DE60222888T3

DE60222888T3 - Echogene polymermikrokapseln und nanokapseln und verfahren zu ihrer herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60222888T3
Application number: DE60222888T
Authority: DE
Inventors: Margaret Wheatley; Dalia El-Sherif
Original assignee: Drexel University
Current assignee: Drexel University
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-04-01
Publication date: 2012-08-23
Anticipated expiration: 2022-04-02
Also published as: ATE375144T1; CA2441609C; AU2002307056B2; JP2004532207A; EP1390016A2; EP1390016B2; DE60222888D1; CA2441609A1; DE60222888T2; EP1390016A4; WO2002078611A3; EP1390016B1; WO2002078611A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Ultraschall-Kontrastmittel werden routinemäßig bei der medizinischen diagnostischen Ultraschallbehandlung sowie bei der industriellen Ultraschallbehandlung verwendet. Für medizinische Diagnostikzwecke sind Kontrastmittel gewöhnlich Gasblasen, welche ihre Kontrasteigenschaften aus dem großen akustischen Impedanzunterschied zwischen Blut und dem darin enthaltenen Gas enthalten. Wichtige Parameter für das Kontrastmittel umfassen Partikelgröße, Bildgebungsfrequenz, Dichte, Kompressibilität, Partikelverhalten (Oberflächenspannung, Innendruck, blasenartige Eigenschaften) sowie Bioverteilung und Toleranz.
Gasgefüllte Partikel sind bei weitem die besten Reflektoren. Verschiedene auf Blasen basierende Suspensionen mit Durchmessern im Bereich von 1 bis 15 Mikron wurden zur Verwendung als Ultraschall-Kontrastmittel entwickelt. Blasen dieser Dimensionen haben Resonanzfrequenzen im diagnostischen Ultraschallbereich und verbessem somit ihre Rückstreuverstärkungskapazitäten. Es wurde festgestellt, dass Beschallung eine verlässliche und reproduzierbare Technik zur Erzeugung standardisierter Echo-Kontrastmittellösungen, die gleichmäßig kleine Mikroblasen enthalten, darstellt. Blasen, die mit dieser Technik erzeugt werden, liegen typischerweise im Größenbereich von 1 bis 15 Mikron Durchmesser mit einem mittleren Blasendurchmesser von 6 Mikron (Keller et al., 1986, J. Ultrasound Med. 5: 493–498). Jedoch ist die Beständigkeit dieser Blasen im Blutstrom als beschränkt befunden worden und die weitere Forschung befasst sich mit neuen Verfahren zur Herstellung von Mikroblasen. Die Forschung konzentrierte sich auch auf die Herstellung von hohen Mikropartikeln zur Verwendung als Kontrastmittel, wobei das Mikropartikel mit Gas gefüllt und bei der Ultraschall-Bildgebung verwendet werden kann. Diese hohlen Mikropartikel haben jedoch auch Anwendungsmöglichkeiten als Arzneiwirkstoffabgabemittel, wenn sie mit Arzneiwirkstoffprodukten assoziiert sind. Diese hohlen Mikropartikel können auch mit einem Agens assoziiert sein, welches ausgewählte Zellen und/oder Gewebe gezielt ansteuert, um zielsuchende Kontrastmittel und/oder zielsuchende Arzneiwirkstoffabgabemittel herzustellen.
Tensid-stabilisierte Mikroblasenmischungen zur Verwendung als Ultraschall-Kontrastmittel sind im US-Patent 5.352,436 offenbart.
WO 9847540 offenbart ein Kontrastmittel für diagnostische Ultraschallbildgebung und gezielte Krankheitsdarstellung und Arzneiwirkstoffangabe, umfassend eine Dispersion einer biokompatiblen azeotropen Mischung, die einen Halogenkohlenstoff enthält.
WO 9421301 offenbart ein Ultraschallmittel, bestehend aus einer biokompatiblen Öl-in-Wasser-Emulsion, worin die Ölphase ein(e) öllösliche(s) Gas/Flüssigkeit oder einen Gasvorläufer umfasst.
US-Patent 5,637,289 , US-Patent 5,648,062 , US-Patent 5,827,502 und US-Patent 5,614,169 offenbaren Kontrastmittel, die wasserlösliche, Mikroblasen-bildende Kohlehydrat-Mikropartikel, gemischt mit mindestens 20% eines nicht-oberflächenaktiven weniger wasserlöslichen Materials, eines Tensids oder einer amphiphilen organischen Säure, umfassen. Das Mittel wird hergestellt durch trockenes Mischen oder durch Mischen von Lösungen von Komponenten, gefolgt von Verdampfung und Mikronisierung.
Das US-Patent 5,648,095 offenbart hohle Mikrokapseln zur Verwendung bei der Bildgebung und Arzneiwirkstoffabgabe. Die hohlen Mikrokapseln werden hergestellt durch Kombination eines flüchtigen Öls mit einer wässrigen Phase, die ein wasserlösliches Material einschließt, wie zum Beispiel Stärke oder ein Polyethylenglykol-Konjugat, um eine primäre Emulsion zu bilden. Die primäre Emulsion wird dann mit einem zweiten Öl kombiniert, um eine sekundäre Emulsion zu bilden, welche gehärtet wird und die Bildung von Mikrokapseln um einen Flüssigkeitskern des flüssigen Öls erlaubt. Das flüchtige Öl wird dann durch Verdampfung entfernt, was eine hohle Mikrokapsel zurücklässt.
Das US-Patent 5,955,143 offenbart hohle Polymer-Mikrokapseln, welche hergestellt werden durch Lösen eines filmbildenden Polymers in einem flüchtigen nicht-wässrigen Lösungsmittel, Dispergieren von feinteiligen Partikeln eines verflüchtigungsfähigen festen Kernmaterials in der Polymerlösung. Induzieren der Bildung einer festen Polymerbeschichtung auf dem teilchenförmigen festen Kernmaterial zur Herstellung von Polymer-Mikrokapseln mit einem verkapselten festen Kern. Dieser Kern wird dann entfernt, um hohle Mikrokapseln zu ergeben, welche dann mit Gas für Kontrastbildgebung gefüllt werden können.
P. Narayan et al. (Polymer Engineering an Science, November 1999, Bd. 39, Nr. 11, Seiten 2242–2255) offenbaren hohle Polymer-Mikrokapseln zur Verwendung als Bildkontrastmittel. Hohle Bereiche in den Polymer-Mikrokapseln werden geschaffen durch Verkapseln von sublimierbaren Feststoffen, gefolgt von Lyophilisierung der sublimierbaren Partikel.
