CZ303992B6 - Nanovlákenné nosice s fotoafinne vázanými mikrosférami a zpusob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Nanovlákenné nosice s fotoafinne vázanými mikrosférami a zpusob prípravy a výroby techto nosicu zejména nanovlákenné povahy, které jsou funkcinalizovány fotoafinne ukotvenými mikrosférami, takzvanými mikro- nebo nanokapslemi, které jsou urceny a mohou s sebou nést a distribuovat jak in vitro, tak i in vivo látky, zejména pak bioaktivní. Jejich pouzití v oblasti selektivního dodávání a uvolnování léciv a bioaktivních látek.

Description

Oblast techniky

Technické řešení podle vynálezu se týká nanovlákenných nosičů s fotoafinně vázanými mikrosférami a způsobu přípravy a výroby těchto nosičů zejména nanovlákenné povahy, které jsou funkcionalizovány fotoafinně ukotvenými mikrosférami, takzvanými mikro- nebo nanokapslemi, které jsou určeny a mohou s sebou nést a distribuovat jak in vitro, tak i in vivo látky, zejména pak bioaktivní. Jejich použití lze očekávat v oblasti selektivního dodávání a uvolňování léčiv a bioaktivních látek.

Dosavadní stav techniky

Pro distribuci bioaktivních látek pro lékařské a veterinární účely se dosud zkoušela řada systémů. Vzhledem k rozměrům buněk v řádech mikrometrů je však zásadní pro distribuci bioaktivních látek využívat systémů, jejichž rozměry jsou s buňkami srovnatelné či spíše ještě menší. Jako nosiče v rozměrech nanometrů pro bioaktivní látky se dosud využívalo především liposomů a nanočástic, jejichž rozměry tomuto požadavku vyhovují.

Liposomy jsou membránové útvary tvořené amfifilními látkami v polárním prostředí. Nejčastěji se jedná o lipidy a však stále širší aplikaci mají i povrchově aktivní látky a amfifilní peptidy. Liposomálních nosičových systémů je popsána celá řada od jednoduchých liposomových systémů, přes stabilizované liposomy, asociované s polyethylenglykolem, což prodlužuje jejich retenci v organismu, imunoliposomy - liposomy s vázanými antigeny nebo protilátkami, nabité lipozomy, pH senzitivní liposomy, či termosenzitivní nosičové systémy. Přes obrovské mnohaleté úsilí se dosud nepodařilo naplnit původní optimistická očekávání o širokém použití liposomů pro řízené dodávání léčiv. Největším problémem se ukázala jejich nízká retence v organismu a rychlá degradace imunitním systémem. Velkou nevýhodou je i jejich křehkost a tendence k destrukci, například změnou iontové síly.

Kompozitní nanočástice představují další variantu nosičů, jejichž velikost odpovídá představám o velikosti pro řízené dodávání léčiv. Nanočástic byla připravena celá řada. Bernardi v roce 2099 připravil nanokapsle složené z polykaprolaktonu s obsahem indometacínu. Při přípravě použil meziplošné nanášení - interfacial deposition. Pozitivní účinek takto připraveného nosiče ověřil jak in vitro při potlačování růstu glioblastů, tak i in vivo na modelu potkana. Alternativním způsobem byly nanokapsle připravené z polyisobutylcyanoacrylátu s olej ovitým vnitřkem využívaným na enkapsulaci hydrofóbních léčiv. Courarie v roce 2004 připravil nanokapsle meziplošnou polymerizací - interfacial polymerization. Dalšími materiály, ze kterých byly připravené nanokapsle jsou polyuretany a polyamidy připravené Montasserem v roce 2006 a směs chitosan Polyethylenglykol, ze které připravil nanokapsle Prego v roce 2006. Obecným problémem nanočástic je především jejich poměrně omezené množství materiálů, ze kterých lze nanočástice připravit, a především nebezpečí jejich průniku hemato-encefalickou bariérou. Zcela nový způsob přípravy nanokapslí vychází z koaxiálně připravených nanovláken ajejich následného rozmělnění

Kromě koaxiálního elektrospinningu lze plněná nanovlákna připravit i alternativní technikou s využitím přeplavovacího elektrostatického zvlákňování. Rada látek však není možné distribuovat v těle nanovláken v aktivní formě, neboť během přípravy samotných nanovláken dochází k takovým nepříznivým procesům (tepelným, průchod vysokým napětím, atd.), že nativní struktura bioaktivních látek může být významně porušena. Cílem řešení podle tohoto vynálezu je vytvořit alternativu, která zachová nativní vlastnosti bioaktivních látek. K tomuto účelu bude využito fotoafinně připojených mikrosfér k nanovlákenným nosičům.

