoso activado por pH o fotoactivado, así como otros agentes de intensificación de contraste líquidos o sólidos. El documento WO 95/23615 por Nycomed describe microcápsulas para la obtención de imágenes que se forman mediante coacervación de una disolución, por ejemplo, una disolución de proteína que contiene un perfluorocarbono. El documento PCT/US94/08416 por el Massachussets Institute of Technology (Instituto de Tecnología de Massachussets) describe micropartículas formadas por polímeros de bloque de polietilenglicol-poli(lactida-co-glicolida) que tienen agentes de obtención de imágenes encapsulados en ellos, incluyendo gases tales como aire y perfluorocarbonos.

Aunque todos los agentes de contraste de ultrasonidos investigados hasta la fecha, tales como burbujas de gas libre o burbujas de gas encapsuladas, son retrodispersores potentes, estos agentes también presentan un alto grado de atenuación. Atenuación elevada da lugar a una profundidad de obtención de imágenes y pérdida de imágenes de tejido distales con respecto al agente de contraste. En muchos casos, la información de obtención de imágenes puede perderse completamente más allá de las regiones que tienen concentraciones significativas del agente de contraste, por ejemplo, el ventrículo izquierdo. Todos los agentes de contraste de ultrasonidos actualmente en investigación comparten este problema en cierto grado.

Para minimizar el problema asociado con la atenuación de agentes de contraste, los investigadores han recurrido a varios enfoques. Casi siempre, se disminuye la cantidad de agente de contraste administrada para permitir que penetre más del haz de ultrasonidos a través del agente de contraste. Aunque la atenuación es menor, la disminución en la dosis conduce a menos que el contraste óptimo para muchas indicaciones clínicas. Alternativamente, los agentes de contraste de ultrasonidos pueden administrarse como una infusión continua. Esto esencialmente disminuye la concentración local del agente y tiene el problema descrito anteriormente para la reducción de dosis. La infusión continua tiene el inconveniente adicional de requerir una dosis total mayor a lo largo del tiempo y no es fácil de realizar en una práctica clínica. Para compensar las dosis menores, los investigadores han usado la obtención de imágenes armónica para intensificar la relación señal con respecto a ruido. Sin embargo, la obtención de imágenes armónica no es habitual en este momento.

Lo que es más importante, estos enfoques no van encaminados a rectificar el problema fundamental con las propiedades acústicas de los agentes de contraste existentes. Por tanto, para que un agente de contraste tenga alta ecogenicidad es necesario crear un dispersor que dé lugar a potencia devuelta total elevada en el transductor que recibe de las regiones de interés a profundidades más allá de la región inicial que contiene el agente de contraste. La potencia devuelta estará gobernada tanto por la retrodispersión como por la atenuación del agente.

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un método para maximizar la ecogenicidad de micropartículas. Es otro objeto de la presente invención maximizar la retrodispersión y la baja atenuación.

Resumen de la invención

Se ha descubierto que las micropartículas con paredes más gruesas formadas por polímeros naturales o sintéticos tiene una ecogenicidad significativamente aumentada y una atenuación baja si se compara con micropartículas con paredes más delgadas. El efecto del espesor de pared se ha determinado teóricamente y se ha predicho el espesor de pared óptimo. Se produjeron micropartículas que tienen estos espesores. En la realización preferida, los polímeros son polímeros biodegradables sintéticos y los espesores de pared se encuentran entre 50 y 660 nm, aunque pueden usarse espesores de pared de desde aproximadamente 30 nm hasta más de 800 nm. El espesor del revestimiento dependerá del tejido objetivo del que va a obtenerse la imagen y dependerá tanto del volumen de sangre como del volumen del tejido del órgano objetivo. Se fabricaron las micropartículas con un diámetro adecuado para el tejido objetivo del que va a obtenerse la imagen, por ejemplo, con un diámetro de entre 0,5 y 8 micras para administración intravascular y un diámetro de entre 0,5 y 5 mm para administración oral para la obtención de imágenes del tracto gastrointestinal u otras luces. Los polímeros preferidos son polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico-co-ácido glicólico, polilactida poliglicolida o polilactida co-glicolida. Estos materiales pueden conjugarse con el polietilenglicol u otros materiales inhibiendo la absorción por el sistema reticuloendotelial (SRE). Pueden usarse las microesferas en una variedad de aplicaciones de obtención de imágenes por ultrasonidos incluyendo aplicaciones de cardiología, aplicaciones de perfusión sanguínea así como para la obtención de imágenes de vena periférica y órgano.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de la pared en la sección eficaz de dispersión total por unidad de volumen como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de octafluoropropano microencapsulado en polímero sintético a una dilución de 1/1620 suponiendo un espesor de pared de 110 nm y un 0,0034% de C_{3}F_{8} (fracción de volumen de gas total), 165 nm y un 0,0032% de C_{3}F_{8}, 220 nm y un 0,0029% de C_{3}F_{8}, 330 nm y un 0,0025% de C_{3}F_{8}, 440 nm y un 0,0021% de C_{3}F_{8}, 660 nm y un 0,0015% de C_{3}F_{8}, 880 nm y un 0,0010% de C_{3}F_{8}, y 1100 nm y un 0,0007% de C_{3}F_{8}.

La figura 2 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre el coeficiente de atenuación acústica como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de octafluoropropano microencapsulado en polímero sintético a una dilución de 1/1620 suponiendo espesores de pared de 110 nm y un 0,0034% de C_{3}F_{8}, 165 nm y un 0,0032% de C_{3}F_{8}, 220 nm y un 0,0029% de C_{3}F_{8}, 330 nm y un 0,0025% de C_{3}F_{8}, 440 nm y un 0,0021% de C_{3}F_{8}, 660 nm y un 0,0015% de C_{3}F_{8}, 880 nm y un 0,0010% de C_{3}F_{8} y 1100 nm y un 0,0007% de C_{3}F_{8}.