US 6,139,818 betrifft echogene gas- oder luftgefüllte Polymer-Mikroballons zur Verwendung als Ultraschall-Kontrastmittel. Dieses Dokument offenbart, dass ein poröses Partikel gebildet werden kann mittels Verwendung einer Emulsion von (1) einem Polymer, gelöst in flüssiger Naphthalin-Lösung, und (2) einer wässrigen Lösung mit einem Emulgator, gefolgt von Gefriertrocknung. Dies führt zur Bildung von Mikroporen in einer Hülle der Mikroballons.
US 5,853,698 betrifft echogene Polymer-Mikrokapseln, die fluorierte Gase enthalten. Dieses Dokument beschreibt die Emulgierung einer Lösung eines synthetischen Polymers mit einer wässrigen Lösung eines flüchtigen Salzporen-bildenden Agens oder eines festen Porenbildenden Agens.
K. Bjerknes et al. (International Journal of Pharmaceutics, 158 (1997) 129–136) offenbaren luftgefüllte polymere Mikroblasen zur Verwendung als Ultraschall-Reflektoren. Bei dem offenbarten Verfahren wird ein Polymer bei hoher Temperatur in derselben Substanz gelöst, welche dann entfernt wird, um den Mikroblasen-Kern zu bilden.
US 5,837,221 richtet sich auf Polymer-Lipid-mikroverkapselte Gase zur Verwendung als Kontrastmittel, und beschreibt, dass Mikropartikel, welche aus der Kombination eines natürlichen oder synthetischen Polymers und einem Lipid gebildet werden, eine signifikant erhöhte Echogenizität gegenüber Mikropartikeln ohne dem Lipid aufweisen. EI-Sherif und Wheatley 2001 (Bioengineering Conference 2001, Proceedings of the IEEE 27. Annual Northeast Bioengineering Conference) richtet sich auf die Entwicklung von biologisch abbaubaren PLGA-Mikrokügelchen zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel und beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von hohlen/porösen PLGA-Mikrokapseln mittels einer modifizierten Doppelemulsions-Lösungsmittelverdampfungs-Technik. Kleine, echogene Mikrokapseln können durch Verkapselung eines entfernbaren flüchtigen Kerns hergestellt werden.
Es bleibt ein Bedarf für Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen, biologisch abbaubaren echogenen Mikrokapseln und Nanokapseln eines reproduzierbaren Größenbereichs mit erhöhter Echogenizität, welche für die Kontrast-Bildgebung und/oder die Arzneiwirkstoffabgabe mit oder ohne Zielsuchkapazitäten eingesetzt werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung echogener Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln, welche umfassen das Lösen einer nicht-wasserlöslichen Substanz, die sich in einem nicht-polaren Lösungsmittel löst und aus dem festen Zustand sublimiert, in einem oder mehreren flüchtigen nicht-polaren Lösungsmittel(n), um eine erste Mischung zu bilden; Lösen eines Polymers in der ersten Mischung, um eine zweite Mischung zu bilden; Emulgieren der zweiten Mischung mit Wasser, um eine erste Population von Mikrokapseln zu bilden, die das Polymer und die nicht-wasserlösliche Substanz umfassen; Mischen der ersten Population von Mikrokapseln mit einer Tensid-Lösung und Rühren/Homogenisieren, um die erste Population von Mikrokapseln aufzubrechen und um eine zweite Population von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln zu bilden, die eine geringere Größe aufweisen; Härten der zweiten Population von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln mit einem Lösungsmittel; und Waschen und vorzugsweise Gefriertrocknen der zweiten Population von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln, um überschüssige nicht-wasserlösliche Substanz aus der zweiten Population von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln zu entfernen.
Somit wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung echogener Polymer-Mikrokapseln oder -Nanokapseln bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Lösen einer nicht-wasserlöslichen Substanz, welche sublimiert, in einem oder mehreren flüchtigen nichtpolaren Lösungsmittel(n), um eine erste Mischung zu bilden;
(b) Lösen eines Polymers in der ersten Mischung, um eine zweite Mischung zu bilden;
(c) Zugeben von Wasser, das ein wasserlösliches Agens umfasst, welches sublimiert, zu der zweiten Mischung vor dem Emulgieren der zweiten Mischung, um eine erste Population von Mikrokapseln, welche das Polymer und die nicht-wasserlösliche Substanz umfassen, herzustellen;
(d) Mischen der ersten Population von Mikrokapseln mit einem Tensid, um die erste Population von Mikrokapseln aufzubrechen und eine zweite Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln zu bilden, die ein geringere Größe aufweisen;
(e) Härten der zweiten Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln durch Mischen der Mikrokapseln oder Nanokapseln mit einem Härter; und
(f) Waschen der zweiten Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln, um echogene Polymer-Mikrokapseln oder -Nanokapseln zu erhalten.

Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel, erhältlich mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, bereitgestellt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung bei einem Individuum bereitgestellt, welches eine echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel der vorliegenden Erfindung, die mit einem Gas gefüllt ist, umfasst. Solche Kontrastmittel können ferner ein zielsuchendes Agens, wie zum Beispiel ein Peptid oder Antikörper, auf der Mikrokapsel- oder Nanokapsel-Oberfläche für die gezielte Abgabe der Kontrastmittel an ausgewählte Gewebe oder Zellen umfassen. Die Anbindung eines zielsuchenden Agens, das für ein Krankheitsgewebe selektiv ist, ergibt ein Kontrastmittel, welches zwischen erkranktem und normalem Gewebe unterscheidet. Die Verwendung von Kontrastmitteln, die echogene Polymer-Nanokapseln der vorliegenden Erfindung umfassen, erlaubt die Bilddarstellung von Geweben über den Zugang an Stellen des Gefäßsystems, welche für den Zugang durch Mikrokapseln zu eng sind, zum Beispiel durchlässige Tumorgefäße.
