DE69432370T2

DE69432370T2 - Proteinverkapselte, unlösliche, gasenthaltende Mikrokügelchen, deren Herstellung und Anwendung als bildgebende Mittel für Ultraschall

Info

Publication number: DE69432370T2
Application number: DE69432370T
Authority: DE
Inventors: Karel J. San Diego Lambert; Sheila Benay San Diego Podell; Edward G. Escondido Jablonski; Carl San Diego Hulle; Kenneth Cardiff Hamilton; Rolf La Jolla Lohrmann
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Current assignee: Molecular Biosystems Inc
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-04
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: FI956312A; AU683485B2; JPH08509002A; KR960703624A; EP0885615A1; EP0885615B1; TW283646B; JP2002167338A; NO955351D0; PL312387A1; KR100218642B1; CA2166459A1; WO1995001187A1; CN1129910A; IL110185A0; AU7218494A; JP3809368B2; JPH11139995A; ES2134321T3; ES2195247T3

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von bildgebenden Mitteln für Ultraschall, die aus proteinhaltigen Mikrokügelchen, die Gase verkapseln, zusammengesetzt sind.
Hintergrund
Diagnostische Ultraschall-Bildzeugung basiert auf dem Prinzip, dass Wellen von Schallenergie auf einen Bereich von Interesse fokussiert und in solch einer Art und Weise reflektiert werden können, dass sie ein Bild davon erzeugen. Ein Ultraschallscanner wird auf einer Körperoberfläche, die über dem abzubildenden Bereich liegt, plaziert, und Ultraschallenergie in Form von Schallwellen wird auf diesen Bereich gerichtet. Der Scanner detektiert reflektierte Schallwellen und übersetzt die Daten in Videobilder. Wenn Ultraschallenergie durch eine Substanz gesendet wird, hängt die Menge an reflektierter Energie von der Geschwindigkeit der Übertragung und den akustischen Eigenschaften der Substanz ab. Veränderungen in den akustischen Eigenschaften der Substanz (z. B. Veränderungen der akustischen Impedanz) treten hauptsächlich an Grenzschichten verschiedener akustischer Dichten, wie Flüssigkeit-Feststoff oder Flüssigkeit-Gas, auf. Deshalb erzeugen Organstrukturen Schallreflexionssignale zur Detektion mit dem Ultraschallscanner, wenn Ultraschallenergie durch Gewebe geleitet wird. Diese Signale können durch die geeignete Verwendung eines Kontrastmittels verstärkt werden.
Bildgebende Mittel für Ultraschall von spezieller Bedeutung nutzen die Verwendung von Gas wegen seiner Wirksamkeit als Ultraschallreflektor. Resonanz-Gasblasen streuen Schall tausend mal wirksamer als ein festes Teilchen der gleichen Größe. Ophir und Parker beschreiben zwei Arten von gasenthaltenden bildgebenden Mitteln, als da sind: (1) freie Luftblasen und (2) verkapselte Luftblasen (Ultrasound in Medicine and Biology 15 (4) (1989), 319–333). Allerdings sind freie Gasblasen der geeigneten Größe zu kurzlebig, um für die meisten in vivo-Anwendungen wirksam zu sein (Meltzer et al., Ultrasound in Medicine and Biology 6 (1980), 263–269). Ophir und Parker weisen darauf hin, dass die Entwicklung von verkapselten Gasblasen ein Versuch war, dieses Problem zu lösen.
Die zweite Hauptklasse von gasenthaltenden Ultraschallkontrastmitteln, die von Ophir und Parker beschrieben werden, sind die verkapselten Mikrobläschen, nachstehend als „Mikrokügelchen" bezeichnet. Die Gasblase ist von einer Hülle umgeben, die aus einem Protein oder anderem bioverträglichem Material besteht. Ein gebräuchliches, im Handel erhältliches Mikrokügelchen-Kontrastmittel ist ALBUNEX^® (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA), das aus mit Humanserumalbumin verkapselten Luft-Mikrokügelchen besteht. Siehe U.S.-Patent Nrn. 4,572,203 und 4,844,882.
Es zeigt sich, dass Luft-Mikrokügelchen schnell an Echofähigkeit verlieren, wenn sie Drücken von 150 mm Hg, wie man ihnen während der Injektion und Zirkulation in vivo begegnen würde, ausgesetzt werden (N. deJong et al., Ultrasound Med. Biol. 19 (1993), 279–288). Die derzeitige Verkapselungstechnologie hat noch ein als Ultraschallkontrastmittel geeignetes Material herzustellen, dass in vivo für die meisten gewünschten Anwendungen lange genug überlebt. Tatsächlich muss ein Mittel, dass die Herzmuskelwand abzubilden vermag, vorübergehenden Druckpulsen von mindestens 250 mm Hg (etwa 5 psig) widerstehen.
Im Bemühen, das Druckinstabilitätsproblem von Mikrokügelchen zu lösen, haben sich jüngste Lehren darauf konzentriert, die Hülle zu verbessern, da man glaubt, dass die Hüllen oder – „membranen" von Mikrokügelchen unter Druck zu zerbrechlich oder spröde sind, was in vivo zu einem schnellen Zusammenbruch führt. Giddey (PCT/EP91/01706; PCT 92/05806) erklärte „Wegen ihrer Starrheit können die Membranen plötzlichen Druckänderungen, denen die Mikrokügelchen zum Beispiel während ihrer Reise durch den Blutstrom ausgesetzt sein können, wobei diese Druckänderungen von Herzschlägen herrühren, nicht standhalten." Um die Starrheit der Hülle zu überwinden, schlug er vor, Luft in einer Proteinlösung, die einen großen Prozentsatz eines Verdickungsmittels (40% – 80% Polyole) enthält, vorzuemulgieren und sie mechanischer Scherung in einem Hochgeschwindigkeitsmischer zu unterwerfen. Bläschen der geeigneten Größe werden gesammelt und mit einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel beschichtet, um sie in einer weichen Hülle zu stabilisieren.
Holmes (PCT WO 92/17213) schlug vor, die in vivo Stabilität von Protein-Mikrokügelchen durch Verstärkung der Hülle mit bioabbaubaren chemischen Vernetzungsmitteln zu erhöhen.
Bichon et al. (EPA 90/810367) und Schneider et al. (Inv. Radiol. 27 (1992), 134–139) beschreiben die Herstellung von porösen (5 bis 2000 nm Porengröße) polymeren „Mikroballons". Sie berichten in der Europäischen Patentanmeldung, daß „die mikroporöse Struktur der Hülle der Mikroballons ein Faktor von Elastizität ist, d. h. die Mikrokügelchen können Druckänderungen leicht hinnehmen, ohne zu brechen."
Erbel und Zotz (U.S.-Patent Nr. 5,190,982) beschreiben eine vernetzte polymere Mikrokapsel, in der Luft eingeschlossen ist.
Schneider et al. (EPA 554,213) zeigen an, dass die Druckbeständigkeit von Mikrokügelchen dadurch verbessert werden kann, dass mindestens ein Teil des Gases, das verkapselt ist, ein Gas ist, das ein Verhältnis S_Gas/MW_Gas ≤ 0.0031 aufweist, wobei S_Gas die Wasserlöslichkeit des Gases in Liter/Liter ist und MW_Gas das mittlere Molekulargewicht des Gases in Dalton ist. Tabelle 1 des Dokuments listet N₂, SF₆, CBrF₃ und CF₄ als diese Kriterien erfüllend auf. Das Dokument lehrt, dass diese Mikrokügelchen auf zwei Weisen hergestellt werden können. Die erste ist ein Zweistufenverfahren, bei dem luftenthaltende Mikrokügelchen mit einem bekannten Verfahren hergestellt werden und die Luft durch das unlösliche Gas durch ein Gasaustauschverfahren, z. B. durch Inkubieren der luftgefüllten Mikrokügelchen unter einer Atmosphäre des unlöslichen Gases für eine ausreichende Zeit, ersetzt wird.
Die zweite ist ein Einstufenverfahren, bei dem Mikrokügelchen mit dem Verfahren von EPA 324,938 (siehe Beispiel 1 des Dokuments) unter Verwendung eines unlöslichen Gases anstelle von Luft hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wurde das Gas über eine Lösung eines hüllenbildenden Materials (z. B. eine Lösung von Albumin) geleitet, während eine Ultraschallspitze in das Gefäß abgesenkt und dann entfernt wurde.