La figura 3 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre la ecogenicidad (potencia devuelta total por unidad de volumen) como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de octafluoropropano microencapsulado en polímero sintético a una dilución de 1/1620 suponiendo espesores de pared de 110 nm y un 0,0034% de C_{3}F_{8}, 165 nm y un 0,0032% de C_{3}F_{8}, 220 nm y un 0,0029% de C_{3}F_{8}, 440 nm y un 0,0021% de C_{3}F_{8} y 660 nm y un 0,0015% de C_{3}F_{8}.

La figura 4 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre la sección eficaz de dispersión total por unidad de volumen como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de aire microencapsulado en polímero natural a una dilución de 1/1620 suponiendo espesores de pared de 40 nm y un 0,0021% de aire (fracción de volumen de gas total), 80 nm y un 0,0020% de aire, 150 nm y un 0,0019% de aire, 300 nm y un 0,0017% de aire, 600 nm y un 0,0013% de aire, y 900 nm y un 0,0010% de aire.

La figura 5 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre el coeficiente de atenuación acústica como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de aire microencapsulado en polímero natural a una dilución de 1/1620 suponiendo espesores de pared de 40 nm y un 0,0021% de aire, 80 nm y un 0,0020% de aire, 150 nm y un 0,0019% de aire, 300 nm y un 0,0017% de aire, 600 nm y un 0,0013% de aire, y 900 nm y un 0,0010% de aire.

La figura 6 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre la ecogenicidad (potencia devuelta total por unidad de volumen) como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de aire microencapsulado en polímero natural a una dilución de 1/1620 suponiendo espesores de pared de 40 nm y un 0,0021% de aire, 80 nm y un 0,0020% de aire, 150 nm y un 0,0019% de aire, 300 nm y un 0,0017% de aire, 600 nm y un 0,0013% de aire, y 900 nm y un 0,0010% de aire.

La figura 7 es una gráfica de los cálculos del efecto del espesor de pared sobre la ecogenicidad como una función de la frecuencia acústica para una distribución de tamaño representativa de aire microencapsulado en polímero natural a una dilución de 1/5400 suponiendo espesores de pared de 15 nm y un 0,0006% de aire, 40 nm y un 0,0006% de aire, 80 nm y un 0,0006% de aire, 150 nm y un 0,0006% de aire, 300 nm y un 0,0005% de aire.

Descripción detallada de la invención

Se describe un método para maximizar la ecogenicidad como función del espesor de pared de micropartículas poliméricas naturales o sintéticas. Las micropartículas son útiles en una variedad de aplicaciones de obtención de imágenes de diagnóstico por ultrasonidos, particularmente en procedimientos de ultrasonidos tales como obtención de imágenes de vasos sanguíneos y ecocardiografía. Aumentar el espesor de pared aumenta significativamente la ecogenicidad si se compara con las mismas micropartículas poliméricas naturales o sintéticas con paredes más delgadas.

I. Cálculo del espesor de polímero óptimo

Con el fin de permitir un mayor entendimiento de la respuesta de microburbujas encapsuladas frente a ultrasonidos de diagnóstico, se usó un modelo matemático (C. Church, J. Acoustical Soc. Amer., 97(3):1510-1521,1995)) para calcular cantidades importantes tales como retrodispersión y coeficientes de atenuación para los valores de parámetros físicos tales como el espesor y la rigidez del revestimiento encapsulador. El revestimiento puede ser un material o bien natural o bien sintético. El modelo consiste en una ecuación del tipo Rayleigh-Plesset (no lineal) para el caso de una burbuja de gas esférica encapsulada por un revestimiento que se comporta colectivamente como un sólido elástico amortiguado, incompresible, continuo. En este documento se usa una solución analítica a esta ecuación, que incluye los componentes armónicos primero y segundo de menor orden, para estimar el efecto del espesor del revestimiento sobre la sección eficaz de dispersión (la razón de la potencia dispersada por las burbujas de gas encapsuladas con respecto a la intensidad del haz acústico incidente) y el coeficiente de atenuación (la velocidad a la que las burbujas de gas eliminan energía acústica del haz) de una suspensión de burbujas de gas encapsuladas. Se usan entonces estos cuantificadores para estimar la potencia devuelta total a partir de una suspensión de burbujas de gas encapsuladas al transductor de ultrasonidos que emite el pulso incidente.

La ecuación del tipo Rayleigh-Plesset que describe la respuesta de una burbuja de gas encapsulada frente a una onda de presión acústica incidente es:

1

en la que R_{1} es el radio de la cavidad rellena de gas, U_{1} es la velocidad radial de la interfase 1 (interfase entre el interior gaseoso y el sólido de encapsulación), R_{2} es el radio exterior del material de encapsulación, \rho_{L} es la densidad del líquido que rodea la burbuja, \rho_{L} es la densidad del revestimiento de encapsulación, P_{G,eq} es la presión del gas en equilibrio dentro de la burbuja, R_{ol} es el radio inicial de la cavidad rellena de gas, P_{\infty}(t) es la presión en el infinito (incluyendo la presión motriz acústica), \sigma_{1} y \sigma_{2} son las tensiones interfaciales en las interfases de gas-revestimiento y revestimiento-líquido, respectivamente, y \mu_{R} y \mu_{L} son las viscosidades eficaces del revestimiento y el líquido circundante, respectivamente,V_{R} = R^{3}_{2} - R^{3}_{1}, G_{R} es la rigidez del revestimiento y R_{el} es la posición de equilibrio sin tensión de la interfase de gas-revestimiento. Puede encontrarse una expresión para la sección eficaz de dispersión \sigma_{D1}, de una burbuja de gas encapsulada suponiendo que la amplitud de pulsación R_{ol}x(t) es pequeña y sustituyendo R_{1}=R_{ol}(1+x) y expresiones relacionadas en la ecuación (1) de Church (1995). La ecuación resultante (2) es:

2

en la que \varpi es la frecuencia (radial) de la onda acústica incidente, \varpi_{0} es la frecuencia de resonancia de la burbuja de gas encapsulada y \delta_{a} es la constante de amortiguamiento de la burbuja de gas encapsulada; se facilitan entre paréntesis, al final de la ecuación, las unidades representativas de la sección eficaz.

