DE19813174A1 - Mikropartikel aus Polymeren und mindestens einer gerüstbildenden Komponente und ihre Herstellung und Verwendung in der Ultraschalldiagnostik und zur ultraschallinduzierten Wirkstofffreisetzung - Google Patents

Mikropartikel aus Polymeren und mindestens einer gerüstbildenden Komponente und ihre Herstellung und Verwendung in der Ultraschalldiagnostik und zur ultraschallinduzierten Wirkstofffreisetzung

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Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue gasgefüllte Mikropartikel, die ein Polymer und mindestens eine gerüstbildende Komponente enthalten. Weitere Aspekte der Erfindung sind pharmazeutische Mittel, die die erfindungsgemäßen Mikropartikel enthalten, deren Verwendung in der Ultraschalldiagnostik und zur ultraschallinduzierten Freisetzung von therapeutischen Wirkstoffen oder diagnostischen Substanzen in vivo sowie Verfahren zur Herstellung dieser Mikropartikel und pharmazeutischen Mittel.
Es ist bekannt, daß durch periphere Injektion von Lösungen, die feine Gasblasen enthalten, kardiale Echokontraste erzielt werden können (Roelandt J, Ultrasound Med Biol 8 (1982): 471-492). Diese Gasblasen werden in physiologisch verträglichen Lösungen z. B. durch Schütteln, durch andere Arten der Agitation oder durch Zusatz von Kohlendioxid erhalten. Sie sind jedoch hinsichtlich ihrer Anzahl und Größe nicht standardisiert und können nur unzulänglich reproduziert werden. Auch sind sie in der Regel nicht stabilisiert, so daß ihre Lebensdauer gering ist. Ihre mittleren Durchmesser liegen meist über Erythrozytengröße, so daß keine Lungenkapillarpassage mit nachfolgender Kontrastierung von Organen wie linkes Herz, Leber, Niere oder Milz möglich ist. Darüber hinaus eignen sie sich nicht für Quantifizierungen, da sich das von ihnen erzeugte Ultraschallecho aus mehreren, nicht voneinander zu trennenden Prozessen wie Blasenentstehung, Koaleszenz und Auflösung zusammensetzt. So ist es z. B. nicht möglich, mit Hilfe dieser Ultraschall-Kontrastmittel über die Messung des Kontrastverlaufs im Myokard Aussagen über die Transitzeiten zu gewinnen.
In der EP-0 131 540 ist die Stabilisierung der Gasblasen durch Zucker beschrieben. Damit wird zwar die Reproduzierbarkeit und Homogenität des Kontrasteffektes verbessert, eine Lungenpassage überstehen diese Blasen jedoch nicht.
In den EP-0 122 624 und EP-0 123 235 wird beschrieben, daß der Gasblasen stabilisierende Effekt von Zuckern, Zuckeralkoholen und Salzen durch Zusatz von Tensiden verbessert wird. Es werden Gasbläschen enthaltende Ultraschall-Kontrastmittel beschrieben, die die Lungenkapillaren passieren können und damit den gewünschten Kontrasteffekt bewirken. Eine Lungenkapillargängigkeit und die Möglichkeit zur Darstellung des arteriellen Gefäß­ schenkels und verschiedener Organe wie Leber und Milz sind bei diesen Ultraschall­ kontrastmitteln gegeben.
Für Organdarstellungen mit ausreichender Signalintensität sowie für Quantifizierungen ist es jedoch weiterhin erforderlich, daß das verwendete Ultraschallkontrastmittel über längere Zeit unverändert im Körper verbleibt. Es stellt sich daher das Problem, Gase, die als Kontrastmittel geeignet sind, mit möglichst geringem Aufwand so zu verkapseln, daß dabei stabile, bioverträgliche und für die Ultraschalldiagnostik geeignete Mikropartikel entstehen.
WO 92/18164 beschreibt in diesem Zusammenhang ein Zweistufenverfahren zur Herstellung weitgehend proteinöser, gasgefüllter Mikrokapseln, mittels dessen zunächst vergleichsweise instabile Proteinkapseln entstehen, die nachträglich stabilisiert werden. WO 96/40277 beschreibt die einstufige Herstellung von Mikropartikeln aus synthetischen Polymeren mittels Sprühtrocknung, die u. a. bei der Ultraschalldiagnostik eingesetzt werden können. Mikropartikel aus synthetischen Polymeren für die Ultraschalldiagnostik und Verfahren zu ihrer Herstellung sind auch Gegenstand der EP-0 398 935 und EP-0 441 468. In US 5,565,215 und 5,578,325 wird beschrieben, wie die in vivo-Stabilität von injizierbaren Partikeln aus synthetischen Polymeren durch die Verwendung von Copolymeren mit Poly- (alkylenglykolen) erhöht werden kann. US 5,611,344 beschreibt, daß sich die Echogenizität von Mikropartikeln aus synthetischen Polymeren erhöhen läßt, wenn anstelle von Luft fluorinierte Gase verkapselt werden. In WO 95/07072 werden Mikropartikel beschrieben, die neben einer gasförmigen Phase einen Wirkstoff oder eine Kombination von Wirkstoffen enthalten, und deren Verwendung zur ultraschallgesteuerten Wirkstofffreisetzung in vivo.
Häufig erweist es sich, beispielsweise bei mikroskopischer Betrachtung, daß Partikel, die Polymere enthalten, keine glatte Oberfläche besitzen und/oder porös sind. Erfahrungsgemäß gehen solche morphologischen Merkmale häufig mit funktionellen Schwächen einher, beispielsweise Instabilität, einem raschen Verlust der Gasfüllung oder einer hohen Agglomerationstendenz in Serum.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Entsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, neue Ultraschall­ kontrastmittel auf der Basis von Mikropartikeln bereitzustellen, die nicht nur hinsichtlich ihrer Größe und Zusammensetzung standardisiert sind, sondern darüber hinaus eine deutlich erhöhte Stabilität und eine verringerte Porosität aufweisen. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung solcher Mikropartikel. Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand der Ansprüche gelöst.
