ES2219646T3 - Procedimiento de administracion (in vivo) de sustancias biologicas y composiciones utilizadas en estos procedimientos. - Google Patents

Procedimiento de administracion (in vivo) de sustancias biologicas y composiciones utilizadas en estos procedimientos.

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ES2219646T3 ES94909778T ES94909778T ES2219646T3 ES 2219646 T3 ES2219646 T3 ES 2219646T3 ES 94909778 T ES94909778 T ES 94909778T ES 94909778 T ES94909778 T ES 94909778T ES 2219646 T3 ES2219646 T3 ES 2219646T3
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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION, SE PRESENTAN COMPOSICIONES UTILES PARA LA ADMINISTRACION IN VIVO DE UN PRODUCTO BIOLOGICO, EN DONDE EL PRODUCTO BIOLOGICO SE ENCUENTRA ASOCIADO A UNA ENVOLTURA POLIMERICA FORMULADA A PARTIR DE UN MATERIAL BIOCOMPATIBLE. EL PRODUCTO BIOLOGICO SE PUEDE ASOCIAR A LA ENVOLTURA POLIMERICA MISMA Y/O EL PRODUCTO BIOLOGICO, OPCIONALMENTE SUSPENDIDO/DISPERSO EN UN AGENTE DE DISPERSION BIOCOMPATIBLE, PUEDE QUEDAR CUBIERTO POR LA ENVOLTURA POLIMERICA. EN OTRO ASPECTO DE LA INVENCION, EL PRODUCTO BIOLOGICO ASOCIADO A LA ENVOLTURA POLIMERICA SE ADMINISTRA A UN SUJETO, DE FORMA OPCIONALMENTE DISPERSA EN UN LIQUIDO BIOCOMPATIBLE ADECUADO.

Description

Procedimiento de administración (in vivo) de sustancias biológicas y composiciones utilizadas en estos procedimientos.
Métodos para la administración in vivo de compuestos biológicos y composiciones útiles para los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la administración in vivo de compuestos biológicos. En un aspecto, un compuesto biológico se asocia con un recubrimiento polimérico formulado con un material biocompatible. El compuesto biológico puede asociarse con el propio recubrimiento polimérico y/o el compuesto biológico, suspendido/disperso en un agente de dispersión no acuoso biocompatible, puede introducirse dentro del recubrimiento polimérico. En otro aspecto, el compuesto biológico asociado con el recubrimiento polimérico se administra a un sujeto, opcionalmente disperso en un líquido biocompatible adecuado.
Antecedentes de la invención
Las micropartículas y cuerpos extraños presentes en la sangre generalmente se aclaran de la circulación mediante los "órganos de filtración de la sangre", concretamente el bazo, pulmones e hígado. La materia particulada contenida en la sangre entera normal comprende glóbulos rojos (típicamente con un diámetro de 8 micrómetros), glóbulos blancos (típicamente con un diámetro de 6-8 micrómetros) y plaquetas (típicamente con un diámetro de 1-3 micrómetros). La microcirculación en la mayoría de los órganos y tejidos permite el paso de estas células sanguíneas. Cuando están presente microtrombos (coágulos de sangre) con un tamaño mayor de 10-15 micrómetros en la circulación, hay riesgo de infarto o bloqueo de los capilares, llevando a isquemia o privación de oxígeno y posible muerte del tejido. Por tanto, debe evitarse la inyección en la circulación de partículas mayores de 10-15 micrómetros diámetro. Sin embargo, una suspensión de partículas menores de 7-8 micrómetros es relativamente segura y se ha usado para la administración de agentes farmacológicamente activos en forma de liposomas y emulsiones, agentes nutricionales y medios de contraste para aplicaciones de obtención de imágenes.
El tamaño de las partículas y su modo de administración determina su comportamiento biológico. Strand et al. [en Microspheres-Biomedical Applications, ed. A. Rembaum, pág. 193-227, CRC Press, (1988)] han descrito que el destino de las partículas depende de su tamaño. Las partículas con un tamaño en el intervalo de unos pocos nanómetros (nm) a 100 nm entran en los capilares linfáticos después de la inyección intersticial y puede tener lugar fagocitosis dentro de los nódulos linfáticos. Después de una inyección intravenosa/intraarterial, las partículas menores de aproximadamente 2 micrómetros se aclararán rápidamente del flujo sanguíneo mediante el sistema reticuloendotelial (RES); también conocido como el sistema fagocito mononuclear (MPS). Las partículas mayores de aproximadamente 7 micrómetros quedan atrapadas, después de la inyección intravenosa, en los capilares pulmonares. Después de la inyección intraarterial, las partículas quedan atrapadas en el primer lecho capilar que alcancen. Las partículas inhaladas son atrapadas por los macrófagos alveolares.
Los compuestos farmacéuticos que son insolubles en agua o poco solubles en agua y sensibles a los ambientes ácidos del estómago no pueden administrarse convencionalmente (por ejemplo, por inyección intravenosa o administración oral). La administración parenteral de tales compuestos farmacéuticos se ha conseguido por emulsión de fármaco solublilizado en aceite con un líquido acuoso (tal como solución salina normal) en presencia de tensioactivos o estabilizantes de emulsión para producir microemulsiones estables. Estas emulsiones pueden inyectarse por vía intravenosa, siempre que los componentes de la emulsión sean farmacológicamente inertes. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.073.943 describe la administración de agentes farmacológicamente activos insolubles en agua disueltos en aceites y emulsionados con agua en presencia de tensioactivos tales como fosfatidas de huevo, plurónicos (copolímeros de polipropilenglicol y polietilenglicol), oleato de poliglicerol, etc. La Publicación Internacional PCT Nº WO85/00011 describe microgotas farmacéuticas de un anestésico recubiertas con un fosfolípido, tal como dimiristoil fosfatidilcolina, con unas dimensiones adecuadas para la inyección intradérmica o intravenosa.
Las microesferas de proteínas se han descrito en la bibliografía como vehículos de agentes farmacológicos o de diagnósticos. Las microesferas de albúmina se han preparado por desnaturalización con calor o reticulación química. Las microesferas desnaturalizadas por calor se producen a partir de una mezcla emulsionada (por ejemplo, albúmina, el agente a incorporar y un aceite adecuado) a temperaturas entre 100ºC y 150ºC. Después, las microesferas se lavan con un disolvente adecuado y se almacenan. Leucuta et al. [International Journal of Pharmaceutics Vol. 41:213-217 (1988)] describe el método de preparación de microesferas desnaturalizadas por calor.
El procedimiento para preparar microesferas reticuladas químicamente implica tratar la emulsión con glutaraldehído para reticular la proteína, seguido de lavado y almacenamiento. Lee et al. [Science Vol. 213:333-235 (1981)] y la Patente de Estados Unidos Nº 4.671.954 describen este método de preparación.
Las técnicas anteriores para la preparación de microesferas de proteínas como vehículos de agentes farmacológicamente activos, aunque son adecuadas para la administración de agentes solubles en agua, no pueden incluir agentes insolubles en agua. Esta limitación es inherente a la técnica de preparación que confía en la reticulación o desnaturalización por calor del componente proteico de la fase acuosa de una emulsión de agua en aceite. Cualquier agente soluble en agua disuelto en la fase acuosa que contiene proteínas puede incluirse dentro de la matriz de proteínas reticulada o desnaturalizada por calor resultante, pero un agente poco soluble en agua o soluble en aceite no puede incorporarse a una matriz proteica formada mediante estas técnicas.
De esta forma, la mala solubilidad acuosa de muchos compuestos biológicos presenta un problema para la administración a seres humanos. De hecho, la administración de agentes farmacológicamente activos que son inherentemente insolubles o poco solubles en medio acuoso puede verse perjudicada seriamente si la administración oral no es eficaz. En consecuencia, las formulaciones usadas actualmente para la administración de agentes farmacológicamente activos que son que son inherentemente insolubles o poco solubles en medio acuoso requieren la adición de agentes para solubilizar al agente farmacológicamente activo. Sin embargo, es habitual que los agentes (por ejemplo emulsionantes) empleados para solubilizar los agentes farmacológicamente activos provoquen graves reacciones alérgicas. De esta forma, un régimen común de administración implica el tratamiento de un paciente con antihistaminas y esteroides antes de la inyección del agente farmacológicamente activo para reducir los efectos secundarios alérgicos de los agentes usados como ayuda para la administración del fármaco.
En un esfuerzo para mejorar la solubilidad en agua de fármacos que son inherentemente insolubles o poco solubles en medio acuoso, varios investigadores han modificado químicamente la estructura de los fármacos con grupos funcionales que imparten una mejor solubilidad en agua. Entre las modificaciones químicas descritas en la técnica están la preparación de derivados sulfonados [Kingston et al., Patente de Estados Unidos 5.059.699 (1991)] y ésteres de aminoácidos [Mathew et al., J. Med. Chem., Vol. 35:145-151 (1992)] que muestran una actividad biológica significativa. Las modificaciones para producir derivados solubles en agua facilitan la administración intravenosa, en medio acuoso (disuelto en un vehículo inocuo tal como solución salina normal) de fármacos que son inherentemente insolubles o poco solubles. Sin embargo, tales modificaciones, incrementan el coste de preparación del fármaco, pueden inducir reacciones secundarias no deseadas y/o reacciones alérgicas y/o pueden reducir la eficacia del fármaco.
Otros compuestos biológicos que son habitualmente inherentemente insolubles o poco solubles en medio acuoso y que se desean administrar disueltos en un vehículo inocuo tal como solución salina normal, a la vez que se provoca un mínimo de reacciones secundarias no deseadas y/o reacciones alérgicas, son agentes de diagnóstico tales como agentes de contraste. Los agentes de contraste son deseables en la obtención de imágenes radiológicas ya que mejoran la visualización de los órganos (es decir, su posición, tamaño y configuración) y otras estructuras celulares del medio circundante. Los tejidos blandos, por ejemplo, tiene una composición celular similar (es decir, están compuestos principalmente por agua) aunque puedan tener funciones biológicas notablemente distintas (por ejemplo, hígado y páncreas).
La técnica de obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI) o resonancia magnética nuclear (RMN) implica la detección de ciertos núcleos atómicos con un campo magnético aplicado usando radiación por radiofrecuencia. En algunos aspectos, es similar a la tomografía computerizada de rayos X (CT) en que puede proporcionar (en algunos casos) imágenes transversales de órganos con una resolución en tejidos blandos potencialmente excelente. En su uso actual, las imágenes constituyen un mapa de distribución de protones en órganos y tejidos. Sin embargo, al contrario que la tomografía computerizada de rayos-X, MRI no usa radiación ionizante. Por lo tanto, MRI es una técnica segura no invasiva para la obtención de imágenes médicas.
Aunque el fenómeno de la RMN se descubrió en 1954, sólo recientemente se ha descubierto su uso en los diagnósticos médicos como medio para determinar la estructura interna. La técnica fue desarrollada en primer lugar por Lauterbur [Nature 242:190-191 (1973)].