Ebenfalls hier beschrieben sind Verfahren zur Bilddarstellung eines Gewebes oder von Geweben bei einem Individuum mittels der Verabreichung eines Kontrastmittels, das echogene Polymer-Mikrokapseln und/oder -Nanokapseln der vorliegenden Erfindung umfasst, die mit einem Gas gefüllt sind. Die bei diesem Verfahren verwendeten Kontrastmittel können ferner ein zielsuchendes Agens, wie zum Beispiel ein Peptid oder ein Antikörper, auf der Mikrokapsel- und/oder Nanokapsel-Oberfläche umfassen für die gezielte Abgabe des Kontrastmittels an das ausgewählte Gewebe oder die ausgewählten Gewebe. Die Anbindung eines zielsuchenden Agens, das selektiv für ein erkranktes Gewebe ist, ermöglicht ein Verfahren zur Unterscheidung von erkranktem Gewebe von normalem Gewebe durch selektive Bilddarstellung. Gleichermaßen ermöglicht die Anbindung eines zielsuchenden Agens, das selektiv für maligne Gewebe ist, ein Verfahren zur Unterscheidung von malignem Gewebe von gutartigem Gewebe durch selektive Bilddarstellung.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Abgabe eines bioaktiven Agens bereitgestellt, welche ein bioaktives Agens umfasst, das an eine echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel der vorliegenden Erfindung absorbiert, damit verbunden, darin verkapselt oder in irgendeiner Kombination davon vorliegt. Solche Zusammensetzungen können ferner ein zielsuchendes Agens, wie zum Beispiel ein Peptid oder ein Antikörper, auf der Mikrokapsel- oder Nanokapsel-Oberfläche zur gezielten Abgabe des bioaktiven Agens an ausgewählte Gewebe oder Zellen umfassen. Die Anbindung eines zielsuchenden Agens, das selektiv für ein erkranktes Gewebe ist, ermöglicht ein Abgabemittel, welches ein bioaktives Agens selektiv an erkranktes Gewebe abgibt. Das bioaktive Agens kann von der Mikrokapsel oder Nanokapsel durch Exposition gegenüber Ultraschall und/oder nach Abbau der Polymer-Kapsel freigesetzt werden. Die Verwendung von Zusammensetzungen, die echogene Polymer-Nanokapseln der vorliegenden Erfindung umfassen, erlaubt die Abgabe von bioaktiven Agenzien an Stellen des Gefäßsystems, die für den Zugang durch Mikrokapseln zu eng sind, zum Beispiel durchlässige Tumorgefäße.
Ebenfalls hier beschrieben sind Verfahren zur Abgabe von bioaktiven Agenzien an ein Individuum mittels Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein bioaktives Agens an echogene Polymer-Mikrokapseln und/oder -Nanokapseln der vorliegenden Erfindung absorbiert, damit verbunden und/oder darin verkapselt oder in irgendeiner Kombination davon umfasst. Die bei diesem Verfahren verwendeten Zusammensetzungen können ferner ein zielsuchendes Agens, wie zum Beispiel ein Peptid oder ein Antikörper, auf der Oberfläche der echogenen Polymer-Mikrokapsel und/oder -Nanokapsel zur gezielten Abgabe des bioaktiven Agens an ausgewählte Gewebe oder Zellen in dem Individuum umfassen. Bei diesem Verfahren wird das bioaktive Agens von der Mikrokapsel und/oder Nanokapsel durch Exposition gegenüber Ultraschall, Abbau der Polymer-Kapsel oder eine Kombination davon freigesetzt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft echogene Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln und Verfahren zur Herstellung solcher für die Verwendung als Kontrastmittel bei der diagnostischen Bildgebung und Zusammensetzungen zur Abgabe bioaktiver Agenzien. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Anbindung eines zielsuchenden Agens an die echogenen Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln der Kontrastmittel und Zusammensetzungen zur Abgabe von bioaktiven Agenzien der vorliegenden Erfindung für die gezielte diagnostische Bildgebung und Abgabe von bioaktiven Agenzien an ein ausgewähltes Gewebe oder an ausgewählte Gewebe. Die Herstellung von echogenen Polymer-Nanokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt die Bilddarstellung von und Abgabe von bioaktiven Agenzien an Bereiche(n) des Gefäßsystems, die für den Zugang durch Mikrokapseln zu eng sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet „echogen”, dass die Mikokapsel oder Nanokapsel in der Lage ist, aufgrund eines akustischen Impedanzunterschieds zwischen dem Blut und der Mikrokapsel oder Nanokapsel ein nachweisbares Echo zu erzeugen, wenn sie mit Ultraschallwellen beschallt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die echogenen Eigenschaften die Folge davon, dass die Mikrokapsel und/oder Nanokapsel hohl und/oder porös ist.
Mit „porös” ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gemeint, dass die Kapsel eine oder mehrere Poren enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden echogene Polymer-Mikrokapseln und/oder -Nanokapseln wie folgt hergestellt. Eine nicht-wasserlösliche Substanz, welche sich in einem nicht-polaren Lösungsmittel löst und aus einem festen Zustand sublimiert, wird zuerst in einem oder mehreren nicht polaren Lösungsmittel(n) gelöst, um eine erste Mischung zu bilden. Irgendeine nicht-wasserlösliche Substanz, die sich ein einem nicht-polaren Lösungsmittel löst und aus einem festen Zustand sublimiert, kann zur Herstellung dieser ersten Mischung eingesetzt werden. Beispiel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Campher, para-Ph, Camphen, Naphthalin; Kokosnussbutter und Theobroma-Öl.
Beispiele nicht-polarer Lösungsmittel, welche eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Methylenchlorid, Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Chloroform, Pentan, Penten und Methylethylketon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die nicht-wasserlösliche Substanz Campher und das Lösungsmittel ist Methylenchlorid. Ein bevorzugtes Verhältnis von Campher zu Methylenchlorid beträgt 0,05 g:10 ml. Zusätzliche nicht-polare Lösungsmittel der oben aufgeführten Beispiele können der Mischung ebenfalls hinzugefügt werden, um die Größe der Kapseln im Nanogrößenbereich einzustellen (Nanokapseln). Die Zugabe eines zweiten, vorzugsweise unterschiedlichen, Lösungsmittels verringert die Größe der Kapseln aufgrund seiner unterschiedlichen Eigenschaften. Beispielsweise beeinflusst die Geschwindigkeit, mit der das Lösungsmittel die Kapseln während der Härtungsphase verlässt, die Größe der Kapseln. Konkreter, je schneller das Lösungsmittel austritt, desto kleiner die Kapsel. Aceton tritt schneller aus den Kapseln aus als Methylenchlorid. Dementsprechend führt die Zugabe von Aceton als zweites Lösungsmittel zu Kapseln von Nanogröße im Vergleich zu den Kapseln von Mikrogröße, die bei Verwendung von nur Methylenchlorid gebildet werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist mit „Nanokapsel” eine Kapsel gemeint, welche eine ausreichend kleine Größe aufweist, um Zugang zum Mikrogefäßsystem des menschlichen Körpers zu haben. Nanokapseln der vorliegenden Erfindung liegen im Größenbereich von etwa 10 nm bis etwa 500 nm, während Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung im Größenbereich von etwa 500 nm bis etwa 1000 Mikron liegen. Nanokapseln dieser Größe bieten insofern einen Vorteil, als sie Zugang zu Bereichen haben, die mit Mikrokapseln schwierig, wenn nicht unmöglich zu erreichen sind. Beispielsweise können Nanokapseln durchlässige Tumorgefäße passieren. Darüber hinaus haben Nanokapseln unterschiedliche Resonanzfrequenzen und bieten somit Vorteile bei sowohl der Bildgebung als auch der Abgabe von bioaktiven Agenzien. Nanokapseln der vorliegenden Erfindung wurden als echogen oberhalb von 10 MHz befunden.