Entsprechend betrifft ein Aspekt der Erfindung gasgefüllte Mikropartikel, die ein Polymer und mindestens eine gerüstbildende Komponente enthalten, insbesondere Mikropartikel, bei denen das Polymer entweder ein Polylactid-co-glykolid (PLGA) oder ein Copolymer, beispielsweise ein Block-copolymer, aus PLGA und Polyethylenglykol (PEG) ist. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten die gasgefüllten Mikropartikel als gerüstbildende Komponente oder Komponenten ein oder mehrere Proteine, beispiels­ weise Albumin, Casein oder Gelatine, und/oder einen oder mehrere Zucker, beispielsweise Monosaccharide, Disaccharide (z. B. Lactose) oder Polysaccharide (z. B. Dextran). Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß die erfindungsgemäßen Mikropartikel im wesentlichen frei von Tensiden sind. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß die Gasfüllung der erfindungsgemäßen Mikropartikel aus Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Edelgasen, Kohlenstoffdioxid, gasförmigen Kohlenwasserstoffen, Perfluorgasen oder Mischungen dieser Gase besteht.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für die erfindungs­ gemäßen Mikropartikel, das (i) die Emulgierung einer nicht-wäßrigen Polymerlösung und einer wäßrigen Lösung der gerüstbildenden Komponente(n), beispielsweise unter Ein­ wirkung von Ultraschall, und (ii) die Sprühtrocknung der erhaltenen Emulsion beinhaltet. Die hierbei entstehenden gasgefüllten Mikropartikel sind für eine Vielzahl ultraschall­ diagnostischer Anwendungen geeignet, einschließlich solcher, die eine Kapillargängigkeit der Partikel (d. h. eine Größe von kleiner als 10 µm) erfordern. Aufgrund ihrer hohen Stabilität können die erfindungsgemäßen Mikropartikel einem zusätzlichen Filtrationsschritt unterworfen werden, wodurch sich Partikel definierter Größen herstellen lassen. Eine erhöhte Kontrasteffektivität kann desweiteren auch dadurch erhalten werden, daß nach der Sprühtrocknung die kontrastreichen Bestandteile durch Flotation von vorhandenen kontrastarmen Bestandteilen abgetrennt werden können. Besonders kontrastaktive Ultraschalldiagnostika können erhalten werden, wenn die Luftfüllung der Mikropartikel in einem weiteren Schritt durch andere Gase, beispielsweise die obengenannten, bevorzugt aber durch Perfluorverbindungen, ersetzt wird.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung erfindungs­ gemäßer Mikropartikel als Träger von therapeutischen Wirkstoffen und diagnostischen Substanzen, insbesondere von Arzneistoffen und/oder biologisch aktiven Substanzen, und die ultraschallinduzierte Freisetzung dieser Stoffe. Das zugrunde liegende Prinzip wird dem Fachmann aus WO 95/07072 bekannt sein. Es besteht, kurz gesagt, darin, daß Feststoffe in gasgefüllte, kontrastaktive Mikropartikel eingebracht, in dieser Form verabreicht und in vivo unter Einwirkung von Ultraschall in zeitlich und örtlich kontrollierter Weise freigesetzt werden.
Die Herstellung solcher erfindungsgemäßen Mikropartikel, die zusätzlich therapeutische Wirkstoffe oder diagnostische Substanzen enthalten, erfolgt ebenfalls nach dem oben­ genannten Herstellungsverfahren, das (i) die Emulgierung einer nicht-wäßrigen Polymer­ lösung und einer wäßrigen Lösung der gerüstbildenden Komponente(n), beispielsweise unter Einwirkung von Ultraschall, und (ii) die Sprühtrocknung der erhaltenen Emulsion beinhaltet. Dabei kann der entsprechende Stoff entweder direkt der Emulsion zugefügt oder, beispielsweise unter Verwendung eines Dreistoffaggregats, als separate wäßrige Lösung versprüht werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen gasgefüllten Mikropartikel enthalten ein Polymer und mindestens eine gerüstbildende Komponente. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel sind kleiner als 100 µm. Bevorzugt sind Partikelgrößen unter 20 µm, und besonders bevorzugt sind Partikel, die kleiner als 10 µm sind. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel besitzen im Vergleich zu bekannten Mikropartikeln auf Polymerbasis eine nicht-poröse, glatte Ober­ fläche, weisen eine signifikant erhöhte Stabilität auf und liefern desweiteren bei ultraschall­ diagnostischen in vivo-Anwendungen deutlich stärkere bzw. länger anhaltende Kontraste.
Der Begriff "Polymer", wie er im folgenden verwendet wird, schließt Polymere, Copolymere sowie deren Derivate ein. "Derivate" im Sinne des hier gebrauchten Begriffes schließen wiederum substituierte und um funktionelle Gruppen ergänzte Polymere ein, beispielsweise durch Alkylierungen, Alkylenierungen, Hydroxylierungen, Oxidationen und andere Modifikationen, die vom Fachmann routinemäßig durchgeführt werden, eingeführte Gruppen. Die Polymere sind vorzugsweise synthetisch und biologisch abbaubar.
Als mögliche Polymere seien genannt: Polylactide, Polyglykolide, Polylactid-co-glykolide, Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polykarbonate, Polyalkylene wie etwa Poly­ ethylen und Polypropylen, Polyalkylenglykole wie etwa Polyethylenglykol, Polyalkylen­ terephthalate wie etwa Polyethylenterephthalat, Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylpyrrolidon, Polysiloxane, Polyvinylacetat, Polystyrol, Polyurethane, derivatisierte Zellulosen wie etwa Alkyzellulose, Hydroxyalkylzellulosen, Zelluloseether, Zelluloseester und Nitrozellulosen, Polymere aus Acrylsäure und Methacrylsäure und deren Derivaten einschließlich Estern sowie Polycaprolactone.
Bevorzugt sind biologisch abbaubare synthetische Polymere aus Hydroxysäuren wie etwa Polylactide, Polyglykolide und Polylactid-co-glykolide (PLGA), Polyethylenglykol (PEG), Polyanhydride, Polyorthoester, Polyurethane, Polyhydroxybuttersäure, Polyvaleriansäure und Polylactid-co-caprolacton, sowie diese Komponenten enthaltende Copolymere. Diese Substanzen werden in vivo in der Regel sowohl nicht-enzymatisch als auch enzymatisch abgebaut.