La ecuación (2) es adecuada para casos en los que la respuesta de una única burbuja de gas encapsulada sea de interés. En ultrasonidos de diagnóstico, es más habitual estar interesarse por las respuestas de una suspensión de muchos millones de burbujas de gas encapsuladas. Cuando está presente una colección de burbujas de gas encapsuladas con un intervalo de tamaños, la sección eficaz de dispersión total por unidad de volumen puede estimarse sumando sencillamente la contribución de cada burbuja de gas encapsulada en un volumen representativo de la suspensión:

(3)\sigma _{D1tot/vol} = \int^{\infty} _{0} \sigma _{D1} (R_{01}) f (R_{01})dR_{01}

\hskip0,5cm

(cm^{2}/cm^{3})

en la que f(R_{ol})dR_{ol} es el número de burbujas de gas encapsuladas por unidad de volumen con radios de entre R_{ol} y R_{ol}+dR_{ol}. Puede estimarse el coeficiente de atenuación de la suspensión usando el método facilitado por K.W. Commander y A. Prosperetti, "Linear pressure waves in bubbly liquids: Comparison between theory and experiments", J. Acoust. Soc. Amer., 85(2):732-746 (1989). Describiendo un medio burbujeante en cuanto a su presión, densidad, velocidad, etc. promedio, estos autores dedujeron una expresión para c_{m}, la velocidad compleja del sonido en la suspensión. Para el caso de burbujas encapsuladas,

(4)A = 8,686 \left(\frac{\varpi v}{c}\right)(dB/cm)

en la que el factor 8,686 es necesario para convertir de neperio a dB. Las ecuaciones (3) y (4) pueden combinarse para dar la siguiente relación de potencia devuelta:

(5)P = I_{0} \sigma _{D1tot/vol} Gexp \left(-\frac{4A}{8,686}x \right) = I_{0} \sigma _{D1tot/vol} G \ exp \left( - \frac{4\varpi v}{c} x \right)(W/cm)

\newpage

en la que x es ahora la distancia entre el transductor y el volumen de muestra, y el factor G representa factores geométricos adicionales que incluyen apertura del transductor, distancia entre el transductor y el volumen de muestra y el ángulo sólido interceptado por la onda esférica dispersada por cada burbuja en el transductor receptor.

Para hacer uso de estos resultados, es necesario proporcionar una distribución de tamaño de burbuja de gas encapsulada y estimar los valores de parámetros físicos usados en el modelo. Se consideran dos casos. El primero es para micropartículas sintéticas producidas a partir de poliésteres y el segundo es para micropartículas producidas a partir de albúmina. La distribución de tamaño para las partículas sintéticas usada en el presente documento es la medida para micropartículas de PLGA-PEG producidas mediante el secado por pulverización, tal como se describe en el documento de los EE.UU. con número de serie 08/681.710 presentado el 29 de julio de 1996. Los valores de los parámetros de población que caracterizan esta distribución, tal como se determina mediante el análisis Coulter Multisizer® son: concentración total: 2,4 x 10^{9} partículas/ml, diámetro medio en número: 2,2 \mum, diámetro medio en volumen: 4,6 \mum y un 6,5% de fracción de volumen de gas. Los cálculos facilitados a continuación se produjeron suponiendo una dilución de 1/1620. La concentración correspondiente fue de 4,4 x 10^{6} partículas/ml mientras que la fracción de volumen de gas fue aproximadamente de un 0,01%. Los valores de los parámetros usados en el modelo son: gas interno: valores apropiados para perfluoropropano, líquido externo: valores apropiados para el agua, densidad de revestimiento: 1,5 g/cm^{3}, viscosidad de revestimiento: 30 poise, rigidez del revestimiento: 10 MPa y espesor del revestimiento: 22, 55, 110, 165, 220, 330, 440, 660, 880 y 1100 nm.

En la figura 1 se muestran los resultados de los cálculos para la sección eficaz de dispersión total a la frecuencia motriz para el intervalo de espesor de revestimiento de PEG-PLGA empleado. A las frecuencias menores, las secciones eficaces aumentan aproximadamente como la frecuencia a la cuarta potencia, tal como se espera para dispersores pequeños, es decir, Rayleigh. A frecuencias biomédicas mayores, la dispersión total aumenta sólo como frecuencia a la potencia 1,5. A frecuencias aún mayores, la intensidad de la dispersión alcanza una meseta y luego disminuye. El efecto de aumentar el espesor del revestimiento es disminuir la sección eficaz de dispersión total en una cantidad aproximadamente igual, o algo superior, al cambio en espesor proporcional. Por tanto, la sección eficaz de dispersión total mostrada por una suspensión de burbujas de gas encapsuladas puede controlarse haciendo variar el espesor del revestimiento.

En la figura 2 se muestran los resultados de los cálculos para el coeficiente de atenuación como función de la frecuencia motriz a distintos espesores de revestimiento. El efecto de aumentar el espesor del revestimiento es la disminución del coeficiente de atenuación en una cantidad aproximadamente igual, o algo inferior, al cambio en espesor proporcional. Por tanto, puede controlarse el coeficiente de atenuación haciendo variar el espesor del revestimiento.