Nachdem die nicht-wasserlösliche Substanz in dem nichtpolaren Lösungsmittel vollständig gelöst ist, wird ein Polymermaterial der ersten Mischung zugegeben. Beispiele von Polymeren, welche bei diesem Verfahren eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polylactid, ein Polyglycolid, ein Polycaprolacton, ein Copolymer von Polylactid und Polyglycolid, ein Copolymer von Lactid und Lacton, ein Polysaccharid, ein Polyanhydrid, ein Polystyrol, ein Polyalkylcyanoacrylat, ein Polyamid, ein Polyphosphazenj, ein Poly(methylmethacrylat) ein Polyeurethan, ein Copolymer von Methacrylsäure und Acrylsäure, ein Compolymer von Hydroxyethylmethacrylat und Methylmethacrylat, eine Polyaminosäure und ein Polypeptid. Bevorzugte Polymere sind diejenigen, welche biokompatibel und/oder biologisch abbaubar sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polymilchsäure-co-Glycolsäure (PLGA). In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass 0,5 g des Polymers zu den 10 ml Lösung der ersten Mischung zugegeben werden.
Das Polymer wird dann in die erste Mischung eingerührt, bis es vollständig gelöst ist und bildet so die zweite Mischung.
Die zweite Mischung wird dann mit Wasser emulgiert. Für die Emulgation mit Wasser wird ein Aliquot von destilliertem Wasser vorzugsweise 1 ml, einer zweiten Mischung zugegeben, die 10 ml Methylenchlorid, Campher und PLGA umfasst, und ein Sonden-Ultraschallrührer wird 30 Sekunden lang eingesetzt. Diese Emulsion einer zweiten Mischung von Methylenchlorid, Campher und PLGA ergibt eine Population von Mikrokapseln, die einen Größenbereich von 0,1 bis 1 mm aufweisen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird diese Population von Mikrokapseln als die erste Population von Mikrokapseln bezeichnet.
Die erste Population von Mikrokapseln wird dann in ein Tensid gegossen und mehrere Minuten lang homogenisiert. Beispiele eines Tensids, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Poly(vinyl)alkohol, Tweene und nicht-ionische Tenside. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mikrokapseln von Campher und PLGA zu 50 ml einer 5%-igen Polyvinylalkohol(PVA)-Lösung zugegeben und 5 Minuten lang bei 9500 UpM homogenisiert. Die Zugabe des Tensids erlaubt den Aufbruch der Mikrokapseln in kleinere Perlen, um eine zweite Population von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln zu bilden. Diese Prozedur verstärkt die Größenverringerung der Mikrokapseln, ein wichtiger Schritt beim Herstellungsverfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zweite Population von Mikrokapseln in einen Härter, wie zum Beispiel 100 ml einer 2%-igen Isopropanollösung, gegossen und eine Stunde lang gerührt. Dies entfernt restliches Methylenchlorid und härtet die Mikrokapseln. Alternativ wird das Isopropanol in den Behälter gegossen, der die Mikrokapseln enthält, und eine Stunde lang gerührt, um restliches Methylenchlorid zu entfernen und die Mikrokapseln zu härten. Beispiele von Härtern, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Isopropanol, Ethanol, Methanol, Ethylether, Petrolether, Heptan und Hexan.
Nach diesem Härtungsschritt werden die Mikrokapseln durch Zentrifugation gewonnen, mit einem Überschuss an destilliertem Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und mehrere Male mit einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Hexan, gewaschen, welches die nicht-wasserlösliche Substanz entfernt, ohne das Polymer aufzulösen. Hexan fungiert auch als Härter, welcher restliches Methylenchlorid entfernt und die Kapseln weiter trocknet. Nach jedem Waschschritt wird das Waschlösungsmittel durch Pipettieren entfernt. Ein letzter Waschschritt mit destilliertem Wasser wird dann durchgeführt. Die gewaschene Population an Polymer-Mikrokapseln und/oder -Nanokapseln wird dann zentrifugiert, bei –85°C eingefroren und dann lyophilisiert, um die Kapseln zu trocknen und etwaige zusätzliche nicht-wasserlösliche Restsubstanz zu entfernen. Dies resultiert in einem freifließenden Pulver von Mikrokapseln und/oder Nanokapseln, das lagerungsstabil ist und routinemäßig in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, wie zum Beispiel Salzlösung, unmittelbar vor Gebrauch resuspendiert werden kann.
Die Partikelgrößenanalyse der Endpopulation von echogenen Polymer-Mikrokapseln, die aus Campher, Methylenchlorid und PLGA hergestellt wurden, zeigte, dass die Population hinsichtlich der Größe innerhalb eines Bereichs von 0,4 bis 1,6 Mikron gleichmäßig ist.
