KR100218642B1 - 열변성된 단백질로부터 캡슐화된 마이크로스피어의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
개선된 압력내성 및 안정성을 갖는 캡슐화된 가스 마이크로스피어는 인간혈청알부민 같은 필모겐 단백질 수용액과 퍼플루오로프로판 같은 수불용성 가스와 혼합하고 대기에 대해 닫혀 있는 장치에서 산소부재하에서 혼합물을 초음파 또는 기계적 공동화시킴으로써 만들어진다.
Description
[발명의 명칭]
열 변성된 단백질로부터 캡슐화된 마이크로스피어의 제조방법
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 기계적 공동화(cavitation) 공정에 사용될 수 있는 밀(mill)의 한 유형 (가울린 밀; Gaulin mill)의 분해 조립도이다.
제2도는 본 발명의 기계적 공동화 공정에 사용될 수 있는 밀의 다른 유형(베마텍밀; Bematek mill)의 분해 조립도이다.
제3도는 본 발명의 기계적 공동화 공정에 사용될 수 있는 밀의 또 다른 유형(실버손밀; Silverson mill)의 분해 조립도이다.
제4a도는 공기로 채워진 알부민 마이크로스피어(microsphere)의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어 현탁액을 주사기에 놓고 40 psig 에서 가압하였다. 가압전과 후 입자 분포가 보여진다.
제4b도는 퍼플루오로프로판으로 채워진 알부민 마이크로스피어의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어 현탁액을 주사기에 놓고 40 psig 에서 가압하였다. 가압전과 후 입자 분포가 보여진다.
제4c도는 퍼플루오로에탄으로 채워진 알부민 마이크로스피어의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어 현탁액을 주사기에 놓고 40 psig 에서 가압하였다. 가압전과 후 입자 분포가 보여진다.
제4d도는 헥사플루오르화황으로 채워진 알부민 마이크로스피어의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어 현탁액을 주사기에 놓고 40 psig 에서 가압하였다. 가압전과 후 입자 분포가 보여진다.
제4e도는 아르곤으로 채워진 알부민 마이크로스피어의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어 현탁액을 주사기에 놓고 40 psig 에서 가압하였다. 가압전과 후 입자 분포가 보여진다.
제5도는 3.0 psig에서 마이크로스피어의 희석 현탁액의 압력 내성을 보여준다. 마이크로스피어의 희석된 현탁액을 1cm 큐벳에 놓고 시간 t=30 초경에 3.0 psig에 적용시켰다. 퍼를루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 헥사프루오르화황 및 공기 마이크로스피어에 대한 데이터가 보여진다.
제6도는 3.0 psig에서 아르곤 마이크로스피어의 희석 현탁액의 압력 내성을 보여준다. 희석된 아르곤 마이크로스피어를 1cm 큐벳에 놓고 시간 t=30 초경에 3.0 psig에 적용시켰다.
제7도는 마이크로스피어에 대한 기체제거된 완충액의 효과를 나타낸다. 마이크로스피어를 증가하는 양의 기체제거된 완충액에 첨가하고, 혼합하고, 농도결정을 위해 혼합물을 일정 체적으로 맞추었다. 공기, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로에탄, 및 헥사플루오르화황 마이크로스피어에 대한 데이타를 기체 제거된 완충액의 체적에 대해 도시하였다.
제8도는 하기의 실시예 11 에서 기술된 데이터의 그래프를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[기술 분야]
본 발명은 불용성 기체를 캡슐화하는 단백질성 마이크로스피어(macrosphere)로 구성되는 초음파 영상화제 및 그것의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.
[배경 기술]
진단용 초음파 영상화제는 음파에너지를 관심있는 부위에 초점을 맞추고 반사시켜서 그것의 영상을 생성할 수 있는 원리에 기초한다. 초음파 스캐너(scanner) 는 영상화되는 부위위에 있는 신체 표면상에 위치하며 음파 형태의 초음파 에너지가 그 부위로 향해진다. 스캐너는 반사된 음파를 검출하고 이 데이터를 비디오 영상으로 전환시킨다. 초음파 에너지가 물질을 통해 전도될 때 반사되는 에너지의 양은 전도 속도 및 물질의 음향 성질에 좌우된다. 물질의 음향 성질의 변화 (가령, 음향 저항의 변화)는 액체-고체 또는 액체-기체와 같은 다른 음향 밀도의 경계면에서 가장 현저하다. 결과적으로, 초음파 에너지가 조직을 통해 보내질 때 기관 구조는 초음파 스캐너에 의해 검출되도록 음파 반사 시그널을 생성한다. 이 시그널을 콘트라스트제(contrast agent)의 적절한 사용에 의해 강화될 수 있다.
특히 중요한 초음파 영상화제는 초음파 반사기로서의 효율성 때문에 기체를 이용한다. 공명(resonant) 기체 버블을 동일한 크기의 고체입자보다 음파를 수천배 더 효율적으로 산란시킨다. Ophir 및 Parker는 두가지 타입의 기체-함유 영상화제를 기술한다: (1) 유리된 공기 버블 및 (2) 캡슐화된 공기 버블(Ultrasound in Medicine and Biology 15(4): 319-333, 1989). 그러나 적당한 크기의 유리된 기체 버블은 너무 일시적이어서 대부분의 생체내 적용에 효과적이지 못하다(Meltzer, et al., Ultrasound in Medicine and Biology 6: 263-269 1980). Ophir 및 parker는 이 문제를 해결하기 위한 시도로 캡슐화된 기체 버블의 개발을 기술하였다.
Ophir 및 parker에 의해 기술된 기체-함유 초음파 콘트라스트제의 두 번째 주요 부류는 하기에서 마이크로스피어(microsphere)로서 나타낸 캡슐화된 마이크로버블이다. 기체 버블은 단백질 또는 다른 생체적합성 물질로 이루어진 셸(shell)에 의해 둘러싸여 있다. 현재 상업적인 마이크로스피어 콘트라스트제는 ALBUNEX (Molecular Bio-systems, Inc., San Diego, CA)인데, 이것은 인간 혈청 알부민 캡슐화된 공기 마이크로스피어로 이루어진다. 미국 특허 4,572,203 및 4,844,882 참조.
공기 마이크로스피어는 주사 및 생체내 순환시 마주치는 것처럼 150 mmHg 압력에 놓였을 때 반향성(echogenicity)을 빠르게 상실하는 것으로 나타났다(deJong, N. et al., Ultrasound Med. Biol. 19: 279-288, 1993). 현재의 캡슐화 기술은 생체내에서 대부분의 원하는 적용방식에 충분하도록 오랜 시간 존재하는 초음파 콘트라스트제로서 적합한 물질을 생성해야 한다. 사실상 심근벽을 영상화할 수 있는 영상화제는 적어도 250mmHg (약 5 psig)의 일시적인 압력 펄스를 견디어야 한다.
마이크로스피어의 압력-불안정성 문제를 해결하기 위한 노력으로 최근의 연구는 셸을 개선하는데 집중되었는데, 그것은 마이크로스피어 셸 또는 막(membrane)이 압력하에서 너무 약하거나 불안정하여 생체내에서 빠르게 부서진다고 여겨지기 때문이다. Giddey(PCT/EP91/01706; PCT 92/05806)은 그것의 강성 때문에 막은 예컨대 혈류를 통과하는 동안 마이크로스피어가 겪을 수 있는 심장 박동에 기인하는 갑작스러운 압력변화를 지탱할 수 없다. 라고 기술하였다. 셸 강성을 극복하기 위해서 Giddey는 많은 함량의 점성화제(viscosifying agent) (40%-80% 폴리올)를 포함하는 단백질 용액중에 공기를 사전에 유화시키고 그것을 고속 블렌더에서 기계적으로 전단시키는 것을 제안하였다. 적당한 크기의 버블을 모으고 소프트 셸에서 그것을 안정화시키기 위해 적당한 계면활성제로 피복시킨다. Holmes (PCT WO 92/17213)은 생체분해성 화학적 가교결합 시약으로 셸을 강화시킴으로써 단백질 마이크로스피어의 생체내 안정성을 강화시키는 것을 제안하였다.