El hecho de que tanto la sección eficaz de dispersión total y el coeficiente de atenuación aumenten aproximadamente en proporción a la disminución del espesor del revestimiento podría parecer que indica que la variación del espesor del revestimiento no tendría ningún efecto sobre la potencia total que se espera se retrodisperse al transductor que emite una onda acústica a la suspensión de burbujas de gas encapsuladas. Sin embargo, a partir de consideraciones adicionales de la ecuación 5, es evidente que las suspensiones de burbujas de gas encapsuladas que poseen revestimientos más gruesos mostrarán mayor potencia devuelta total. Esto se muestra en la figura 3. La razón para esto es que mientras la potencia retrodispersada total es directamente proporcional a la sección eficaz de dispersión total, también es proporcional a la exponencial del coeficiente de atenuación. Por tanto, si el espesor del revestimiento se disminuye en un factor de dos, el efecto del aumento en la sección eficaz de dispersión total será aumentar la potencia total en aproximadamente dos mientras que el efecto de atenuación será "aumentar" la potencia total en un factor de aproximadamente exp(-2)= 1/7,4, para un descenso neto de aproximadamente el 73%. La potencia devuelta total aumenta a medida que aumenta es espesor del revestimiento.

Se esperan resultados similares para las micropartículas producidas a partir de albúmina, tal como se muestra en las figuras 4-6. Los parámetros usados para la albúmina se detallan en C. Church, J. Acoustical Soc. Amer., 97(3):1510-1521 (1995).

La potencia devuelta total para micropartículas poliméricas sintéticas (figura 3) y para micropartículas de albúmina (figura 6) son para un factor de dilución de micropartícula de 1/1620. El espesor óptimo del revestimiento (definido como aquel espesor que proporciona un máximo en la potencia devuelta total a una profundidad de 2 cm en una suspensión de burbujas de gas encapsuladas) dependerá de la dilución de burbujas de gas encapsuladas (es decir, la concentración de burbujas de gas encapsuladas). Esto se muestra en la figura 7 para micropartículas de albúmina en una dilución de 1/5400. A medida que la suspensión se diluye, es posible utilizar micropartículas con revestimientos más delgados. Esto sucede porque, aunque revestimientos más delgados dan lugar a una atenuación mayor y mayor intensidad de dispersión en una base "por burbuja", esto se compensa suficientemente por el número de micropartículas para dar una potencia devuelta total mayor.

En la siguiente tabla se resumen los espesores óptimos de revestimiento para tres diluciones para micropartículas tanto de albúmina como de PEG-PLGA.

3

Para las burbujas cuya distribución de tamaño es relativamente estable in vivo, la elección de espesor de revestimiento óptimo se basará en la concentración esperada de la partícula en el órgano objetivo de interés. Para mostrar como puede seleccionarse un espesor de revestimiento, se consideran las micropartículas sintéticas anteriormente descritas. Si las micropartículas se dosifican a aproximadamente 0,25 ml/kg y se supone que el volumen de sangre es de 50 ml/kg, las micropartículas se diluirán a 1/200 tras la inyección intravenosa. En el miocardio, la sangre constituye el 10% del volumen compartimental total y las micropartículas se diluyen adicionalmente en el compartimento en un factor de 10. Por tanto, la dilución final será aproximadamente de 1/2000. A esta dilución, el espesor óptimo de revestimiento puede extrapolarse de los datos en la tabla y es 200 nm. Por tanto, el espesor óptimo para usar como un agente de perfusión del miocardio para estos tipos de micropartículas es de aproximadamente 200 nm.

Basándose en esta información, deberían utilizarse revestimientos más gruesos para optimizar el diseño de una micropartícula particular que encapsule al gas, minimizando la atenuación y maximizando la potencia retrodispersada devuelta, permitiendo utilizar altas dosis de agentes de contraste de ultrasonidos con atenuación mínima. Se describen métodos para producir micropartículas con el espesor de pared adecuado.

II. Procedimientos y reactivos para obtener micropartículas con diferentes espesores de revestimiento

Tal como se usa en el presente documento, el término micropartícula incluye microesferas y microcápsulas, así como micropartículas, a menos que se especifique lo contrario. Las micropartículas pueden tener forma esférica o no. Las microcápsulas se definen como micropartículas que tienen un revestimiento polimérico externo que rodea a un núcleo de otro material, en este caso, un gas. Las microesferas son micropartículas que tienen una estructura alveolar formada por poros a través del polímero o combinaciones de estructuras microcapsulares o alveolares que se llenan con gas para fines de obtención de imágenes, tal como se describe más adelante. El término "espesor de la pared" o "espesor del polímero" se refiere al diámetro del polímero desde el interior de la micropartícula hasta el exterior. En el caso de una microcápsula con un núcleo hueco, el espesor de la pared será igual al espesor del polímero. En el caso de una micropartícula porosa que tiene canales o poros en una esfera polimérica, el espesor de la pared puede ser igual a la mitad del diámetro de la micropartícula.

Polímeros

Pueden utilizarse tanto matrices biodegradables como no biodegradables para la microencapsulación de gases, aunque se prefieren las matrices biodegradables, particularmente para la inyección intravenosa. Pueden utilizarse polímeros no erosionables para las aplicaciones de ultrasonidos administradas por vía enteral. Pueden utilizarse polímeros sintéticos o naturales para fabricar las micropartículas. Se prefieren los polímeros sintéticos debido a la síntesis más reproducible y a la degradación controlada. El polímero se selecciona basándose en el tiempo requerido para la estabilidad in vivo, en otras palabras, el tiempo requerido para la distribución al sitio en el que se desea la obtención de imágenes, y el tiempo requerido para la obtención de imágenes.