Akustische Dosis-Wirkung-Experimente wurden unter Verwendung dieser echogenen Polymer-Mikrokapseln durchgeführt. Vier sphärisch fokussierte Einzelelement-Breitband-Messwandler (12,7 mm Elementdurchmesser) von 50,8 mm (Panametrics, Waltham, MA) mit Zentralfrequenzen von 2,25 MHz, 5 MHz, 7,5 MHz bzw. 10 MHz wurden ausgewählt, um den herkömmlichen medizinischen Ultraschallbereich zu repräsentieren. Die 6-d6-Bandbreiten der Messwandler waren 89%, 92%, 71% bzw. 65%. Eine bekannte Menge (0,01 g bis 1,0 g) der echogenen Polymer-Mikrokapseln wurde in 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung in einem Probenbehälter eingewogen und eine Dosis-Wirkung wurde registriert. Die Dosen der Dosis-Wirkung-Kurve wurden sechs Mal wiederholt. Frischer Puffer wurde bei jeder Dosis eingesetzt und eine zehnsekündige Verzögerung nach der Verabreichung des Mittels in dem Behälter stellte ein angemessenes Mischen vor der Gewinnung eines Signals sicher. Das Signal wurde mit einem Zeitfenster von 2,0 Mikrosekunden, nachdem das Geräusch des Wandsignals abgeklungen war, gesteuert. Der quadratische Mittelwert („root mean square”; rms) des gesteuerten Signals wurde berechnet und der Mittelwert für 50 A-Linien ohne Mittel wurde als Grundlinie s₀(t) genommen. Gleichermaßen wurde der Mittelwert für 50 A-Linien mit Kontrastmittel S_CA(t) berechnet und relativ zu S₀(t) als Verstärkung ΣE, ausgedrückt in dB, angegeben. ΣE = 20log₁₀[rms(S_CA(t)rms(S₀(t))]
Die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung ergaben eine Dosis-Wirkung-Beziehung.
In dem Emulgationsschritt wird ein Agens zugegeben, das in einer wässrigen Lösung gelöst wird und welches sublimiert. Beispiele solcher Agenzien, die wasserlöslich sind und sublimieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ammoniumcarbonat und andere Ammoniumsalze, Theobromin und Theobrominacetat. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 1,0 ml einer 4%-igen wässrigen Ammoniumcarbonatlösung der zweiten Mischung vor der Sondenbeschallung zugegeben.
Eine Größenverteilungsanalyse dieser Mikrokapseln mittels Coulter-Größenanalyse zeigte einen mittleren Durchmesser von 1,242 μm. Die Größenverteilungsanalyse von Mikrokapseln mittels Horiba-Größenanalyse offenbarte einen mittleren Durchmesser von 1,210 μm.
Die Polymer-Mikrokapseln, die gemäß diesem Verfahren unter Verwendung von Campher und Ammoniumcarbonat hergestellt worden waren, waren echogen und es wurde gezeigt, dass eine in vitro-Dosis-Wirkung in Bezug zu der Frequenz stand, mit der sie beschallt wurden, wobei sich eine Verstärkung von 14,8, 25,4, 25,3 und 20,8 dB, wenn sie mit Ultraschallenergie von 2,25, 5, 7,5 bzw. 10 MHz bestrahlt wurden, für eine Dosis von nur 8 μm Mikrokapseln/ml Puffer ergab (etwa 1,6 × 10⁶ Mikroblasen pro ml). Diese Dosis ist relativ niedrig im Vergleich zu der Dosis von 6 mg/ml, welche erforderlich ist, um eine 23-dB-Verstärkung mit Mikrokapseln zu erhalten, worin nur Campher verkapselt und sublimiert wurde. Somit erfordern die gemäß diesem Verfahren hergestellten Mikrokapseln, worin Ammoniumcarbonat, ein Agens, das löslich ist und sublimiert, in einer wässrigen Lösung gelöst und vor der Emulgation zugegeben wird, eine niedrigere Dosis, um die selbe akustische Verstärkung wie Mikrokapseln zu ergeben, die ohne diesen zusätzlichen Schritt hergestellt wurden.
Ein Schatteneffekt wurde ebenfalls mit den Mikrokapseln beobachtet.
In vivo-Power-Doppler-Bildgebung, wurde ebenfalls bei Neuseeland-Weißen-Kaninchen unter Verwendung dieser Mikrokapseln als Bildgebungsmittel durchgeführt und zeigte eine Verstärkung des Bilds im Vergleich zu der Bildgebung ohne das Agens. Die in vivo-Dosis-Wirkung-Kurven zeigten eine signifikante akustische Verstärkung von bis zu 24 dB mit einer Dosis von 0,15 ml/kg.
Somit können, wie hier demonstriert, echogene Polymer-Mikrokapseln und Nanokapseln, die gemäß diesen Verfahren hergestellt wurden, für die Bilddarstellung irgendeines der verschiedenen Gewebe und deren Epithel und/oder Endothel, die routinemäßig mit Ultraschalltechniken dargestellt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Nierengewebe, Gehirngewebe, Tumorgefäße, Hautgewebe, Pankreasgewebe, Brustgewebe, Herzgewebe, Prostatagewebe, Uterusgewebe, Nebennierengewebe, Retinagewebe, Muskelgewebe, Bereiche von Plaques und Bereiche von Ischämie, eingesetzt werden.
Zur Verwendung als Kontrastmittel ist es bevorzugt, dass die echogenen Mikrokapseln und/oder Nanokapseln der vorliegenden Erfindung hohl oder porös sind, so dass sie mit Gas gefüllt werden können. Solche gasgefüllten Polymer-Mikrokapseln werden hergestellt durch Kontaktieren von echogenen hohlen oder porösen Polymer-Mikrokapseln mit einem Gas und Äquilibrieren der Mikrokapseln mit dem Gas für eine ausreichende Zeitspanne, um die Diffusion des Gases in die Polymer-Mikrokapseln zu gestatten, was in einer gasgefüllten Polymer-Mikrokapsel resultiert. Diese Prozedur der Exposition von hohlen oder porösen Polymer-Mikrokapseln gegenüber dem Gas kann bei Umgebungsdruck (Atmosphärendruck), bei einem subatmosphärischen Druck oder bei einem erhöhten Druck durchgeführt werden. Die Zeitspanne, welche erforderlich ist, um das Füllen der hohlen Mikrokapseln mit dem Gas zu bewirken, ist relativ kurz, typischerweise sind nur einige wenige Minuten erforderlich, wobei die tatsächliche Zeit von der Art und Weise und dem Druck, mit der bzw. bei dem die hohlen Mikrokapseln mit dem Gas äquilibriert werden, abhängt. Der Begriff „Gas”, wie in dieser Beschreibung verwendet, umfasst Substanzen, welche unter normalen Lagerungsbedingungen gasförmig sind, z. B. bei etwa 15–25°C, und/oder bei der normalen Körpertemperatur eines Säugers, z. B. 37°C bei Menschen. Die resultierenden gasgefüllten Polymer-Mikrokapseln dieser Erfindung können als trockenes freifließendes Pulver gelagert werden, vorzugsweise in Anwesenheit des Gases, das in den Polymer-Mikrokapseln enthalten ist.