Leider ist keines dieser Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen von proteinverkapselten, mit unlöslichem Gas gefüllten Mikrokügelchen praktisch verwendbar. Unter Verwendung des ersten (Zweistufen)-Verfahrens kann nur eine kleine Zahl von luftgefüllten Albumin-Mikrokügelchen den Kontakt mit einer unlöslichen Gasumgebung überleben (der zweite Schritt des Zweistufenverfahrens). Der Ausstrom von löslichen Gasen (Luft) aus den Mikrokügelchen ist größer als der Einstrom von unlöslichem Gas in die Mikrokügelchen, was zu einem vollständigen Zusammenbruch der Mikrokügelchen führt, der nur Hüllenbruchstücke zurücklässt. Dieser Effekt ist bei den unlöslicheren Gasen, wie Perfluorethan, besonders ausgeprägt. Das zweite Verfahren erzeugt Mikrokügelchen, die Volumen verlieren, wenn Druck angewendet wird, und keine Wiederherstellung nach dem Aufheben des Drucks zeigen. Man glaubt, dass beide Verfahren minderwertige Mikrokügelchen erzeugen, da die Mikrokügelchen deutliche Mengen an Luft enthalten und dass die Gegenwart von Luft während der Bildung die Vorteile des Herstellens der Mikrokügelchen in Gegenwart von unlöslichem Gas allein verringern könnte. Es wird in diesem Zusammenhang bemerkt, dass frühere Forscher die Gegenwart von Sauerstoff für die Herstellung von Mikrokügelchen durch Hohlraumbildung als notwendig angesehen haben.
Suslick berichtete, dass mit Ultraschall verbundene Hohlraumbildung nur in Gegenwart von Sauerstoff als ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen geeignet sei. In ausführlichen Untersuchungen berichteten Suslick et l. (Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 7708–7710; J. Am. Chem. Soc. 112 (1990), 7807–7809), dass Sauerstoff an der hohlraumbildungsinduzierten intermolekularen Umlagerung von Disulfidbrücken teilhat, die für eine stabile Proteinhülle benötigt werden. Suslick gibt an „Wir finden, daß Mikrokapselbildung durch das Fehlen von O₂ stark gehemmt wird." Er erklärt weiter „Wenn die Reaktion unter einer inerten Atmosphäre (He, Ar oder N₂) durchgeführt wird, werden keine Mikrokügelchen gebildet." „Experimentell werden nur dann hohe Konzentrationen an Mikrobläschen synthetisiert, wenn die Reaktion unter O₂ oder Luft durchgeführt wird." Siehe auch U.S. 4,774,958. Die frühere Überzeugung, daß Luft zur Erzeugung von AlbuminMikrokügelchen notwendig ist, wurde auch in Holmes erwähnt (PCT WO 92/17213). Darin wurde die Herstellung von Mikrokügelchen offenbart, die verschiedene Gase mit niedrigem Molekulargewicht enthielten. Allerdings gaben die Autoren, als sie die Herstellung von Albumin-Mikrokügelchen durch Beschallung beschrieben, an, „Ein weiteres bewährtes beschriebenes Verfahren, d. h. US-A-4,774,958, zur Herstellung eines gasenthaltenden Bläschens, besteht in der Beschallung des Gemisches in Gegenwart von Luft." (Hervorhebung hinzugefügt).
Nun wurde gefunden, dass hohe Konzentrationen von proteinhaltigen Mikrokügelchen, die relativ unlösliches Gas einschließen, durch Ultraschall oder mechanische Hohlraumbildungsverfahren in Gegenwart des unlöslichen Gases ohne die Gegenwart von Sauerstoff hergestellt werden können. Solche Mikrokügelchen zeigen eine überraschende und wesentlich verbesserte Stabilität und Elastizität gegenüber angewendetem Druck bei besserer oder gleichwertiger Echofähigkeit. Die proteinhaltige Hülle verhindert die Koaleszenz und widersteht der Ausdehnung aufgrund von Diffusion von gelösten atmosphärischen Gasen aus dem umgebenden Milieu.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von proteinumhüllten Mikrokügelchen, das mechanische Energie in Form von Scherkräften verwendet. Diese Kräfte sind für das mechanische Scheren eines Flüssigkeits-Gas-Gemisches unter Bildung einer Mikrobläschensuspension verantwortlich und auch für das Verursachen von hydrodynamischer Hohlraumbildung, die Energie freisetzt. Diese Energie kann von der umgebenden Flüssigkeit absorbiert werden, um lokale Proteindenaturierung und Abscheidung an einer Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche zu bewirken, wobei einzelne Mikrokügelchen gebildet werden. Hydrodynamische Hohlraumbildung kann von Ultraschall- (akustischer) Hohlraumbildung auf der Basis der Art unterschieden werden, in der jede Druckänderungen in Flüssigkeitssystemen erzeugt, die zur Freisetzung von Energie führen. Bei der ersteren werden Druckänderungen durch den schnellen Fluss einer Flüssigkeit durch eine Öffnung oder über eine Oberfläche erzeugt, wohingegen bei der letzteren Zyklen von hochfrequenten Schallwellen schnelle lokale Druckänderungen erzeugen. (Siehe F. Ron Young, Cavitation, McGraw-Hill Book Co. London (1989), S. 4–5.) Zusätzlich wird hydrodynamische Hohlraumbildung in einer fließenden Flüssigkeit, d. h. einer Flüssigkeit, die durch oder über ein stationäres Objekt fließt, erzeugt. Zum Vergleich wird akustische Hohlraumbildung in einem Flüssigkeitssystem erzeugt, das während genügend Zyklen zunehmenden und abnehmenden Drucks (positiver und Saugdruck) stationär bleiben muß, um Hohlraumbildung zu zeigen. Sogar in einem Durchflussbeschallungssystem, wie in dem im U.S.-Patent Nr. 4,957,656 beschriebenen, macht es die Verweilzeit in einem akustischen Hohlraumbildungsverfahren schwerer, sie zu steuern, als in einem echten hydrodynamischen Hohlraumbildungssystem mit Einrichtungsdurchlauf, wie es in der vorliegenden Endung beschrieben ist.
Mikrobläschen-Suspensionen, die durch mechanische Scherkräfte hergestellt wurden, werden per se als Kontrastmittel verwendet oder durch weitere Bearbeitung zu Mikrokügelchen geformt. Zum Beispiel beschreibt PCT Publication Nr. WO 92/05806 die Herstellung einer Mikrobläschen-Suspension, die sie als einen „Schaum" bezeichnen, aus einem filmbildenden Protein, das durch Schlagen einer Proteinlösung, die Verdichtungsmittel enthält, zu einem groben Schaum bei einer konstanten Temperatur unterhalb der, die das Protein denaturieren würde, hergestellt wird. Der so erhaltene Schaum wird dann mechanisch geschert, wobei Bläschen einer gewünschten Größenordnung gebildet werden, die durch die Gegenwart des Verdichtungsmittels stabilisiert werden. Die Bläschen können dann durch Wärmedenaturierung oder durch die Zugabe von Vernetzungsmitteln, um den Proteinfilm, der die Bläschen umgibt, zu härten, weiter zu Mikrokügelchen verarbeitet werden.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 450 745 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen durch Erzeugen einer Öl-in-Wasser-Emulsion durch mechanisches Scheren und gleichzeitige oder nachfolgende Zugabe eines wasserunlöslichen Polymers, das sich an der Grenzfläche abscheidet. Die hydrophobe Phase wird dann verdampft, wobei luftoder gasgefüllte Mikrokügelchen gebildet werden.
So betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen aus wärmedenaturierbarem Protein, in dem eine Proteinlösung mechanischen Scherkräften unterworfen wird. Solche Kräfte erzeugen eine Suspension aus Mikrobläschen, die gleichzeitig oder nachfolgend mit einer diskreten Hülle verkapselt werden. Wegen der Natur des hohlraumbildenden Erwärmens ist die Denaturierung des Proteins lokalisiert und erzeugt die Hülle durch Abscheiden an der Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche. Dieses neue Verfahren ist leichter auf größeren Maßstab zu übertragen und führt zu verbesserten Produktausbeuten verglichen mit den früheren Verfahren auf akustischer Grundlage zur Herstellung von Mikrokügelchen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von verkapselten, gasenthaltenden Mikrokügelchen bereit, die als bildgebendes Mittel für Ultraschall verwendbar sind, umfassend:

a) Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines wärmedenaturierbaren Proteins bei einer Temperatur, die erforderlich ist, um die Temperatur des Beginns der Denaturierung während nachfolgender mechanischer Emulgierung zu erreichen;
b) Vereinigung der Lösung mit einem Gas;
c) Emulgieren des Proteinlösung-/Gas-Gemischs durch mechanische Scherung des Gemischs, um eine Suspension von gasenthaltenden Mikrobläschen mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 μm zu bilden; und
d) Verkapseln der gasenthaltenden Mikrobläschen unter Bildung von Mikrokügelchen durch mechanische Hohlraumbildung in der Suspension, wodurch das Protein denaturiert und dadurch an der Gas-Lösungsgrenzfläche abgeschieden wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines Mühlentyps (einer Gaulin-Mühle), der beim erfindungsgemäßen mechanischen Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann;
2 ist eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines anderen Mühlentyps (einer Bematek-Mühle), der beim erfindungsgemäßen mechanischen Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann;
3 ist eine auseinandergezogene schematische Ansicht noch eines anderen Mühlentyps (einer Silverson-Mühle), der beim erfindungsgemäßen mechanischen Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann.
4a zeigt die Druckbeständigkeit von luftgefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchensuspension wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind gezeigt.
4b zeigt die Druckbeständigkeit von perfluorpropangefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchensuspension wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind gezeigt.
4c zeigt die Druckbeständigkeit von perfluorethangefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchensuspension wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig (2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind gezeigt.
4d zeigt die Druckbeständigkeit von schwefelhexafluoridgefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchensuspension wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig (2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind gezeigt.
4e zeigt die Druckbeständigkeit von argongefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchensuspension wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig (2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind gezeigt.
5 zeigt die Druckbeständigkeit von verdünnten Suspensionen von Mikrokügelchen bei 3,0 psig (0,21 bar). Eine verdünnte Suspension von Mikrokügelchen wurde in eine 1-cm-Küvette gegeben und in der Zeit t = 30 s 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt. Es sind Daten für perfluorethan- perfluorpropan-, schwefelhexafluorid- und luftenthaltende Mikrokügelchen aufgeführt.
6 zeigt die Druckbeständigkeit einer verdünnten Lösung von argonenthaltenden Mikrokügelchen bei 3,0 psig (0,21 bar). Verdünnte argonenthaltende Mikrokügelchen wurden in eine 1-cm-Küvette gegeben und in der Zeit t = 30 s 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt.
7 zeigt die Wirkung von entgastem Puffer auf Mikrokügelchen. Mikrokügelchen wurden unter Mischen zu steigenden Mengen von entgastem Puffer gegeben und das Gemisch zur Bestimmung der Konzentration auf ein konstantes Volumen gebracht. Daten für Luft-, perfluorpropan-, perfluorethan- und schwefelhexafluoridenthaltende Mikrokügelchen sind gegen das Volumen des entgasten Puffers aufgetragen.
8 zeigt Graphen der im nachstehenden Beispiel 11 beschriebenen Daten.
Ausführungsformen der Durchführung der Erfindung
Mikrokügelchen können in einer wässrigen Suspension durch mechanische Hohlraumbildung von wässrigen Lösungen aus filmbildenden Proteinen in Gegenwart eines unlöslichen Gases und in der essentiellen Abwesenheit von Sauerstoff, d. h. unter anaeroben (geschlossenes System) Bedingungen, erzeugt werden. Die Mikrokügelchen sind echoreflektierend und von einer Größe, die zur transpulmonaren Passage geeignet sind, mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 10 μm und mehr als 0,1 μm. Die Größenverteilung kann durch Fraktionieren in größere oder kleinere Mikrokügelchen-Populationen geändert werden. Die Mikrokügelchen können durch Entfernen von überschüssiger wässriger Phase konzentriert werden oder nicht, oder gesammelt und in einer zweiten wässrigen Lösung resuspendiert werden.
Das Gas, das verwendet wird, um diese Mikrokügelchen herzustellen, braucht nur pharmakologisch verträglich und vorzugsweise in den wässrigen Medien, in die sie gegeben werden (d. h. ursprünglich dem Medium, in dem sie hergestellt werden, und wenn sie verwendet werden, im Blut), unlöslich zu sein. Löslichkeit in Wasser ist eine gute Näherung für Löslichkeit in solchen Medien. Der Begriff „Gas" bezieht sich auf jede Verbindung, die ein Gas ist oder bei der Temperatur, bei der die Bilderzeugung durchgeführt wird (typischerweise normale physiologische Temperatur), ein Gas bilden kann. Das Gas kann aus einer einzelnen Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen zusammengesetzt sein. Geeignete Gase schließen fluorhaltige Gase, wie Schwefelhexafluorid, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluormethan und Perfluorbutan ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Löslichkeit eines Gases kann durch Bestimmen des Bunsen-Koeffizienten des Gases von Interesse definiert werden. Dieser Wert ist das Gasvolumen, das von einem Einheitsvolumen des Lösungsmittels absorbiert wird (siehe W.-Y. Wen, J. A. Muccitelli, J. Sol. Chem. 8 (1979), 225–240). Ein Gas, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sollte vorzugsweise einen Bunsen-Koeffizienten in Wasser bei 25°C von weniger als 0,01 ml/ml Lösung besitzen. Tabelle 1 listet die Bunsen-Koeffizienten von einigen Gasen auf.
Tabelle 1
Eine weitere Eigenschaft des in den Mikrokügelchen enthaltenen Gases ist, dass das Diffusionsvermögen des Gases vorzugsweise geringer als 4 × 10^–5 cm²/s bei 25°C in Wasser ist. Es sollte allerdings erwähnt werden, dass sich die Diffusionskonstante in unterschiedlichen Lösungsmitteln und bei verschiedenen Temperaturen verändert, aber zum Zweck der Auswahl eines Gases sollte das Gas dieses Kriterium erfüllen.
Pharmakologisch verträglich bezieht sich auf die Eigenschaft, dass das gewählte Gas biokompatibel sein muss und minimale Toxizität aufweisen muss.
Perfluorpropan ist bevorzugt, weil es ein unlösliches Gas bereitstellt, dass (1) bei den Herstellungs- und Verwendungstemperaturen nicht kondensiert, (2) keine isomeren Formen hat, (3) Mikrokügelchen ergibt, die ausgezeichnete Druckbeständigkeit zeigen und (4) pharmakologisch verträglich ist.
Das gasenthaltende Mikrobläschen wird von einer filmbildenden Proteinhülle verkapselt. Der Begriff filmbildend bezieht sich auf die Fähigkeit des Proteins, beim Unlöslichmachen des Proteins (hervorgerufen durch Wärmedenaturierung) eine Hülle um das eingeschlossene Gas zu bilden, wobei die hydrophilen Gruppen nach außen angeordnet und die hydrophoben Gruppen nach innen angeordnet sind. Das Protein besitzt notwendigerweise sowohl hydrophile als auch hydrophobe Aminosäuren. Geeignete Proteine schließen natürlich vorkommende Proteine, wie Albumin, gamma-Globulin (menschlich), apo-Transferrin (menschlich), b-Lactoglobulin und Urease ein. Obwohl natürlich vorkommende Proteine bevorzugt sind, können synthetische Proteine (homopolymer oder heteropolymer) verwendet werden, die eine Tertiärstruktur zeigen und Wärmedenaturierung zugänglich sind. Albumin und insbesondere Humanalbumin ist besonders gut geeignet für die vorliegende Erfindung. Das Protein liegt in der Lösung in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 10% w/v, vorzugsweise etwa 1 bis 5% w/v und am stärksten bevorzugt etwa 1% w/v vor.
Proteine, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, oder die daraus erhaltenen Mikrokügelchen können zur Zweck der Organselektivität oder des Unterdrückens von Immunaktivität chemisch modifiziert werden (z. B. Modifizierung mit Polyethylenglykol). Allerdings beinhaltet die vorliegende Erfindung nicht die Zugabe von chemischen Vernetzungsmitteln oder zusätzliche Modifikationen der Proteine zum Zweck des Erzeugens der Mikrokügelchen.