Polímeros sintéticos representativos son: poli(hidroxiácidos) tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y poli(ácido láctico-co-ácido glicólico), poliglicolidas, polilactidas, combinaciones y copolímeros de polilactida co-glicolida, polianhídridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles tales como poli(etilenglicol), poli(óxidos de alquileno) tales como poli(óxido de etileno), poli(tereftalatos de alquileno) tales como poli(tereftalato de etileno), alcoholes polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, haluros polivinílicos tales como poli(cloruro de vinilo), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poliestireno, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas derivatizadas tales como alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato - butirato de celulosa, acetato - ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa y sal sódica de sulfato de celulosa (denominados conjuntamente en el presente documento como "celulosas sintéticas"), polímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico o copolímeros o derivados de los mismos incluyendo ésteres, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli (metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo) (denominados conjuntamente en el presente documento como "poli(ácidos acrílicos)"), poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), y poli(lactida-co-caprolactona), copolímeros y combinaciones de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, "derivados" incluyen polímeros que tienen sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas rutinariamente por los expertos en la técnica.

Ejemplos de polímeros no biodegradables preferidos incluyen acetato de etilenvinilo, poli(ácido (met)acrílico), poliamidas, copolímeros y mezclas de los mismos.

Ejemplos de polímeros biodegradables preferidos incluyen polímeros de hidroxiácidos tales como ácido láctico y ácido glicólico, polilactida, poliglicolida, polilactida-co-glicolida, y copolímeros con PEG, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactida-co-caprolactona), combinaciones y copolímeros de los mismos.

Ejemplos de polímeros naturales preferidos incluyen proteínas tales como albúmina, hemoglobina, fibrinógeno, poliaminoácidos, gelatina, lactoglobulina y prolaminas, por ejemplo, zeína, y polisacáridos tales como alginato, celulosa y polihidroxialcanoatos, por ejemplo, polihidroxibutirato. Las proteínas pueden estabilizarse mediante reticulación con un agente tal como glutaraldehído o desnaturalización térmica.

Polímeros bioadhesivos de interés particular para su uso en la obtención de imágenes de las superficies mucosas, tal como en el tracto gastrointestinal, incluyen polianhídridos, poli(ácido acrílico), poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo).

Disolventes

Tal como se define en el presente documento, el disolvente polimérico es un disolvente que es volátil o tiene un punto de ebullición relativamente bajo o puede eliminarse a vacío y es aceptable para su administración a seres humanos en cantidades mínimas, tales como cloruro de metileno, agua, acetato de etilo, etanol, metanol, dimetilformamida (DMF), acetona, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF), ácido acético y dimetilsulfóxido (DMSO), o combinaciones de los mismos. En general, el polímero se disuelve en el disolvente para formar una disolución polimérica que tiene una concentración de entre el 0,1 y el 60% en peso con respecto a volumen (p/v), más preferiblemente entre el 0,25 y el 30%.

Gases

Puede incorporarse en las micropartículas cualquier gas biocompatible o farmacológicamente aceptable. El término gas se refiere a cualquier compuesto que es un gas o que puede formar un gas a la temperatura a la que se está llevando a cabo la obtención de imágenes. El gas puede estar compuesto por un único compuesto tal como oxígeno, nitrógeno, xenón, argón, nitrógeno, gases fluorados, o una mezcla de compuestos, tal como el aire. Se prefieren los gases fluorados. Ejemplos de gases fluorados incluyen CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, SF_{6}, C_{2}F_{4}, y C_{3}F_{6}. El perfluoropropano es particularmente preferido porque es farmacológicamente aceptable. Normalmente, las micropartículas huecas llenas de aire se producen mediante los métodos descritos y el aire dentro de las micropartículas puede intercambiarse con cualquiera de los gases biocompatibles descritos. El gas normalmente se intercambia sometiendo a vacío las micropartículas para extraer el aire y después aplicando una atmósfera del gas biocompatible a una temperatura y presión particulares. La temperatura y la presión del gas que va a intercambiarse dependerán de las propiedades de las micropartículas.

Agentes formadores de poros

Los agentes formadores de poros pueden microencapsularse para introducir vacíos internos. El agente formador de poros puede ser un líquido o un compuesto volátil o una sal sublimable que puede eliminarse durante la microencapsulación o puede eliminarse una vez formadas las micropartículas utilizando secado a vacío o liofilización. Tras la eliminación del agente formador de poros, se crean vacíos internos que pueden llenarse con el gas de interés. Puede utilizarse más de un agente formador de poros. El agente o agentes formador(es) de poros puede(n) incluirse en la disolución polimérica en una cantidad de entre el 0,01% y el 90% en peso con respecto a volumen, para aumentar la formación de poros. Por ejemplo, en el secado por pulverización, evaporación de disolvente, un agente formador de poros tal como una sal volátil, por ejemplo, biocarbonato de amonio, acetato de amonio, cloruro de amonio o benzoato de amonio u otra sal que pueda liofilizarse, puede encapsularse como partículas sólidas o como una disolución. Si el agente formador de poros se encapsula como una disolución, la disolución que contiene el agente formador de poros se emulsiona con la disolución polimérica para crear gotitas del agente formador de poros en el polímero. La disolución polimérica que contiene las partículas del agente formador de poros o la emulsión de la disolución del agente formador de poros en el polímero se seca entonces por pulverización o se toma a través de un proceso de evaporación/extracción del disolvente. Una vez que el polímero se precipita, las micropartículas endurecidas pueden congelarse y liofilizarse para extraer el agente formador de poros residual o las micropartículas endurecidas pueden secarse a vacío para extraer el agente formador de poros.