Die gasgefüllten Mikrokapseln eignen sich als Kontrastmittel bei der medizinischen Bildgebung, zum Beispiel diagnostischem Ultraschall. Untraschall-Kontrastmittelzusammensetzungen umfassen typischerweise die hohlen oder porösen Polymer-Mikrokapseln, gefüllt mit einem Gas und dispergiert in einer wässrigen Flüssigkeit, die als Träger für das Kontrastmittel dient. Wässrige Flüssigkeiten, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, isotone Salzlösung und phosphatgepufferte Salzlösung. Die Kontrastmittelzusammensetzung wird dann in den Blutstrom injiziert und für die Ultraschall-Visualisierung spezieller Blutgefäße oder Körperorgane verwendet.
Die Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln der vorliegenden Erfindung können für die Abgabe bioaktiver Agenzien verwendet werden. In dieser Ausführungsform kann ein bioaktives Agens an die Oberfläche der Mikrokapsel oder Nanokapsel adsorbiert und/oder gebunden werden. Zur Adsorption eines Arzneiwirkstoffprodukts an die Mikrokapseloberflächen wird der Arzneiwirkstoff in destilliertem Wasser oder einem Puffer gelöst und dann werden die getrockneten Mikrokapseln in destilliertem Wasser mit dem Arzneiwirkstoff suspendiert. Die Suspension wird über Nacht gerührt und dann die Suspension zentrifugiert, um Kapseln zu gewinnen. Die resultierenden Mikrokapseln werden dann gewaschen, eingefroren und lyophilisiert. Die lyophilisierten Mikrokapseln haben das abzugebende Arzneiwirkstoffprodukt an ihren Oberflächen adsorbiert. Bioaktive Agenzien können auch an die Mikrokapseln und/oder Nanokapseln gemäß wohlbekannten Konjugationsverfahren gebunden werden. Beispielsweise kann ein Konjugationsverfahren wie in Beispiel 8 gelehrt unter Ersatz des RGD-Peptids durch das bioaktive Agens verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich kann ein bioaktives Agens in der Mikrokapsel oder Nanokapsel verkapselt werden. Wasserlösliche bioaktive Agenzien können in den Mikrokapseln oder Nanokapseln durch Einschluss von Wasser während der Emulgation und Lösen des bioaktiven Agens in diesem Wasser verkapselt werden. Nicht-wasserlösliche bioaktive Agenzien können in den Mikrokapseln oder Nanokapseln durch Lösen der bioaktiven Verbindung in dem nicht-polaren organischen Lösungsmittel im ersten Schritt der Herstellung dieser Kapseln verkapselt werden. Beispiele bioaktiver Agenzien, welche an die Mikrokapseln und/oder Nanokapseln der vorliegenden Erfindung adsorbiert, gebunden und/oder darin verkapselt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, antineoplastische Mittel und Antitumormittel, wie zum Beispiel Azacytidin, Cytarabin, Fluoruracil, Mercaptopurin, Methotrexat, Thioguanin, Bleomycin-Peptid-Antibiotika, Podophyllin-Alkaloide wie Etoposid, VP-16, Teniposid und VM-26, Pflanzenalkaloide wie Vincristin, Vinblastin und Paclitaxel, Alkylierungsmittel wie Busulfan, Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Melphanlan und Thiotepa, Antibiotika wie Dactinomycin; Daunorubicin, Pliamycin und Mitomycin, Cisplatin und Nitrosoureasen wie BCNU, CCNU und Methyl-CCNU, Anti-VEGF-Moleküle, Gentherapie-Vektoren und Peptid-Inhibitoren wie MMP-2 und MMP-9, welche bei Lokalisierung an Tumoren das Tumorwachstum verhindern.
Nach der Herstellung können Mikrokapseln und/oder Nanokapseln, welche das bioaktive Agens umfassen, in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel für die Injektion in Lebewesen, einschließlich Menschen, suspendiert werden. Nach der Injektion wird das bioaktive Agens entweder durch allmählichen biologischen Abbau der Polymer-Mikrokapselstruktur oder durch Initiierung der Freisetzung des bioaktiven Agens mittels Exposition gegenüber Ultraschall oder durch eine Kombination davon freigesetzt.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur direkten Abgabe eines bioaktiven Agens an irgendeines der verschiedenen Gewebe und deren Epithel und/oder Endothel eingesetzt werden, welche einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Nierengewebe, Lungengewebe, Gehirngewebe, Tumorgefäße, Hautgewebe, Pankreasgewebe, Brustgewebe, Herzgewebe, Prostatagewebe, Darmgewebe, Uterusgewebe, Nebennierengewebe, Retinagewebe, Muskelgewebe, Bereiche von Plaques, Entzündungsbereiche und Bereiche von Ischämie.
Die Mikrokapseln und/oder Nanokapseln der vorliegenden Erfindung können ferner ein zielsuchendes Agens umfassen, welches an die Kapseloberfläche gebunden ist und nach systemischer Verabreichung das Kontrastmittel oder das Abgabemittel zu (einem) ausgewählten Gewebe oder Geweben oder einer ausgewählten Zelle im Körper führen kann. Zielsuchende Agenzien, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können Peptide, Antikörper, Antikörperfragmente oder Zelloberflächenrezeptor-spezifische Liganden umfassen, die für ein Gewebe oder eine Zelle selektiv sind. Beispiele umfassen, sind jedoch keineswegs beschränkt auf, RGD, welches an αν-Integrin auf Tumorblutgefäßen bindet, NGR-Motive, welche an Aminopeptidase N auf Tumorblutgefäßen binden, und ScFvc, welches an die EBD-Domäne von Fibronectin bindet. Dementsprechend können zielsuchende Agenzien routinemäßig so ausgewählt werden, dass ein Kontrastmittel oder Abgabemittel der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination davon zu einer gewünschten Position im Körper, wie zum Beispiel (einem) ausgewählten Gewebe oder Geweben, Zellen oder einem ausgewählten Organ, geführt wird oder so, dass das Kontrastmittel oder Abgabemittel der vorliegenden Erfindung zwischen verschiedenen Geweben wie erkranktem Gewebe gegenüber Normalgewebe oder malignem Gewebe gegenüber gutartigem Gewebe unterscheiden kann. Zielgesteuerte Kontrast- und/oder Abgabemittel können allein oder mit Populationen von Kontrastmitteln und/oder Abgabemitteln der vorliegenden Erfindung, welche kein weiteres zielsuchendes Agens umfassen, verabreicht werden.