Bichon et al. (EPA 90/810367) 및 Schneider et al. (Inv. Radiol. 27: 134-139, 1992)는 다공성 (5 내지 2000 nm 구멍크기) 중합체 마이크로발룬(microballoon)의 제조를 기술하였다. 그들은 마이크로발룬의 외피의 마이크로다공성 구조는 탄력 인자이다. 즉 마이크로스피어는 부서지지 않고 압력 변화를 쉽게 수용할 수 있다고 유럽 특허출원에서 발표하였다.
Erbel 및 Zotz (미국 특허 5,190,982)는 공기가 포획된 가교결합된 중합체 마이크로캡슐을 기술하였다.
Schneider et al. (EPA 554,213)은 마이크로스피어의 압력 내성은 캡슐화되는 기체의 적어도 일부분이 S기체/MW기체 0.0031인 기체이도록 함으로써 개선될 수 있다고 기술하였는데, 여기서 S기체 는 기체의 물 용해도 (리터/리터)이고 MW기체 는 기체의 평균분자량 (달톤)이다. 참고문헌의 표1은 이 기준을 만족시키는 것으로서 N2, SF6, CBrF3및 CF4를 나열하고 있다. 참고문헌은 이 마이크로스피어는 두 방법중 어느 것으로 만들어질 수 있다고 기술한다. 첫 번째 방법은 공기-함유 마이크로스피어가 공지된 방법에 의해 제조되고 기체-교환 방법에 의해, 가령 불용성 기체의 대기하에서 공기로 채워진 마이크로스피어를 적당한 시간동안 배양함으로써 공기가 불용성 기체로 치환되는 2-단계 방법이다.
두 번째 방법은 공기 대신에 불용성 기체를 이용하여 EPA 324,938 방법 (참고문헌의 실시예1참조)에 의해 마이크로스피어가 제조되는 1-단계 방법이다. 이 방법에서는 기체를 셸-형성 물질 용액 (가령, 알부민 용액)위로 지나게 하면서 소니케이터 혼(horn)을 용기속으로 낮춘 다음 제거하였다.
불행하게도, 이 방법중 어느 것도 단백질 캡슐화 불용성 기체로 채워진 마이크로스피어의 안정한 현탁액을 제조하는데 실질적으로 유용하지 못하다. 첫 번째 방법(2-단계 방법)을 이용하면 공기로 채워진 알부민 마이크로스피어의 단지 소수만이 불용성 기체환경 (2 단계 방법의 두 번째 단계)에의 노출시 지속될 수 있다. 마이크로스피어 외부로의 가용성 기체(공기)의 유출은 마이크로스피어 속으로의 불용성 기체의 유입보다 더 커서, 마이크로스피어의 완전한 파괴를 일으켜서 단지 셸 파편만을 남기게 된다. 이러한 효과는 퍼플루오로에탄 같은 더 불용성인 기체의 경우 특히 현저하다. 두 번째 방법은 압력이 적용될 때 체적을 상실하고 압력의 방출후 회복을 나타내지 않는 마이크로스피어를 생성한다. 이 방법 둘다 마이크로스피어가 상당한 양의 공기를 함유하기 때문에 열등한 마이크로스피어를 생성하며 형성되는 동안 공기의 존재는 불용성 기체만이 존재할 경우 마이크로스피어를 생성하는 이점을 줄일 수 있다고 생각된다. 이 점과 관련하여 종전의 연구자들은 공동화(cavitation)에 의한 마이크로스피어의 제조시 산소의 존재를 필수적인 것으로 생각한다는 것이 주목된다.
Suslick은 초음파-연관 공동화는 단지 산소의 존재하에서 마이크로스피어를 제조하는 방법으로서 적합하다고 발표했다. 세부 연구에서 Suslick et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7708-7710, 1991; J. Am. Chem. Soc. 112: 7807-7809, 1990)은 안정한 단백질 셸에 필요한 디술피드 결합의 공동화-유도되는 분자간 재배열에 산소가 관여한다고 발표하였다. Suslick은 마이크로캡슐 형성은 O2의 부재하에서 강하게 저해된다는 것을 발견했다고 기술하였다. 그는 반응이 불활성 대기(He, Ar 또는 N2)하에서 행해지면 마이크로 캡슐이 형성되지 않는다, 실험적으로 단지 반응이 O2또는 공기하에서 행해질때만 고농도의 마이크로버블이 합성된다고 기술하였다. 또한 미국 특허 4,774,958 참조. 알부민 마이크로스피어 형성에 공기가 필요하다는 종전의 견해는 또한 Holmes (PCT WO 92/17213)에서 주지되었다. 거기서는 각종 저분자량 기체를 함유하는 마이크로스피어의 생성이 개시되었다. 그러나, 초음파 처리에 의한 알부민 마이크로스피어 생성을 기술하면서 Holmes는 공기의 존재하에서 혼합물의 초음파 처리에 의해 기체-함유 버블을 생성하기 위한 다른 잘 확립된 방법이 US-A-4,774,958에서 기술되었다고 하였다.
본 발명의 한 면은 비교적 불용성인 기체를 포획한 고농도의 단백질성 마이크로스피어가 산소없이 불용성 기체 존재하에서 초음파 또는 기계적 공동화 방법에 의해 만들어질 수 있다는 기대되지 않은 발견에 관한 것이다. 그러한 마이크로스피어는 적용된 압력에 대해 놀랍고 크게 개선된 안정성 및 탄력성과 양호한 또는 등가의 반향성을 나타낸다. 단백질성 셸은 합체를 방지하고 주위 환경으로부터 용해된 대기 기체의 확산에 기인한 팽창에 저항성이 있다.
본 발명의 다른 면은 전단력의 형태로 기계적 에너지를 이용하는 단백질 셸의 마이크로스피어 제조를 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 이 힘은 기계적으로 액체-기체혼합물을 전단하여 마이크로버블 현탁액을 형성하고, 또한 에너지를 방출하는 유체역학적 공동화를 일으키는데 관여한다. 이 에너지는 주위의 액체에 의해 흡수되어 기체-액체 계면에서 국부화된 단백질 변성 및 침전을 일으켜서 개별적인 마이크로스피어를 형성할 수 있다. 유체역학적 공동화는 각각이 에너지 방출로 이끄는 액체 시스템에서 압력변화를 생성하는 방식에 기초하여 초음파 (음향) 공동화와 구별할 수 있다. 전자에서는 압력 변화가 구멍을 통한 또는 표면을 지나는 액체의 급류에 의해 생성되는 반면에, 후자에서는 고주파 음파의 사이클이 빠른 국부적인 압력 변화를 생성한다 (F. Ron Young. 1989 Cavitation pages 4-5, McGraw-Hill Book Co. London). 부가적으로,유체역학적 공동화는 유동 액체, 즉 정지물체를 통해서 또는 지나서 유동하는 액체에서 생성된다. 이에 반하여 음향 공동화는 공동화를 나타내는데 충분한 압력 증가 및 감소 (포지티브 및 흡입 압력)의 사이클을 통해서 정지상태로 유지되어야 하는 액체 시스템에서 생성된다. 미국 특허 4,957,656에서 기술된 것과 같은 연속 유동 초음파 처리 시스템에서 조차 음향 공동화 공정에서의 잔류시간은 본 발명에 의해 기술된 것과 같은 진정한 단일-패스 유체역학적 공동화 시스템에서 보다 제어하는 것을 더 어렵게 한다.