Die Mikrokügelchen werden durch Unlöslichmachen von Anteilen eines Proteins in Lösung als Ergebnis von Hohlraumbildung in Gegenwart eines Gases, vorzugsweise ohne die Gegenwart von Sauerstoff (d. h. in einem geschlossenen System, in dem Luftkontamination vermieden wird) erzeugt. Solch ein Unlöslichmachen von Proteinen ist hauptsächlich durch lokale Proteindenaturierung und Anordnung um den Gaskern gekennzeichnet, wobei das letztere in Gegenwart des unlöslichen Gases gefördert werden kann.
Das System, das verwendet wird, um das Protein zur Bildung der Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung durch Wärme unlöslich zu machen, ist anaerob, d. h. gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen, und wird als „geschlossenes System" bezeichnet. Zum Vergleich ist ein „offenes System" eines, das zur Atmosphäre hin offen ist. Das in den Mikrokügelchen, die in solch einem geschlossenen System hergestellt wurden, eingeschlossene Gas enthält notwendigerweise nur das zur Erzeugung verwendete Gas. Kontamination durch Atmosphären-gase kann unter Verwendung einer O₂-Elektrode zum Messen des Vorhandenseins von O₂ im Ausstrom des Systems überwacht werden. In der vorliegenden Erfindung werden Mikrokügelchen hergestellt, die anfänglich nur das zur Erzeugung verwendete Gas enthalten. Wenn der Gasgehalt experimentell bestimmt wird, gibt es allerdings eine gewisse Menge an unvermeidbarer Kontamination durch die Atmosphärengase während des experimentellen Verfahrens, wodurch die Menge an gemessenem so erhaltenem Gas weniger als 100% beträgt. Demgemäß sind Gasmessungen, die größer als 85% sind, repräsentativ für Mikrokügelchen, deren ursprünglicher Gasgehalt vollständig aus unlöslichem Gas bestand.
Nach der Erzeugung der Mikrokügelchen sollte während der Verpackung Kontakt mit der Atmosphäre vermieden werden. Zum Beispiel sollten die Mikrokügelchen innerhalb von 5 bis 30 s von dem Zeitpunkt an, an dem sie das geschlossene System verlassen, in Fläschchen oder anderen luftdichten Behältern verschlossen werden. Zusätzlich sollte während der Verpackung überstehender Gasraum in den Fläschchen entfernt und durch das Gas ersetzt werden, das bei der Erzeugung verwendet wurde.
Gefüllt mit einem unlöslichen Gas zeigen diese Protein-Mikrokügelchen bemerkenswerte Stabilität, sie überstehen 40 psig (> 2000 mm Hg, 2,76 bar) bei einer Konzentration von etwa 1,0 × 10⁹ Mikrokügelchen pro ml. Die Mikrokügelchen zeigen außerdem Elastizität in einer verdünnten Suspension, wobei sie unter einem Druck von 3–10 psig (0,21 bis 0,69 bar) Kompression zeigen, und beim Aufheben des Drucks zu ihrem ursprünglichen Volumen zurückkehren. Zusätzliche chemische Vernetzung wäre von Nachteil, weil die so erhaltenen Mikrokügelchen eine zu starre Struktur hätten, um erhöhte Druckstabilität zu zeigen.
Die Mikrokügelchen sind, im Gegensatz zu freien Mikrobläschen, gegenüber Koaleszenz- und diffusionsgetriebener Ausdehnung resistent. Der mittlere Durchmesser oder das Gesamtvolumen von unlösliches Gas enthaltenden Mikrokügelchen, die in Luft- oder sauerstoffgesättigter Lösung bei verschiedenen Temperaturen inkubiert werden, nimmt nicht zu. Die Proteinhülle ist, obwohl sie elastisch ist, wenn sie Druck ausgesetzt ist, stark genug, um Ausdehnung oder Zerreißen durch Gasdiffusion oder -austausch zu widerstehen. Das Vorhandensein der Proteinhülle verhindert Koaleszenz und hält das Gas bis zu mehrere Monate in kleinen, einzelnen Bläschen, ähnlich luftgefüllten Protein-Mikrokügelchen. Das Unvermögen von Mikrokügelchen, die mit unlöslichem Gas gefüllt sind, durch Austausch mit solvatisierten Atmosphärengasen messbar zu expandieren, ist eine neue und Schlüsseleigenschaft zur Verwendung dieses Materials als Ultraschallkontrastmittel.
Protein-Mikrokügelchen, die unlösliches Gas einschließen, zeigen Beständigkeit gegenüber Zusammenbruch beim Kontakt mit entgasten, wässrigen Lösungen. Anders als freie Mikrobläschen oder verkapselte, mit Luft gefüllte Mikrokügelchen können mit unlöslichem Gas gefüllte Mikrokügelchen zu unter Vakuum entgastem Wasser gegeben werden und in hoher Verdünnung ihre Unversehrtheit behalten. Luftgefülltes Material kollabiert in Blut wegen des Ausströmens der Sauerstoffkomponente der Gasphase. Die Fähigkeit von mit einem unlöslichen Gas gefüllten Mikrokügelchen, dem Zusammenbruch in einer teilweise entgasten oder unter Druck gesetzten Umgebung zu widerstehen, erhöht die Lebensdauer von Ultraschallkontrast-mitteln in vivo dramatisch.
Die Mikrokügelchen werden durch mechanische Hohlraumbildung hergestellt. Ein Verfahren für Ultraschallherstellung von luftgefüllten Mikrokügelchen ist von Cerny (USP 4,957,656) beschrieben worden.
Mechanische Hohlraumbildung wird in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der erfindungsgemäßen, mit unlöslichem Gas gefüllten Mikrokügelchen verwendet. Sie kann auch zum Herstellen von mit Luft oder löslichem Gas (z. B. N₂, H₂, Argon) gefüllten Mikrokügelchen verwendet werden.
Im neuen mechanischen Hohlraumbildungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird die wässrige Lösung von wärmedenaturierbarem Protein bei einer Temperatur bereitgestellt, die erforderlich ist, um die Temperatur des Beginns der Denaturierung während der nachfolgenden mechanischen Emulgierung der Lösung zu erreichen. Die Denaturierungstemperatur des Proteins in Lösung liegt normalerweise im Bereich von 50 bis 100°C. Sie kann aus Tabellen für thermische Proteindenaturierung in der Literatur oder experimentell durch ein beliebiges bekanntes Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann zur experimentellen Bestimmung der Denaturierungstemperatur eine Proteinlösung in einem Wasserbad unter Rühren erwärmt werden. Die Denaturierungstemperatur ist die Temperatur, bei der zuerst unlösliches Material beobachtet wird. Man beachte, daß die Denaturierungstemperatur von der Art, Reinheit und Quelle des Proteins, der Konzentration des Proteins in der Lösung, dem pH-Wert, dem Puffer, der Innenstärke, der Gegenwart von Stabilisatoren und der Gegenwart von chemischen Denaturierungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln beeinflusst wird. Deshalb ist es nötig, die Denaturierungstemperatur des Proteins in der Umgebung zu bestimmen, in der es verwendet wird, um Mikrokügelchen herzustellen. Falls gewünscht, können Zusatzstoffe, wie oberflächenaktive Mittel oder polare Lösungsmittel verwendet werden, um die Temperatur zu ändern, bei der die Denaturierung stattfindet.
Tabelle 2 listet die Denaturierungstemperaturen von einigen natürlich vorkommenden Proteinen auf, die wie vorstehend beschrieben experimentell bestimmt wurden: Tabelle 2

*TRIS =: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
**MES =: 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
***DTT =: Dithiothreitol

Jedes Gerät, das verwendet wird, um das Proteinlösung-/Gas-Gemisch zu scheren, verursacht wegen der mechanischen Scherkräfte, die auf die Lösung ausgeübt werden, eine gewisse Menge zusätzliche Erwärmung der Proteinlösung. Diese Wärme muss ausreichen, um lokale Denaturierng des Proteins an der Gas-Flüssigkeitsgrenzfläche zu bewirken. Es ist deshalb wichtig, die durch das Gerät verursachte Temperaturerhöhung zu bestimmen, so dass die Temperatur, bei der die Proteinlösung in das Gerät eingeführt wird, angepasst werden kann, um solch eine lokale thermische Denaturierng zu erreichen. Insbesondere muss die Massentemperatur der Flüssigkeit im Gerät mit der Temperatur des Beginns der Denaturierung direkt vor der Hohlraumbildung übereinstimmen. Das Hohlraumbildungsereignis erzeugt die zusätzliche Wärme, die erforderlich ist, um das Protein lokal zu denaturieren. Die Temperatur des Beginns der Denaturierng ist als die Temperatur definiert, bei der das Protein am Rande der Denaturierng steht, aber die Lösung kein denaturiertes Protein enthält. Diese Temperatur liegt gerade unterhalb, typischerweise 1 bis 5°C unterhalb, der Denaturierungstemperatur. Wenn nötig, kann die Ausgangsproteinlösung vor dem Einführen in das Gerät auf eine Temperatur vorgewärmt werden, die es ermöglicht, dass die Temperatur des Beginns der Denaturierung erreicht wird.