Se conoce que los núcleos con un espín nuclear apropiado se alinean en la dirección del campo magnético aplicado. El espín nuclear puede alinearse de dos formas: frente a o contra el campo magnético externo. La alineación con el campo es más estable; mientras que la energía debe absorberse para alienarse en el estado menos estable (es decir, contra el campo aplicado). En el caso de los protones, estos núcleos progresan con un movimiento de precesión o resuenan a una frecuencia de 42,6 MHz en presencia de un campo magnético de 1 tesla (1 tesla = 10^{4} gauss). A esta frecuencia, un pulso de radiofrecuencia (RF) de radiación excitará a los núcleos y cambiará su orientación de espín para alinearse frente al campo magnético aplicado. Después del pulso de RF, los núcleos excitados se "relajan" o vuelven al equilibrio o a la alineación con el campo magnético. La reducción de la señal de relajación puede describirse usando dos términos de relajación. T_{1}, el tiempo de relajación de la red del espín o tiempo de relajación longitudinal, es el tiempo necesario para que los núcleos vuelvan al equilibrio con la dirección del campo magnético aplicado externamente. El segundo, T_{2} o tiempo de relajación espín-espín, se asocia con el desfase de la precesión inicialmente coherente de los espines individuales de los protones. Los tiempos de relajación de distintos fluidos, órganos y tejidos en distintas especies de mamíferos están bien documentados.
Una ventaja de MRI es que pueden seleccionarse diferentes planos de exploración y espesores de la sección sin perder resolución. Esto permite obtener directamente imágenes transversales, coronales y sagitales de alta calidad. La ausencia de partes mecánicas en movimiento en el equipo de MRI imparte un alto grado de fiabilidad. Se admite generalmente que MRI tiene un mayor potencial que la tomografía computerizada de rayos-X para el examen selectivo de tejidos. En la CT, únicamente los coeficientes de atenuación de los rayos-X determinan el contraste de la imagen, mientras que al menos tres variables distintas (T_{1}, T_{2} y densidad del espín nuclear) contribuyen a la imagen por resonancia magnética.
Debido a sutiles diferencias fisioquímicas entre órganos y tejidos, MRI puede ser capaz de diferenciar tipos de tejido y en la detección de enfermedades que pueden no detectarse con rayos-X o CT. En comparación, CT y rayos-X sólo son sensibles a diferencias en las densidades de electrones en tejidos y órganos. Las imágenes que se pueden obtener con técnicas de MRI también pueden permitir a un médico detectar estructuras más pequeñas que aquellas detectables por CT, debido a su mejor resolución espacial. Adicionalmente, usando técnicas de MRI puede obtenerse fácilmente cualquier plano de una imagen, incluyendo transversal, coronal y sagital.
Actualmente, MRI se usa ampliamente para ayudar en el diagnóstico de muchos trastornos médicos. Los ejemplos incluyen daños en las articulaciones, trastornos en la médula ósea, tumores en tejidos blandos, invasión mediastinal, linfadenopatía, hemangioma cavernoso, hemocromatosis, cirrosis, carcinoma de células renales, leiomioma uterino, adenomiosis, endometriosis, carcinomas de mama, estenosis, enfermedad de la arteria coronaria, disección aórtica, hipertrofia lipomatosa, septum auricular, pericarditis constrictiva y similares [véase, por ejemplo, Edelman & Warach, Medical Progress 328:708-716 (1993); Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328:785-791 (1993)].
Las imágenes de resonancia magnética empleadas habitualmente se basan actualmente en señales protónicas que surgen de las moléculas de agua dentro de las células. Por consiguiente, habitualmente es difícil descifrar las imágenes y distinguir órganos individuales y estructuras celulares. Hay dos formas potenciales para diferenciar mejor las señales protónicas. La primera implica usar un agente de contraste que altera la T_{1} o T_{2} de las moléculas de agua en una región en comparación con otra. Por ejemplo, el ácido gadolinio dietilentriaminopentaacético (Gd-DTPA) reduce el tiempo de relajación del protón T_{1} de las moléculas de agua próximas al mismo, mejorando por tanto las imágenes obtenidas.
La segunda vía para diferenciar órganos individuales y estructuras celulares es introducir otro núcleo para obtener de las imágenes (es decir, un agente para la obtención de imágenes). Usando este segundo enfoque, la obtención de imagen sólo puede tener lugar cuando se ha administrado el agente de contraste. Una ventaja de este método es el hecho de que la imagen se obtiene sin interferencias del agua presente alrededor. Los agentes de contraste adecuados deber ser bio-compatibles (es decir, no tóxicos, químicamente estables, no reactivos con tejidos) y con una vida limitada antes de su eliminación del cuerpo.
Aunque típicamente se ha seleccionado hidrógeno como base para la exploración MRI (debido a su abundancia en el cuerpo), esto puede tener como resultado áreas con una imagen pobre por falta de contraste. De esta forma, el uso de otros núcleos activos MRI (tales como flúor) puede ser ventajoso. El uso de ciertos perfluorocarbonos en diversas tecnologías de diagnóstico de imagen tales como ultrasonidos, resonancia magnética, radiografía y tomografía computerizada se ha descrito en un artículo de Mattery [véase SPIE, 626, XIV/PACS IV, 18-23 (1986)]. El uso de flúor es ventajoso porque el flúor no se encuentra de forma natural en del cuerpo.
Las sugerencias en la técnica anterior de compuestos que contienen flúor útiles para la obtención de imágenes por resonancia magnética con propósitos de diagnóstico médico se limitan a un grupo seleccionado de moléculas que contienen flúor que son solubles en agua o pueden formar emulsiones. Por consiguiente, el uso en la técnica anterior de emulsiones de fluorocarbonos de fluorocarbonos acuosos solubles tiene varias desventajas, por ejemplo, 1) el uso de emulsiones inestables, 2) la falta de especificidad y de administración específica a órganos, 3) el potencial para inducir reacciones alérgicas debido al uso de emulsionantes y tensioactivos (por ejemplo, fosfatidas de huevo y lecitina de yema de huevo), 4) capacidades de administración limitadas, y 5) los fluorocarbonos solubles en agua se diluyen rápidamente en la sangre después de una inyección intravenosa.
Breve descripción de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones útiles para la administración in vivo de compuestos biológicos, en forma de micropartículas adecuadas para la administración parenteral en suspensión acuosa. Las composiciones de la invención comprenden un compuesto biológico (en forma de sólido o líquido) asociado con un recubrimiento polimérico. El recubrimiento polimérico es un material biocompatible, reticulado por medio de enlaces disulfuro. El uso de las composiciones de la invención para la administración de compuestos biológicos obvia la necesidad de administración de compuestos biológicos en una emulsión que contiene, por ejemplo, etanol y aceite de ricino polietoxilado, diluido en solución salina normal (véase, por ejemplo, Norton et al., en Abstracts of the 2nd National Cancer Institute Workshop on Taxol & Taxus, 23-24 de septiembre, 1992). Una desventaja de tales composiciones conocidas es su propensión a producir efectos secundarios alérgicos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para encapsular compuestos biológicos en un recubrimiento polimérico. Aún más de acuerdo con la presente invención se proporcionan medios para obtener datos locales de oxígeno y temperatura y para obtener imágenes de por resonancia magnética con flúor de órganos y tejidos del cuerpo.
La administración de compuestos biológicos en forma de una suspensión microparticulada permite algún grado de administración específica a órganos tales como el hígado, pulmones, bazo, circulación linfática y similares, mediante el uso de partículas de distinto tamaño y mediante la administración por distintas vías. El método de administración de la invención permite adicionalmente la administración de compuestos biológicos, tales como agentes farmacológicamente activos sustancialmente insolubles en agua, empleando un volumen mucho menor de líquido y necesitando un tiempo de administración mucho menor en relación con los volúmenes y tiempos de administración requeridos por los sistemas de administración de la técnica anterior (por ejemplo, se requiere una infusión intravenosa de aproximadamente uno a dos litros de líquido durante un periodo de 24 horas para administrar una dosis humana típica de 200-400 mg de taxol).
Por ejemplo, puede administrarse de forma intravenosa una suspensión de recubrimientos poliméricos de la invención, haciendo posible la obtención de imágenes de órganos vascularizados (por ejemplo, hígado, bazo, vasos linfáticos y pulmones) y de médula ósea. La especificidad de órgano se consigue como resultado de la absorción de los recubrimientos poliméricos que contienen organoflúor con un tamaño de micrómetros en el sistema reticuloendotelial (RES) (también conocido como sistema de fagocito mononuclear (MNP)). Los órganos tales como el hígado y el bazo juegan un papel importante al retirar especies extrañas (por ejemplo, materia particulada) del flujo sanguíneo y por lo tanto se denominan habitualmente "órganos de filtración de la sangre". Estos órganos suponen una gran parte del RES. Además, los nódulos linfáticos dentro de la circulación linfática contienen células del RES. Por consiguiente, es posible obtener imágenes del sistema linfático empleando recubrimientos poliméricos que contienen organoflúor con un tamaño de micrómetros de la presente invención. Administrado por vía oral o como supositorio, puede realizarse la obtención de imágenes del estómago y del tracto gastrointestinal. Tales suspensiones también pueden inyectarse en un espacio no vascular, tal como la cavidad cerebro-espinal, permitiendo también la obtención de imágenes de tal espacio.
La presente invención supera las desventajas de la técnica anterior proporcionando 1) suspensiones inyectables de recubrimientos poliméricos que contienen un compuesto biológico, 2) compuestos biológicos en una forma que tiene una mejor estabilidad en comparación con emulsiones simples, 3) especificidad de órganos (por ejemplo, hígado, bazo, pulmón y similares) debido a la absorción de los recubrimientos poliméricos de la invención por el sistema RES o MNP, 4) un sistema sin emulsionantes, evitando por tanto agentes que pueden causar potencialmente reacciones alérgicas, y 5) la capacidad de inyectar dosis relativamente pequeñas de compuesto biológico y conseguir todavía una buena respuesta debido a que los recubrimientos poliméricos que contienen un compuesto biológico de la invención pueden dirigirse a un órgano específico.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una representación esquemática de un recubrimiento polimérico preparado de acuerdo con la presente invención. En la figura, A se refiere al recubrimiento polimérico insoluble reticulado con enlaces disulfuro, B se refiere al interior del recubrimiento polimérico, que puede contener un fluorocarbono que contiene oxígeno disuelto, un aceite biocompatible con compuesto biológico disuelto en medio acuoso, una suspensión de partículas sólidas dispersas en un líquido y similares, C designa el espesor del recubrimiento polimérico, típicamente aproximadamente 5-50 nanometros y D se refiere al diámetro del recubrimiento polimérico, típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 hasta 20 \mum.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones para la administración in vivo de un compuesto biológico,
donde dicho compuesto biológico se selecciona entre:
un sólido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso, contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico,
un líquido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso, contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico,
o mezclas de los dos,
donde la mayor dimensión transversal de dicho recubrimiento no es mayor de 10 micrómetros,
donde dicho recubrimiento polimérico comprende un material biocompatible que está sustancialmente reticulado por medio de enlaces disulfuro, y
donde el exterior de dicho recubrimiento polimérico está opcionalmente modificado con un agente adecuado, donde dicho agente está unido a dicho recubrimiento polimérico mediante un enlace covalente opcional.
Como se usa en este documento, la expresión "administración in vivo" se refiere a la administración de un compuesto por vías de administración tales como oral, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, intracraneal, por inhalación, tópica, transdérmica, supositorio (rectal), pesario (vaginal) y similares.