기계적 전단력에 의해 생성된 마이크로버블 현탁액은 추가 공정에 의해 마이크로스피어로 형성되거나 또는 그 자체가 콘트라스트제로서 사용된다. 예컨대, PCT 공개 번호WO 92/05806 은 단백질을 변성시키는 온도 이하의 일정한 온도에서 점성화제를 함유하는 단백질 용액을 거친 거품으로 일구어서 제조되는 필모겐 단백질(filmogenic pro-tein)의 마이크로버블 현탁액 (그들은 거품으로 나타냈다)의 제조를 기술한다. 그 다음엔 결과적인 거품을 기계적으로 전단하여 원하는 범위의 버블을 형성하는데 이것은 점성화제의 존재에 의해 안정화된다. 그 다음 버블을 둘러싸는 단백질 필름을 경화시키기 위해서 가교결합제의 첨가에 의해 또는 열 변성에 의해 버블을 추가로 마이크로스피어로 가공할 수 있다.
유럽특허출원 공개 제 0 450 745 A1 호는 물에서의 오일 에멀션을 기계적 전단에 의해 형성함과 동시에 또는 그 후에 계면에서 침전되는 수-불용성 폴리머를 첨가함으로써 마이크로스피어를 제조하는 방법을 기술한다. 그 다음 소수성 층을 증발시켜서 공기 또는 기체로 채워진 마이크로스피어를 형성한다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질 용액을 기계적 전단력에 적용시킴으로써 열-변성가능 단백질로부터 마이크로스피어를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 그러한 힘은 별개의 셸에 의해 동시에 또는 이후에 캡슐화되는 마이크로버블의 현탁액을 생성한다. 공동화 가열의 성질 때문에 단백질의 변성이 국부화되고 액체-기체 계면에서 침전됨으로써 셸을 형성한다. 이러한 새로운 방법은 종전의 음향에 기초한 마이크로스피어 제조방법과 비교했을 때 대규모화가 더 용이하며 개선된 생성물 수율로 이끈다.
[발명의 개시]
본 발명의 한 면은 필모겐 단백질의 수용액과 약리학적으로 수용가능한 수 불용성 기체의 혼합물을 산소의 부재하에서 초음파 또는 기계적 공동화시키는 것으로 이루어지는, 초음파 영상화제로서 유용한 캡슐화된 기체 마이크로스피어를 제조하는 방법이다.
본 발명의 다른 면은 필모겐 단백질의 수용액과 약리학적으로 수용가능한 불용성 기체의 혼합물을 대기에 대해 닫힌 장치에서 초음파 또는 기계적 공동화시키는 것으로 이루어지는, 초음파 영상화제로서 유용한 캡슐화된 기체 마이크로스피어를 제조하는 방법이다.
본 발명의 다른 면은 열-불용성화된 필모겐 단백질에 의해 캡슐화된 기체의 마이크로스피어 수성 현탁액을 함유하는 초음파 영상화제 조성물인데, 여기서 캡슐화된 기체는 완전히 약리학적으로 수용가능한 수 불용성 기체이다.
본 발명의 다른 면은 열-불용성화된 필모겐 단백질에 의해 캡슐화된 퍼플루오로프로판 기체의 마이크로스피어 수성 현탁액을 함유하는 초음파 영상화제 조성물이다.
본 발명의 다른 면은 초음파 영상화제로서 유용한 캡슐화된 기체 마이크로스피어의 제조방법인데, 이것은 다음으로 이루어진다:
a) 후속되는 기계적 유화과정동안 초기 변성온도를 달성하는데 필요한 온도에서 열-변성가능 단백질의 수용액을 제공하는 단계; b) 이 용액을 기체와 혼합하는 단계; c) 단백질 용액과 기체 혼합물을 기계적 전단에 의해 유화시켜서 약 0.1 내지 약 10 미크론 범위내의 평균 직경을 갖는 기체 마이크로버블의 현탁액을 형성하는 단계; 및 d) 현탁액을 기계적으로 공동화시켜서 기체-용액 계면에서 단백질이 변성되게 하고 그로 인하여 침전되게 함으로써 기체 마이크로버블을 캡슐화하여 마이크로스피어를 형성하는 단계.
[발명을 실행하기 위한 방식]
본 발명의 신규한 마이크로스피어는 불용성 기체의 존재 및 산소의 실질적인 부재, 즉 무기성 (닫힌 계) 조건하에서 필모겐 단백질의 수용액의 초음파 또는 기계식 공동화로부터 수성 현탁액으로 형성된다. 마이크로스피어는 음향 반사성이고 폐를 경유하는(transpulmonary)통로에 적당한 크기이며 10 미크론 미만, 0.1 미크론 이상의 평균 직경을 가진다. 크기 분포는 크고 작은 마이크로 개체로 분류함으로써 변경될 수 있다. 마이크로스피어는 과잉의 수상(水相)을 제거하여 농축되거나 제2수용액으로 수집되어 재현탁될 수 있으며 그렇지 않을 수도 있다.
이들 신규한 마이크로스피어를 제조하는데 사용되는 기체는 반드시 그것이 놓여지는 수성매질 (즉 초기에 제조되는 매질, 사용할 때에는 혈액)에서 약리학적으로 수용되고 불용성이어야 한다. 물에 대한 용해도는 그러한 매질에 대한 용해도와 아주 비슷하다. 용어 기체는 기체이거나 또는 영상화가 실행되는 온도(통상적으로 정상 생리학적 온도)에서 기체를 형성할 수 있는 어떤 화합물을 말한다. 기체는 단일 화합물 또는 화합물의 혼합물로 구성될 수 있다. 적당한 기체는 헥사플루오르화황, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로메탄, 및 퍼플로오로부탄과 같은 플루오르-함유 기체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 기체의 용해도는 관심대상의 기체의 분젠 계수를 측정함으로써 한정될 수 있다. 이 값은 용매의 단위부피당 흡수되는 기체의 부피이다(Wen, W-Y, Muccitelli, JA, J, Sol. Chem. 8: 225-240 (1979) 참조). 본 발명에서 사용하는데 적당한 기체는 0.01 mL/mL 용액미만의 25oC에서의 물 분젠 계수를 가져야 한다. 표1은 몇가지 기체의 분젠 계수를 나타낸다.
마이크로스피어에 함유되는 기체의 다른 특징은 기체의 확산율이 25℃ 물에서 4×10 cm /sec 미만이라는 것이다. 그러나 확산율 상수는 상이한 용매와 상이한 온도에 따라 변하지만 기체를 선택하기 위해서는 이 조건을 충족시켜야 한다는 것을 주목해야 한다.
약리학적으로 수용가능한은 선택된 기체가 생체적합성이고 최소독성을 가져야 하는 성질을 말한다.
퍼플루오로프로판이 바람직한데 왜냐하면 (1) 제조온도 및 사용온도에서 응축되지 않고, (2) 이성질체 형태를 갖지 않고, (3) 뛰어난 내압성을 나타내는 마이크로스피어를 생성하고, (4) 약리학적으로 수용되는 불용성 기체를 제공하기 때문이다.
기체 마이크로버블은 필모겐 단백질 셸로 캡슐화된다. 용어 필모겐은 (열 변성에 의해 유발되는)단백질 불용화시, 외부에 배향된 친수성기와 내부에 배향된 소수성기를 가진, 포획된 기체 주위에 셸을 형성하는 단백질의 능력을 말한다. 단백질은 필수적으로 친수성 및 소수성 아미노산을 가진다. 적당한 단백질은 알부민, 감마-글로불린(사람), 아포-트랜스페린(사람), b-락토글로불린, 및 우레아제와 같은 천연 단백질을 포함한다. 비록 천연 단백질이 바람직하지만 3차구조를 나타내고 열변성에 민감한 합성 단백질 (단일 중합성 또는 헤테로 중합성)이 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 적당한 것은 알부민이고 보다 바람직하게는 사람 알부민이다. 단백질은 약 0.1 내지 10% w/v, 바람직하게는 약 1 내지 5% w/v, 가장 바람직하게는 약 1% w/v 범위의 농도에서 용액으로 존재한다.