-1 CZ 303992 B6

Modifikace polymemích povrchů pomocí fotoreaktivních molekul je založená na vzniku reaktivních molekul interagujících se specifickými molekulami. Fotoreaktivní reakce jsou nejčastěji iniciované vystavením fotoreaktivní látky ultrafialovému záření (100 až 400 nm) Van Gerven, T., et al., A review of intensification of photocatalytic processes. Chemical Engineering and Processing, 2007. 46(9): p. 781-789.

Popsané byly také systémy excitované viditelným (400 až 760 nm) a infračerveným zářením (760 až 20 000 nm) He, D., H. Susanto, and M. Ulbricht, Photo-irradiation for preparation, modification and stmulation ofpolymeric membranes. Progress in Polymer Science, 2009. 34(1): p. 6298. Světelné záření excituje elektrony, což vede ke změně reaktivity látek. Efektivita procesu a reakční mechanizmus závisí na vlastnostech reaktivních látek. Díky těmto vlastnostem je reakční mechanizmus fotoreaktivních látek v mnohých případech specifický. Fotoreaktivní látky se dělí na fotoaktivační, které po absorpci záření iniciují chemickou změnu jiné molekuly, a fotoreaktivní molekuly, které po excitaci přímo reagují s cílovou molekulou. Hlavními výhodami fotoreaktivních reakcí je jejich selektivita, kompatibilita se širokým spektrem rozpouštědel a vysoký dynamický rozsah. V současnosti se využívají především na chemickou syntézu, fotopolymerizaci, fotolitografii, fotokatalýzu a tvorbu UV-citlivých materiálů.

Aplikace fotoreaktivních činidel v spojitosti s polymery se využívá v oblastech:

Fotodegradace, což je proces, při kterém dochází k degradaci polymeru na základě interakce se světelným zářením Moad, C. L. and D. J. Winzor, Quantitative characterization of radiation degradation in polymers by evaluation of scission and cross-linking yields. Progress in Polymer Science, 1998. 23(5): p 759-813.

Příkladem je fotodegradace celulózy, PES (poletylén sulfonát) a PP (polypropylén).

Fotofunkcionalizace polymerů založená na vazbě fotoaktivní látky na polymer. Dochází k přepojení řetězců (síťování), adici anebo eliminaci funkčních skupin. Příkladem je reakce aromatických azidů za uvolnění N₂ a vzniku vysoce reaktivních nitrénů. Důležitá je také dimerizační reakce pomocí [2+2] cykloadice, jako například u cinamátu, kumarínu a styrylpyridinu.

Fotofunkcionalizace se využívá při zlepšování vlastností polymemích membrán, uhlíkových nanomateriálů Colavita, Ρ. E., et al. Photo-induced surface functionalization of carbon surfaces: The role of photoelectron ejection. 2008: AVS a hydrogelů Yoon, J. J., H. J., Chung, and T. G. Park, Photo-crosslinkable and biodegradablPluronic/heparin hydrogels for local and sustained delivery of angiogenic growth factor. Journal of Biomedical Materiál Research Part A, 2007. 83A(3): p. 597-605.

Při nanovlákenných materiálech jsou pro modulaci vlastnosti důležité povrchově navázané ligandy. Fotofunkcionalizace nanovlákenných materiálů připravených elektrostatickým zvlákňováním byla popsána za účelem síťování řetězců. Nanovlákna byla připravena z poly(methyl methacrylate-co-2-hydroxyethyl acrylate) a síťována během přípravy pomocí cinamátu na principu [2+2] cykloadice Gupta, P., et al., In Šitu Photo Cross-Linking of Cinnamate Functionalized Poly(methyl methacrylate-co-2-hydroxyethyl acrylate) Fibers during Electrospinning. Macromolecules, 2004. 37(24): p. 9211-9218.

Síťování pomocí fotoaktivovatelných látek bylo využito pro síťování dextranové fáze s nanovlákny z PLGA Jiang H., et al., Optimalization and Characterization of Dextran Membranes Prepared by Electrospinning. Biomacromolecules, 2004. 5(2): p. 326-333.

Fotoreaktivní látky se využívají také k funkcionalizaci biomolekul, jako jsou proteiny Vodovozova, E. L., Photoaffinity labeling and its application in structural biology. Biochemistry (Mosc), 2007. 72(1): p. 1-20. Safa, A. R., N. D. Mehta, and M. Agresti, Photoaffinity labeling ofP-glycoprotein in multidrug resistant cells with photoactive analogs of colchicine. Biochem Biophys Res Commun, 1989. 162(3): p. 1402-8. DNA Khodyreava, S. N. and O. I. Lavrik, Photoaffinity labeling techniques for studying DNA replication and DNA repair. Curr Med Chem, 2005. 12(6):

-2CZ 303992 B6

p. 641-55 a lipidy Ježek, P., et al., Photoactivated azido fatty acid irreversibly inhibits anion and proton transport through the mitochondrial uncouplingprotein. J. Biol. Chem, 1996. 271(11): p. 6199-205.