Durch die Exposition von Polyalkylenglykolen wie beispielsweise Polyethylenglykol (PEG) auf der Oberfläche der Mikropartikel wird deren Hydrophilie und infolgedessen auch ihre Stabilität in vivo erhöht. Bevorzugt sind daher Copolymere aus Polylactid-co-glykoliden und Polyethylenglykol ("PLGA-PEG-Copolymere"), wobei es sich bei diesen Copolymeren beispielsweise um A-B-Block-Copolymere oder A-B-A-Block-Copolymere mit einem A-Block aus PEG bzw. PLGA und einem B-Block aus PLGA bzw. PEG handeln kann. Möglichkeiten zur Herstellung von Block-Copolymeren sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise aus dem US-Patent 5,565,215, in dem verschiedene Verfahren zur Her­ stellung von Di-, Tri- und Multi-Block-Copolymeren offenbart sind.
Als gerüstbildende Komponenten haben sich Biomoleküle, beispielsweise Proteine, Oligo­ peptide, Aminosäuren, Mono-, Di- und Polysaccharide sowie deren Gemische als besonders geeignet erwiesen. Es hat sich herausgestellt, daß sowohl der Zusatz solcher gerüst­ bildenden Komponenten an sich als auch die Auswahl bestimmter Kombinationen dieser gerüstbildenden Komponenten für die Morphologie und die funktionellen Qualitäten der erfindungsgemäßen Mikropartikel entscheidend sind. Auch eine Quervernetzung der gerüstbildenden Komponente(n) durch Methoden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, etwa chemisch durch Glutaraldehyd, aber auch Erwärmen oder Autoklavierung, ist denkbar.
Unter den Proteinen sind Albumin, Casein, Gelatine, Lysozym, Myoglobin oder Gammaglobulin als gerüstbildende Komponenten bevorzugt, besonders bevorzugt ist Albumin. Die Proteine können aus biologischem Material isoliert oder mittels gängiger, dem Fachmann bekannter rekombinanter Verfahren hergestellt werden. Es hat sich erwiesen, daß insbesondere der Zusatz von Albumin sehr günstige Auswirkungen auf die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Mikropartikel hat. Die erfindungsgemäßen Mikro­ partikel zeichnen sich insbesondere durch eine nicht-poröse Oberfläche und eine erhöhte Stabilität aus.
Neben Proteinen lassen sich auch Zucker, beispielsweise Monosaccharide, Disaccharide (z. B. Lactose) und/oder Polysaccharide (z. B. Dextran, Stärke, Amylose, Hydroxyethyl­ stärke) als gerüstbildende Komponente(n) verwenden. Überraschenderweise wurde darüber hinaus festgestellt, daß die Verwendung von Albumin in Verbindung mit einem Mono-, Di- oder Polysaccharid zu einer zusätzlichen signifikanten Verbesserung der Qualität der Mikropartikel führt. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Mikropartikel, die neben einem Polymer sowohl Albumin als auch Lactose als gerüstbildende Komponenten enthalten. Diese besonders bevorzugten Mikropartikel sind, wie auch die PLGA-PEG- Albumin-Mikropartikel, nicht-porös, weisen aber im Vergleich zu diesen zusätzlich eine auffällig glatte Oberfläche, eine stark verringerte Agglomerationstendenz im Serum, eine äußerst homogene Partikelform und eine besonders ausgeprägte Stabilität auf. Darüber hinaus haben Analysen, bei denen unter mikroskopischer Sichtkontrolle die Zerstörung und Gasblasenfreisetzung der Mikropartikel unter Ultraschall untersucht wurden, über­ raschenderweise ergeben, daß diese bevorzugten erfindungsgemäßen Mikropartikel - im Gegensatz zu früheren, auf Mikropartikeln basierenden Ultraschallkontrastmitteln - nicht bereits bei dem ersten Puls einer zerstörerisch wirkenden Frequenz ihre gesamte Gasfüllung verlieren, sondern erst nach und nach. Dies bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Mikro­ partikel im Vergleich zu den bekannten Partikeln unter diesen Bedingungen über längere Zeiträume hinweg kontrastaktiv bleiben.
Durch den Zusatz von gängigen, dem Fachmann bekannten Tensiden, beispielsweise Tweens, Synperonics, Pluronics, Poloxamene, Poloxamine, Alkylsulfate, Alkylbenzol­ sulfonate, Alkylpolyglykoside, Alkylammoniumhalogenide oder deren Gemische, können die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mikropartikel weiter modifiziert werden. Die Verwendung solcher Zusatzstoffe ist jedoch nicht erforderlich. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel, die im wesentlichen frei von Tensiden sind, besitzen bereits die erforderliche Stabilität. Bevorzugt sind daher Mikropartikel, die z. B. nicht mehr als 0,1% (w/v) Tenside enthalten. Besonders bevorzugt sind solche, die vollkommen frei von Tensiden sind.
Als Gase, die in den Mikropartikeln in freier oder gebundener Form enthalten sein können, sind beispielsweise geeignet: Luft, Edelgase, Stickstoff, Kohlenstoffdioxid, Sauerstoffs gasförmige Kohlenwasserstoffe, fluorinierte Gase sowie Mischungen dieser Gase. Hinsichtlich der fluorinierten Gase sind vor allem Perfluorverbindungen bevorzugt, wie z. B. CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SF6, C2F4, C3F6, besonders bevorzugt ist Perfluorbutan (C4F10).