Como se usa en este documento, el término "compuesto biológico" se refiere a agentes farmacéuticamente activos (tales como agentes analgésicos, agentes anestésicos, agentes anti-asmáticos, antibióticos, agentes anti-depresivos, agentes anti-diabéticos, agentes anti-hongos, agentes anti-hipertensores, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-neoplásicos, agentes ansiolíticos, agentes enzimáticamente activos, construcciones de ácido nucleico, agentes inmunoestimuladores, agentes inmunosupresores, gases fisiológicamente activos, vacunas y similares), agentes de diagnóstico (tales como agentes de contraste de ultrasonidos, agentes de radiocontraste o agentes de contraste magnético), agentes con valor nutricional y similares.
Como se usa en este documento, el término "micrómetro" se refiere a una unidad de medida de una milésima de milímetro.
Pueden emplearse diversos materiales biocompatibles en la práctica de la presente invención para la formación de un recubrimiento polimérico. Como se usa en este documento, el término "biocompatible" describe una sustancia que no altera o afecta de forma apreciable de forma adversa, el sistema biológico en el que se introduce. Esencialmente, cualquier material, natural o sintético, que tenga grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro dentro de su estructura, puede utilizarse para la preparación de un recubrimiento reticulado con disulfuros. Los grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro pueden existir anteriormente dentro de la estructura del material biocompatible o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada. Por ejemplo, materiales biocompatibles de origen natural tales como proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, polinucleótidos, polisacáridos (por ejemplo, almidón, celulosa, dextranos, alginatos, quitosano, pectina, ácido hialurónico y similares), lípidos, etc. son candidatos para tal modificación. También pueden formarse otros enlaces, tales como ésteres, amidas, éteres y similares durante la etapa de irradiación ultrasónica (siempre que los grupos funcionales requeridos estén presentes en el material de partida).
Como ejemplos de materiales biocompatibles adecuados, pueden emplearse proteínas de origen natural o sintéticas, siempre que tales proteínas tengan suficientes grupos sulfhidrilo o disulfuro de forma que la reticulación (mediante la formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, como resultado de la oxidación durante la irradiación ultrasónica) pueda tener lugar. Los ejemplos de proteínas adecuadas incluyen albúmina (que contienen 35 restos cisteína), insulina (que contiene 6 cisteínas), hemoglobina (que contiene 6 restos cisteína por unida \alpha_{2}\beta_{2}), lisozima (que contiene 8 restos cisteína), inmunoglobulinas, \alpha-2-macroglobulina, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno y similares, así como combinaciones de cualquiera dos o más de las mismas.
Una proteína preferida actualmente para el uso en la formación de un recubrimiento polimérico es la albúmina. Otra proteína preferida actualmente para el uso en la formación de un recubrimiento polimérico es la hemoglobina. Otra proteína más preferida actualmente para el uso en la formación de un recubrimiento polimérico es una combinación de albúmina y hemoglobina. Opcionalmente, proteínas tales como \alpha-2-macroglobulina, una conocida opsonina, podrían usarse para potenciar la absorción de las partículas de compuesto biológico contenidas en el recubrimiento por macrófagos o potenciar la absorción de las partículas de compuesto biológico contenidas en el recubrimiento en el hígado y bazo. Otras proteínas funcionales, tales como anticuerpos o enzimas, que podrían facilitar la unión específica del compuesto biológico en un sitio deseado, pueden usarse en la formación del recubrimiento polimérico.
De forma similar, los polipéptidos sintéticos que contienen grupos sulfhidrilo o disulfuro también son buenos candidatos para la formación de partículas que tienen un recubrimiento polimérico. Además, los polialquilenglicoles (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada), alcohol polivinílico, metacrilato de polihidroximetilo, ácido poliacrílico, polietiloxazolina, poliacrilamida, polivinil pirrolidona y similares, son buenos candidatos para la modificación química (para introducir enlaces sulfhidrilo y/o disulfuro) y formación del recubrimiento (provocando la reticulación del mismo).
En la preparación de las composiciones de la invención, se emplea un agente de dispersión no acuoso para suspender o disolver el compuesto biológico. Los agentes de dispersión contemplados para el uso en la práctica de la presente invención incluyen cualquier líquido capaz de suspender o disolver un compuesto biológico, pero que no reacciona químicamente con el polímero empleado para producir el recubrimiento o con el compuesto biológico. Los ejemplos incluyen aceites vegetales (por ejemplo aceite de soja, aceite mineral, aceite de maíz, aceite de colza, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de cartamo, aceite de semilla de algodón y similares), hidrocarburos alifáticos, cicloalfifáticos o aromáticos que tienen 4-30 átomos de carbono (por ejemplo n-dodecano, n-decano, n-hexano, ciclohexano, tolueno, benceno y similares), alcoholes alifáticos o aromáticos que tienen 1-30 átomos de carbono (por ejemplo, octanol y similares), ésteres alifáticos o aromáticos que tienen 2-30 átomos de carbono (por ejemplo carilato de etilo (octanoato) y similares), alquilo, arilo o ésteres cíclicos que tienen 2-30 átomos de carbono (por ejemplo, éter dietílico, tetrahidrofurano y similares, haluros de arilo o alquilo que tienen 1-30 átomos de carbono (y opcionalmente más de un sustituyente halógeno, por ejemplo, CH_{3}Cl, CH_{2}Cl_{2}, CH_{2}Cl-CH_{2}Cl y similares), cetonas que tienen 3-30 átomos de carbono (por ejemplo, acetona, metil etil cetona y similares), polialquilenglicoles (por ejemplo, polietilenglicol y similares) o combinaciones de dos o mas de los mismos.
Se prefieren especialmente las combinaciones de agentes de dispersión que incluyen líquidos volátiles tales como diclorometano, acetato de etilo, benceno y similares (es decir, disolventes que tienen un alto grado de solubilidad para el agente farmacológicamente activo y son solubles en el otro agente de dispersión empleado) junto con un agente de dispersión menos volátil. Cuando se añade al otro agente de dispersión, estos aditivos volátiles ayudan a conducir la solubilidad del agente farmacológicamente activo al agente de dispersión. Esto es deseable ya que esta etapa consume habitualmente mucho tiempo. Después de la disolución, el componente volátil puede retirarse por evaporación (opcionalmente al vacío).
Las partículas de compuesto biológico contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico, o asociadas con el mismo, preparadas como se describe en este documento, se administran en forma de una suspensión en un medio biocompatible. Este medio puede seleccionarse entre agua, medio acuoso tamponado, solución salina, solución salina tamponada, soluciones opcionalmente tamponadas de aminoácidos, soluciones opcionalmente tamponadas de azúcares, soluciones opcionalmente tamponadas de carbohidratos, soluciones opcionalmente tamponadas de vitaminas, soluciones opcionalmente tamponadas de polímeros sintéticos, emulsiones que contienen líquidos y similares.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona un método para la preparación de un compuesto biológico para la administración in vivo, comprendiendo dicho método someter al medio que contiene material biocompatible que puede reticularse con enlaces disulfuro a condiciones ultrasónicas de alta intensidad durante un tiempo suficiente para reticular dicho material biocompatible sustancialmente con enlaces disulfuro.
donde dicho compuesto biológico está completamente contenido dentro de un recubrimiento polimérico,
donde la mayor dimensión transversal de dicho recubrimiento no es mayor de 10 micrómetros, y
donde el compuesto biológico es un sólido o líquido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso.
De esta forma, de acuerdo con la presente invención, los compuestos biológicos contenidos dentro de los recubrimientos poliméricos se sintetizan usando ultrasonidos de alta intensidad. Dos procesos acústicos no lineales están implicados en la formación de recubrimientos poliméricos estables (es decir, emulsión y cavitación acústicas). Primero, la emulsión acústica dispersa el compuesto biológico en la solución proteica acuosa. Después, la dispersión formada se reticula químicamente y se estabiliza por formación de enlaces disulfuro. Los enlaces disulfuro se forman con los restos cisteína (en el caso de que el polímero sea una proteína tal como albúmina) que se oxidan con superóxido producido mediante cavitación acústica.
La suspensión resultante se filtra opcionalmente a través de filtros centricon (corte de 100 kDa) y las construcciones filtradas o microburbujas se resuspenden en solución salina normal o un tampón adecuado. La Figura 1 muestra una representación esquemática de tal construcción. El diámetro medio de estas construcciones es de aproximadamente 2 micrómetros. La distribución del tamaño de partícula, determinada con un contador de partículas Elzone, parece ser bastante estrecha (se observa típicamente una distribución gaussiana con un diámetro medio de 3 micrómetros). El intervalo de tamaño de las partículas obtenidas con esta técnica está entre 0,1 micrómetro y 20 micrómetros. Un intervalo de tamaño preferido es de 0,5 a 10 micrómetros y el intervalo más preferido es de 1 a 5 micrómetros. Este tamaño es ideal para aplicaciones médicas, ya que pueden realizarse inyecciones intravenosas o intraarteriales sin riesgo de bloqueo de vasos sanguíneos pequeños y posterior daño al tejido (isquemia debida a la privación de oxígeno). Como comparación, los glóbulos rojos normales tienen un diámetro de aproximadamente 8 micrómetros.
Una característica no obvia del proceso descrito anteriormente es la elección del agente de dispersión, específicamente con respecto a la polaridad del agente de dispersión. La formación de un recubrimiento alrededor de las partículas de compuesto biológico implica la reorientación del material biocompatible en la interfaz entre las fases acuosa y no acuosa de forma que las regiones hidrófilas del material biocompatible están expuestas a la fase acuosa mientras que las regiones hidrófobas del material biocompatible están orientadas hacia la fase no acuosa. En el caso de que el material biocompatible sea una proteína, para realizar el despliegue o cambiar la conformación de la misma, debe suministrarse energía al polímero. La energía libre de la interfaz (tensión interfacial) entre las dos fases líquidas (es decir, acuosa y no acuosa) contribuye a los cambios en la conformación de la proteína en dicha interfaz. La energía térmica también contribuye a la energía total que se necesita para el despliegue y/o cambio de conformación de la proteína.
La entrada de energía térmica es una función de variables tales como la potencia acústica empleada en el proceso de irradiación ultrasónico de alta intensidad, el tiempo de irradiación ultrasónica a alta intensidad, la naturaleza del material que se somete a la irradiación ultrasónica de alta intensidad, el volumen del material que se somete a irradiación ultrasónica de alta intensidad y similares. La potencia acústica de los procesos de irradiación ultrasónica de alta intensidad puede variar ampliamente, incluyéndose típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 1000 watios/cm^{2}; prefiriéndose actualmente una potencia acústica en el intervalo de aproximadamente 50 hasta 200 watios/cm^{2}. De forma similar, el tiempo de exposición a irradiación ultrasónica de alta intensidad puede variar ampliamente, incluyéndose típicamente en el intervalo de unos pocos segundos a aproximadamente 5 minutos. Preferiblemente, el tiempo de exposición a irradiación ultrasónica de alta intensidad estará dentro del intervalo de aproximadamente 15 hasta 60 segundos. Los especialistas en la técnica reconocerán que cuanto mayor sea la potencia acústica aplicada, menos tiempo de exposición a irradiación ultrasónica de alta intensidad se necesita y viceversa.