Aditivos para estabilizar el gas encapsulado Lípidos

En general, la incorporación de compuestos durante la producción de las micropartículas que son hidrófobas y, en una cantidad eficaz, por lo que se limita la penetración y/o la captación de agua por las micropartículas, es eficaz en estabilizar la ecogenicidad de las micropartículas poliméricas que tienen gas encapsulado en ellas, especialmente gases fluorados gases tales como los perfluorocarbonos. Los lípidos que pueden utilizarse para estabilizar el gas dentro de las micropartículas poliméricas incluyen las siguientes clases de lípidos: ácidos grasos y derivados, mono, di y triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol y derivados de esteroides, terpenos y vitaminas. Los ácidos grasos y derivados de los mismos pueden incluir ácidos grasos saturados e insaturados, ácidos grasos en número par e impar, isómeros cis y trans y derivados de ácidos grasos, incluyendo alcoholes, ésteres, anhídridos, hidroxiácidos grasos y prostaglandinas. Los ácidos grasos saturados e insaturados que pueden utilizarse incluyen moléculas que tienen entre 12 átomos de carbono y 22 átomos de carbono tanto en la forma linear como en la ramificada. Ejemplos de ácidos grasos saturados que pueden utilizarse incluyen los ácidos láurico, mirístico, palmítico y esteárico. Ejemplos de ácidos grasos insaturados que pueden utilizarse incluyen ácidos láuricos fisetérico, miristoleico, palmitoleico, petroselínico y oleico. Ejemplos de ácidos grasos ramificados que pueden utilizarse incluyen los ácidos isoláurico, isomirístico, isopalmítico e isoesteárico e isoprenoides. Los derivados de ácidos grasos incluyen el ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoico, ácido N-[12-(((7'dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metil-amino)octadecanoíl]-2-aminopalmítico, N-succinil-dioleoilfosfatidiletanolamina y palmitoíl-homocisteína; y/o combinaciones de los mismos. Mono, di y triglicéridos o derivados de los mismos que pueden utilizarse incluyen moléculas que tienen ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos entre 6 y 24 átomos de carbono, digalactosildiglicérido, 1,2-dioleoíl-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoíl-sn-3 succinilglicerol; y 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.

Fosfolípidos que pueden utilizarse incluyen ácidos fosfatídicos, fosfatidilcolinas tanto con lípidos saturados como insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, lisofosfatidil derivados, cardiolipina, y \beta-acil-y-alquil-fosfolípidos. Ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidilcolinas, tales como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipentadecanoilfosfatidilcolina dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibehenoilfosfatidilcolina (DBPC), ditricosanoilfosfatidilcolina (DTPC), dilignoceroilfatidilcolina (DLPC); y fosfatidiletanolaminas tales como dioleoilfosfatidiletanolamina o 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. También pueden utilizarse fosfolípidos sintéticos con cadenas de acilo simétricas (por ejemplo, con una cadena de acilo de 6 carbonos y otra cadena de acilo de 12 carbonos).

Esfingolípidos que pueden utilizarse incluyen ceramidas, esfingomielinas, cerebrósidos, gangliósidos, sulfátidos y lisosulfátidos. Ejemplos de esfingolípidos incluyen los gangliósidos GM1 y GM2.

Esteroides que pueden utilizarse incluyen colesterol, sulfato de colesterol, hemisuccinato de colesterol, 6-(5-colesterol 3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-deoxi-1-tio-\alpha-D-galactopiranósido, 6-(5-colesten-3\beta-tloxi)hexil-6-amino-6-deoxil-1-tio-\alpha-D-manopiránosido y (4'-trimetil-35- amonio)butanoato de colesterilo.

Compuestos lipídicos adicionales que pueden utilizarse incluyen tocoferol y derivados, y aceites y aceites derivatizados, tales como estearilamina.

Puede utilizarse una variedad de lípidos catiónicos, tales como DOTMA, cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio; DOTAP, 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano; y DOTB, 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoíl-sn-glicerol.

Los lípidos más preferidos son los fosfolípidos, preferiblemente DPPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC y lo más preferiblemente DPPC, DAPC y DBPC.

El contenido en lípidos oscila desde 0,01 - 30 (p del lípido/p del polímero); lo más preferiblemente entre 0,1 - 12 (p del lípido/p del polímero). Los lípidos pueden añadirse a la disolución polimérica antes de la formación de las micropartículas.

Otros compuestos hidrófobos

Otros compuestos hidrófobos preferidos incluyen aminoácidos tales como triptófano, tirosina, isoleucina, leucina y valina, compuestos aromáticos tales como un alquilparabeno, por ejemplo, metilparabeno y ácido benzoico.

Micropartículas y métodos para la fabricación de las mismas

En la realización más preferida, las micropartículas se producen mediante secado por pulverización. El polímero y el agente formador de poros se pulverizan a través de una boquilla y el disolvente polimérico se elimina por evaporación mediante un gas de secado caliente. Pueden utilizarse otras técnicas, tales como extracción del disolvente, encapsulación por fusión en caliente y evaporación del disolvente, para producir micropartículas que tienen un espesor de la pared del diámetro apropiado para optimizar la ecogenicidad. Los agentes formadores de poros se utilizan normalmente para crear los vacíos internos. Los agentes formadores de poros se microencapsulan y se eliminan tras la formación de la micropartícula mediante liofilización o secado a vacío. La evaporación del disolvente se describe por E. Matiowitz, et al., J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L. R. Beck, et al., Fertil. Steril., 31, 545 (1979); y S. Benita, et al., J. Pharm. Sci., 73, 1721 (1984). La microencapsulación por fusión en caliente se describe por E. Matiowitz, et al., Reactive Polymers, 6, 275 (1987).