Ein geeignetes Gasgemisch ergibt sich ebenfalls, wenn in einem mit gasförmigen Stickstoff gefüllten Gefäß bei Normaldruck und 10°C flüssiges Perfluorhexan eingebracht wird. Durch den Dampfdruck von Perfluorhexan bei 10°C reichert sich ausreichend gasförmiges Per­ fluorhexan in der Gasphase an (ca. 20 Vol%), so daß für die Ultraschalldiagnostik besonders geeignete Mikropartikel mit dem entstandenen Gasgemisch erzeugt werden können. Derartige Mischungen lassen sich auch mit anderen Gasen (z. B. O2, Ar, Xe, CF4, SF6) und bei Raumtemperatur flüssigen, aber ausreichend flüchtigen Verbindungen (z. B. C7F16) erzeugen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikropartikel, das (i) die Emulgierung einer nicht-wäßrigen Polymerlösung und einer wäßrigen Lösung der gerüstbildenden Komponente(n), beispielsweise unter Einwirkung von Ultraschall, und (ii) die Sprühtrocknung der erhaltenen Emulsion beinhaltet. Die Emulgierung wird bevorzugt unter Einwirkung von Ultraschall durchgeführt. Statt unter Einwirkung von Ultraschall kann die Herstellung der Emulsion jedoch auch anders, beispielsweise mechanisch erfolgen.
Als Lösungsmittel für das Polymer sind alle organischen Lösungsmittel geeignet, die vergleichsweise niedrige Siedetemperaturen besitzen und in Spurenmengen dem Menschen verabreicht werden können, wie etwa Methylenchlorid. Andere Lösungsmittel, beispiels­ weise Ethylacetat, Aceton, Ethanol, DMSO und Chloroform können ebenfalls alleine oder in Kombination - miteinander oder mit Methylenchlorid - verwendet werden.
Allgemein sind 0,1-10%-ige Polymerlösungen zur Emulgierung geeignet. Bevorzugt sind 0,1-5%-ige Lösungen, besonders bevorzugt sind 0,2-1%-ige Lösungen. Diese nicht­ wäßrigen Lösungen können Tenside enthalten. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Mikro­ partikel besteht jedoch darin, daß ihre günstigen morphologischen und funktionellen Eigen­ schaften nicht vom Zusatz von Tensiden abhängen, so daß die Mikropartikel im wesentlichen frei von Tensiden sein können. Besonders bevorzugt sind Polymerlösungen, die Polymilchsäure (PLA), Polyglykolsäure (PGA) und Polyethylenglykol (PEG) enthalten. Geeignet sind vor allem PLA:PGA-Gemische, deren PLA-Gewichtsanteil 50-100% (w/w) beträgt. Bevorzugt sind PLA:PGA-Verhältnisse im Bereich zwischen 80 : 20 (w/w) und 20 : 80 (w/w), und besonders bevorzugt sind PLA:PGA-Gemische mit einem Verhältnis von PLA:PGA von 70 : 30 (w/w). Die PEG-Ketten können ein Molgewicht im Bereich von 1000-20 000 g/mol besitzen. Bevorzugt ist PEG mit einem Molgewicht von 2000-10 000 g/mol, wobei PEG 5000, d. h. PEG mit einem Molekulargewicht von 5000 g/mol, besonders bevorzugt ist. Im Falle von PLGA-PEG-Lösungen, die als Lösungsmittel Methylenchlorid enthalten, haben sich Lösungen mit einer inherenten Viskosität zwischen 0,4 und 1,0 dl/g als geeignet erwiesen. Bevorzugt sind solche mit einer inherenten Viskosität zwischen 0,5 und 0,8 dl/g, und besonders bevorzugt solche mit einer inherenten Viskosität zwischen 0,68 und 0,74 dl/g. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mikropartikel eignen sich ferner Polymer­ lösungen, die PLGA und PLGA-PEG enthalten. Besonders geeignet sich dabei Mischungen von 9 Teilen PLGA mit 1 Teil PLGA-PEG.
Allgemein können wäßrige Lösungen der gerüstbildenden Komponente(n) verwendet werden, die diese in einer Konzentration von 0,1-50% (w/v) enthalten. Bevorzugt sind Konzentrationen von 0,5-20% (w/v), besonders bevorzugt Konzentrationen von 2-10% (w/v). Wenn Mischungen verwendet werden, so beziehen sich die genannten Angaben zur bevorzugten Konzentration auf die Gesamtkonzentration dieser Komponenten. Im Falle der besonders bevorzugten Kombination von Albumin und Lactose hat sich ein Verhältnis dieser beiden Stoffe zwischen 1 : 10 und 10 : 1 (w/w) als geeignet erwiesen. Bevorzugt ist ein Verhältnis zwischen 1 : 5 und 5 : 1, und besonders bevorzugt ein Verhältnis von 1 : 2,5. Die genannten Verhältnisse beziehen sich auf die Albumin- und Lactoseanteile in der zur Emulgierung verwendeten wäßrigen Phase.
Das Gewichtverhältnis (w/w) des Polymers und der gerüstbildenden Komponente(n) liegt üblicherweise im Bereich zwischen 1 : 50 und 50 : 1. Bevorzugt ist hierbei der Bereich zwischen 1 : 30 und 30 : 1 und besonders bevorzugt der zwischen 1 : 5 und 1 : 20.
Eines der besonders bevorzugten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikro­ partikel besteht darin, 1 Volumenteil einer PLGA-PEG-Lösung in Methylenchlorid (mit einem PLA:PGA-Massenverhältnis von 70 : 30 und PEG 5000) in 5 Volumenteilen einer wäßrigen Lösung, die 2% (w/v) Albumin und 5% (w/v) Lactose enthält, unter Einwirkung von Ultraschall mindestens 10-30 Sekunden zu emulgieren. Anschließend wird die dabei erhaltene Emulsion in einer gängigen, dem Fachmann geläufigen Sprühtrocknungsapparatur sprühgetrocknet, beispielsweise in einem mit einer Zweistoffdüse ausgestatteten Büchi- Sprühtrockner B-191.
Bei der Sprühtrocknung wird die Emulsion atomisiert und durch die direkte Einwirkung heißer Gase getrocknet. Mit den üblicherweise verwendeten Geräten wird die zu trocknende Lösung oder Emulsion durch das Einlaßventil eingebracht, durch ein Rohr transportiert und dann durch das Auslaßventil atomisiert. Die Temperaturen an den Ein- und Auslaßventilen sind jeweils variabel. Die Größe der entstehenden Teilchen ist außer von den Temperaturen noch von einer Reihe weiterer Parameter abhängig, etwa der verwendeten Düse, dem Düsendruck, der angelegten Pumpleistung, der "Flow"-Rate, der Art und Konzentration des verwendeten Polymers und der ausgewählten gerüstbildenden Komponente(n) sowie deren Massenverhältnisse.