La energía libre de la interfaz es directamente proporcional a la diferencia de polaridad entre los dos líquidos. De esta forma, a una temperatura dada, es esencial un mínimo de energía libre en la interfaz entre los dos líquidos para formar el recubrimiento polimérico deseado. De esta forma, si se toma una serie homóloga se agentes de dispersión con un cambio gradual en la polaridad, por ejemplo, ésteres etílicos de ácidos alcanoicos, entonces los homólogos mayores son cada vez más apolares, es decir, la tensión de la interfaz entre estos agentes de dispersión y el agua aumenta según aumenta el número de átomos de carbono en el éster. De esta forma, se descubre que aunque el acetato de etilo es inmiscible en agua (es decir, un éster de un ácido de 2 carbonos), a temperatura ambiente (\sim20ºC), este agente de dispersión en solitario no dará un rendimiento significativo de partículas recubiertas con recubrimiento polimérico. Por el contrario, un éster superior tal como octanoato de etilo (éster de un ácido de 8 carbonos) da partículas recubiertas con recubrimiento polimérico con un alto rendimiento. De hecho, el heptanoato de etilo (éste de un ácido de 7 carbonos) da un rendimiento moderado mientras que los ésteres inferiores (ésteres de ácidos de 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono) dan un rendimiento pobre. De esta forma, a una temperatura dada, se puede fijar una condición sobre la tensión interfacial mínima con el agente de dispersión acuoso requerida para la formación de partículas recubiertas con recubrimiento polimérico con altos rendimientos.
La temperatura es otra variable que puede manipularse para afectar al rendimiento de partículas recubiertas con recubrimiento polimérico. En general, la tensión superficial de un líquido disminuye con un aumento de temperatura. La velocidad de cambio de la tensión superficial es normalmente distinta para distintos líquidos. De esta forma, por ejemplo, la tensión de interfaz (\Delta\gamma) entre dos líquidos puede ser \Delta\gamma_{1} a la temperatura T_{1} y \Delta\gamma_{2} a la temperatura T_{2}. Si \Delta\gamma_{1} a T_{1} está cerca del mínimo requerido para formar los recubrimientos poliméricos de la presente invención, y si \Delta\gamma_{2} (a temperatura T_{2}) es mayor que \Delta\gamma_{1}, entonces un cambio de temperatura de T_{1} a T_{2} aumentará el rendimiento de los recubrimientos poliméricos. Esto, de hecho, se observa en el caso del heptanoato de etilo, que da un rendimiento moderado a 20ºC pero un alto rendimiento a 10ºC.
La temperatura también afecta a la presión de vapor de los líquidos empleados. Cuanto menor sea la temperatura, menor es la presión de vapor total. Cuando menor es la presión de vapor total, más eficaz es el colapso de la burbuja de cavitación. Un colapso más eficaz de la burbuja de irradiación ultrasónica está correlacionado con un aumento de la velocidad de formación de superóxido (HO_{2}^{-}). El aumento de la velocidad de formación de superóxido conduce a un aumento del rendimiento de los recubrimientos poliméricos a menores temperaturas. Sin embargo, como compensación, la velocidad de reacción de la oxidación de los grupos sulfhidrilo (es decir, para formar enlaces disulfuro) con los iones de superóxido aumenta al aumentar la temperatura. Por lo tanto, para un líquido dado sometido a condiciones de irradiación ultrasónica, existe un intervalo relativamente estrecho de temperaturas óptimas de trabajo con las que se obtiene un alto rendimiento de recubrimientos poliméricos.
De esta forma, una combinación de dos efectos, es decir, el cambio en la tensión superficial con la temperatura (lo que afecta directamente al despliegue y/o cambios conformacionales del polímetro) y el cambio en el rendimiento de la reacción (siendo la reacción la reticulación del polímero mediante la formación de enlaces disulfuro) con la temperatura dicta la conversión global o rendimiento de partículas recubiertas con recubrimiento polimérico. Las temperaturas adecuadas para la preparación de recubrimientos poliméricos de la invención se incluyen en el intervalo de aproximadamente 0-80ºC.
El proceso de irradiación ultrasónica descrito anteriormente puede manipularse para producir compuestos biológicos que contienen partículas recubiertas con el recubrimiento polimérico en un intervalo de tamaños. Los radios de partícula preferidos actualmente están en el intervalo de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 micrómetros. Una distribución de tamaño estrecha en este intervalo es muy adecuada para la administración intravenosa de compuestos biológicos. Las partículas recubiertas con el recubrimiento polimérico se suspenden preferiblemente en un medio biocompatible (como se ha descrito en este documento) antes de la administración por los medios adecuados.
Además, el recubrimiento polimérico puede modificarse con un agente adecuado, asociándose el agente con el recubrimiento polimérico mediante un enlace covalente opcional. Los enlaces covalentes contemplaos para tales enlaces incluyen enlaces éster, éter, uretano, diéster, amida, amina secundaria o terciaria, éster fosfato, éster sulfato y similares. Los agentes adecuados contemplados para esta modificación opcional del recubrimiento polimérico incluyen polímeros sintéticos (polialquilenglicoles (por ejemplo, polietilenglicol lineal o ramificado), alcohol de polivinilo, polihidroxietil metacrilato, ácido poliacrílico, polietiloxazolina, poliacrilamida, polivinilpirrolidona y similares), fosfolípidos (tales como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), esfingomielina y similares), proteínas (tales como enzimas, anticuerpos y similares), polisacáridos (tales como almidón, celulosa, dextranos, alginatos, quitosano, pectina, ácido hialurónico y similares), agentes de modificación química (tales como 5'-fosfato de piridoxal, derivados de piridoxal, dialdehídos, ésteres de diaspirina y similares), o combinaciones de dos o mas de los mismos.
Las variaciones sobre el tema general de compuestos biológicos disueltos incluidos en un recubrimiento polimérico son posibles. Se podría usar una suspensión de partículas finas de compuesto biológico en un agente de dispersión biocompatible (en lugar de un agente de dispersión biocompatible que contiene un compuesto biológico disuelto) para producir un recubrimiento polimérico que contiene partículas del compuesto biológico suspendidas en un agente de dispersión. En otras palabras, el recubrimiento polimérico podría contener una solución saturada de compuesto biológico en un agente de dispersión. Otra variación es un recubrimiento polimérico que contiene un núcleo sólido de compuesto biológico producido disolviendo inicialmente el compuesto biológico en un disolvente orgánico volátil (por ejemplo, benceno), formando el recubrimiento polimérico y evaporando el disolvente volátil al vacío, por ejemplo, en un evaporador rotatorio o liofilizando toda la suspensión. Esto da como resultado una estructura que tiene un núcleo sólido de compuesto biológico rodeado de un recubrimiento de polímero. Este último método es particularmente ventajoso para administrar altas dosis de compuesto biológico en un volumen relativamente pequeño. En algunos casos, el material biocompatible que forma el recubrimiento alrededor del núcleo puede ser un agente terapéutico o de diagnóstico, por ejemplo, en el caso de la insulina, que puede administrarse como parte de un recubrimiento polimérico formado con el proceso de irradiación ultrasónica descrito anteriormente. En otros casos, el polímero que forma el recubrimiento podría participar en la administración de un compuesto biológico, por ejemplo, en el caso de la hemoglobina, que puede administrarse como parte de un recubrimiento polimérico formara con el proceso de irradiación ultrasónica descrito anteriormente, proporcionando por tanto un sustituto de la sangre con una alta capacidad de unión al oxígeno.
Las variaciones en el recubrimiento polimérico también son posibles. Por ejemplo, se puede incluir una pequeña cantidad de PEG que contiene grupos sulfhidrilo en el polímero. Tras la exposición a la irradiación ultrasónica, el PEG se reticula en el polímero y forma un componente del recubrimiento polimérico. Como alternativa, el PEG puede unirse al recubrimiento polimérico después de la precipitación del recubrimiento (en lugar de incluirse como parte del medio con el que se prepara el recubrimiento).
El PEG es conocido por su carácter no adhesivo y se ha unido a proteínas y enzimas para aumentar su tiempo de circulación in vivo [Abuchowski et al., J. Biol. Chem. Vol. 252:3578 (1977)]. El PEG también se ha unido a fosfolípidos que forman la bicapa lipídica en liposomas para reducir su absorción y prolongar sus vidas in vivo [Klibanov et al., FEBS Letters Vol. 268:235 (1990)]. De esta forma, la incorporación de PEG en las paredes de recubrimientos proteicos reticulados altera su tiempo de circulación en la sangre. Esta propiedad puede utilizarse para mantener mayores niveles de compuesto biológico en sangre y tiempos de liberación prolongados para el compuesto biológico.
Los derivados electrófilos de PEG son útiles para la modificación del recubrimiento polimérico, incluyendo PEG-imidazoles, succinimidil succinatos, nitrofenil carbonatos, tresilatos y similares; derivados nucleófilos de PEG incluyendo PEG-aminas, ésteres de aminoácidos, hidrazidas, tioles y similares. El recubrimiento polimérico modificada con PEG se espera que persista en la circulación durante periodos más largos que sus homólogos no modificados. La modificación del recubrimiento polimérico con PEG puede realizarse antes de la formación del recubrimiento o después de la formación del mismo. La técnica preferida actualmente es modificar el recubrimiento polimérico después de la formación del mismo. Otros polímeros, incluyendo dextrano, alginatos, hidroxietilalmidón y similares, pueden utilizarse en la modificación del recubrimiento polimérico.
Además, son posibles varias variaciones. Por ejemplo, puede cambiarse el agente de dispersión dentro del recubrimiento polimérico, puede utilizarse una gran diversidad de compuestos biológicos y puede utilizarse un amplio intervalo de proteínas así como otros polímeros sintéticos y naturales en la formación de las paredes del recubrimiento polimérico. Las aplicaciones también tienen un intervalo bastante amplio. Además de las aplicaciones biomédicas tales como la administración de fármacos, los agentes de diagnóstico (en aplicaciones de obtención de imágenes), sangre artificial (hemoglobina reticulada sonoquímicamente) y agentes nutricionales parenterales, las estructuras del recubrimiento polimérico de la invención pueden incorporarse en aplicaciones cosméticas tales como cremas para la piel o productos de cuidado capilar, en aplicaciones de perfumería, en tintas sensibles a la presión, pesticidas y similares.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los recubrimientos poliméricos preparadas como se ha descrito anteriormente se usan para la administración in vivo de compuestos biológicos, tales como agentes farmacéuticamente activos, agentes de diagnóstico o agentes con valor nutricional. Los ejemplos de agentes farmacológicamente activos contemplados para usar en la práctica de la presente invención incluyen agentes analgésicos (por ejemplo, acetominofeno, aspirina, ibuprofeno, morfina y derivados de la misma y similares), agentes anti-asmáticos (por ejemplo, azelastina, ketotifeno, traxanox y similares), antibióticos (por ejemplo, neomicina, estreptomicina, cloranfenicol, cefalosporina, ampicilina, penicilina, tetraciclina y similares), agentes anti-depresivos (por ejemplo, nefopam, oxipertina, imipramina, trazadona y similares), agentes anti-diabéticos (por ejemplo, biguanidinas, hormonas, derivados de sulfonilurea y similares), agentes anti-fúngicos (por ejemplo anfotericina B, nistatina, candicidina y similares), agentes anti-hipertensores (por ejemplo, propanolol, propafenona, oxiprenolol, nifedipina, reserpina y similares), agentes anti-inflamatorios esteroideos (por ejemplo, cortisona, hidrocortisona, dexametasona, prednisolona, predniona, fluazacort y similares), agentes anti-inflamatorios no esteroideos (por ejemplo, indometacina, ibuprofeno, ramifenizona, piroxicam y similares), agentes anti-neoplásicos (por ejemplo, adriamicina, ciclofosfamida, actinomicina, bleomicina, duanorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina, metotrexato, fluorouracil, carboplatino, carmustina (BCNU), cisplatino, etoposido, interferones, fenesterina, análogos y profármacos de paclitaxel, taxanos y otros fármacos similares a paclitaxel, por ejemplo Taxotere y similares), camptotecina y derivados de la misma (compuestos prometedores para el tratamiento de cáncer de colon), vinblastina, vincristina, así como agentes anti-neoplásicos hormonales tales como estrógenos, progestógenos, tamoxifeno y similares), agentes ansiolíticos (por ejemplo, dantroleno, diazepam y similares), agentes enzimáticamente activos (por ejemplo, ADNasa, ribozimas y similares), construcciones de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de codificación de IGF-1, secuencia de codificación del Factor VIII, secuencia de codificación del Factor IX, secuencias de nucleótidos antisentido y similares), agentes inmunoestimuladores (es decir, interleucinas, interferones, vacunas y similares), agentes inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina (CsA), azatioprina, mizorobina, FK506, prednisona y similares), así como otros agentes farmacológicamente activos tales como cimetidina, mitotano, visadina, halonitrosoureas, antraciclinas, elipticina, benzocaína, barbituratos y similares.