Hlavním účelem těchto derivátů je zjištění interakcí v okolí značené látky, dynamiky struktur a jejich biochemické úlohy. Příkladem fotofunkcionalizovaného lipidu je fosfatidyl etanolamín funkcionalizován pomocí N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoátu využitý pro sledování interakce s fosfolipázou A2 Rajasekharan, R. and. J. D. Kemp, Synthesis of photoreactive phosphatidylethanolamine and its interaction withphospholipase A2. J Lipid Res, 1994. 35(1): p. 45-51.

Liposomy připravené inkorporací fotoreaktivních analogů lipidů do lipidové vrstvy se využívají hlavně z důvodu UV inicializovaného uvolnění obsahu Spratt, T., B. Bondurant, and D. F. O'Brien, Rapid release of liposomal contents upon photoinitiateďdestabilization with UV exposure. Biochim Biophys Acta, 2003. 1611(1-2): p. 35^43. Wang J.-Y., et al., Photo-Sensitive Liposomes: Chemistry and Application in Drug Delivery. Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2010. 10: p. 172-181. Využití si tyto liposomy nacházejí v oblasti fotodynamické terapie. Příkladem je uvolnění doxorubicínu z liposomů vytvořených z fosfatidyl cholínu a fotoreaktivního diacetylen fosfatidyl cholinu. Uvolnění obsahu liposomů bylo iniciováno osvícením UV světlem (254 nm) 15. Yavlovich, A., et al., A novel class of photo-triggerable liposomes containing DPPC:DC(8,9)PC as vehicles for delivery of doxorubicin to cells. Biochim Biophys Acta, 2010.

Zajímavým je nanosystém složený s lipozomálního jádra z fosfatidyl cholinu a obalu vytvořeného síťováním s diakrylátom pluroniku F-127 Choi, W. I., et al., Remarkably enhanced stability andfunction of core/shell nanoparticles composed of a lecithin core and a pluronic shell layer by photo-crosslinking he shell layer: in vitro and in vivo study. Acta Biomaterialia, 2010. 6(7): p. 2666-73.

Podstata vynálezu

S využitím metody klasického nebo koaxiálního elektrostatického zvlákňování (klasický, coreshell elektrospinning, či přeplavovacího elektrostatického zvlákňování) se připraví nosiče nanovlákenné povahy. Typicky je možné použít metod tvorby koaxiálních nanovláken spojujících hladinové a jehlové zvlákňování.

Tyto nanovlákenné nosiče se povrchově upraví, fyzikálně nebo chemicky tak, aby bylo možné na nich specificky adorovat mikrosféry či nanosféry. Tyto struktury lze dále naplnit různými polymery či bioaktivními látkami. Povrch nanovlákenných nosičů lze navíc chemicky modifikovat a opatřit fotoafinní látkou tak, aby umožnila po navázání na nanovlákenný nosič (s využitím některých výše zmíněných modifikací) a osvícení fotoafinní připojení k nosiči.

Takto utvořené struktury mohou s výhodou obsahovat bioaktivní látky a lze je použít například pro řízené dodávání léčiv. Výhodou tohoto přístupu oproti dosud používaným technikám je pevné specifické ukotvení mikrosfér obsahující bioaktivní látky, výběr materiálů, které jsou pomalu degradovány imunitním systémem (prodlouženou retenci), specifickou asociaci s funkcionalizovanými nanovlákny, což umožní regulovat řadu biologických jevů.

-3CZ 303992 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Nanovlákna s navázanou funkcionalizovanou molekulou pro vazbu liposomů jsou vyrobena klasicky nebo metodou koaxiálního spinningu nebo jinou dostupnou alternativní metodou, například s využitím přeplavovacího spinneru a podobně. Povrch nanovláken je fyzikálně (typicky expozicí v plazmě) nebo chemicky upraven, tak, aby bylo možné navázat další afinitní struktury, typicky vhodnou protilátku, DNA/RNA aptamery, sacharidy, peptidy apod. Nanovlákna jsou povrchově modifikována tak, aby na povrchu vznikla alespoň jedna třída povrchově aktivních látek, které se budou specificky vázat k afinitním strukturám. Tyto afinitní struktuiy budou součásti vnějšího pláště liposomů se kterými budou nanovlákna před použitím smíchána. Po smíchání dojde k adhezi liposomů na povrch nanovláken díky afinitním strukturám. Součástí vnějšího povrchu liposomů bude i fotoafinní molekula, která po osvícení bude kovalentně reagovat s nanovlákennou strukturou, na kterou bude takto ukotvena. Bioaktivní látka může být dodána jak v průběhu tvorby nanovláken, tak i inkorporovaná do liposomů.