Puede añadirse una variedad de tensioactivos durante la síntesis de las micropartículas. Emulsionantes o tensioactivos ejemplo que pueden utilizarse (0,1 - 5% en peso) incluyen la mayoría de los emulsionantes fisiológicamente aceptables. Los ejemplos incluyen las formas naturales y sintéticas de sales biliares o ácidos biliares, ambos conjugados con aminoácidos y no conjugados, tales como taurodesoxicolato y ácido cólico.

Tamaño de la micropartícula

En una realización preferida para la preparación de micropartículas inyectables que pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar, las micropartículas deben tener un diámetro de entre aproximadamente uno y diez micras. Las micropartículas más grandes pueden obstruir el lecho pulmonar, y las micropartículas más pequeñas pueden no proporcionar ecogenicidad suficiente. Las micropartículas más grandes son útiles para la administración mediante vías distintas a la inyección, por ejemplo vía oral (para la evaluación del tracto gastrointestinal), aplicación a otras superficies mucosas (rectal, vaginal, oral, nasal) o mediante inhalación. El tamaño de partícula preferido para la administración oral es de entre aproximadamente 0,5 micras y 5 mm. El análisis del tamaño de partícula puede llevarse a cabo en un contador Coulter, mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido o microscopía electrónica de transmisión.

Control del espesor de la pared

El espesor preferido de la pared es superior a 20 nm, más preferiblemente en el intervalo de entre 160 y 220 nm hasta aproximadamente 700 nm, en cuyo punto la ventaja derivada por el aumento del espesor de la pared comienza a disminuir. Para cada una de las técnicas de microencapsulación descritas anteriormente, hay varias formas en las que puede controlarse el espesor final del revestimiento del la micropartícula polimérica.

Concentración del polímero

El espesor final del revestimiento polimérico puede aumentarse mediante el aumento de la concentración de la fase polimérica durante el proceso de encapsulación. Esto es aplicable a polímeros sintéticos o a polímeros naturales, tales como proteínas o polisacáridos. Para un tamaño de gotita de polímero dado, utilizando una disolución polimérica más concentrada se dará como resultado más polímero por unidad de volumen de la gotita y, por tanto, un revestimiento más grueso. La concentración del polímero para lograr un espesor de revestimiento dado dependerá principalmente del tipo de polímero, del disolvente polimérico, de la solubilidad del polímero en el sistema de disolvente y de la temperatura a la que se realiza la encapsulación. Pueden utilizarse concentraciones de polímero en el intervalo de entre el 0,1 y el 60%. Las concentraciones de polímero preferidas están en el intervalo de entre el 0,5 y el 30%.

Tal como se describió anteriormente, pueden utilizarse agentes formadores de poros tales como sales volátiles o sublimables, para producir micropartículas con vacíos internos. El agente formador de poros puede microencapsularse como sólidos o como una disolución acuosa o puede codisolverse en la disolución polimérica. Para el caso de agentes formadores de poros sólidos, el tamaño de las partículas sólidas y la cantidad del agente sólido encapsulado regirán el espesor final del revestimiento polimérico. Los revestimientos más finos de las micropartículas se obtendrán cuando el diámetro de las partículas formadoras de poros sólidas se aumentan con respecto a la fase de gotita polimérica o cuando se aumenta el peso del agente formador de poros sólido con respecto a la fase de gotita polimérica. El diámetro de las micropartículas de formación de poros sólidas está entre el 1 y el 95% del diámetro de la fase de gotita polimérica. El diámetro del agente formador de poros sólido puede ajustarse al diámetro apropiado utilizando técnicas convencionales, tales como mediante el molino de chorro. El peso del agente formador de poros sólido que va a encapsularse está entre el uno y el 50% (p/p de polímero).

Para el caso de un agente formador de poros que se disuelve en el disolvente polimérico, la concentración del revestimiento se regirá por la cantidad del agente formador de poros encapsulado. A medida que se aumenta la cantidad total del agente formador de poros, el espesor final del revestimiento disminuirá.

Para un agente formador de poros microencapsulado como una disolución acuosa, el espesor final del revestimiento polimérico se regirá por el volumen de la disolución formadora de poros encapsulada con respecto a la fase polimérica, el peso del agente formador de poros microencapsulado y el tamaño de gotita de la disolución del agente formador de poros con respecto al tamaño de gotita polimérica. El espesor final del revestimiento polimérico disminuirá a medida que aumenta la razón de volumen de la disolución formadora de poros con respecto a la fase polimérica. La razón de volumen de la disolución formadora de poros con respecto a la fase polimérica es de entre 0,002 y 0,5, con razones preferidas en el intervalo de 0,01 a 0,1. Para una razón de volumen dada del agente formador de poros, el espesor del revestimiento polimérico disminuirá a medida que aumente la concentración del agente formador de poros en la disolución formadora de poros que va a encapsularse. El peso del agente formador de poros que va a encapsularse es de entre el uno y el 50% (p/p de polímero). A medida que disminuye el tamaño de gotita de la disolución formadora de poros que va a encapsularse con respecto a la disolución polimérica, aumentará el espesor del revestimiento de la micropartícula final. El tamaño de la gotita de la disolución formadora de poros puede controlarse mediante el procedimiento utilizado para crear las gotitas. El diámetro de las gotitas de la disolución formadora de poros está en el intervalo de entre el uno y el 95% del diámetro de las gotitas de la fase polimérica. Si se utiliza homogeneización para crear las gotitas formadoras de poro, la velocidad de la homogeneización (500 - 20.000 rpm), el tiempo de la homogeneización (0,1 - 10 minutos), la temperatura de la homogeneización (4 - 50ºC) y el tipo de paletas (es decir, cabezal ranurado, cabezal cuadrado, cabezal circular) utilizadas regirán el tamaño final de las gotitas de la disolución formadora de poros. Las condiciones de homogeneización se ajustan para crear el tamaño de la gotita de interés. Si se utiliza sonicación para crear las gotitas de la disolución formadora de poros líquida en la gotita de polímero, el tipo de sonda de sonicación, el tiempo de la sonicación (0,1 - 10 minutos), la temperatura de la sonicación (4 - 40ºC), la frecuencia de la sonda y la potencia de la sonicación pueden utilizarse para modificar el tamaño de la gotita.