Die Wahl der Parameter bei der Sprühtrocknung ist weitgehend geräteabhängig. Im Falle des verwendeten Büchi Mini Spray Dryers B191 hat sich jedoch beispielsweise als günstig erwiesen: Einlaßtemperatur: 110°C; Auslaßtemperatur: 60°C; Aspirator: 100%; Pumpe: 15%; Düse: 0,7 mm; Flow: 600 l/hr. Zur Resuspension des Sprühtrocknungsgutes wird bevorzugt eine 0,9%-ige NaCl-Lösung verwendet. Als Richtwert kann hierbei gelten, daß ein Volumen von 1 ml zur Resuspension von 0,1 g Sprühtrocknungsgut geeignet ist.
Das aus oben genanntem Verfahren erhältliche Sprühtrocknungsgut kann zur Abtrennung von nicht-gasgefüllten Bestandteilen einem Flotationsschritt unterworfen werden. Dies ist in zweierlei Hinsicht vorteilhaft: Zum einen wird durch die Abtrennung nicht-kontrastaktiver oder kontrastarmer Bestandteile die Qualität des Ultraschallkontrastmittels verbessert, zum anderen werden möglicherweise noch vorhandene überschüssige Moleküle entfernt.
Bevorzugt wird das Partikelflotat durch Zentrifugation hergestellt. Aufgrund ihrer hohen Stabilität überstehen die erfindungsgemäßen Mikropartikel den Flotationsschritt unbe­ schadet, und man erhält auf diesem Wege eine Partikelsuspension, die in sich einen hohen Grad an Homogenität aufweist.
Mikroskopisch erscheinen die bei diesem Herstellungsverfahren erhältlichen Mikropartikel insgesamt sehr homogen, und die einzelnen Partikel besitzen eine außergewöhnlich glatte und nicht-poröse Oberfläche. Desweiteren wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Mikropartikel eine außergewöhnlich hohe Beständigkeit aufweisen. Es wurde beobachtet, daß ihr Gaskern im Wasser nur sehr langsam entweicht, wodurch eine Filtration, etwa durch ein 10 µm-Filter, ermöglicht wird.
Die Luftfüllung der nach dem oben beschriebenen, bevorzugten Verfahren erhältlichen Mikropartikel kann durch fluorierte Gase, vorzugsweise Perfluorverbindungen, ersetzt werden. Dazu werden erfindungsgemäße, durch Sprühtrocknung einer Emulsion erhaltene Mikropartikel im Gefriertrockner evakuiert und dann mit dem gewünschten Gas oder Gasgemisch begast.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel sind für eine Vielzahl diagnostischer Verfahren geeignet. Sie können zur Darstellung physiologischer und pathologischer Zustände des gesamten Herz-/Kreislaufsystems, der Gewebeperfusion und der inneren Organe verwendet werden. Darüber hinaus gelingt mit den erfindungsgemäßen Partikeln die Detektion und Charakterisierung von Tumoren, von Perfusionsdefekten und von Gefäßanomalien. Die Darstellung innerer Organe ist während der Perfusionsphase möglich, aber auch nach der Phagozytose der Mikropartikel durch die Zellen des retikohistiozytären Systems (RHS), wie z. B. der Milz, der Leber und/oder der Lymphknoten.
Die Verwendung der Mikropartikel führt u. a. zur Kontrast- bzw. Signalverstärkung bei Verwendung konventioneller (z. B. B-Bild, Doppler-, Korrelations- und Duplexverfahren), aber auch neuerer Ultraschallverfahren (z. B. Harmonic-, Stimulated Acoustic Emission- und Pulse Inversion-Verfahren.)
Daneben lassen sich erfindungsgemäße Mikropartikel auch als Träger von therapeutischen Wirkstoffen und diagnostischen Substanzen, insbesondere von Arzneistoffen und/oder biologisch aktiven Substanzen einsetzen. Dazu werden die entsprechenden Stoffe in gasgefüllte, kontrastaktive Mikropartikel eingebracht, in dieser Form verabreicht und in vivo unter Einwirkung von Ultraschall in zeitlich und örtlich kontrollierter Weise freigesetzt. Solche Mikropartikel könnten sowohl für therapeutische Zwecke (beispielsweise bei der Tumortherapie) als auch bei diagnostische Verfahren (z. B. einer lokal begrenzten Freisetzung von Adrenalin oder Theophyllin zur Funktionstestung) eingesetzt werden. Bei der Herstellung solcher Mikropartikel wird der entsprechende Stoff entweder direkt der Voremulsion zugefügt oder, beispielsweise im Falle der Verwendung eines Dreistoff­ aggregats, in Form einer separaten Lösung sprühgetrocknet.
Als Wirkstoffe sind, neben Arzneistoffen, biologisch aktive Moleküle besonders geeignet. Als Beispiele hierfür seien genannt: Peptide, Proteine (etwa Antigene, Enzyme, Hormone oder Rezeptoren), Kohlenhydrate, Nukleinsäuren (RNA- und/oder DNA-Moleküle, Nukleoside, Nukleotide), Lipide, Polysaccharide, desweiteren synthetische anorganische oder organische Moleküle, die eine biologische Wirkung hervorrufen, wenn sie einem Menschen oder einem Tier verabreicht werden. Diese, sowie weitere, dem Fachmann bekannte Wirkstoffe können einzeln oder in Kombination in den erfindungsgemäßen Mikropartikeln enthalten sein. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel sind in der Lage, die enthaltenen Wirkstoffe lokal freizusetzen. Die bevorzugten Freisetzungsorte sind diejenigen, die auch besonders gut diagnostisch dargestellt werden können (siehe oben).