Los ejemplos de agentes de diagnóstico contemplados para el uso en la práctica de la presente invención incluyen agentes de contraste ultrasónicos, agentes de radiocontraste (por ejemplo, yodo-octanos, halocarbonos, renografina y similares), agentes de contraste magnético (por ejemplo, fluorocarbonos, compuestos paramagnéticos solubles en lípidos), GdDTPA, compuestos paramagnéticos acuosos y similares), así como otros agentes.
Los ejemplos de agente con valor nutricional contemplados para el uso en la práctica de la presente invención incluyen aminoácidos, azúcares, proteínas, carbohidratos, vitaminas liposolubles (por ejemplo, vitaminas A, D, E, K y similares) o grasas, o combinaciones de dos o más de los mismos.
Las diferencias clave entre el recubrimiento polimérico que contiene un compuesto biológico de la invención y las microesferas de proteínas de la técnica anterior están en la naturaleza de la formación y el estado final de la proteína después de la formación del recubrimiento polimérico y en su capacidad para transportar agentes poco solubles en agua o sustancialmente insolubles en agua. De acuerdo con la presente invención, el polímero (por ejemplo, una proteína) se reticula químicamente de forma selectiva mediante la formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, con los restos cisteína que existen en la estructura natural de varias proteínas. Se usa un proceso de irradiación ultrasónica para dispersar un agente de dispersión que contiene un compuesto biológico disuelto o suspendido en una solución acuosa de un material biocompatible con grupos sulfhidrilo o disulfuro (por ejemplo, albúmina) por lo que se forma un recubrimiento de polímero reticulado alrededor de pequeños gránulos de medio no acuoso. El proceso de irradiación ultrasónica produce cavitación en el líquido que provoca un intenso calor local y tiene como resultado la formación de iones superóxido que reticulan el polímero oxidando los restos sulfhidrilo (y/o rompiendo los enlaces disulfuro existentes) para formar nuevos enlaces disulfuro para la reticulación.
Al contrario que el proceso de la invención, el método de la técnica anterior de reticulación con glutaraldehído no es específico y es reactivo esencialmente con cualquier grupo nucleófilo presente en la estructura de la proteína (por ejemplo, aminas, sulfhidrilos e hidroxilos). La desnaturalización por calor descrita en la técnica anterior altera de forma significativa e irreversible la estructura de la proteína. Por el contrario, la formación de disulfuro contemplada en la presente invención es muy específica y no desnaturaliza sustancialmente la proteína. Además, las partículas o gránulos de compuesto biológico contenidos dentro de un recubrimiento polimérico difieren de las microesferas de proteínas reticuladas o desnaturalizadas por calor de la técnica anterior porque el recubrimiento polimérico producida por el proceso de la invención es relativamente fino en comparación con el diámetro de la partícula recubierta. Se ha determinado (por microscopia de transmisión de electrones) que el "espesor del recubrimiento" del recubrimiento polimérico es de aproximadamente 25 nanometros para una partícula recubierta con un diámetro de 1 micrómetro (1000 nanometros). Por el contrario, las microesferas de la técnica anterior no tiene tienen recubrimientos de proteínas, sino que en su lugar, tienen la proteína dispersa en todo el volumen de la microesfera.
El recubrimiento polimérico que contiene núcleos sólidos o líquidos de compuesto biológico permite la administración de altas dosis de compuesto biológico en volúmenes relativamente pequeños. Esto minimiza la incomodidad del paciente al recibir grandes volúmenes de líquido y minimiza la estancia en el hospital. Además, las paredes del recubrimiento polimérico son generalmente completamente degradables in vivo con enzimas proteolíticas (por ejemplo, cuando el polímero es una proteína), dando como resultado la ausencia de efectos secundarios producidos por el sistema de administración, como es el caso frecuentemente con las formulaciones actuales.
De acuerdo con esta realización de la presente invención, los gránulos o partículas de compuesto biológico están contenidas dentro de un recubrimiento que tiene un diámetro transversal no mayor de aproximadamente 10 micrómetros. Se prefiere más un diámetro transversal menor de 5 micrómetros, aunque un diámetro de aproximadamente 2 micrómetros es actualmente el más preferido para la vía de administración intravenosa.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se ha descubierto que los recubrimientos poliméricos descritos en este documento, cuando se preparan con hemoglobina, tienen una capacidad de unión al oxígeno sorprendentemente alta y por lo tanto son útiles como sustitutos de la sangre. La hemoglobina (Lehninger, en Biochemistry, Worth Publishers, Inc., New York, pág. 145-149, 1975) es una proteína con un peso molecular de 64.500 que consiste en un tetrámero (dos cadenas \alpha y dos cadenas \beta). Cada cadena \alpha y \beta se une a un residuo hemo con un enlace no covalente. Las cadenas \alpha y \beta también se mantienen juntas mediante enlaces no covalentes resultantes de los enlaces de hidrógeno y de las fuerzas de van der Waals. Los cuatro grupos hemo, uno en cada subunidad, pueden unirse a cuatro moléculas de oxígeno. Estos grupos hemo planos contienen un átomo de hierro que tiene una coordinación cuadrada-plana. Los cuatro grupos hemo están situados relativamente lejos entre sí en la molécula intacta.
La interacción o cooperación de las unidades hemo en la unión del oxígeno aumenta en gran medida la capacidad de unión a oxígeno de cada unidad hemo en la molécula tetramérica de hemoglobina. En general, se esperaría que una unidad hemo aislada se uniese a una única molécula de oxígeno. Sin embargo, las unidades hemo vecinas de la molécula de hemoglobina cooperan para aumentar el oxígeno unido por unidad hemo. Esta cooperación se describe en términos del "Coeficiente de Hill" cuyo valor refleja la cantidad de sitios de unión a oxígeno en interacción. En el caso de la hemoglobina nativa, el coeficiente de Hill es aproximadamente 2,8.
La hemoglobina soluble constituye aproximadamente el 90% de la proteína total en glóbulos rojos. 100 ml de sangre entera pueden absorber aproximadamente 21 ml de oxígeno gaseoso debido a la capacidad de unión de la hemoglobina. Igualmente importante que la unión al oxígeno, la hemoglobina también es eficaz en la liberación del oxígeno unido a los tejidos. La capacidad de la hemoglobina para unirse y liberar oxígeno se expresa habitualmente de forma cuantitativa como P_{50} (o P_{1/2}). Por ejemplo, el P_{50} de la sangre entera, es decir, la presión parcial de oxígeno que tiene como resultado una saturación del cincuenta por ciento en la hemoglobina, es aproximadamente 28 mm
Hg.
La relación entre la presión parcial de oxígeno y el porcentaje de saturación de la hemoglobina puede representarse como una curva sigmoidal, cuya posición se ve afectada por el pH (el efecto Bohr). Cuando mayor es el pH de la solución de hemoglobina a una presión parcial de oxígeno dada, mayor es el porcentaje de saturación con oxígeno y menor es la P_{50}; La curva de saturación con oxígeno se inclina a la izquierda en la abscisa. Inversamente, cuando menor es el pH de la solución de hemoglobina, menor es el porcentaje de saturación con oxígeno y mayor es la P_{50}; la curva de saturación con oxígeno se inclina a la derecha en la abscisa. De esta forma, según se mueve la hemoglobina del pH relativamente alcalino de los pulmones al pH relativamente ácido de tejidos pobres en oxígeno (produciendo ácido láctico por la respiración anaeróbica), la molécula de hemoglobina tendrá una tendencia a liberar su carga de oxígeno. De esta forma, en general, la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno cambia en dirección opuesta a la de la P_{50} de la hemoglobina.
Las modificaciones de la molécula de hemoglobina o de su conformación pueden asociarse con cambios en la afinidad de unión al oxígeno. Por ejemplo, la asociación con 2,3-difosfo-glicerato (2,3-DPG, como ocurre dentro de la RBC) reduce la asociación entre oxígeno y hemoglobina, facilitando la liberación de oxígeno a los tejidos; los niveles en suero de 2,3-DPG aumentan en condiciones fisiológicas en las cuales es deseable una mayor liberación de oxígeno, por ejemplo, en altas altitudes y durante el embarazo. La oxidación del ión hierro en el grupo prostético hemo de Fe(II) a Fe(III) tiene como resultado la formación de methemoglobina (met-Hb), que se une al agua de forma tan fuerte que impide la transferencia de oxígeno. Esta oxidación o "auto-oxidación" es un proceso continuo in vivo que se mantiene mediante un sistema de enzimas redox dentro de los glóbulos rojos.
La hemoglobina, la proteína para el transporte y administración de oxígeno, puede separarse de las membranas de la pared del glóbulo rojo o estroma (el estroma contiene los antígenos específicos que determinan el tipo de sangre) y de otras células y componentes del plasma. Si se realiza tal separación y aislamiento, la hemoglobina sin estroma resultante no contiene materiales antigénicos; de esta forma, el tipo y la concordancia de sangre ya no son necesarios.
Se ha descubierto que la hemoglobina sin estroma (SFH), fuera del entorno del glóbulo rojo, muestra una propensión a unirse al oxígeno demasiado fuertemente (una baja P_{50}) y también una vida media en circulación corta después de la transfusión. La baja P_{50},que refleja una inclinación a la izquierda en la curva de unión a oxígeno de la hemoglobina, era, en parte, una consecuencia de la exposición de hemoglobina sin estroma a un mayor pH en el plasma (7,4) que el experimentado dentro del eritrocito (7,2); además, la asociación natural entre hemoglobina y 2,3-difosfoglicerato se destruyó al retirar la hemoglobina del glóbulo rojo, reduciendo adicionalmente de esta forma la P_{50}. En términos de aclaración de la circulación, se observa que la hemoglobina sin estroma se elimina rápidamente en los riñones, con una vida media en transfusión (t_{1/2}) de sólo aproximadamente 100 minutos. El coeficiente de Hill para la SFH está en el intervalo de 2,3-2,8.