본 발명에 적당한 단백질, 또는 생성된 마이크로스피어는 기관표적화 또는 소진(quen-ching) 면역 활성을 위하여 화학변성될 수 있다(예를 들면 폴리에틸렌글리콜로의 변성). 그러나, 본 발명은 화학 가교제의 첨가, 또는 마이크로스피어를 형성하기 위한 단백질의 추가 변성을 수반하지 않는다.
본 발명의 마이크로스피어는 산소없이 불용성 기체의 존재하에서(즉, 공기 오염을 피하는 닫힌 계에서) 공동화의 결과로서 용액내에서 단백질의 불용화 부분에 의하여 형성된다. 그러한 단백질 불용화는 주로 국부 단백질 변성과 기체 코어 주위의 배향을 특징으로 하며, 후자는 불용성 기체의 존재하에서 향상될 수 있다.
본 발명의 마이크로스피어의 형성을 위해 단백질을 열-불용화하는데 사용되는 시스템은 무기성, 즉 대기에 대하여 닫혀야 하며 닫힌 계로 언급된다. 반대로 열린계는 대기에 개방된 시스템이다. 그러한 닫힌 기에서 만들어진 마이크로스피어에 포획된 기체는 필수적으로 단지 형성에 사용되는 불용성 기체를 함유한다. 대기 기체에 의한 오염은 O전극을 사용하여 모니터하여 시스템 방출에서 O존재를 측정할 수 있다. 본 발명에서, 초기에단지 형성에 사용되는 기체를 함유하는 마이크로스피어가 생성된다. 그러나, 기체함량이 실험적으로 결정되는 경우, 일정한 양이 실험과정중에 대기 기체에 의해 불가피하게 오염되면 따라서 측정된 생성기체의 양을 100% 미만이 되게 한다. 따라서, 85% 이상의 기체 측정은 초기 기체 함유물이 완전히 불용성 기체인 마이크로스피어를 나타낸다.
마이크로스피어의 형성후, 패키징동안 대기 노출을 피해야 한다. 예를 들면, 마이크로스피어는 그것이 닫힌 계로부터 방출된 때로부터 5 내지 30초 이내에 바이얼 또는 다른 기밀 용기에 밀봉되어야 한다. 또한, 바이얼의 어떤 상부 공간은 제거하고 패키징동안 형성에 사용되는 기체로 대체되어야 한다.
불용성 기체로 충전되며, 이들 단백질 마이크로스피어는 약 1.0109마이크로스피어/mL의 농도에서 40 psig ( 2000 mmHg)의 노출을 3 내지 10 psig 압력하에서 압축을 나타내고 압력 해제시 원래의 부피로 되돌아가는, 묽은 현탁액에서 탄성을 나타낸다. 추가의 화학가교결합은 생성된 마이크로스피어가 너무 단단한 구조를 가져서 향상된 압력안정성을 나타내기 때문에 불리하다.
유리된 마이크로버블과는 다른 본 발명의 마이크로스피어는 합체 및 확산 유도된 팽창에 대한 내성이 있다. 여러 온도에서 공기 또는 산소포화용액내에 배양된 불용성 기체를 함유하는 마이크로스피어는 평균 직경 또는 전체 부피가 증가하지 않는다. 가압시 탄성이더라도 단백질 셸은 기체 확산 또는 교환에 의한 팽창 또는 찢어짐에 내성일 정도로 충분히 강하다. 단백질 셸의 존재는 합체를 방지하고 공기 충전된 단백질 마이크로스피어와 유사하게, 수개월까지 개개의 버블로 소량의 기체를 유지한다. 불용성 기체 충전된 마이크로스피어가 용매화된 대기기체로 충전됨으로써 어느 정도 팽창될 수 없다는 것은 신규하며 초음파제로서의 재료 용도에 대한 핵심 성질이다.
불용성 기체-포획된 단백질 마이크로스피어는 탈기체 수용액에 노출시 내붕괴성을 나타낸다. 공기로 충전된 유리된 마이크로버블 또는 캡슐화된 마이크로스피어와는 달리 불용성 기체-충전된 마이크로스피어는 진공기체제거된 물에 첨가되고 고 희석도로 완전성을 유지할 수 있다. 공기 충전된 재료는 기체상의 산소 성분의 유출에 기인하여 혈액내에서 붕괴된다. 불용성 기체로 충전된 마이크로스피어가 부분적으로 탈기체되거나 가압된 환경에서 붕괴에 저항할 수 있는 능력은 생체내 초음파 콘트라스트의 지속을 극적으로 증가시킨다.
본 발명의 마이크로스피어는 초음파 또는 기계식 공동화에 의해 생성된다. 공기충전된 마이크로스피어의 초음파 제조방법은 Cerny (USP 4,957,656) 가 기술하였다.
기계식 공동화는 본 발명의 신규한 불용성 기체-충전된 마이크로스피어의 바람직한 제조방법이다. 또한 공기-충전된, 또는 가용성 기체 (예를 들면, N2,H2,아르곤)-충전된 마이크로스피어를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 신규한 기계식 공동화 방법에서, 열변성 단백질의 수용액은 용액의 연속기계식 에멀션화 동안 초기 변성온도를 달성하는데 필요한 온도에서 제공된다. 용액내 단백질의 변성온도는 보통 50 내지 100oC 범위이다. 그것은 문헌의 열 단백질 변성표, 또는 어떤 공지방법에 의하여 실험적으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 실험적으로 변성온도를 결정하기 위하여, 단백질 용액은 교반하면서 수욕내에서 가열될 수 있다. 변성온도는 불용성 재료가 처음 관찰되는 온도이다. 변성온도는 단백질의 성질, 순도 및 공급원, 용액내 단백질의 농도, pH, 완충액, 이온강도, 안정화제의 존재 및 화학 변성제 또는 세제의 존재에 의해 영향받는다는 것을 주목해야 한다. 그러므로, 마이크로스피어를 제조하는데 사용되는 환경에서 단백질의 변성온도를 결정하는 것이 필요하다. 원한다면, 제제 또는 극성 용매와 같은 첨가제가 변성이 일어나는 온도를 변화시키는데 사용될 수 있다.
표2는 상술된 바와 같이 실험적으로 결정된 몇가지 천연 단백질의 변성온도를 제공한다.
*TRIS=2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올
**MES=2-(N-모르폴리노)에탄술폰산
***DTT=디티오트레이톨
단백질 용액/ 기체 혼합물을 전단하는데 사용되는 각각의 장치는 용액에 미치는 기계식 전단력에 기인하여 단백질 용액의 일정량의 추가의 열을 유발한다. 열은 기-액 계면에서 단백질의 국부 변성을 유발하는데 충분해야 한다. 따라서 단백질 용액이 장치로 도입되는 온도가 그러한 국부 열 변성을 달성하기 위해 조절될 수 있도록 장치에 의해 유발되는 온도증가의 양을 결정하는 것이 중요하다. 상세하게는, 장치내 액체의 증가된 온도는 공동화 직전 초기 변성온도와 일치해야 한다. 공동화는 단백질을 국부적으로 변성하는데 필요한 부가적 열을 발생시킨다. 초기 변성온도는 단백질이 막 변성되려 하는, 그러나 용액이 어떤 변성된 단백질도 함유하지 않는 온도로 정의된다. 이 온도는 변성온도 바로 아래, 통상은 1 내지 5 C 아래이다. 필요하다면, 출발 단백질 용액은 장치로 도입되기 전에 초기 변성온도가 도달될 수 있는 온도로 예비가열될 수 있다.