RGD-Peptid wurde an echogene Polymer-Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung konjugiert. Die Mikrokapseln wurden mit einem RGD-Peptid beschichtet, welches für die Angiogenese spezifische Integrine, ανβ3 und ανβ5 zum Ziel hat. Die Mikrokapseln wurden dann in vitro innerhalb von 6 Stunden an Ratten-Neuroblastomzellen gebunden. Die Resultate dieser Studie demonstrieren, dass an ein ausgewähltes zielsuchendes Agens gebundene Mikrosphären zur gezielten Ansteuerung ausgewählter Zellen verwendet werden können. Solche Mikrokapseln sind von Nutzen für die gezielte Bildgebung, gezielte therapeutische Bildgebung und Abgabe bioaktiver Agenzien unter Verwendung der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung als Vehikel.
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung gegeben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Materialien
Poly(D,L-lactid-co-glycolsäure, 50:50, PL-GA) (Medisorb 5050 DL 3A, Chargennummer 1010-412) wurde von Alkermes bezogen. Poly(vinylalkohol) (PVA), 88 Mol-% hydrolysiert, mit einem M_w von 25.000 wurde von Polysciences, Inc. bezogen. (1R)-(+)-Campher, Ammoniumdihydrogenphosphat, GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser)-Peptid-Komplex, EDC(1-Ethyl-3,3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid), Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) und L-Glutamin stammten von Sigma. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Hank's ausgewogene Salzlösung und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Fisher bezogen. Ammoniumcarbonat wurde von J. T. Baker bezogen. Alle anderen Chemikalien hatten Reagenzienreinheitsgrad von Fisher.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung von Campher-enthaltenden Mikrokapseln
Campher (0,05 g) und PLGA (0,5 g) wurden in 10 ml Methylenchlorid gelöst und mit einer Sonde bei 117 Volt 30 Sekunden lang beschallt. Die resultierende Emulsion wurde dann in eine 5%-ige PVA-Lösung gegossen und 5 Minuten lang bei 9.500 UpM homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann in eine 2%-ige Isopropanollösung gegossen und eine Stunde lang gerührt. Die Kapseln wurden mittels Zentrifugation gewonnen, drei Mal mit Hexan, dann ein Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und unter Verwendung eines Virtis-Benchtop-Gefriertrockners lyophilisiert, um den Campher-Kern zu entfernen.
Beispiel 3: Herstellung von Mikrokapseln, die Campher und Ammoniumcarbonat enthielten
Campher (0,05 g) und PLGA (0,5 g) wurden in 10 ml Methylenchlorid gelöst. 1,0 ml 4%-ige Ammoniumcarbonatlösung wurden der Polymerlösung zugegeben und mit einer Sonde bei 117 Volt 30 Sekunden lang beschallt. Die Emulsion wurde dann. in eine 5%-ige PVA-Lösung gegossen und 5 Minuten lang mit 9.500 UpM homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann in eine 2%-ige Isopropanollösung gegossen und eine Stunde lange gerührt. Die Kapseln wurden mittels Zentrifugation gewonnen, drei Mal mit Hexan, dann ein Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und unter Verwendung eines Virtis Benchtop-Gefriertrockners lyophilisiert, um den Campher- und Ammoniumcarbonat-Kern zu entfernen.
Beispiel 4: Größenverteilung
Statische Lichtstreuung unter Verwendung eines Horiba LA-910-Partikelgrößenanalysators (Horiba Instrument) und Coulter Multisizer II wurde angewandt und verglichen, um die Größenverteilung der Kapseln zu messen.
Beispiel 5: Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Rasterelektronenmikrographien (unter Verwendung eines Amray-Modells 1830D SEM) wurden von den gefriergetrockneten Kapseln gemacht. Die Kapseln wurden auf Metallstumpen mit doppelseitigem elektrischen Klebeband montiert. Sie wurden goldbeschichtet und unter dem SEM beobachtet.
Beispiel 6: akustische Studien in vitro
Die gefriergetrockneten Kapseln wurden in ein individuell gefertigtes 100-ml-Gefäß, das mit einem akustischen Fenster versehen war, eingewogen und 50 ml phosphatgepufferte Salzlösung(PBS)-Lösung wurden zugegeben. Die Suspension wurde dann in der akustischen Anordnung platziert und unter Verwendung von Messwandlern mit variierenden Zentralsequenzen, 2,25, 5, 7,5 und 10 MHz, beschallt. Die akustische Verstärkung wurde unter Verwendung von Lab View analysiert. Dosis-Wirkung-Kurven wurden für Dosen im Bereich von 0 mg/ml bis 12 μg/ml von Ablesungen, die innerhalb der ersten 30 Sekunden genommen worden waren, erstellt.
Beispiel 7: akustische Studien in vivo
Alle in vivo-Studien wurden mit Neuseeland-Weißen-Kaninchen jeden Geschlechts innerhalb des Gewichtsbereichs von 2,0 bis 5,0 kg durchgeführt. Die Kaninchen wurden mit einer intramuskulären Injektion von 0,65 mg/ml Ketamin-Hydrochlorid (Ketaset, Aveco) und Xylazin-Hydrochlorid (Gemini) sediert. Nach jedem Experiment wurde das Kaninchen durch eine tödliche Dosis von Pentobarbital (Beuthanasia) getötet. Das Mittel wurde vor der Injektion abgewogen und in Salzlösung suspendiert. Das Mittel wurde durch eine katheterisierte Ohrvene unter Verwendung einer 18-Zoll-Nadel injiziert. Unmittelbar nach der Injektion wurde die Injektionseintrittsstelle mit 5 cc Salzlösung gespült. Eine Power-Doppler-Bilddarstellung der Niere wurde unter Verwendung eines Abdominalscans durchgeführt.
In vivo-Dosis-Wirkung-Kurven wurden bei verschiedenen Kaninchen erstellt. Ein individuell gefertigter Silex 10 MHz-Manschettenmesswandler wurde um die distale Aorta unterhalb der Nierenarterien platziert, welche vor dem Experiment durch einen chirurgischen Eingriff freigelegt wurde. Dieser Aufbau verringerte Interferenz und Hintergrundgeräusche von Atembewegungen. Ein gepulstes Dopplerinstrument (SDD 600; Vingmed Sound, Oslo, Norwegen) zeichnete die Quadrat-Audio-Outputs auf. Die Kontrastverstärkung (in dB) wurde durch eine bekannte Technik aus den aufgezeichneten Daten, Änderung der Energie über die Zeit, berechnet.