Das Vorhandensein von freien PEG-Enden auf der Oberfläche der Mikropartikel bietet darüber hinaus die Möglichkeit der zusätzlichen Ankopplung reaktiver Gruppen, die sich in vivo selbst gezielt an freie Rezeptoren anlagern können ("Targetting"). Dadurch lassen sich die therapeutischen und diagnostischen Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Mikropartikel bedeutend erweitern.
Üblicherweise werden die erfindungsgemäßen Mikropartikel in einer physiologisch verträglichen Lösung resuspendiert. Die dadurch entstehenden pharmazeutischen Mittel werden bevorzugt durch Injektion, z. B. intravenös, intraarteriell, intracutan oder subcutan verabreicht. Die Verabreichung kann aber auch oral, intrauterin, intravesikulär erfolgen.
Geräte
In den nachfolgenden Beispielen wurden folgende Geräte verwendet: Die Sprühtrocknung wurde in einem Büchi Mini Spray Dryer B191 durchgeführt, die standardmäßig mit einer Zweistoffdüse mit einem Innendurchmesser von 0,7 mm ausgestattet ist. Für die Herstellung Wirkstoff enthaltender Mikropartikel wurde diese Sprühtrocknungsapparatur üblicherweise in Verbindung mit einem Dreistoffaggregat (Sonderanfertigung der Firma Schlick-Düsen, Germany, für B-191 (Innendurchmesser der Düse: 0,8 mm); auf Anfrage erhältlich) ver­ wendet. Dieser Aufsatz ist jedoch nicht unbedingt erforderlich. Vielmehr lassen sich auch wirkstoffhaltige erfindungsgemäße Mikropartikel mit einem standardmäßigen, d. h. mit einer Zweistoffdüse ausgerüsteten Sprühtrockner, herstellen. Die Beschallung der Lösung mit Ultraschall wurde mit einem Branson Sonifier II unter Verwendung eines Standard Resonators 1/2", Best.Nr. 101-147-037 durchgeführt. Die Gefriertrocknung der Lösungen und die Begasung der Lyophilisate erfolgte im Gefriertrockner Lyovac GT2, Leybold- Heraeus. Die Dispergierung zur Herstellung der Emulsionen wurde mit einem Ultra Turrax (Janke u. Kunkel; IKA-Labortechnik) durchgeführt. Die in vivo-Untersuchungen erfolgten mit einem HP 77020 E (5 MHZ-Schallkopf) und einem ATL-UM9 (L 10-5-Schallkopf). Zur Untersuchung der Partikelmorphologie wurde ein Zeiss Axioplan Phasenkontrast­ mikroskop verwendet.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung des Erfindungsgegenstandes, ohne ihn auf diese beschränken zu wollen:
Beispiel 1 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-Albumin-Mikropartikeln (A- 1)
12 ml einer 2,5% (w/v)-igen Polylactid-co-glykolidlösung in Methylenchlorid (PLGA, 70 : 30, Resomer RG 503) werden in 60 ml einer 5%-igen Albuminlösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 69°C; Auslaßtemperatur = 40°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 5%; Düse = 0,7 mm, Flow = 600 l/hr. 0,1 g Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls durch 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von ca. 8.107 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 2 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Lactose- Mikropartikeln (B-2)
12 ml einer 2,5%-igen (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylen­ chlorid (PLGA-PEG, 70 : 30, PEG 5000, inh.visc. 0,68d l/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer wäßrigen Lösung, die 2% (w/v) Albumin und 5% (w/v) Lactose enthält, unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 110°C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0,7 mm, Flow = 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von ca. 5,8.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 3 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikro­ partikeln (C-3)
12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA (70 : 30)-PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer 5% Albuminlösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 110°C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0,7 mm, Flow = 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung re­ suspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von ca. 9.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 4 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin Mikro­ partikeln (D-4)
12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA (70 : 30)-PEG 5000, inh.visc. 0,98 dl/g, Lot# D97002, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer 5% Albuminlösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 110°C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0.7 mm, Flow = 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsguts werden in 1 ml 0,9%igen NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 5.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 5 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikro­ partikeln (E-5)
0,3 g Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol (PLGA (50 : 50)-PEG 5000, inh. visc. 0,41 dl/g, Lote D97033, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 5 ml DMSO gelöst und mit 7 ml Methylenchlorid verdünnt und in eine 5% Albuminlösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 80°C; Auslaßtemperatur = 49°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 10%; Düse = 0.7 mm, Flow: 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 4,8.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikel. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 6 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Gelatine-Mikro­ partikeln (F-6)
12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA-PEG, 70 : 30, PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer 5%igen autoklavierten Gelatinelösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 110°C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0,7 mm, Flow: 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 1,8.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 7 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Dextran-Mikro­ partikeln (G-7)
12 ml einer 2, 5%-igen (w/v) Polylaktid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA (70 : 30)-PEG 5000, inh. visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer wäßrigen Lösung, die 10% (w/v) Dextran enthält, unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 min emulgiert. Die gebildete o/w-Emul­ sion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 110 °C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0,7 mm, Flow: 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 3.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 8 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Casein-Mikropartikeln (H-8)
12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA (70 : 30)-PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer 5% Caseinlösung unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 Minuten emulgiert. Die gebildete o/w-Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B 191): Einlaßtemperatur = 110°C; Auslaß­ temperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 20%; Düse = 0,7 mm, Flow 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsguts werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung redispergiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 2,6.107 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 9 Herstellung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Lactose-Mikro­ partikeln (I-9)
In 12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung mit 0,1% Tween 20 in Methylenchlorid (PLGA (70 : 30)-PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden 1 ml einer 0,1%igen Propandiollösung in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung. unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 20 s emulgiert. Die gebildete w/o-Emulsion in 30 ml einer 10%-igen Lactoselösung. dispergiert (Ultra Turrax T25, 2000 Upm). Die gebildete w/o/w Emulsion wird unter folgenden Bedingungen sprühgetrocknet (Büchi Mini Spray Dryer B191): Einlaßtemperatur = 55°C; Auslaß­ temperatur = 37°C; Aspirator = 100%; Pumpe = 10%; Düse = 0,7 mm, Flow: 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsguts werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung redispergiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 1,0.107 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 20 µm.