일단 단백질 용액의 적당한 출발 온도가 달성되면, 용액은 예를 들면 5% 내지 200% 기체:액체, 바람직하게는 약 20% 내지 100% 범위의 부피 대 부피 비율로 에멀션화 단계전 또는 그 동안에 기체를 단백질 용액에 도입함으로써 적당한 기체와 조합된다. 적당한 기체: 액체비율은 장치의 구조, 기체의 물리적 특성(용해도, 밀도, 분자량 등)에 의존하며 출력을 최적화하도록 조절될 수 있다.
기체와 단백질 용액이 혼합된 후, 혼합물은 마이크로스피어를 제조하는 조건하에서 에멀션화되고 공동화된다. 이것은 고속 믹서, 밀, 유체화 장치 등과 같이, 기계식 전단 및 유체역학적 공동화가 생성될 수 있는 장치를 사용하여 달성된다. 바람직한 장치는 고속 회전자 및 고정자로 구성된 장치로 정의되는 콜로이드 밀이며, 분산 또는 에멀션화는 대향면에 의해 영향을 받는다. Advanced Filtration Separation Technology, p. 108-110 참조. 사용될 수 있는 특정 밀링장치의 예는 다음과 같다:
모델 #2 1/2 -Bematek, Beverly, MA
모델 W250V -Greerco, Hudson, NH
모델 2F -APV Gaulin, Everett, MA
모델 L4R -Silverson, Chesham, UK
모델 polytron
PT3000 -Kinematica, Littaw, Switzerland
불용성 기체-충전된 마이크로스피어를 제조하는데 사용되는 경우, 콜로이드 밀은 공기가 혼합물로 도입되는 것을 피하도록 기압을 선택해야 한다.
제1도 내지 제3도는 기계식 공동화 방법이 사용될 수 있는 몇가지 종류의 밀의 상세를 더 제공한다.
제1도는 가울린 밀(Gaulin mill)의 필수 요소를 묘사한다. 그것들은 모터(도시되지 않음)에 작동가능하도록 연결된 회전 샤프트(10); 샤프트(10)의 단부에 고정된 디스크 로터(12); 및 고정자(11)이다. 고정자(11)는 중앙보어개구(18) 및 로터를 수용하는 카운터보어(16)를 가진다. 이 밀에서 단백질 용액 및 기체는 티(tee)(15)를 거쳐 밀을 통해 공급된다. 단백질 용액/기체 혼합물은 로터의 표면 및 고정자 사이에서 유화되고 공동화한다. 이 밀의 갭(gap)은 고정자 카운터보어의 방사상 표면(17) 및 로터의 원주방사상 표면 사이의 공간이다. 마이크로스피어산물의 온도는 혼합물이 고정자(11)를 지나쳐 나감에 따라 재어질 것이다 (예를 들면 도시되지 않은 열전대에 의해).
제2도는 베마텍 밀(Bematek mill)의 필수 요소를 보여준다. 이 밀은 제1도의 가울린 밀과 구조 및 기능이 유사하며, 주요 차이점은 로터 및 고정자 카운터보어의 구성이다. 그것은 나사줄로 된 (threaded) 선단부(22)를 갖는 원추대 로터(21)를 운반하는 회전식 샤프트(20), 그리고 중앙원통형 개구(25) 및 로터를 받아드리도록 제작된 원추대 카운터 보어(24)를 갖는 고정자(23)를 포함한다. 단백질 용액/ 기체 혼합물은 개구(25)를 통해 이 밀안으로 공급된다. 기체 및 용액은 그것들이 샤프트(22)상의 나사줄을 통과함에 따라 혼합되고, 그 혼합물은 밀의 갭을 통과함에 따라 유화되고 공동화된다. 갭은 로터 및 고정자의 원뿔표면들 사이의 공간으로서 정의된다.
제3도는 실버손 밀(Silverson mill)을 도시한다. 이 밀의 구조는 제1도 및 제2도의 밀의 구조와 매우 다르다. 묘사된 실버손 밀은 패들 날 로터(31)를 운반하는 회전 샤프트(30)를 가진다. 로터는 컵모양의 구멍난 스크린 고정자(32)안에 받아드려진다. 고정자는 입구피팅(inlet fitting)(34) 으로 끼워맞추어진 하우징(33)상에 장착된다. 입구피팅(34)은 구멍난 스크린 고정자(32)의 바닥 중앙에 하우징(33) 개구안으로 확장한다. 하우징은 입구피팅과 그리고 고정자의 바닥에의 개구 (도시되지 않음)와 통하는 중앙개구(도시되지 않음)를 가진다. 이 밀에서 용액/기체는 입구피팅을 통해 고정자의 바닥안으로 공급되며, 패들로터의 평면(35) 및 고정자의 내부원통형 표면 사이에서 유화되고 공동화된다. 이 밀의 갭 은 로터(31) 및 고정자(32) 사이의 공간으로서 정의될 수 있으나, 공정에 대한 갭 크기의 효과는 고정자의 구멍(36)의 크기에 의해 영향을 받는다.
밀을 통과한 후에 산물은 전형적으로 10-20 C로 냉각되고, 침강시킴으로써 또는 마이로크로스피어에 악영향을 미치지 않는 생체적합성 탈포제를 첨가함으로써 탈포(defoaming)된다.
혼합물을 그러한 밀 또는 등가 장치를 통과시키는 것은 혼합물을 유화시키고 공동화하여 약 0.1 내지 10 미크론 (평균 지름)의 범위의 마이크로스피어를 형성한다. 마이크로스피어의 크기는 적당한 입자 카운터, 예를 들면 쿨터 멀티사이저Ⅱ (Coulter Multisizer Ⅱ; Coulter Electronics, Hialeah, F1)에 의해 결정될 수 있다.
제1도 내지 제3도에 기술된 것들과 같은 밀을 사용할 때, 로터 속도, 갭 크기 및 기체: 액체 비율은 마이크로스피어 산물의 특성 (평균 크기, 크기 분포 및 마이크로스피어의 농도) 에 영향을 미치는 주요한 공정 매개변수이다. 이들 매개변수는 산물이 원하는 특성을 갖도록 경험적으로 조절된다. 어떤 주어진 산물에 대해 그것의 특성은 임상적으로 정의된다. 예를 들면 심근관류에 사용되는 퍼플루오로프로판 마이크로스피어에 대한 추정특성은 평균크기 4 미크론; 크기분포 10 미크론 이하 90%; 농도 7×10 내지 2×10 마이크로스피어/mL 이다.
본 발명의 다음 실시예에 의해 더욱 설명된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
[실시예1]
기계적 공동화 공정 온도 모니터링과 인간 혈청 알부민의 조절
상기한 바와 같이, 단백질 용액은 프로세싱전에 전열처리되어 공정온도가 초기 변성온도에 도달하고 유지될 수 있다.
전형적인 실행방법은 다음과 같다.
모델 2 1/2 베아텍 콜로이드 밀 (제2도; Bematek Systems, Beverly MA)은 파이프가 설치되어 입구가 열 교환기에 연결되었다. 기체가 스며들지 않는 배관을 사용하여 열교환기 호스 바브(barb) 사이의 부드러운 연결을 만들었다.
공정 헤드로부터의 출구를 스테인레스 강철 후-공정 냉각기에 연결했다.