Se han explorado hemoglobinas modificadas químicamente que abordan algunas de las desventajas de la hemoglobina sin estroma. Las modificaciones descritas en la técnica anterior incluyen varios medios para la reticulación intramolecular de hemoglobina sin estroma; medios para la reticulación intermolecular de hemoglobina sin estroma con agentes de bajo peso molecular; medios para la reticulación intra e intermolecular de hemoglobina sin estroma con agentes de bajo peso molecular; y medios para unir hemoglobina sin estroma a otros polímeros.
Los métodos para la reticulación intramolecular de hemoglobina sin estroma se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.584.130, 4.598.064 y 4.600.531. Este tratamiento modifica la hemoglobina sin estroma uniendo covalentemente los restos lisina-99 de las cadenas alfa de la proteína mediante un puente fumarato. Como consecuencia de esta reticulación intramolecular, la hemoglobina reticulada con diaspirina tiene una afinidad por el oxígeno equivalente a la de la sangre. Además, la hemoglobina reticulada con diaspirina (peso molecular 64.500) ya no se puede separar en dímeros (peso molecular 32.250). Como resultado, el tiempo de retención de la hemoglobina reticulada con diaspirina alfa-alfa es de cuatro a ocho horas (que es de dos a cuatro veces la de la hemoglobina sin estroma). Sin embargo, este no es un tiempo suficientemente largo para la utilidad en el tratamiento de hemorragia aguda, ya que se necesita un transportador de oxígeno que pueda transportar oxígeno durante varios días cuando el paciente ha perdido una cantidad considerable de sangre. La P_{50} de la hemoglobina sin estroma está en el intervalo fisiológico (24-28 mm Hg) al igual que el coeficiente de Hill (2,5-2,8).
Las moléculas de hemoglobina también se han reticulado de forma intramolecular entre sí usando agentes de reticulación de bajo peso molecular. Por ejemplo, la unión de moléculas de hemoglobina entre sí y/o con proteínas de suero y derivados de gelatina usando dialdehídos, seguido opcionalmente de la adición de fosfato de piridoxal, se ha descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.336.248. La reticulación con un agente de reticulación de bajo peso molecular bifuncional o polifuncional, se ha descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.001.401, 4.001.200, 4.053.590 y 4.061.736. Los productos de la reticulación intramolecular de la hemoglobina habitualmente no son tetrámeros solubles sencillos, sino tetrameros múltiples de hemoglobina unidos para formar oligómeros solubles. Típicamente, los productos de tal reticulación intramolecular tienen propiedades de transporte y administración de oxígeno que no son equivalentes a las de la sangre (P_{50} de 18-23 para la hemoglobina polimerizada con glutaraldehído en comparación con la P_{50} de 28 para la sangre entera) y coeficientes Hill en el intervalo 1,8-2,8). Además, se conoce que los productos de reticulación intermolecular con glutaraldehído de la técnica anterior son antigénicos [véase D.H. Marks et al., en Military Med. 152: 473 (1987)].
En general, la reticulación intramolecular e intermolecular de la hemoglobina reduce algunos de los problemas de toxicidad renal que resultan de la disociación de hemoglobina no modificada en dímeros-\alpha\beta. Sin embargo, la presión osmótica coloidal (COP) ejercida por la hemoglobina soluble no se reduce de forma significativa por la reticulación intramolecular. Esto, por lo tanto, limita los niveles de dosificación de sustitutos de sangre con hemoglobina soluble adecuados para la administración. En general, un aumento en la COP tiene como resultado una reducción en la presión hidrostática y una reducción conjunta en la velocidad de filtración glomerular, dando como resultado oliguria y, en casos graves, anuria. La administración de hemoglobinas solubles descritas en la técnica anterior ha resultado en braquicardia, aumento de la presión sanguínea y en una caída en la clarificación de creatinina. La vasoconstricción y la obstrucción tubular se han sugerido como causa de los efectos renales, que están todos relacionados con el uso de hemoglobinas solubles como sustitutos en la sangre. Una forma muy polimerizada de hemoglobina, tal como la que puede prepararse como se ha descrito en este documento, puede aliviar estos problemas.
Los compuestos altamente fluorados y particularmente los compuestos de perfluorocarbono, también se han considerado como sustitutos de glóbulos rojos, debido a sus altas solubilidades para el oxígeno. Entre los compuestos altamente fluorados útiles para tales aplicaciones están los perfluorocarbonos, por ejemplo, perofluorodecalina, perfluoroindano, perfluorometiladamantano, perfluorotripropilamina, perfluorotributilamina, bromuro de perfluorooctilo y similares. Para el uso intravenoso, estos fluorocarbonos, al ser inmiscibles en agua, deben dispersarse como emulsiones inyectables. Los emulsionantes usados típicamente en estas aplicaciones son lecitina de yema de huevo y fosfatidas de huevo, teniendo las dos el potencial de precipitar reacciones alérgicas. Véase, por ejemplo, el documento PCT 92/06517, que describe una emulsión que contiene un compuesto fluoroquímico y fosfolípidos, tales como lisofosfatidilcolina y liofosfatidiletanolamina como tensioactivos, o el documento PCT 93/11868, que describe una emulsión con lecitina de yema de huevo como emulsionante que contiene compuesto orgánicos altamente fluorados sustituidos con cloro no cíclicos como transportadores de oxígeno.
Fluosol-DA (Alpha Therapeutics), una emulsión de perfluorodecalina y perfluorotripropil amina, es el único producto aprobado por la FDA para el uso en la prevención de isquemia pasajera en angioplastía con balón. Otro producto de fluorocarbono, Oxygent (Alliance Pharmaceuticals), o bromuro de perfluorooctilo, se ha aprobado como agente oral para obtención de imágenes. Para una revisión de los compuestos perfluoro como sustitutos en la sangre, véase Riess et al. en Angew Chem. Int. Ed. Engl. 17:621-634 (1978).
Por el contrario, los recubrimientos poliméricos preparados con hemoglobina, como se describe en este documento, son moléculas macroscópicas "gigantes" (debido a la extensiva polimerización o reticulación de grandes cantidades de moléculas tetraméricas de hemoglobina) que, debido al gran tamaño de las mismas, son insolubles en medio acuoso. La polimerización tiene lugar como resultado de la reticulación de los grupos sulfhidrilo en los restos cisteína de la proteína durante el proceso de irradiación ultrasónica. El recubrimiento polimérico preparado de acuerdo con la presente invención comprende típicamente al menos 10^{4} moléculas de polímero reticulado y puede tener tantas como 10^{12} tetrámeros de hemoglobina reticulados en un único "megámero" de hemoglobina. Inesperadamente, se ha descubierto que el oxígeno se puede unir de manera reversible a estas construcciones insolubles con afinidades que están en el intervalo útil para un sustituto de glóbulo rojo (RBC), es decir, una P_{50} entre 10 mm Hg a aproximadamente 50 mm Hg.
Debido a su tamaño y a su naturaleza reticulada, es probable que las construcciones de hemoglobina insoluble de la presente invención tengan un tiempo de circulación in vivo considerablemente más largo que los sustitutos de glóbulos rojos (RBC) de la técnica anterior. Además, debido a su gran tamaño molecular (macroscópico), no es probable que induzcan los problemas de toxicidad renal que tienen lugar habitualmente con los formas solubles tetraméricas u oligoméricas convencionales de la hemoglobina descritas en la técnica anterior.
La naturaleza "celular" discreta de las construcciones de hemoglobina insoluble de la presente invención las hace que sea probable que transporten oxígeno de manera fisiológica, no como los glóbulos rojos in vivo. Debido a la naturaleza "megamérica" de las construcciones de hemoglobina insoluble de la invención, tendrán una presión osmótica coloidal o presión oncótica despreciable en comparación con una cantidad equivalente (en términos de capacidad de transporte de oxígeno) de hemoglobina soluble de cualquiera de las técnicas anteriores. Esto permitiría la infusión intravenosa de altas concentraciones de construcción de hemoglobina de la invención, mientras que la hemoglobina soluble de la técnica anterior solo puede infundirse a una concentración máxima de 6-8 g/dl por temor a una pérdida severa de agua de los tejidos circundantes al espacio vascular debido a los gradientes osmóticos.
La composición de la invención tiene una ventaja significativa sobre las composiciones de hemoglobina encapsulada de la técnica anterior. Las formaciones de hemoglobina liposómica de la técnica anterior comprenden hemoglobina soluble con una capa externa de lípidos. Las composiciones de hemoglobina encapsulada en liposomas de la técnica anterior tienen varias desventajas que son superadas por la presente invención. El escape de hemoglobina soluble de las composiciones liposómicas puede causar potencialmente nefrotoxicidad. Las construcciones insolubles de la presente invención no dejarán escapar hemoglobina debido a su naturaleza extensivamente reticulada. Se conoce que la agregación de liposomas activa la proteína complemento C3a. Esta agregación es poco probable en el caso de construcciones insolubles debido a su tamaño, que es considerablemente mayor que el intervalo de tamaño liposómico.
La composición de la invención de hemoglobina reticulada insoluble evita la toxicidad asociada con las composiciones de hemoglobina soluble de la técnica anterior. La nefrotoxicidad o toxicidad renal de la hemoglobina está relacionada principalmente con la eliminación de la hemoglobina dimérica, tetramérica u oligomérica de la circulación. La hemoglobina de la presente invención, al estar extensivamente reticulada o ser megamérica, no puede eliminarse en el riñón y es poco probable que sea nefrotóxica. Las construcciones insolubles de la presente invención no pueden ser clarificadas por los riñones y por lo tanto evitan este problema. Una ventaja adicional de las construcciones de hemoglobina extensivamente reticulada de la presente invención sobre la técnica anterior es la mayor persistencia intravascular debido a la forma insoluble.
La morfología de la construcción de hemoglobina insoluble (IHC) se determinó usando microscopía de transmisión de electrones (TEM). Para obtener el micrográfico TEM de una sección transversal de una IHC bovina, la IHC se fijó con glutaraldehído, se pigmentó con tetróxido de osmio y ferrocianato potásico (para proporcionar contraste en regiones de alta concentración de proteína), se embebió en una resina de baja viscosidad y se ultra-microtomó (espesor de la sección \sim75 nm). Como se espera que tenga lugar un encogimiento del diámetro total y algo de distorsión en la forma de la IHC durante este proceso, el verdadero diámetro de la IHC se representa mejor con la distribución de tamaño de la partícula de la solución (3 micrómetros; desv. típica 1), en lugar de las medidas directas del micrografo TEM. Un análisis más profundo del micrografo TEM muestra tres regiones distintivas: una región transparente central; una capa oscura, fina alrededor de la partícula; y una región gris poco unida, difusa y moteada asociada con la superficie exterior de la partícula. La capa oscura fina es el recubrimiento de IHC. Contiene una alta densidad de proteínas y, durante el procedimiento de pigmentación, proporciona el mayor contraste. La materia gris poco unida parece ser proteína nativa que se adhiere al recubrimiento de IHC durante la etapa de fijación en la preparación de muestra. Las medidas iniciales de este y muchos otros micrográficos indican que el espesor del recubrimiento de la hemoglobina bovina es de aproximadamente 25-35 nm. La hemoglobina es una proteína más o menos esférica (L. Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman, New York, 1988) con un diámetro de 5,5 nm. De esta forma, el recubrimiento de proteína de la IHC tiene un espesor de aproximadamente 4 a 20 moléculas de hemoglobina. De esta forma, una burbuja de 3,0 \mum de diámetro contendría de aproximadamente 10^{4} a 10^{12} moléculas de hemoglobina.