Wenn die geeignete Ausgangstemperatur der Proteinlösung erreicht worden ist, wird die Lösung mit einem geeigneten Gas vereinigt, zum Beispiel durch Einführen des Gases in die Proteinlösung vor oder während des Emulgierungsschrittes in einem Volumen zu Volumen-Verhältnis im Bereich von etwa 5% bis 200%, vorzugsweise etwa 20% bis 100%, Gas : Flüssigkeit. Das geeignete Gas : Flüssigkeitsverhältnis hängt von der Geometrie des Geräts und den physikalischen Eigenschaften des Gases (Löslichkeit, Dichte, Molekulargewicht etc.) ab und kann angepasst werden, um die Ausbeute zu optimieren.
Nachdem das Gas und die Proteinlösung vereinigt wurden, wird das Gemisch emulgiert und unter Bedingungen, die Mikrokügelchen erzeugen einer Hohlraumbildung unterworfen. Dies wird unter Verwendung eines Geräts erreicht, in dem mechanisches Scheren und hydrodynamische Hohlraumbildung erzeugt werden können, wie Hochgeschwindigkeitsmischern, Mühlen, Fluidizern und ähnlichem. Ein bevorzugtes Gerät ist eine Kolloidmühle, die als „eine Maschine, die aus einem Hochgeschwindigkeitsrotor und einem Stator besteht, wobei Dispersion oder Emulgierung durch die gegenüberliegenden Flächen bewirkt wird" definiert ist, Advanced Filtration and Separation Technology, S. 108-110. Beispiele für spezielle Mühlengeräte, die verwendet werden können, sind die nachstehenden:
Modell #2½ – Bematek, Beverly, MA
Modell W250V – Greerco, Hudson, NH
Modell 2F – APV Gaulin, Everett, MA
Modell L4R – Silverson, Chesham, UK
Modell Polytron
PT3000 – Kinematica, Littau, Schweiz
Wenn sie verwendet werden, um mit unlöslichem Gas gefüllte Mikrokügelchen herzustellen, sollten die Kolloidmühlen gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen sein, um den Eintrag von Luft in das Gemisch zu verhindern.
Die 1–3 liefern weitere Einzelheiten für einige Mühlentypen, die beim mechanischen Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden können.
1 zeigt die wesentlichen Elemente einer Gaulin-Mühle. Diese sind: eine rotierende Welle (10), die betriebsfähig mit einem Motor (nicht gezeigt) verbunden ist; ein Scheibenrotor (12), der am Ende der Welle (10) befestigt ist; und ein Stator (11). Stator (11) hat eine zentrale Bohrungsöffnung (18) und eine Senkung (16), in die der Rotor aufgenommen wird. In dieser Mühle werden die Proteinlösung und das Gas durch die Mühle über ein „T-Stück" (15) zugeführt. Das Proteinlösung-/Gas-Gemisch wird emulgiert und bildet zwischen den Oberflächen des Rotors und Stators Hohlräume. Der „Spalt" in dieser Mühle ist der Raum zwischen radialen Oberfläche (17) der Statorsenkung und der radialen Umfangsoberfläche des Rotors. Die Temperatur des Mikrokügelchenprodukts wird gemessen (z. B. mit einem Thermoelement, nicht gezeigt), wenn das Gemisch hinter dem Stator (r) austritt.
2 zeigt die wesentlichen Elemente einer Bematek-Mühle. Diese Mühle ist in Struktur und Funktion der Gaulin-Mühle aus 1 ähnlich – – der Hauptunterschied besteht in den Anordnungen des Rotors und der Statorsenkung. Sie beinhaltet eine rotierende Welle (20), die einen kegelstumpfförmigen Rotor (21) trägt, der ein Vorderende mit Gewinde aufweist (22), und einen Stator (23), der eine zentrale zylindrische Öffnung (25) und eine kegelstumpfförmige Senkung (24) aufweist, die angepasst ist, um den Rotor aufzunehmen. Das Proteinlösungs/Gas-Gemisch wird in diese Mühle über Öffnung (25) eingeführt. Das Gas und die Lösung werden gemischt, wenn sie die Gewindedrehungen (22) der Welle passieren, und das Gemisch wird emulgiert und einer Hohlraumbildung unterworfen, wenn es den Spalt der Mühle passiert. Der Spalt ist definiert als der Raum zwischen den konischen Oberflächen des Rotors und Stators.
3 zeigt eine Silverson-Mühle. Die Struktur dieser Mühle ist von denen der Mühlen aus 1 und 2 ziemlich verschieden. Die abgebildete Silverson-Mühle hat eine rotierende Welle (30), die einen Paddelschaufelrotor (31) trägt. Der Rotor wird in einem becherförmigen perforierten Siebstator (32) aufgenommen. Der Stator ist auf ein Gehäuse (33) montiert, das mit einer Einlassarmatur (34) ausgestattet ist. Die Einlassarmatur (34) erstreckt sich bis in das Gehäuse (33), wobei sie sich an der Bodenmitte des perforierten Siebstators (32) öffnet. Das Gehäuse hat eine zentrale Öffnung (nicht gezeigt), die mit der Einlassarmatur und einer Öffnung (ebenfalls nicht gezeigt) am Boden des Stators verbunden ist. In dieser Mühle wird die Lösung/das Gas über die Einlassarmatur in den Boden des Stators eingeführt und wird zwischen den flachen Flächen (35) des Paddelrotors und der inneren zylindrischen Oberfläche des Stators emulgiert und Hohlraumbildung durchgeführt. Der „Spalt" dieser Mühle kann als der Raum zwischen dem Rotor (31) und Stator (32) definiert werden, aber der Einfluss der Spaltgröße auf das Verfahren wird von der Größe der Perforationen (36) des Stators beeinflußt.
Nach dem Durchlaufen der Mühle kann das Produkt gekühlt werden, typischerweise auf 10– 20°C, und durch Absetzen lassen oder durch Zugabe von bioverträglichen Entschäumungsmitteln, die die Mikrokügelchen nicht negativ beeinflussen, entschäumt werden.
Beim Durchlaufen des Gemischs durch solch eine Mühle oder äquivalente Vorrichtung kommt es zur Emulgierung und Hohlraumbildung des Gemischs, wobei Mikrokügelchen im Bereich von etwa 0,1 bis 10 μm (mittlerer Durchmesser) gebildet werden. Die Mikrokügelchengröße kann mit einem geeigneten Teilchenzähler, zum Beispiel einem Coulter Multisizer II (Coulter Electronics, Hialeah, Fl) bestimmt werden.
Wenn eine Mühle, wie die in 1–3 beschriebenen verwendet wird, sind die Rotorgeschwindigkeit, die Spaltgröße und das Gas : Flüssigkeits-Verhältnis die Hauptverfahrens-parameter, die die Eigenschaften (mittlere Größe, Größenverteilung und Konzentration der Mikrokügelchen) des Mikrokügelchen-Produkts beeinflussen. Diese Parameter werden empirisch angepasst, um ein Produkt mit den gewünschten Eigenschaften bereitzustellen. Für jedes gegebene Produkt werden seine Eigenschaften klinisch festgelegt. Zum Beispiel lauten mutmaßliche Spezifikationen für Perfluorpropan-Mikrokügelchen, die für Herzmuskel-perfusionen verwendet werden: mittlere Größe, 4 μm; Größenverteilung, 90% unter 10 μm; Konzentration, 7 × 10⁸ bis 2 × 10⁹ Mikrokügelchen/ml.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
BEISPIEL 1
Temperaturüberwachung und -Steuerung bei mechanischem Hohlraumbildungsverfahren für Humanserumalbumin
Wie vorstehend beschrieben, wird die Proteinlösung vor der Bearbeitung vorerwärmt, so dass die Verfahrenstemperatur die Temperatur des Beginns der Denaturierung erreichen und halten kann.