용액온도를 세곳(T1, T2 및 T3)에서 모니터했다. T1 열전대를 전열 열 교환기 및 밀헤드 사이의 Swagelok 티 에 장착하여 단백질 용액의 공급온도를 측정했다. 기체를 안내하기 위한 제2 티 를 또한 공급구에 설치했다. T2 열전대를 공정헤드로부터의 출구 안쪽에, 로터로부터 약 1cm 및 샤프트로부터 2cm 에 설치하여 공정의 온도를 정밀하게 측정할 수 있었다.
이 방법에, 두가지 온도, 즉 공급온도(T1) 및 공정온도(T2)를 독립적으로 측정할 수 있고, 이들을 비교하여 프로세싱 동안의 용액의 가열량을 결정할 수 있다.
이 실시예에서, U.S.P. 알부민을 표준 식염수와 희석하여 1% (w/v) 용액을 만들었다. 변성온도는 실험적으로 결정하였으며 상기한 바 대로 78 C이었다. 그것을 100 mL/min 속도의 퍼플루오로프로판(50% v/v) 과 함께 탈기체후에 200 mL/min 속도로 밀안으로 공급했다. 10 C 내지 15 C의 T1 및 T2 사이의 차이가 기록되었다. 77 C (변성온도보다 1 C 낮음)의 공정온도를 얻기 위해서, 공급온도를 62 C 내지 67 C 범위로 조절했다. 발생열량이 서로 다른 밀링매개변수에 따라 변하기 때문에, 기체 마이크로버블을 변성단백질의 박피로 성공적으로 캡슐화하는 동안 공정온도가 단백질의 벌크 변성을 피하기 위해, 밀링 매개변수 (밀의 선택, 밀 세팅, 유속, 기체: 액체 비율 등) 의 각각의 변화에 따른 T1 및 T2 사이의 차이를 결정하는 것이 필요하다. 냉각기-외부 온도(T3)를 또한 모니터했으며, 최상의 결과를 위해 20 C 에서 표적화했다.
[실시예2]
서로 다른 기체를 함유하는 마이크로스피어를 만드는 기계적 공동화 방법
다양한 기체를 함유하는 마이크로스피어를 다음과 같이 제조했다:
5% 인간 알부민 용액(USP) 을 2 시간동안 계속된 진공하에서 탈공기시켰다. 빈 용기를 관심있는 기체로 채움으로써 진공을 해제했다. 사용된 불용성 기체는 헥사플루오르화황, 퍼플루오로에탄 및 퍼플루오로프로판을 포함한다. 더 용해성이 큰 기체, 즉 공기, 질소, 산소 및 아르곤을 함유하는 마이크로스피어도 또한 제조했다. 아르곤의 사용은 고분자량이지만 비교적 가용성이 있는 기체중 대표적인 것이다. 알부민 용액을 in-line 열 교환기를 통해 68 C로 조절했고, 2 1/2 콜로이드 밀(Greerco, Hudson, NH, 모델 W250V 또는 AF Gaulin, Everett. MA, 모델 2F) 안으로 100 mL/min 속도로 펌프했다. 실온의 특정 기체를 120-220 mL/min의 유속으로 입구의 바로 상류의 액체 공급에 첨가했다. 로터 및 고정자 사이의 갭을 2/1000 인치 (0.005cm)로 조절했고, 알부민 용액을 73 C의 공정 온도에서 약 7000 rpm으로 연속적으로 밀링했다. 그렇게 형성된 마이크로스피어의 농밀한 백색용액을 열 교환기에 의해 10 C의 온도로 즉시 냉각했고, 유리병에 수집했다. 그 유리병을 즉시 봉인했다. 그 물질은 쿨터카운터를 사용하여 농도 및 크기 분포에 관하여 특성지어졌다. 그 결과를 하기 표3에 나타낸다.
[실시예3]
로터속도 및 갭크기의 효과
1% 알부민 용액을 50% 기체 대 액체(v/v) 비율로 퍼플루오로프로판 (100 mL/min) 과 조합시켰다. (200 mL/min). 마이크로스피어는 변화하는 로터속도 및 갭크기를 사용하여 실시예1에 기술된 방법에 따라 제조했다. 얻어진 데이터를 표4에 나타낸다.
이들 결과는 로터속도가 증가함에 따라 농도가 증가하고 평균크기가 감소하는 반면에, 갭크기의 증가는 농도를 감소시킨다는 것을 보여준다.
[실시예4]
기체 대 액체 비율의 효과
0.012 의 대략적인 갭 및 9950 ft/min 의 로터 팁 속도를 갖는 가울린 밀을 사용하여, 0.5% 알부민 용액 (100 mL/min) 을 20, 50, 70 또는 100 ml/min 속도의 퍼플루오로프로판 (20, 50, 70 또는 100% 기체 대 액체 v/v)과 조합시켰다. 얻어진 데이터를 표5에 나타낸다.
이들 결과는 기체: 액체 비율이 증가함에 따라 농도 및 평균크기 둘다가 증가하는 것을 보여준다.
[실시예5]
초음파 공동화에 의해 불용성 기체-충전 마이크로스피어를 만드는 방법
공기, 헥사플루오르화황 및 퍼플루오로에탄 마이크로스피어는 배치 및 연속 둘다의 초음파 공동화 공정에 의해 제조했다. 5%, USP의 인간 알부민 용액을 진공하에 탈기체시키고, 특정기체하에 저장했다. 연속 초음파 처리공정을 Cerny (USP 4,957,656)에 의해 기술된 바대로 수행하여, 불용성 기체를 공기로 대체했다. 배치 공정은 3/4 액체 프로세싱 혼(Sonics 및 Materials, Danbury CT)을 사용하여 수행했다. 기체는 혼을 통과하여 알부민안으로 들어가서 총공정동안 공기를 배제했다. 알부민을 73 C로 가온했고, 브란손 피에조일렉트릭 컨버터 및 동력원(Branson Utrasonics, Danbury CT) 을 사용하여 60 미크론 이중진폭에 20 KHz로 5 초동안 초음파 처리했다. 그 산물을 즉시 유리병으로 옳긴후 기체하에 봉인했다.
그 산물은 2.5 내지 3.3 미크론의 평균 크기를 갖는 1.4×10 내지 1.0×10 마이크로스피어/mL 의 농도의 진하고 우유같은 마이크로스피어의 현탁액으로 구성되었다.
[실시예6]
마이크로스피어의 현미경 검사
다양한 기체를 함유하는 알부민 마이크로스피어를 실시예2 또는 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조했다. 산물의 현미경 검사는 구형 마이크로스피어의 단순분산 현탁액을 보여주었다. 마이크로스피어를 현탁액이 정화될때까지 주사기에서 고압을 가하여 붕괴시켰다. 모든 경우에 현미경 검사는 붕괴된 마이크로스피어로부터의 투명한 막성외피의 존재를 보여주었다.
[실시예7]
마이크로스피어의 압력 저항
다양한 기체를 함유하는 알부민 마이크로스피어를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조했다. 10 mL 의 개개의 현탁액을 압력계 끼워진 10mL 기체로 채워진 유리주사기 (Hamil-ton, Reno NV) 에 넣었다. 모든 상부간격을 제거하고 기구를 봉인했다. 40 psig 의 일정 압력을 3 분동안 가하였다. 그 다음 쿨터 카운터를 사용하여 샘플입자 농도 및 분포를 측정했다. 가압 전후의 데이터 (제4a도 내지 제4e도) 의 비교는 불용성 기체 마이크로스피어의 40 psig 에 대한 상대적 저항성을 증명했다.