El examen de las construcciones de hemoglobina insoluble (IHC) de las presente invención (microburbujas o microesferas) mediante dicroísmo circular reveló que el contenido de hélices alfa y hojas plegadas beta no era significativamente diferente del de la hemoglobina sin estroma purificada (SFH). Esta observación es significativa porque indica que el procedimiento de reticulación y la formación de hemoglobina insoluble no tiene como resultado la desnaturalización (es decir, la alteración de la estructura terciaria y cuaternaria) de la proteína. Esta observación, por supuesto, se corrobora con los datos funcionales que muestran la retención de la unión reversible de oxígeno y la cooperación entre las unidades hemo de unión al oxígeno después de la etapa sintética.
Una IHC de hemoglobina bovina y humana se sintetizó como se describe en el Ejemplo 14. Como reconocerán los especialistas en la técnica, la hemoglobina empleada puede derivarse de cualquier fuente vertebrada, invertebrada o eucariótica o puede ser el producto de la manipulación genética de células de vertebrados, invertebrados o eucariontes. La Tabla 1 proporciona un resumen de los resultados actuales.
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Todos los experimentos de unión se hicieron a 25ºC en tampón Tris (pH 7,4). La IHC retiene su capacidad para unirse al oxígeno de forma reversible, tal y como se demuestra con el espectro visible con UV de la IHC, lo que indica la presencia de formas met-Fe(III), oxi-Fe(II) y desoxi-Fe(II). La IHC puede ciclarse entre los estados desoxi y oxi durante más de diez ciclos sin degradación sustancial. Esto es importante porque indica que el entorno que rodea al sitio hemo activo no se ha alterado de forma significativa en el proceso de fabricación del sustituto de glóbulo rojo con la IHC.
Estos datos de unión a oxígeno sugieren que la IHC comprende sustancialmente hemoglobina no desnaturalizada. Si se hubiera desnaturalizado, no se observaría reactividad fisiológica (o menos).
Se ha demostrado que los efectores alostéricos de la hemoglobina nativa tales como el hexafosfato de inositol (IHP) y 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) aumentan la P_{50} (es decir, reducen la afinidad al oxígeno) y mejoran la cooperatividad. Los mismos efectos se observan en la IHC. Aunque los valores P_{50} aumentan en la misma cantidad, se observa un efecto más pronunciado en la cooperatividad de la IHC. El n_{max} aumentó en gran medida en comparación con la de la hemoglobina nativa en presencia de IHP 1,7 mM y 2,3-BPG (14 vs 2,8) (véase la Tabla 1).
Este aumento inesperadamente grande en la cooperatividad se debe aparentemente a los enlaces covalentes entre los tetrámeros de hemoglobina dentro del recubrimiento de IHC. El coeficiente de Hill no puede ser mayor que la cantidad de sitios de unión que interactúan. Los valores de aproximadamente 2,8 en la hemoglobina nativa reflejan la cooperatividad en un tetrámero. Sin embargo, en el recubrimiento de IHC, existe una comunicación entre varios de los tetrámeros reticulados (desde la formación de enlaces disulfuro) al unirse al oxígeno. Es probable que las interacciones con los tetrámeros más cercanos sean las más fuertes; sin embargo, pueden existir otras interacciones más débiles entre tetrámeros separados. Esencialmente, un alto n_{max} es una indicación de que múltiples tetrámeros cooperan en el cambio del estado desoxi-T a oxi-R dentro del recubrimiento de IHC al unirse al oxígeno. De nuevo, los micrográficos TEM de la hemoglobina IHC revelan un espesor de recubrimiento de aproximadamente seis tetrámeros de hemoglobina. Una burbuja de 3,0 \mum de diámetro contendría aproximadamente de 10^{4} a 10^{12} moléculas de
hemoglobina.
La estabilidad al almacenar la IHC se comprobó con recuentos de partículas en distintos periodos de tiempo después de la preparación. La IHC se almacenó en solución salina estéril a 4ºC hasta 6 meses. A los 3 meses, la concentración de la IHC había decrecido aproximadamente un 10% mientras que a los 6 meses había se había reducido aproximadamente en un 25-30%.
Se ha determinado que la velocidad de auto-oxidación de la IHC (de oxi-Fe(II) a met-Fe(III)) es mayor de 60 horas, 96 horas y 25 días a 37ºC, 25ºC y 4ºC, respectivamente. No se tomaron precauciones especiales para mantener una atmósfera inerte al obtener estos resultados. La técnica anterior demuestra claramente el beneficio de mantener una atmósfera inerte tal como nitrógeno para reducir la velocidad de auto-oxidación de la hemoglobina. El almacenamiento en tales condiciones aumentaría en gran medida la fracción de hemoglobina Fe(II) mantenida durante un mayor periodo de tiempo.
Además, la auto-oxidación puede evitarse mediante el almacenamiento de la suspensión IHC con el sistema de reducción de Hyashi et al. descrito anteriormente.
La pasteurización se investigó como método de esterilización en etapa final para las suspensiones de IHC. Se utilizaron varias condiciones de pasteurización distintas. Se usaron recuentos de partículas después de cada condición para determinar cualquier efecto perjudicial de la temperatura en la IHC.
Condición 1: La temperatura de la suspensión IHC aumentó de 25 - 62,8ºC en 8 minutos y se mantuvo a esta temperatura durante 30 minutos. Los recuentos de partículas mostraron una degradación de menos del 20%.
Condición 2: La temperatura de la suspensión IHC aumentó de 25 - 71,7ºC en 10 minutos y se mantuvo a esta temperatura durante 15 segundos. Los recuentos de partículas mostraron una degradación de menos del 20%.
Condición 3: La temperatura de la suspensión IHC aumentó de 25 - 89,5ºC en 12 minutos y se mantuvo a esta temperatura durante 2 segundos. Los recuentos de partículas mostraron una degradación severa de más del 70%.
De esta forma, se descubrió que las condiciones 1 y 2 eran adecuadas como formas de pasteurización. La radiación gamma como modalidad de esterilización en etapa final también es adecuada.
La afinidad por el oxígeno (o P_{50}) de la IHC puede alterarse por modificación química de la hemoglobina con efectores alostéricos conocidos. En general, la modificación de la hemoglobina restringe la transición entre las dos conformaciones oxi y desoxi, de forma que la función de oxigenación casi siempre se altera de alguna forma. Por ejemplo, si la hemoglobina se modifica en la forma oxi, normalmente se favorece una alta afinidad al oxígeno, mientras que se da el caso contrario si la modificación se realiza en estado desoxi. Los derivados de piridoxal son modificadores útiles ya que esta molécula imita al efector alostérico natural 2,3-difosfoglicerato (DPG). Se unen a los grupos amino terminales de la hemoglobina. Por ejemplo, la hemoglobina puede hacerse reaccionar con piridoxal-5'-fosfato (PLP) que imita la interacción natural de 2,3-DPG para aumentar la P_{50}. Otros derivados de piridoxal, tales como 2-nor-2-formil PLP, un agente bifuncional que une las cadenas \beta de hemoglobina o tetrafosfato de bis-piridoxal, son modificadores útiles. Otros reticuladores tales como tri(metilfosfatos sódicos) de acilo también pueden utilizarse para reticular las cadenas \beta.
También se pueden usar modificadores aldehído. Por ejemplo, el glutaraldehído es útil en la polimerización de hemoglobina y puede usarse junto con PLP.
Los ésteres de diaspirina tales como 3,5-bis(dibromosalicil)fumarato y la correspondiente monoaspirina son modificadores alostéricos útiles. Los enlaces aspirina se une entre las cadenas \alpha de hemoglobina y el reactivo monofuncional a una lisina interna. Ambos aumentan la P_{50} de la hemoglobina.
De esta forma, se pueden preparar construcciones de "baja afinidad" o "alta afinidad" para la aplicación en situaciones distintas de los casos de trauma y pérdida de sangre aguda, tales como en situaciones en las que se requiere una administración local de oxígeno y es beneficiosa.
Una construcción de "baja afinidad", es decir, una con una P_{50} alta (> 28 mm Hg), producida con la técnica anterior, tiene utilidad en el uso de oxígeno como adyuvante en el tratamiento de tumores por radiación o quimioterapia. Tales construcciones se cargan a la máxima capacidad de oxígeno fuera del cuerpo y después se administran en la circulación del tumor. Esto permite una gran cantidad de liberación de oxígeno en el tumor. El oxígeno activado producido en presencia de radiación o quimioterapia tiene como resultado una mayor actividad citotóxica en el sitio del tumor.
Una construcción de "alta afinidad" (P_{50} < 28 mm Hg) tiene utilidad para la "Administración Isquémica de Oxígeno". La isquemia, o privación de oxígeno en un tejido, puede tener lugar en varios estados patológicos, por ejemplo, ataques, infarto de miocardio y similares. La liberación preferente de oxígeno en tales áreas ayudaría a minimizar el daño permanente al tejido. Un vehículo de oxígeno o sustituto de RBC con una afinidad al oxígeno similar a la sangre entera no liberara oxígeno de forma preferente en tal sitio. Sin embargo, uno con una alta afinidad al oxígeno (es decir, una P_{50} baja en comparación con la sangre entera), aunque retiene la mayor parte del oxígeno en condiciones de los gradientes de oxígeno que se encuentran normalmente, liberará su oxígeno de forma preferente en tal sitio isquémico debido al gran gradiente de oxígeno entre la sangre y el tejido. Las afinidades de las construcciones de hemoglobina insoluble de la presente invención pueden manipularse fácilmente hasta un valor adecuado (P_{50}) para tal aplicación cambiando la naturaleza de la reticulación, usando una hemoglobina natural adecuada con la afinidad deseada o usando una hemoglobina modificada genéticamente con la afinidad adecuada.
Las construcciones de hemoglobina insoluble de la presente invención pueden encapsular y por tanto actuar como vehículos eficaces de agentes farmacológicos tales como vehículos de oxígeno (por ejemplo, fluorocarbonos), fármacos, agentes de diagnóstico y similares. Los fluorocarbonos encapsulados (FC) son vehículos de oxígeno eficaces que transportan y liberan oxígeno disuelto en relación lineal con la presión parcial de oxígeno mientras que el recubrimiento de hemoglobina de la IHC transporta y libera oxígeno unido en una relación sigmoidal con la presión de oxígeno. Esta combinación única de hemoglobina y fluorocarbono dentro de la misma formulación permite el máximo transporte y liberación de oxígeno in vivo.