Beispiel 10 Begasung von Polylactid-co-glykolid-PEG-Mikropartikeln mit Decafluorbutan (J-10)
0,1 g des in der Formulierung C-3 gewonnenen Sprühguts werden in ein Vial abgefüllt und im Gefriertrockner auf 200 mbar evakuiert. Anschließend wird die Probe mit Decafluor­ butan (Flurochem) belüftet, erneut evakuiert und ein zweites Mal mit Decafluorbutan begast und luftdicht verschlossen. 0,1 g des Sprühtrocknungsguts werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lö­ sung resuspendiert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von 1,2.109 T/ml an perfluorgasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels MasterSizerS und liegt bei < 70 µm.
Beispiel 11 Gewinnung von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG Mikropartikel durch Flotation (K-11)
1,2 g des in der Formulierung C-3 gewonnenen Sprühguts werden in 100 ml Wasser resuspendiert und in einem Scheidetrichter 48 h bei 4°C flotiert. Der Unterstand wird verworfen und das Flotat wird in 10 ml Wasser aufgenommen. Die Suspension wird in Aliquots à 2 ml abgefüllt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und für 72 h gefriergetrocknet. Mit 2 ml 0,9%iger NaCl-Lösung wird das Lyophilisat resuspendiert, 10 µm filtriert und analysiert.
Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 12 Herstellung von Methylenblau-haltigen gasgefüllten Polylactid-co-glykolid- PEG-Mikropartikeln mittels eines Dreistoffaggregats (L-12)
12 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid -polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA-PEG, 70 : 30,PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 60 ml einer wäßrigen Lösung, die 2% (w/v) Albumin und 5% (w/v) Lactose enthält, unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 min emulgiert (o/w1). Die wäßrige Phase (w2) besteht aus 20 ml einer 1% (w/v) Methylenblau-Lösung. Die Sprühtrocknung erfolgt am Büchi Mini Spray Dryer B191, der mit einem Dreistoffaggregat (Sonderanfertigung der Fa. Schlick-Düsen, Germany) ausgerüstet ist unter folgenden Bedingungen: Kanal 1: o/w1-Emulsion, 10 ml/min; Kanal 2: w2, 2,7 ml/min; Einlaß­ temperatur = 110°C; Auslaßtemperatur = 60°C; Aspirator = 100%; Düseninnendurchmesser = 0,8 mm, Flow=600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsguts werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lö­ sung. resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von ca. 5,5.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 13 Herstellung von DNA-haltigen gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG- Mikropartikeln mittels eines Dreistoffaggregats (M-13)
3 ml einer 2,5% (w/v) Polylactid-co-glykolid-polyethylenglykol Lösung in Methylenchlorid (PLGA-PEG, 70 : 30,PEG 5000, inh.visc. 0,68 dl/g, Birmingham Polymers Inc., Alabama, U.S.A.) werden in 15 ml einer wäßrigen Lösung die 2% (w/v) Albumin und 5% (w/v) Lactose enthält unter Ultraschall (Branson Sonifier, Stufe 7) für 2 min emulgiert (o/w1). Für die Herstellung der wäßrigen DNA -Lösung wird 1 mg DNA (β-gal Plasmid pUT 651, Cayla) in Gegenwart von 0,075% (w/v) Polyethylenimin (80% ethoxyliert, Aldrich) in 2 ml Tris-Puffer 10 mM pH 7,4 bei RT für 30 min inkubiert. Anschließend wird das Volumen auf 10 ml mit Tris-Puffer aufgefüllt (w2).
Die Sprühtrocknung erfolgt am Büchi Mini Spray Dryer B191, der mit einem Dreistoff­ aggregat (Sonderanfertigung der Fa. Schlick-Düsen, Germany) ausgerüstet ist unter folgenden Bedingungen: Kanal 1: o/w1-Emulsion, 5 ml/min; Kanal 2: w2, 2,8 ml/min; Einlaßtemperatur = 90 °C; Auslaßtemperatur= 50°C; Aspirator= 100%; Düsen ID. = 0,8 mm, Flow = 600 l/hr. 0,1 g des Sprühtrocknungsgut werden in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung. resuspendiert. Die Suspension wird gegebenenfalls 10 µm filtriert.
Die Teilchenzahlbestimmung ergibt eine Partikelkonzentration von ca. 5,5.108 T/ml an gasgefüllten Mikropartikeln. Die Teilchengrößenbestimmung der Partikel erfolgte mittels Malvern MasterSizerS und liegt bei < 10 µm.
Beispiel 14 In vitro Ultraschallechogenitätstests
Die in vitro Kontrasteffektivität der gasgefüllten Mikropartikel wurde bestimmt, um Hinweise auf die Eignung des Kontrastmittels in vivo ableiten zu können. Es wurden 100 µl der resuspendierten Mirkropartikelsuspension in 500 ml entgastem aqua purificata (37°C) gegeben. Die Beschallung erfolgte mit einem HP Sonus 1000 mit einem Schallkopf bei einer Frequenz von 3,5 MHZ und einer Schalleistung von 25 dB im B-Mode. Der Schallkopf wurde senkrecht in die Suspension eingetaucht bis gerade die Transducer Oberfläche vollständig von der Lösung benetzt wurde. Als Parameter für die Qualität des Kontrastes wurden die visuelle Kontrastdauer und -intensität im Vergleich zu Mikropartikeln, hergestellt gemäß den Ausführungen des Patents EP 19602930.9 herangezogen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1
In vitro Ultraschallechogenität
Beispiel 15 In vivo Ultraschallechogenitätstests
Das Kontrastmittel wurde intravenös in den Hund (Beagle) appliziert und sowohl die Signalverstärkung im B-Mode im linken Ventrikel gemessen als auch die Intensitäts- Steigerung des Dopplersignals im Spektraldoppler an der Arteria femoralis bestimmt. In einer weiteren Untersuchung wurde der Dopplershift durch "stimulated accoustic emission" im Farbdoppler Mode im Nierenparenchym nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.