Příklad 2

Nanovlákna s navázanou funkcionalizovanou molekulou pro vazbu proteoliposomu jsou vyrobena klasicky nebo metodou koaxiálního spinningu nebo jinou dostupnou alternativní metodou, například s využitím přeplavovacího spinneru a podobně. Povrch nanovláken je fyzikálně (typicky expozicí v plazmě) nebo chemicky upraven, tak, aby bylo možné navázat další afinitní struktury, typicky vhodnou protilátku, DNA/RNA aptamery, sacharidy, peptidy apod. Nanovlákna budou povrchově modifikována tak, aby na povrchu vznikla alespoň jedna třída povrchově aktivních látek, které se budou specificky vázat k afinitním strukturám. Tyto afinitní struktury budou součásti vnějšího pláště proteoliposomů, se kterými budou nanovlákna před použitím smíchána. Po smíchání dojde k adhezi proteoliposomů na povrch nanovláken díky afinitním strukturám. Součástí vnějšího povrchu proteoliposomů bude i fotoafinní molekula, která po osvícení bude kovalentně reagovat s nanovlákennou strukturou, na kterou bude takto ukotvena. Bioaktivní látka může být dodána jak v průběhu tvorby nanovláken, tak i inkorporovaná do proteoliposomů.

Příklad 3

Nanovlákna s navázanou funkcionalizovanou molekulou pro vazbu nanokapslí jsou vyrobena metodou koaxiálního spinningu nebo jinou dostupnou alternativní metodou, například s využitím přeplavovacího spinneru nebo technologií NanospiderTM a podobně. Povrch nanovláken může být fyzikálně, například nábojově, nebo chemicky upraven, například protilátkou, tak, aby byla možná adheze nanokapslí. Povrch nanokapslí bude modifikován fotoafinní složkou, která umožní fotoafinní reakci s povrchem nanovláken.

Průmyslová využitelnost

Technické řešení podle vynálezu, to jest nanovlákenné nosiče s fotoafinně vázanými mikrosférami jsou funkcionalizovány fotoafinně ukotvenými mikrosférami, takzvanými mikro- nebo nanokapslemi, které jsou určeny a mohou s sebou nést a distribuovat jak in vitro, tak i in vivo látky, zejména pak bioaktivní. Jejich použití lze očekávat v oblasti selektivního dodávání a uvolňování léčiv a bioaktivních látek.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Nanovlákenné nosiče s fotoafinně vázanými mikrosférami, vyznačující se tím, že nanovlákna jsou povrchově upravena expozicí v plazmě, přičemž povrch plazmou upravených nanovlákenných nosičů je opatřen fotoafmní látkou, která po navázání na nanovlákenný nosič a osvícení, se připojí k mikrosférám.
2. 2. Nanovlákenné nosiče s fotoafinně vázanými mikrosférami, podle nároku 1, vyznačující se tím, že takto utvořené struktury s výhodou obsahují bioaktivní látky, například pro řízené dodávání léčiv.
3. 3. Způsob výroby nanovlákenných nosičů sfotoafinně vázanými mikrosférami, vyznačený tím, že povrch nanovláken je po expozici v plazmě následně chemicky upraven pro navázání další afinitní struktury, kterou je vhodná protilátka, DNA/RNA aptamery, sacharidy, peptidy, s tím, že nanovlákna jsou povrchově modifikována tak, že na povrchu vznikne alespoň jedna třída povrchově aktivních látek, které se specificky váží k afinitním strukturám, přičemž tyto afinitní struktury jsou součástí vnějšího pláště liposomů, se kterými jsou nanovlákna před použitím smíchána, čímž dojde k smíchání a k adhezi liposomů na povrch nanovláken díky afinitním strukturám, součástí vnějšího povrchu liposomů je i fotoafmní molekula, která po osvícení kovalentně reaguje s nanovlákennou strukturou, na kterou je takto ukotvena.
4. 4. Způsob výroby nanovlákenného nosiče s fotoafinně vázanými mikrosférami, podle nároku 3, vyznačený tím, že povrch nanovlákenného nosiče je upraven expozicí v plazmě a následně chemicky upraven k navázání další afinitní struktury, typicky protilátkou, DNA/RNA aptamery, sacharidy, peptidy, s tím, že nanovlákenné nosiče jsou povrchově modifikovány, přičemž vznikne alespoň jedna třída povrchově aktivních látek, které se specificky vážou k afinitním strukturám, tyto afinitní struktury jsou součástí vnějšího pláště proteoliposomů, se kterými jsou nanovlákenné nosiče před použitím smíchány, po smíchání dojde k adhezi proteoliposomů na povrchu nanovlákenného nosiče.