[실시예8]
마이크로스피어의 희석현탁액의 압력 저항
다양한 기체를 함유하는 마이크로스피어를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조했다. 개개의 마이크로스피어의 샘플을 인산염-완충 식염수의 mL당 동 부피의 캡슐화된 기체, 약 1:60 희석도로 희석시켰다. 희석된 현탁액을 적당한 상부간격을 갖는 봉인된 용기내에서 0.5 psig 내지 7.5 psig의 순간정지압력하에 놓았다. 제5도는 마이크로스피어 농도에 대한 압력의 효과를 보여준다. 불용성 기체, 즉 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로에탄 및 헥사플루오르화 황을 함유하는 마이크로스피어를 동일 농도 및 크기분포의 공기 또는 고분자량 아르곤-충전 마이크로스피어 보다 매우 더 압력-저항적이다 (제6도). 혈류에서의 생리적 압력은 말초정맥압력인 1.5 psig로부터 심근벽에의 2.5 psig 까지의 범위이다.
[실시예9]
마이크로스피어에 대한 탈기체된 완충액의 효과
다양한 기체를 함유하는 알부민 마이크로스피어를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조했다. 인산염 완충 식염수(PBS)는 사용전에 비등시킴으로써 탈기체시켰다. 뜨거운 완충액의 0.05 mL 내지 1.5 mL 앨리 을 13×100 시험관에 넣고 수욕에서 실온으로 1 분동안 냉각시켰다. 일정 부피의 3.0 mL로 맞추고, 마이크로스피어 농도를 결정했다. 제7도는 불용성 기체인 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로에탄 및 헥사플루오르화황을 함유하는 마이크로스피어는 탈기체된 용액에서 향상된 생존률을 갖는다는 것을 보여준다.
공기, 헥사플루오르화황 또는 퍼플루오르에탄을 함유하는 마이크로스피어를 총 혈액안으로 희석시켰다. 공기-충전 마이크로스피어는 붕괴되었다. 불용성 기체-충전 마이크로스피어는 신선한 전혈에서 희석후에도 생존하는 것으로 보여졌다.
[실시예10]
탄력성
다양한 기체를 함유하는 마이크로스피어를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조했다. 마이크로스피어를 실시예 8에 기술된 바대로 인산염 완충 식염수로 희석했고, 현미경의 대 위에 위치한 깨끗한 셀안에 넣었다. 셀을 질소원에 연결시켜 마이크로스피어에 대한 생리적 압력의 신속한 적용과 해제의 효과를 관찰하였다.
가용성 기체를 함유하는 마이크로스피어에 1.5 psig 이상의 압력을 적용하면 결과적으로 구형체의 완전 손실이 관찰되었다. 마이크로스피어는 압력의 해제시에 원래형태로 복귀되지 않아 비가역적 파괴임을 가리켰다. 1.5 psig 이하의 압력을 적용하면 결과적으로 외피의 변형 및 구겨짐을 가져와서 마이크로스피어가 불완전하게 손실되었다. 구형 외관 및 집단은 적용된 압력의 해제시에도 회복될 수 없었다.
불용성 퍼플루오로카본 기체를 함유하는 마이크로스피어의 현탁액에 최고 여러 psig 까지의 압력을 적용하면 결과적으로 마이크로스피어의 직경의 감소를 가져왔다. 마이크로스피어의 직경은 압력의 해제시에 원래의 직경으로 되돌아갔다.
헥사플루오르화황 마이크로스피어는 또한 적용된 생리적 압력하에서 공기-충전 마이크로스피어에 비해 향상된 탄력성을 나타냈으나, 퍼플루오로카본 마이크로스피어에 비해 감소된 탄력성을 보여줬다.
이러한 관찰은 불용성 기체를 함유하는 마이크로스피어는 압력에 저항적일 뿐만 아니라, 압력의 해제후에 회복되었다는 것을 가리켰다. 이것은 탄력적인 단백질 외피를 암시한다.
[실시예11]
개방계와 폐쇄계에서 만든 마이크로스피어의 비교
[처리방법]
A) 수동음파파쇄: 개방계(EPA 554,213 1-단계법과 대등함)
미국특허 No. 4,844,882와 유럽특허출원 554,213에 기술된 방법을 사용하여 다음과 같이 마이크로스피어를 제조하였다:
20cc 주사기 몸통이 지지대에 장착되고 끝을 통해 삽입된 T-형 열전쌍을 끼워맞추었다. 주사기를 스위스 레드크로스 5% 사람혈청알부민으로 16cc 표시선까지 채웠다. 기체(퍼플루오로프로판(CF) 또는 헥사플루오르화황(SF))를 주사기 몸통 상부로 도입하고 액체의 표면을 넘쳐흐르게 하였다. 고주파분해 혼을 용액표면 아래로 10cc 표시선까지 낮추고 용액의 온도가 72.8-73 C로 올라갈때까지 대략 1분 50% 파워에서 작동시켰다. 혼을 즉시 메니스커스 ±1mm 로 당기고 파워레벨을 65%로 증가시켰다. 음파파쇄를 5초간 계속하고 1.2-2 C 더 온도를 증가시켰다. 생성물을 유리 바이알에 용량만큼 붓고 밀봉하였다.
B) 연속음파파쇄: 폐쇄계
미국특허 No. 4,957,656에 기술된 방법을 사용하여 다음과 같이 퍼플루오로프로판과 헥사플루오르화황 마이크로스피어를 제조하였다.
사람혈청알부민을 멸균염수로 1% w/v 용액으로 희석하였다. 용액을 초기변성까지 대략 76 C로 가열하였다. 계를 외부대기에 대해 폐쇄하고 공기 대신에 퍼플로오로프로판 또는 헥사플루오르화황 기체를 도입하였다. 기체/알부민 혼합물을 대략 100ml 액체/분으로 소니케이터 혼을 통해 흘림으로써 연속해서 생성물을 만들었다. 생성물은 열교환기를 통한 통과에 의해 음파파쇄실로 부터 나올 때 냉각되고 마이크로스피어의 벌크 액체현탁액에 대해 주어진 것과 유사하였다.
C) 기계적 공동화: 폐쇄계
퍼플루오로프로판 또는 헥사플루오르화황 기체를 함유하는 알부민 마이크로스피어를 또한, 실시예 2에 기술된 것과 유사하게 1% 사람혈청 알부민과 기체의 혼합물을 분쇄함으로써 폐쇄계에서 제조하였다. 주어진 밀의 기계적 공동화에 의해 마이크로스피어 형성을 허용하기에 충분한 온도로 가열된 알부민 용액은 혼합된 1:1(v/v)기체이었고 콜로이드 밀에 도입되었다. 액체유속은 밀의 용량 또는 크기에 따라 다른데 전형적으로 100 내지 500ml/분이다. 이 평가를 위해 실버손(Silverson) L4R 밀과 베마텍(Bematek)3 생성콜로이드밀이 사용되었다. 밀로부터의 유출물은 열교환시스템을 통해 통과시켜 냉각되며 결과된 알부민 마이크로스피어 현탁액은 대량으로 수집되었다. 생성물을 다른 공정들과 마찬가지로 유리 바이알에 채웠다.
[분석방법]
A) 집단동태
50 미크론 구멍을 사용하는 쿨터멀티사이저(Coulter multisizer)Ⅱ로 집단동태를 평가하였다.
「처리방법」에 기술된 바와같이 제조된 알부민 마이크로스피어를 Isoton 으로 1:10,000 희석하고 500μl 샘플을 분석하였다. 본래의 마이크로스피어 현탁액 ml 당 농도, 평균크기 및 캡슐화된 기체 부피를 얻었다.
B) 기체함량
처리방법에 기술된 바와같이 제조된 두몫의 마이크로스피어에 포획된 퍼플루오로프로판의 백분율을 Hewlett Packard 5890 에서 기체크로마토그라피에 의해 구하였다. 마이크로스피어 현탁액의 샘플을 기밀주사기에 취하였다. 기체를 에탄올 등의 거품방지제를 사용하여 마이크로스피어로부터 배출시키고 포획된 기체를 열전도도에 의해 검출하였다.