Beispiel 8: Beschichtung von Mikrokapseln mit RGD-Peptid
Getrocknete Mikrokapseln (100 mg) wurden mit 5 mg 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (1:1 Molverhältnis von COOH-Gruppen), 1,4 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) (1:2 Molverhältnis zu EDC) in 10 ml Puffer (01, M MES, 0,3 M NaCl, pH 6,5) kombiniert und 15 Minuten lang gerührt. RGD-Peptid (150 μg) wurde dann zugegeben und 24 Stunden lang gerührt. Die Mikrokapseln wurden mit entionisiertem Wasser drei Mal gewaschen und lyophilisiert.
Beispiel 9: Zellkultur
Die NB2A-Maus-Neuroblastomzellen wurden unter Verwendung von Wachstumsmedium, das 90% DMEM, 10% FBS und 2 mM L-Glutamin enthielt, kultiviert. Das Medium wurde alle drei Tage ausgetauscht und die Zellen aufgeteilt. Das Experiment wurde mit den Zellen bei Passage 10 durchgeführt.
Beispiel 10: Mikrokapsel-Anbindung
Zellen wurden in jeder Mulde einer 12-Mulden-Zellkulturplatte zusammen mit 3 ml Wachstumsmedium ausplattiert. Nach drei Tagen wurden die Zellen konfluent und das Wachstumsmedium wurde ausgetauscht. Die Zellen wurden dann mit Hank's Salzlösung gewaschen und durch ein modifiziertes Medium ersetzt, das Mikrokapseln, PLGA entweder mit oder ohne RGD-Peptid, enthielt, und in dem Wachstumsmedium in einer Konzentration von 0,5 mg/ml suspendiert. Die Zellen wurden dann 0, 1 und 6 Stunden lang inkubiert. Nach jedem angegebenen Zeitpunkt wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden erneut mit Hank's Salzlösung gewaschen.
Die Zellen wurden dann unter einem Mikroskop der Reihe Wesco Verta 7000 beobachtet. Digitale Aufnahmen wurden unter Verwendung einer Olympus DP11 Digitalkamera, die mit dem Mikroskop über eine Schnittstelle verbunden war, bei einer Vergrößerung von 625× aufgenommen.

Claims

Verfahren zur Herstellung echogener Polymer-Mikrokapseln oder -Nanokapseln, wobei das Verfahren umfasst: (a) Lösen einer nicht-wasserlöslichen Substanz, welche sublimiert, in einem oder mehreren flüchtigen nichtpolaren Lösungsmittel(n), um eine erste Mischung zu bilden; (b) Lösen eines Polymers in der ersten Mischung, um eine zweite Mischung zu bilden; (c) Zugeben von Wasser, das ein wasserlösliches Agens umfasst, welches sublimiert, zu der zweiten Mischung vor dem Emulgieren der zweiten Mischung, um eine erste Population von Mikrokapseln, welche das Polymer und die nicht-wasserlösliche Substanz umfassen, herzustellen; (d) Mischen der ersten Population von Mikrokapseln mit einem Tensid, um die erste Population von Mikrokapseln aufzubrechen und eine zweite Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln zu bilden, die eine geringere Größe aufweisen; (e) Härten der zweiten Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln durch Mischen der Mikrokapseln oder Nanokapseln mit einem Härter; und (f) Waschen der zweiten Population von Mikrokapseln oder Nanokapseln, um echogene Polymer-Mikrokapseln oder -Nanokapseln zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt des Lyophilisierens der echogenen Polymer-Mikrokapseln oder -Nanokapseln nach dem Waschschritt umfasst.
Echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel, erhältlich durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2.
Echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel nach Anspruch 3, wobei das nicht-wasserlösliche Polymer ein Vertreter ist, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polylactid, Polyglykolid, einem Copolymer von Lactid und Lacton, einem Polyanhydrid, einem Polystyrol, einen Polyalkylcyanoacrylat, einem Polyamid, einen Polyphosphazen, einem Poly(methylmethacrylat), einem Polyurethan, einen Copolymer von Methacrylsäure und Acrylsäure, einem Copolymer von Hydroxyethylmethacrylat und Methylmethacrylat sowie einem Polypeptid besteht.
Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung bei einem Patienten, wobei das Kontrastmittel eine echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel nach Anspruch 3 oder 4, gefüllt mit einem Gas, umfasst.
Kontrastmittel nach Anspruch 5, welches ferner ein zielsuchendes Agens umfasst, das mit einer äußeren Oberfläche der Mikrokapsel oder Nanokapsel verbunden ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 6, welches selektiv erkranktes Gewebe als Ziel hat und das erkrankte Gewebe von normalem Gewebe unterscheidet oder welches selektiv malignes Gewebe als Ziel hat und das maligne Gewebe von gutartigem Gewebe unterscheidet.
Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung bei einem Individuum mit Geweben mit einem Gefäßsystem, das zu eng für den Zugang durch Mikrokapseln ist, wobei das Kontrastmittel nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7 eine echogene Nanokapsel umfasst.
Zusammensetzung zur Abgabe eines bioaktiven Agens, wobei die Zusammensetzung eine echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel nach Anspruch 3 oder 4 und ein bioaktives Agens umfasst, das an die echogene Polymer-Mikrokapsel oder -Nanokapsel adsorbiert, damit verbunden, darin verkapselt oder in irgendeiner Kombination davon vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, welche ferner ein zielsuchendes Agens, verbunden mit einer äußeren Oberfläche der Mikrokapsel oder Nanokapsel, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Freisetzung des bioaktiven Agens in dem Individuum durch Ultraschall induziert werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das bioaktive Agens durch Abbau der echogenen Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln freigesetzt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der Abbau der echogenen Polymer-Mikrokapseln und -Nanokapseln und die Freisetzung des bioaktiven Agens durch Ultraschall verändert wird.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Zusammensetzung erkranktes Gewebe oder malignes Gewebe als Ziel hat.
Zusammensetzung zur Abgabe eines bioaktiven Agens an Gewebe in einem Individuum mit einem Gefäßsystem, welches für den Zugang durch Mikrokapseln zu eng ist, wobei die Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 14 eine echogene Polymer-Nanokapsel umfasst.