III. Aplicaciones diagnósticas

Las micropartículas normalmente se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato o solución salina o manitol, después se administra una cantidad eficaz para la detección administrada a un paciente utilizando una vía apropiada, normalmente mediante inyección en un vaso sanguíneo (i.v.) o por vía oral. Las micropartículas que contienen un agente de obtención de imágenes encapsulado pueden utilizarse en la obtención de imágenes vasculares, así como en aplicaciones para detectar enfermedades hepáticas y renales, en aplicaciones de cardiología, en detectar y caracterizar masas y tejidos tumorales, y en medir la velocidad de la sangre periférica. Las micropartículas también pueden unirse con ligandos que minimizan la adhesión tisular o que dirigen las micropartículas a regiones específicas del cuerpo in vivo, tal como se describió anteriormente.

Los métodos y las composiciones descritos anteriormente se entenderán adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Producción de micropartículas poliméricas que tienen ecogenicidad aumentada

Se disolvieron 3,2 gramos de PEG-PLGA (75:25) (VI (viscosidad intrínseca) = 0,75 dL/g), 6,4 g de PLGA (50:50) (VI = 0,4 dL/g) y 384 mg de diaraquidoilfosfatidilcolina en 480 ml de cloruro de metileno. Se añadieron 20 ml de una disolución de biocarbonato de amonio 0,18 g/ml a la disolución polimérica y la mezcla de polímero/sal se homogeneizó a 10.000 RPM durante 2 minutos utilizando un homogeneizador Virtis. Se bombeó la disolución a una velocidad de flujo de 20 ml/min y se secó por pulverización utilizando un secador por pulverización de Buchi Lab. La temperatura de la entrada fue de 40ºC y la temperatura de la salida fue de 20 - 22ºC. Los diámetros de partícula oscilaron desde 1 - 10 micras cuando se clasificaron por tamaño en un contador de partículas Coulter Counter con una media promedio en número de 2,0 micras. La microscopía electrónica de barrido demostró que las partículas eran generalmente esféricas con superficies lisas y crenulaciones superficiales ocasionales. Las microesferas se prepararon para la microscopía electrónica de transmisión incluyéndolas en resina blanca LR seguido por polimerización bajo luz UV. Se cortaron las secciones delgadas en un ultramicrotomo LKB utilizando cuchilla de vidrio y se visualizaron en un MET (microscopio electrónico de transmisión) Zeiss EM-10 a 60 kv. El espesor del revestimiento de las micropartículas está en el intervalo de entre 200 y 240 nm.

Claims (15)

1. \global\parskip0.930000\baselineskip

   1. Método para maximizar la ecogenicidad de micropartículas de polímero que encapsulan un gas para su uso en la obtención de imágenes por ultrasonidos que comprende las etapas de:

   determinar teóricamente la potencia total devuelta como una función del material polimérico, el gas, la distribución de tamaño de la burbuja de gas encapsulada y la dilución, y

   variar el espesor de pared de las micropartículas de modo que se establece un intervalo del espesor de pared que da como resultado las mayores cantidades de potencia total devuelta.
2. 2. Método para preparar micropartículas, en el que el espesor de pared se determina tal como se explica en la reivindicación 1.
3. 3. Método según la reivindicación 2, en el que las micropartículas se forman a partir de un polímero sintético.
4. 4. Método según la reivindicación 3, en el que el polímero sintético es un polímero sintético distinto de un copolímero de bloque de polietilenglicol y poli(lactido-co-glicolido).
5. 5. Método según la reivindicación 2, en el que las partículas poliméricas se forman a partir de un polímero seleccionado del grupo que consiste en

   poli(hidroxiácidos),

   polianhídridos,

   poliortoésteres,

   poliamidas,

   policarbonatos,

   polialquilenos,

   alcoholes polivinílicos,

   polivinil éteres,

   ésteres polivinílicos,

   haluros polivinílicos,

   polivinilpirrolidona,

   polisiloxanos,

   poli(alcoholes vinílicos),

   poli(acetato de vinilo),

   poliestireno,

   poliuretanos,

   celulosas sintéticas,

   ácidos poliacrílicos,

   poli(ácidos butíricos),

   poli(ácido valérico), y

   poli(lactido-co-caprolactona),

   polisacáridos,

   polihidroxialcanoatos

   copolímeros y mezclas de los mismos.

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6. 6. Método según la reivindicación 2, en el que las micropartículas se forman a partir de un polímero no proteico.
7. 7. Método según la reivindicación 2, en el que las micropartículas se forman a partir de un polímero natural.
8. 8. Método según la reivindicación 3, en el que el espesor de pared de las micropartículas se encuentra entre 50 y 660 nm.
9. 9. Método según la reivindicación 7, en el que el polímero natural es una proteína y el espesor de pared de las micropartículas se encuentra entre 20 y 600 nm.
10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que el gas es un gas biocompatible y está presente en una cantidad ecogénica.
11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que el gas es un gas fluorado.
12. 12. Método según la reivindicación 11, en el que el gas fluorado se selecciona del grupo que consiste en CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, SF_{6}, S_{2}F_{4} y C_{3}F_{6}.
13. 13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que el gas se selecciona del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, xenón, argón, gases fluorados y aire.
14. 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, que comprende además disminuir la atenuación mediante el aumento del espesor de pared de las micropartículas.
15. 15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, que comprende además aumentar la ecogenicidad mediante la determinación del espesor de pared de las micropartículas a una dilución particular de las micropartículas.