Ein typisches Praxisverfahren ist wie nachstehend: Eine Modell 2½'' Bematek-Kolloidmühle (2; Bematek Systems, Beverly MA) wurde verrohrt, so dass die Eintrittsöffnung mit einem Wärmetauscher verbunden wurde. Es wurde gasundurchlässiger Schlauch verwendet, um die weichen Verbindungen zwischen den Wärmetauscherschlauchtüllen herzustellen.
Die Austrittsöffnung des Prozesshopfes wurde mit einem dem Verfahren nachgeschaltetem Edelstahl-Kühler verbunden.
Die Lösungstemperatur wurde an drei Stellen (T1, T2 und T3) überwacht. Das T1-Thermoelement wurde in einem Swagelok-T-Stück zwischen dem Vorerwärmungswärmetauscher und dem Mühlenkopf montiert, um die Zufuhrtemperatur der Proteinlösung zu messen. Ein zweites T-Stück zum Einleiten von Gas wurde ebenfalls an der Zufuhröffnung angebracht. Das T2-Thermoelement wurde innerhalb des Ausgangs des Prozesshopfes, ungefähr 1 cm vom Rotor und 2 cm von der Welle angeordnet, so dass die Temperatur des Verfahrens genau gemessen werden konnte. Auf diese Art können die beiden Temperaturen, die Zufuhrtemperatur (T1) und die Verfahrenstemperatur (T2), unabhängig gemessen und verglichen werden, um die Menge der Erwärmung der Lösung während der Bearbeitung zu bestimmen.
Für dieses Beispiel wurde U.S.P.-Albumin mit normaler Kochsalzlösung zu einer 1 %igen (w/v) Lösung verdünnt. Die Denaturierungstemperatur wurde experimentell wie beschrieben zu 78°C bestimmt. Nach dem Entgasen wurde sie mit 200 ml/min in die Mühle eingeführt, zusammen mit Perfluorpropan mit 100 ml/min (50% v/v). Es wurden Unterschiede zwischen T1 und T2 von 10° bis 15°C notiert. Um eine Verfahrenstemperatur von 77°C (1°C unter der Denaturierungs-temperatur) zu erhalten, wurde die Zufuhrtemperatur auf einen Bereich von 62°C bis 67°C eingestellt. Da die erzeugte Wärmemenge mit unterschiedlichen Mahlparametern variiert, ist es nötig, den Unterschied zwischen T1 und T2 bei jeder Änderung der Mahlparameter zu bestimmen (Wahl der Mühle, Mühleneinstellungen, Fliessgeschwindigkeit, Gas : Flüssigkeits-Verhältnis etc.), um die Verfahrenstemperatur zu erzielen, um Massendenaturierung des Proteins zu verhindern, während die Gasmikrobläschen erfolgreich mit einer dünnen Hülle aus denaturiertem Protein verkapselt werden.
Die Kühleraustrittstemperatur (T3) wurde ebenfalls überwacht, und wurde für die besten Ergebnisse auf 20°C eingestellt.
BEISPIEL 2
Mechanisches Hohlraumbildungsverfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die unterschiedliche Gase enthalten Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden wie nachstehend hergestellt: 5%ige Humanalbuminlösung (USP) wurde 2 h unter kontinuierlichem Vakuum entgast. Das Vakuum wurde durch Füllen des evakuierten Behälters mit dem Gas von Interesse aufgehoben. Verwendete unlösliche Gase beinhalten Schwefelhexafluorid, Perfluorethan und Perfluorpropan. Es wurden auch Mikrokügelchen hergestellt, die löslichere Gase, Luft, Stickstoff, Sauerstoff und Argon, enthielten. Die Verwendung von Argon war repräsentativ für ein Gas mit hohem Molekulargewicht, das aber relativ löslich ist. Die Albuminlösung wurde über einen In-Line-Wärmetauscher auf 68°C eingestellt und mit 100 ml/min in eine 2 ½'' (63,5 mm) Kolloidmühle (Greerco, Hudson, NH, Modell W250V oder AF Gaulin, Everett, MA, Modell 2F) gepumpt. Das spezifische Gas wurde bei Raumtemperatur kurz oberhalb der Eintrittsöffnung mit einer Fließgeschwindigkeit von 120–200 ml/min zu der Flüssigkeitszufuhr zugegeben. Der Spalt zwischen dem Rotor und dem Stator wurde auf 2/1000stet Inch (0,005 cm) eingestellt, und die Albuminlösung wurde kontinuierlich mit etwa 7000 U/min bei einer Verfahrenstemperatur von 73°C gemahlen.
Die so erzeugte dichte, weiße Lösung von Mikrokügelchen wurde mit einem Wärmetauscher sofort auf eine Temperatur von 10°C gekühlt und in Glasfläschchen gesammelt. Die Fläschchen wurden sofort verschlossen. Das Material wurde unter Verwendung eines Coulter Counters in Bezug auf Konzentration und Größenverteilung charakterisiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
BEISPIEL 3
Einfluß von Rotorgeschwindigkeit und Spaltgröße
Eine 1%ige Albuminlösung (200 ml/min) wurde mit Perfluorpropan (100 ml/min) bei einem 50% Gas zu Flüssigkeit-Verhältnis (v/v) vereinigt. Gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden unter Verwendung verschiedener Rotorgeschwindigkeiten und Spaltgrößen Mikrokügelchen hergestellt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Diese Ergebnisse zeigen, dass mit wachsender Rotorgeschwindigkeit die Konzentration zunimmt und die mittlere Größe abnimmt, während zunehmende Spaltgröße die Konzentration senkt.
BEISPIEL 4
Einfluss des Gas zu Flüssigkeit-Verhältnisses
Eine 0,5%ige Albuminlösung (100 ml/min) wurde unter Verwendung einer Gaulin-Mühle mit einem ungefähren Spalt von 0,012 und einer Rotorblattspitzengeschwindigkeit von 9950 ft/min (50,5 m/s) mit Perfluorpropan mit 20, 50, 70 oder 100 ml/min (20, 50, 70 oder 100% Gas zu Flüssigkeit v/v) vereinigt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 5 aufgeführt:
Tabelle 5
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die Konzentration als auch die mittlere Größe mit wachsendem Gas : Flüssigkeits-Verhältnis zunehmen.
BEISPIEL 5
Mikroskopische Untersuchung von Mikrokügelchen
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die mikroskopische Untersuchung der Produkte ergab eine monodisperse Suspension aus kugelförmigen Mikrokügelchen. Die Mikrokügelchen wurden durch Anwendung von hohem Druck in einer Spritze zum Zusammenbrechen gebracht, bis die Suspension klar wurde. In allen Fällen ergab die erneute mikroskopische Untersuchung das Vorhandensein von durchsichtigen, membranartigen Hüllen von den zusammengebrochenen Mikrokügelchen.
BEISPIEL 6
Druckbeständigkeit von Mikrokügelchen
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. 10 ml jeder Suspension wurden in eine gasdichte 10-ml-Glasspritze (Hamilton, Reno NV), die mit einem Druckmanometer ausgestattet war, gegeben. Der gesamte überstehende Gasraum wurde entfernt, und das Gerät wurde verschlossen. Ein konstanter Druck von 40 psig (2,76 bar) wurde 3 min lang angewendet. Dann wurde ein Counter-Counter verwendet, um die Probenteilchenkonzentration und -verteilung zu messen. Vergleiche der Daten (4a–4e) vor und nach der Druckanwendung zeigten eine relative Beständigkeit der unlösliches Gas enthaltenden Mikrokügelchen gegenüber 40 psig (2,76 bar).
BEISPIEL 7
Druckbeständigkeit von verdünnten Suspensionen aus Mikrokügelchen
Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Jede Probe von Mikrokügelchen wurde auf ein gleiches Volumen von verkapseltem Gas pro ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 M) verdünnt, etwa eine 1 : 60 Verdünnung. Die verdünnte Suspension wurde in einem verschlossenen Behälter mit adäquatem Gasraum unmittelbaren statischen Drücken von 0,5 psig (0,035 bar) bis 7,5 psig (0,52 bar) ausgesetzt. 5 zeigt den Einfluß von Druck auf die Mikrokügelchen-Konzentration. Mikrokügelchen, die die unlöslichen Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und Schwefelhexafluorid enthalten, sind viel druckbeständiger als mit Luft oder mit Argon mit hohem Molekulargewicht gefüllte Mikrokügelchen derselben Konzentration und Größenverteilung (6). Physiologische Drücke im Blutstrom liegen im Bereich eines peripheren venösen Drucks von 1,5 psig (0,10 bar) bis 2,5 psig (0,17 bar) in der Herzmuskelwand.