Tabelle 2
In vivo Ultraschallechogenität
Beispiel 16 Untersuchung der Partikelmorphologie mittels Phasenkonstrastmikroskopie
Die Morphologie PLGA-PEG-haltiger Mikropartikel, die als gerüstbildende Komponente(n) entweder nur Albumin (a) oder aber Albumin in Verbindung mit Lactose (b) enthielten, wurde mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (1000-fache Vergrößerung; Phasen­ kontrast ph 2). Dazu wurden je 10 µl resuspendiertes Partikelflotat pro Deckgläschen eingesetzt.
Diese Aufnahmen (vgl. Abb. 7) zeigen, daß die Verwendung von Albumin als einzigen gerüstbildenden Komponente zu relativ homogenen PLGA-PEG-Mikropartikeln führt, die eine vergleichsweise geringe Aggregationstendenz aufweisen (Abb. 7a). Sie zeigen weiterhin, daß PLGA-PEG-Mikropartikel, die gemäß einem weiterem Aspekt der Erfindung als gerüstbildende Komponenten Albumin und Lactose enthalten, ihrer Form nach noch homogener sind und nahezu keine Aggregationstendenz mehr aufweisen (Abb. 7b).
Abbildungen
Abb. 1 Ultraschallaufnahmen des linken Herzventrikels eines Hundes im apikalen 4- Kammerblick im B-Mode (a) ohne Ultraschallkontrastmittel (Leerwert) und (b) nach intravenöser Gabe von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Lactose- Mikropartikeln (Beispiel B-2; Dosis: 1 µl/kg).
Abb. 2 Ultraschallaufnahmen des linken Herzventrikels eines Hundes im apikalen 4- Kammerblick im B-Mode (a) ohne Ultraschallkontrastmittel (Leerwert) und (b) nach intravenöser Gabe von gasgefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikropartikeln (Beispiel C-3; Dosis: 1 µl/kg).
Abb. 3 Ultraschallaufnahmen der Arteria femoralis eines Hundes (Spektraldoppler) (a) ohne Ultraschallkontrastmittel (Leerwert) und (b) nach intravenöser Gabe von Decafluor­ butan-gefüllten Polylactid-co-glykolid-PEG Mikropartikeln (Beispiel J-10; Dosis: 1 µl/kg).
Abb. 4 Ultraschallaufnahme der Arteriafemoralis eines Hundes (Spektraldoppler) (a) ohne Ultraschallkontrastmittel und (b) nach intravenöser Gabe von gasgefüllten, durch Flotation von kontrastarmen Bestandteilen abgetrennten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikro­ partikeln (Beispiel K-11; Dosis: 5 µl/kg).
Abb. 5 Ultraschallaufnahme der Niere eines Hundes (Farbdoppler) (a) ohne Ultraschallkontrastmittel und (b) nach intravenöser Gabe von gasgefüllten, durch Flotation von kontrastarmen Bestandteilen abgetrennten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikro­ partikeln (Beispiel K-11; Dosis: 5 µl/kg).
Abb. 6 Ultraschallaufnahme des linken Herzventrikels eines Hundes im apikalen 4- Kammerblick im B-Mode nach intravenöser Gabe von gasgefüllten, durch Flotation von kontrastarmen Bestandteilen abgetrennten Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Mikro­ partikeln (Beispiel K-11; Dosis: 2 µl/kg).
Abb. 7 Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von Polylactid-co-glykolid-PEG- Albumin-Mikropartikeln (a) bzw. Polylactid-co-glykolid-PEG-Albumin-Lactose-Mikro­ partikeln (b) (jeweils 1000-fache Vergrößerung).

Claims (16)

1. Gasgefüllte Mikropartikel, die ein Polymer und mindestens eine gerüstbildende Komponente enthalten.
2. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer entweder ein Polylactid-co-glykolid (PLGA) oder ein Copolymer oder Block-Copolymer aus PLGA und Polyethylenglykol (PEG) ist.
3. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, die als gerüstbildende Komponente(n) ein oder mehrere Proteine und/oder einen oder mehrere Zucker enthalten.
4. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß dem Anspruch 3, wobei Albumin, Casein und/oder Gelatine als gerüstbildende Komponente(n) verwendet werden.
5. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß dem Anspruch 3, wobei Mono-, Di- und/oder Poly­ saccharide als gerüstbildende Komponente(n) verwendet werden.
6. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1-5, wobei die Mikropartikel im wesentlichen frei von Tensiden sind.
7. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1-6, wobei die Gasfüllung aus Luft, Sauerstoff Stickstoff- Edelgasen, Kohlenstoffdioxid, gasförmigen Kohlenwasserstoffen oder Perfluorgasen oder aus Mischungen dieser Gase besteht.
8. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1-7, die therapeutische Wirkstoffe oder diagnostische Substanzen enthalten.
9. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei dem Wirkstoff um einen Arzneistoff oder um eine biologisch aktive Substanz handelt.
10. Gasgefüllte Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 8 und 9, wobei es sich bei der biologisch aktiven Substanz um Peptide, Proteine und/oder Nukleinsäuren handelt.
11. Verfahren zur Herstellung von gasgefüllten Mikropartikeln gemäß den Ansprüchen 1-10, das folgende Schritte beinhaltet:
  • (i) Emulgierung einer nicht-wäßrigen Lösung des Polymers und einer wäßrigen Lösung mindestens einer gerüstbildenden Komponente und
  • (ii) Sprühtrocknung der erhaltenen Emulsion.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Luftfüllung der Mikropartikel in einem weiteren Schritt durch andere Gase, bevorzugt Perfluorverbindungen, ersetzt wird.
13. Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 und 12, wobei das Sprühtrocknungsgut anschließend einem Flotationsschritt zur Abtrennung nicht-kontrastaktiver Bestandteile unterzogen wird.
14. Verwendung der Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 als Kontrastmittel in der Ultraschalldiagnostik.
15. Verwendung der Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur ultraschall­ induzierten Wirkstofffreisetzung.
16. Pharmazeutische Mittel, die die Mikropartikel gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 in einem pharmazeutisch verträglichen Suspensionsmedium enthalten.
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