C) 압력저항
알부민 마이크로스피어의 압력저항을 유럽특허출원 554,213에서 신테티카(Sintetica)에 의해 보고된 것과 유사한 방법으로 평가하였다. 마이크로스피어를 3ml압력 큐베트에서 통기된 인산염 완충된 염수에 600nm에서 대략 1흡광도 단위로 희석시켰다. 목부를 압력원에 부착시키고 큐베트를 기록용 분광광도계에 놓았다. 쿠베트내 압력은 150초에 걸쳐 0으로부터 5 또는 10psig 로 선형증가시켰고 150초 되었을 때 압력을 해제하였다. 압력램프(ramp)는 20psi압력원(N 탱크)과 5리터 스테인레스강 저장소 사이에 놓인 균형 맞춘 솔레노이드 밸브(Honeywell) 와 압력변환기(Omega) 에 의해 조장되었다. 큐베트를 디지탈압력 게이지를 통해 강 저장소에 연결시켰다. 아날로그 대 디지탈 변환기와 디지탈 대 아날로그 변환기판(National Instruments)이 장치된 PC-형 컴퓨터가 밸브의 개방을 조절하고 압력변환기를 판독하였다. 저장소 및 큐베트를 원하는 압력이 달성될때까지 선택된 비율로 가압하였다. 마이크로스피어 현탁액의 광학밀도는 시간과 압력의 함수로서 모니터하였다. 데이터를 큐베트 내 마이크로스피어의 자연부유율에 대해 교정하였다.
[결과]
A) 집단동태
수동음파파쇄, 연속음파파쇄 및 기계적 공동화의 방법에 의해 제조된 알부민 마이크로스피어를 제조후 24 시간내에 농도, 평균크기, 캡슐화된 기체부피 및 크기분포에 대해 분석하였다. 모든 측정은 최저 두세트로 수행하고 평균으로 제공된다. 이들 측정의 결과를 표 6에 제공한다.
모든 방법들에 의해 제조된 마이크로스피어는 4 C에서 적어도 몇주간 이 연구의 기간동안 안정하였다.
B) 기체함량
두몫의 마이크로스피어에 포획된 퍼를루오로프로판 기체의 조성을 분석한 것을 표 7에 재공한다.
* 두몫의 결과의 평균
이들 결과는 수동음파파쇄를 사용하여 개방계에서 만들어진 마이크로스피어는 폐쇄계(연속음파파쇄 및 기계적 공동화) 에서 만들어진 것보다 마이크로스피어를 형성하기 위해 사용된 기체의 훨씬 더 적은 양을 캡슐화한다. 폐쇄계에서 만든 마이크로스피어는 산소전극을 사용하여 구한바 산소의 부재하에 만들어졌다. 모든 세가지 방법으로 만든 마이크로스피어를 취급과 샘플링의 동안에 대기에 같은 양 노출시켰고(이것은 두 폐쇄계 과정을 사용하여 만든 마이크로스피어에서 100% 미만의 퍼플루오로프로판 기체를 설명해준다), 따라서 기체캡슐화의 효율을 감소시킨 개방계에서의 형성의 동안에 존재하는 산소(및 다른 대기중 기체들)가 있다.
C) 압력저항
기체가 채워진 마이크로스피어의 현탁액은 압력을 증가시킴에 따라 크기감소 및 연관된 표면적의 변화로 인해 광학밀도가 감소할 것이다. 수축은 두가지 요인에 기인한다. 즉, 기체의 법칙에 따른 가역적압축과, 헨리의 법칙에 따른 증가된 용해도로 인한 기체코어의 주위액체로의 비가역적 손실이 그것이다. 적용된 압력의 해제시, 압축으로 인한 부피손실의 부분만 회복되는데, 이것은 광학밀도의 증가에 의해 관찰될 수 있다. 포획된 기체의 주위용액으로의 손실은 가압제거시 마이크로스피어에 다시 들어오지 않으며, 용액 위 헤드공간으로 손실된다.
제8도는 연속음파파쇄 및 기계적 공동화(폐쇄계) 법 뿐만아니라 수동음파파쇄(개방계)법에 의해 퍼플루오로프로판기체로 제조된 알부민 마이크로스피어 1 OD 현탁액에서 10psi까지의 선형압력 구배를 부과하는 결과를 나타낸다. 두 폐쇄계 법은 압력을 증가시킴에 따라 압축을 나타내었고, 구배의 끝에서 압력의 해제시 전체적으로 부피가 회복된 마이크로스피어를 산출하였다. 주위 용액으로의 포획된 기체의 손실은 관찰되지 않았다. 개방계(수동음파 파쇄법) 에서 제조된 알부민 마이크로스피어는 적용된 압력으로 더 큰 압축을 나타내었고 압력의 해제시 기체코어의 비가역적 손실로 인해 부피의 단지 부분적인 회복을 나타내었으며, 마이크로스피어의 40%파괴가 결과되었다.
Claims (22)
- 필모겐 단백질의 수용액과 25oC물에서 0.01 mL/mL 미만의 용해도를 갖는 약리학적으로 수용가능한 불용성 기체의 혼합물을 산소의 부재하에서 초음파 또는 기계적 공동화에 적용시키는 것으로 이루어지는 초음파 영상화제로서 유용한 약 0.1 내지 약 10미크론 범위의 평균 직경을 갖는 캡슐화된 기체 마이크로스피어의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 초음파 또는 기계적 공동화는 대기에 대해 닫혀있는 장치에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 필모겐 단백질은 인간 혈청 알부민이고, 생리학적으로 수용가능한 기체는 퍼플루오로프로판인 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기의 단계들로 이루어지는 초음파 영상화제로서 유용한 캡슐화된 기체 마이크로스피어의 제조방법: a) 후속되는 기계적 유화공정동안 초기 변성온도를 달성하는데 필요한 온도에서 열-변성가능 단백질의 수용액을 제공하는 단계; b) 이 용액을 기체와 혼합하는 단계; c) 단백질 용액과 기체혼합물을 기계적 진단에 의해 유화시켜서 약 0.1 내지 약 10 미크론 범위의 평균직경을 갖는 기체 마이크로버블의 현탁액을 형성하는 단계; 및 d) 현탁액을 기계적으로 공동화시켜서 단백질이 변성되게 하여서 기체-용액 계면에 침전되게 함으로써 기체 마이크로버블을 캡슐화하여 마이크로스피어를 형성하는 단계.
- 제4항에 있어서, 단백질은 천연적으로 존재하는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 단계(c) 및 (d)는 혼합물을 밀(mill)을 통과시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약리학적으로 수용가능한 기체는 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로에탄, 헥사플루오르화황, 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로메탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 필모겐 단백질은 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 약리학적으로 수용가능한 가체는 25oC 물에서 4×10-5cm2sec 미만의 확산률을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 온도는 용액을 가열함에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 온도는 단백질의 변성온도를 변경시키는 첨가제를 용액에 포함시킴에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 단백질은 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 단백질은 합성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 용액중의 단백질 농도는 약 0.1 내지 10% w/v인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 옹액중의 단백질 농도는 약 1 내지 5% w/v인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 옹액중의 단백질 농도는 약 1% w/v인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기체는 불용성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 불용성 기체는 헥사플루오르화황, 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판 또는 퍼플루오로부탄인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기체는 공기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기체 대 단백질 용액의 비율은 5% 내지 200% v/v인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기체 대 단백질 용액의 비율은 20% 내지 100% v/v인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 초기 변성온도는 단백질의 변성온도 보다 약 1o내지 5o이하인 것을 특징으로 하는 방법.
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