BEISPIEL 8
Einfluss von entgastem Puffer auf Mikrokügelchen
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde durch Kochen direkt vor der Verwendung entgast. 0,05 ml- bis 1,5 ml-Anteile des heißen Puffers wurden in 13 × 100 Teströhrchen gegeben, und man ließ sie 1 min in einem Wasserbad auf Raumtemperatur abkühlen. In jedes Röhrchen wurde ein konstantes Volumen an Mikrokügelchen gegeben. Nach dem Mischen wurde das Endvolumen mit PBS auf 3,0 ml gebracht und die Konzentration der Mikrokügelchen wurde bestimmt. 7 zeigt, dass für die Mikrokügelchen, die die unlöslichen Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und Schwefelhexafluorid enthielten, in entgasten Lösungen ein verbessertes Überleben erhalten wird.
Mikrokügelchen, die Luft, Schwefelhexafluorid oder Perfluorethan enthielten, wurden in Vollblut verdünnt. Luftgefüllte Mikrokügelchen zeigten Zusammenbruch. Es zeigte sich, dass die mit unlöslichem Gas gefüllten Mikrokügelchen die Verdünnung in frischem Vollblut überlebten.
BEISPIEL 9
Elastizität
Mikrokügelchen, die aus verschiedenen Gasen hergestellt wurden, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Mikrokügelchen wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, und in eine klare Zelle auf dem Tisch eines Mikroskops gegeben. Die Zelle wurde mit einer Stickstoffquelle verbunden, die die Beobachtung der Auswirkungen von schnellem Anwenden und Aufheben von physiologischen Drücken auf die Mikrokügelchen ermöglichte.
Die Anwendung von 1,5 psig (0,10 bar) oder mehr auf die Mikrokügelchen, die lösliches Gas enthielten, führte zur Beobachtung des vollständigen Verlustes der kugelförmigen Körper. Die Mikrokügelchen bildeten sich beim Aufheben des Drucks nicht zurück, was irreversible Zerstörung anzeigte. Die Anwendung von weniger als 1,5 psig (0,10 bar) führte zur Verformung und Verschrumpelung der Hülle mit unvollständigem Verlust von Mikrokügelchen. Die kugelförmige Erscheinung oder Population konnte nach Aufheben des angewendeten Drucks nicht wiederhergestellt werden.
Die Anwendung von Druck bis zu mehreren psig auf eine Suspension von Mikrokügelchen, die die unlöslichen Perfluorkohlenstoffgase enthielten, führte zu einer Verringerung des Durchmessers der Mikrokügelchen. Der Durchmesser der Mikrokügelchen kehrte beim Aufheben des Drucks zu den originalen Dimensionen zurück Schwefelhexafluoridenthaltende Mikrokügelchen zeigten ebenfalls unter angewandtem physiologischen Druck erhöhte Elastizität im Vergleich zu luftgefüllten Mikrokügelchen, aber geringere Elastizität im Vergleich zu den perfluorkohlenstoffenthaltenden Mikrokügelchen.
Diese Beobachtungen zeigen, dass die Mikrokügelchen, die unlösliche Gase enthielten, nicht nur druckbeständig waren, sondern sich auch nachdem der Druck aufgehoben wurde, erholten. Dies ist bezeichnend für eine elastische Proteinhülle.
BEISPIEL 10
Vergleich von Mikrokügelchen die in einem offenen System und in einem geschlossenen System hergestellt wurden
VERFAHRENSMETHODEN:
A) manuelle Beschallung: offenes System (äquivalent zu EPA 554,213 Einstufenverfahren)
Das im U.S.-Patent Nr. 4,844,882 und der Europäischen Patentanmeldung 554,213 beschriebene Verfahren wurde verwendet, um Mikrokügelchen wie nachstehend herzustellen: Ein 20 cm³-Spritzenzylinder wurde mit einem T-artigen Thermoelement, das durch die Spitze eingeführt und auf einen Trägerständer montiert war, ausgestattet. Die Spritze wurde bis zur 16 cm³-Marke mir Schweizer Rotes Kreuz-5% Humanserumalbumin gefüllt. Gas (Perfluorpropan (CF₈) oder Schwefelhexafluorid (SF₆) wurde in das obere Ende des Spritzenzylinders eingeführt und über die Oberfläche der Flüssigkeit geleitet. Eine Ultraschallspitze wurde auf die 10 cm³-Marke abgesenkt, unter die Oberfläche der Lösung, und bei 50% Leistung betrieben, bis die Temperatur der Lösung auf 72,8–73°C anstieg; ungefähr 1 min. Die Spitze wurde sofort zum Meniskus ± 1 mm zurückgezogen und das Leistungsniveau auf 65% erhöht. Die Beschallung wurde 5 s fortgesetzt, mit einem zusätzlichen Temperaturanstieg von 1,2–2°C. Das Produkt wurde in ein Glasfläschchen gegossen, bis es voll war, und verschlossen.
B) Kontinuierliche Beschallung: Geschlossenes System
Das im U.S.-Patent Nr. 4,957,656 beschriebene Verfahren wurde verwendet, um Perfluorpropan- und schwefelhexafluoridenthaltende Mikrokügelchen wie nachstehend herzustellen: Humanserumalbumin wurde mit steriler Kochsalzlösung zu einer 1% w/v Lösung verdünnt. Die Lösung wurde bis zum Beginn der Denaturierung erwärmt, ungefähr auf 76°C. Das System wurde gegenüber der äußeren Atmosphäre abgeschlossen und Perfluorpropan- oder Schwefelhexafluoridgas wurde anstelle von Luft in den Flüssigkeitsstrom eingeleitet (1 : 1). Das Produkt wurde durch Vorbeiströmen des Gas/Albumingemisches an der Ultraschallspitze mit ungefähr 100 ml Flüssigkeit min kontinuierlich hergestellt. Das Produkt wurde beim Austritt aus der Beschallungskammer durch Passieren eines Wärmetauschers gekühlt und als eine Massen-Flüssigsuspension von Mikrokügelchen gesammelt. Handhabungs- und Lagerungs-bedingungen waren ähnlich denen für manuell hergestellte Mikrokügelchen.
C) Mechanische Hohlraumbildung: Geschlossenes System
Albumin-Mikrokügelchen, die Perfluorpropan- oder Schwefelhexafluoridgas enthielten, wurden auch in einem geschlossenen System durch Mahlen eines Gemisches aus 1%igen Humanserum-albumin und Gas, vergleichbar mit dem in Beispiel 2 beschriebenen, hergestellt. Albuminlösung, die auf eine Temperatur erwärmt wurde, die ausreicht, um Mikrokügelchen durch mechanische Hohlraumbildung einer gegebenen Mühle zu erzeugen, wurde 1 : 1 (v : v) mit Gas gemischt und in eine Kolloidmühle eingeführt. Die Flüssigkeitsfliessgeschwindigkeit hing von der Kapazität oder Größe der Mühle, typischerweise 100 bis 500 ml/min, ab. Eine Silverson-L4R-Mühle und eine Bematek-3'' (76,2 mm)-Produktionskolloidmühle wurden für diese Auswertung verwendet. Der Ausstrom aus der Mühle wurde durch Passieren eines Wärmetauschersystems gekühlt und die so erhaltene Albumin-Mikrokügelchensuspension wurde in der Menge gesammelt. Das Produkt wurde, ähnlich wie bei den anderen Verfahren, in Glasfläschchen gefüllt.
ANALYTISCHE VERFAHREN
A) Populationsdynamik
Die Populationsdynamik wurde mit einem Coulter Multiziser II unter Verwendung einer 50 μm-Blende ausgewertet. Die wie in VERFAHRENSMETHODEN hergestellten Albumin-Mikrokügelchen wurden 1 : 10000 in Isoton verdünnt, und eine 500 μl-Probe wurde analysiert. Konzentration, mittlere Größe und verkapseltes Gasvolumen pro ml der originalen Mikrokügelchensuspension wurden erhalten.
B) Gasgehalt
Der Prozentsatz an Perfluorpropan, das in Doppelproben von Mikrokügelchen, die wie in VERFAHRENSMETHODEN beschrieben hergestellt worden waren, eingeschlossen war, wurde mit Gaschromatographie an einem Hewlett Packard 5890 bestimmt. Eine Probe der Mikrokügelchensuspension wurde in eine gasdichte Spritze aufgenommen. Das Gas wurde unter Verwendung eines Antischaummittels in Ethanol aus den Mikrokügelchen freigesetzt, und das eingeschlossene Gas wurde per Wärmeleitfähigkeit delektiert.
C) Druckbeständigkeit
Die Druckbeständigkeit von Albumin-Mikrokügelchen wurde mit einem Verfahren, das dem glich, von dem Sintetica in der Europäischen Patentanmeldung 554,213 berichtete, ausgewertet. Mikrokügelchen wurden in einer 3 ml-Druckküvette in belüfteter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung bis zu ungefähr 1 Absorptionseinheit bei 600 nm verdünnt. Der Hals wurde mit einer Druckquelle verbunden, und die Küvette in ein Aufnahmespektrophotometer gestellt. Der Druck in der Küvette wurde linear über 150 s von 0 bis 5 oder 10 psig (0,35 bis 0,69 bar) erhöht, dann wurde der Druck aufgehoben. Die Druckrampe wurde durch ein proportionierendes Magnetspulenventil (Honeywell) und einen Druckübersetzer (Omega), die zwischen einer 20 psi (1,38 bar)-Druckquelle (N₂-Tank) und einem 5-Liter-Edelstahlreservoir angeordnet war, erzeugt. Die Küvette wurde durch ein digitales Manometer mit dem Stahlreservoir verbunden. Ein PC-Computer mit einem Analog-Digitalwandler und einem Digital-Analogwandlerboard (National Instruments) steuerte das Öffnen des Ventils und las den Druckübersetzer. Das Reservoir und die Küvette wurden mit einer gewählten Geschwindigkeit unter Druck gesetzt, bis der gewünschte Druck erreicht war. Die optische Dichte der Mikrokügelchensuspension wurde als Funktion von Zeit und Druck aufgezeichnet. Die Daten wurden um die natürliche Flotationsrate von Mikrokügelchen in der Küvette korrigiert.
ERGEBNISSE
A) Populationsdynamik
Albumin-Mikrokügelchen, die mit den Verfahren der manuellen Beschallung, kontinuierlichen Beschallung und mechanischen Hohlraumbildung hergestellt worden waren, wurden auf ihre Konzentration, mittlere Größe, verkapseltes Gasvolumen und Größenverteilung innerhalb von 24 h nach der Herstellung untersucht. Als Messungen wurden mindestens im Doppel durchgeführt und sind als Mittelwert aufgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Mit allen Verfahren hergestellte Mikrokügelchen waren für die Dauer dieser Untersuchung stabil, mindestens einige Wochen bei 4°C.
B) Gasgehalt
Analysen der Zusammensetzung von eingeschlossenem Perfluorpropangas in Doppelproben von Mikrokügelchen sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7

Verfahren % C₃F₈

manuelle Beschallung 70,0

kontinuierliche Beschallung 89,5

mechanische Hohlraumbildung 95,5
Diese Ergebnisse zeigen, daß Mikrokügelchen, die in einem offenen System unter Verwendung von manueller Beschallung hergestellt wurden, viel weniger des Gases verkapseln, das verwendet wurde, um die Mikrokügelchen zu erzeugen als jene, die in geschlossenen Systemen (kontinuierliche Beschallung und mechanische Hohlraumbildung) hergestellt wurden. Die Mikrokügelchen, die im geschlossenen System hergestellt wurden, wurden in Abwesenheit von Sauerstoff hergestellt, wie unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode bestimmt wurde. Mikrokügelchen, die mit allen drei Verfahren hergestellt wurden, wurden während der Handhabung und Probeannahme gleichlang der Atmosphäre ausgesetzt (was für das Messen von weniger als 100% Perfluorpropangas in den Mikrokügelchen, die unter Verwendung der zwei in geschlossenen System durchgeführten Verfahren hergestellt wurden, verantwortlich ist), folglich war Sauerstoff (und andere atmosphärische Gase) während der Erzeugung in dem offenen System vorhanden, was die Wirksamkeit der Gasverkapselung herabsetzte.
C) Druckbeständigkeit
Die optische Dichte einer Suspension aus gasgefüllten Mikrokügelchen nimmt wegen einer Abnahme der Größe und der damit verbundenen Änderung der Oberfläche mit zunehmendem Druck ab. Das Schrumpfen beruht auf zwei Faktoren; reversibler Kompression gemäß der Gasgesetze und irreversiblem Verlust des Gaskerns an die umgebende Flüssigkeit wegen erhöhter Löslichkeit gemäß Henry's Gesetz. Beim Aufheben eines angewandten Drucks wird nur der Kompressionsbedingte Anteil des Volumenverlustes wiederhergestellt, und dies kann durch eine Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Der Verlust von eingeschlossenem Gas an die umgebende Flüssigkeit tritt beim Aufheben des Drucks nicht wieder in die Mikrokügelchen ein, sondern geht an den überstehenden Gasraum über der Lösung verloren.
8 zeigt das Ergebnis des Auferlegens eines linearen Druckgradienten bis zu 10 psi (0,69 bar) auf 1 OD-Suspensionen von Albumin-Mikrokügelchen, die mit Perfluorpropangas durch das manuelle Beschallungverfahren (offenes System) sowie auch das kontinuierliche Beschallungs- und mechanische Hohlraumbildungsverfahren (geschlossene Systeme) hergestellt wurden. Beide im geschlossenen System durchgeführte Verfahren ergaben Mikrokügelchen, die mit zunehmendem Druck Kompression zeigten, mit einer vollständigen Wiederherstellung des Volumens beim Aufheben des Drucks am Ende des Gradienten. Verlust von eingeschlossenem Gas an die umgebende Lösung wurde nicht beobachtet.
Albumin-Mikrokügelchen, die im offenen System (manuelles Beschallungsverfahren) hergestellt wurden, zeigten eine höhere Kompression mit angewandtem Druck und nur eine teilweise Wiederherstellung des Volumens beim Aufheben des Drucks wegen des irreversiblen Verlustes des Gaskerns, was zu einer 40%igen Zerstörung von Mikrokügelchen führte.

Claims

Verfahren zur Herstellung verkapselter gasenthaltender Mikrokügelchen, welche als ein bildgebendes Mittel für Ultraschall verwendbar sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines wärmedenaturierbaren Proteins bei einer Temperatur, die erforderlich ist, um die Temperatur des Beginns der Denaturierung während nachfolgender mechanischer Emulgierung zu erreichen; b) Vereinigung der Lösung mit einem Gas; c) Emulgieren des Proteinlösung-/Gas-Gemischs durch mechanische Scherung des Gemischs, um eine Suspension von gasenthaltenden Mikrobläschen mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 μm zu bilden; und d) Verkapseln der gasenthaltenden Mikrobläschen unter Bildung von Mikrokügelchen durch mechanische Hohlraumbildung in der Suspension, wodurch das Protein denaturiert und dadurch an der Gas-Lösungsgrenzfläche abgeschieden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Temperatur durch Erwärmen der Lösung erreicht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Temperatur durch Verwendung von Zusatzstoffen in der Lösung, welche die Denaturierungstemperatur des Proteins verändern, erreicht wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein natürlich vorkommendes Protein ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein Humanserumalbumin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein ein synthetisches Protein ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Proteins in der Lösung von 0,1 bis 10% w/v ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Proteins in der Lösung von 1 bis 5% w/v ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Proteins in der Lösung etwa 1% w/v ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gas unlöslich ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gas Schwefelhexafluorid, Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan oder Perfluorbutan ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Gas Luft ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von Gas zu Proteinlösung 5% bis 200% v/v ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis von Gas zu Proteinlösung 20% bis 100% v/v ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte (c) und (d) durch Durchleiten des Gemischs durch eine Mühle bewirkt werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur des Beginns der Denaturierung etwa 1°C bis 5°C unterhalb der Denaturierungstemperatur des Proteins liegt.