La capacidad para administrar hemoglobina (Hb) y fluorocarbono (FC) de forma simultánea no se ha descrito en la técnica anterior. El fluorocarbono encapsulado dentro del núcleo del recubrimiento de hemoglobina puede actuar como reserva de oxígeno. Esta combinación permite la administración de oxígeno unido al vehículo en relación sigmoidal con la presión (es decir, del fluorocarbono). Esta combinación permite la liberación "en segundo plano" de oxígeno de forma lineal (del fluorocarbono) con respecto a la pO_{2} del tejido y la liberación de un "bolo" de oxígeno de forma sigmoidal (de la hemoglobina) con respecto a la pO_{2} del tejido. Esto permite una administración de oxígeno más eficaz especialmente en casos en los que se tienen que administrar grandes cantidades de oxígeno en periodos cortos, por ejemplo, en la isquemia de tejidos o terapia contra tumores.
La combinación Hb/Fc ha añadido la ventaja del control externo para localizar la dosis administrada de forma intravascular. Como el núcleo ^{19}F se observa fácilmente mediante imágenes de resonancia magnética (MRI), es posible trazar la acumulación de la suspensión administrada en el sistema vascular y el tejido. Esto tiene grandes ventajas en el tratamiento de tumores donde el oxígeno se usa como adyuvante con la radiación o quimioterapia para controlar de forma precisa la suspensión de hemoglobina/Fc que transporta oxígeno al sitio deseado.
Diversos fluorocarbonos (FC) son adecuados para el uso en la práctica de la presente invención, como se describe en detalle a continuación.
Además, las proteínas que no tienen capacidad de unirse al oxígeno pero tienen restos cisteína o grupos sulfhidrilo reticulables (nativos o introducidos artificialmente) pueden usarse para encapsular fluorocarbonos biocompatibles con afinidades al oxígeno adecuadas para usar como sustitutos en la sangre. Como ejemplo, la albúmina puede usarse para encapsular perfluorodecalina o perfluorotripropilamina para usar como sustituto en la sangre.
Diversos fármacos son candidatos para la encapsulación en microesferas de hemoglobina de la presente invención. Varios agentes quimioterapéuticos requieren la presencia de oxígeno para proporcionar una citotoxicidad tumoral máxima. La administración de tales fármacos en construcciones de vehículo de oxígeno tales como hemoglobina combina eficazmente los componentes esenciales de citotoxicidad en un único paquete. Varios fármacos citotóxicos útiles son solubles en aceite. Estos fármacos pueden disolverse en un fluorocarbono u otro aceite biocompatible tal como aceite de soja, aceite de cartamo, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón y similares. La solución de aceite/fármaco se somete a irradiación ultrasónica con una solución de hemoglobina para producir microesferas de aceite/fármaco dentro de un recubrimiento de hemoglobina insoluble reticulado. La suspensión puede oxigenarse antes de la administración intravascular. Los fármacos citotóxicos solubles en aceite incluyen ciclofosfamida, BCNU, melfalan, mitomicinas, taxol y derivados, taxotere y derivados, camptotecina, adriamicina, etoposida, tamoxifeno, vinblastina, vincristina y similares; antiinflamatorios no esteroideos tales como ibuprofeno, aspirina, piroxicam, cimetidina y similares; esteroides tales como estrógeno, prednisolona, cortisona, hidrocortisona, diflorasona y similares; fármacos tales como fenesterina, mitotano, visadina, halonitrosoureas, antrocilinas, elipticina, diazepam y similares; agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, azatioprina, FK506 y similares.
Los fármacos solubles en agua también pueden encapsularse dentro del recubrimiento de IHC con un método de doble emulsión. Primero, una solución de fármaco acuoso se emulsiona con un aceite biocompatible para obtener una emulsión de agua en aceite (W/O). La emulsión W/O se trata como una fase oleosa y se somete a irradiación ultrasónica con una solución de hemoglobina acuosa como se ha descrito anteriormente para producir IHC que contiene dentro de su recubrimiento una microemulsión del fármaco soluble en agua deseado. Los emulsionantes contemplados para usar en esta realización de la presente invención incluyen los Pluronics (copolímeros en bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno), fosfolípidos de yema de huevo (por ejemplo, fosfatidas, lecitina de yema de huevo y similares); ésteres de ácidos grasos (por ejemplo, mono- y di-estearato de glicerol, mono- y di-palmitato de glicerol y similares). Los fármacos solubles en agua contemplados para el uso en esta realización de la presente invención incluyen fármacos antineoplásicos tales como actinomicina, bleomicina, ciclofosfamida, duanorubicina, doxorubicina, epirubicina, fluorouracil, metotrexato, mitomicinas, tamoxifeno, estrógenos, progestógenos y similares.
La técnica de doble emulsión también es adecuada para la administración de otro material soluble en agua de valor terapéutico, diagnóstico o nutricional. Por ejemplo, el contenido en hemoglobina de la IHC puede aumentarse encapsulando una microemulsión de hemoglobina en la IHC.
Para hacer a la IHC más parecida a los glóbulos rojos, se puede formar una bicapa de fosfolípidos alrededor de las microburbujas de hemoglobina reticulada. Tal bicapa tiene como resultado la formación de un verdadero "análogo de glóbulo rojo" y puede crearse con un proceso de dos etapas. Los fosfolípidos o lípidos cargados utilizados en la formación de esta bicapa incluyen fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, esfingomielina, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico, sarcosinatos (sarcosinamidas), betaínas, alquidos monoméricos y diméricos y similares. Los lípidos no iónicos también pueden utilizarse en esta invención, incluyendo ésteres de ácidos grasos polietileno, éteres de ácidos grasos polietileno, acil hexosamidas de cadena larga, amidas de acil aminoácidos de cadena larga, aminas de aminoácidos de cadena larga, ésteres de polixoetilensorbitán, mono- y di-ésteres de polioxi glicerol, mono- y di-estearato de glicerol, mono- y di-oleato de glicerol, mono- y di-palmitato de glicerol y similares.
Otra variación de esta técnica es utilizar lípidos fotopolimerizables o lípidos que puedan reticularse fácilmente mediante una reacción química para proporcionar un recubrimiento de "membrana" lipídica más estable. Los lípidos fotopolimerizables que pueden utilizarse en la presente invención incluyen lípidos sustituidos con acrilato o metacrilato (tales como fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico y similares); lípidos con insaturación polimerizable nativa (tales como fosfatidil colinas no saturadas con grupos diacetileno o grupos dieno conjugados y similares) y similares. Los lípidos que experimentan fácilmente reticulación mediante intercambio tiol-disulfuro también son buenos candidatos para la formación de un recubrimiento lipídico estable para la IHC. Los ejemplos de tales lípidos incluyen derivados de fosfatidil colinas esterificados con ácido lipoico y similares.
Las IHC sintetizadas por irradiación ultrasónica pueden administrarse en forma de una suspensión en un medio biocompatible, como se he descrito anteriormente, así como otros agentes de valor nutricional.
Las vías preferidas de administración in vivo son la intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral, por inhalación, tópica, transdérmica, por supositorio, pesario y similar.
En resumen, las construcciones de hemoglobina insoluble de la presente invención tienen numerosas ventajas sobre la hemoglobina soluble de la técnica anterior, la hemoglobina soluble encapsulada de la técnica anterior y los sustitutos de la sangre o vehículos de oxígeno de fluorocarbono de la técnica anterior. Estas ventajas incluyen:
- mayor capacidad de oxígeno;
- afinidad al oxígeno variable;
- hemoglobina insoluble "megamérica", que se espera que permanezca más tiempo en la circulación que la hemoglobina soluble tetramérica u oligomérica de la técnica anterior;
- menor potencial de toxicidad en el riñón debido al gran tamaño molecular;
- debido al tamaño mucho mayor que los liposomas, la formación de agregados que estimula proteínas complemento es poco probable.
- se comporta más como RBC debido a su naturaleza "celular" discreta en comparación con la hemoglobina soluble de la técnica anterior;
- puede transportar una reserva de oxígeno no unido junto con oxígeno unido a la hemoglobina;
- puede usarse como un vehículo de fluorocarbono (FC) sin emulsionantes potencialmente alérgicos o tóxicos;
- la hemoglobina reticulada en construcciones Hb/Fc proporciona una mejor estabilidad en relación con los sistemas emulsionados de la técnica anterior que usan fosfatidas de huevo y/o otros tensioactivos sintéticos;
- el perfil de liberación de oxígeno de Hb/Fc es una combinación de relación sigmoidal y lineal en relación a la pO_{2} del tejido.
- las construcciones Hb/Fc pueden detectarse y controlarse in vivo con MRI con ^{19}F.
- las construcciones de hemoglobina o Hb/Fc pueden usarse como vehículos para fármacos además de transportar oxígeno;
- puede aplicarse una membrana bicapa lipídica a la construcción de hemoglobina para hacer que parezca más fisiológica;
- la construcción de hemoglobina puede modificarse con polímeros tales como PEG para aumentar más la persistencia intravascular.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha descubierto que los compuestos que contienen organoflúor, que en general son hidrófobos, inmiscibles en agua y por consiguiente difíciles de administrar, pueden encapsularse en recubrimientos poliméricos (como las descritas anteriormente), se pueden usar fácilmente y son biocompatibles. El tamaño de partícula de los recubrimientos poliméricos producidas de acuerdo con la presente invención tienen un diámetro medio de aproximadamente 2 micrómetros, lo cual es ideal para aplicaciones médicas, ya que las inyecciones intravenosas o intraarteriales pueden realizarse sin riesgo de bloqueo de los pequeños vasos sanguíneos y posterior daño al tejido (por ejemplo, causado por isquemia debido a la privación de oxígeno). Como comparación, las glóbulos rojos tienen un diámetro de aproximadamente 8 micrómetros (por tanto, el biomaterial inyectable debe tener un diámetro menor de 8-10 micrómetros para evitar el bloqueo de los vasos sanguíneos).
Los átomos de flúor de origen natural (^{19}F) dan una señal de resonancia magnética clara y por tanto pueden funcionar como agentes de contraste o "sondas" en la MRI. Las ventajas específicas del uso de ^{19}F incluyen: 1) una concentración nativa en el cuerpo extremadamente baja (el flúor no se encuentra de forma natural en el cuerpo), 2) una alta sensibilidad a la resonancia magnética nuclear, 3) una relación magnetogírica próxima a la del ^{1}H, permitiendo así que la resonancia magnética con ^{19}F se realice con modificaciones menores de los dispositivos MRI existentes y 4) baja toxicidad de la mayoría de los compuestos que contienen organoflúor.
En general, los fluorocarbonos son biocompatibles y no tóxicos. Los fluorocarbonos son estables y no reactivos y por consiguiente es poco probable que se metabolicen debido a sus fuertes enlaces carbono-flúor (aproximadamente 130 kcal/mol). Como comparación, los enlaces carbono-hidrógeno (aproximadamente 100 kcal/mol) son más débiles y mucho más reactivos. La FDA ha aprobado dos fluorocarbonos, perfluorotripropilamina y perfluorodecalina, para uso medicinal como sustitutos en la sangre con el nombre comercial de Fluosol DA.
Varios fluorocarbonos distintos pueden usarse en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, los compuestos que satisfacen las siguientes fórmulas genéricas pueden incorporarse en los recubrimientos poliméricos empleando el procedimiento de la invención como se ha descrito en este documento:
(a)
C_{x}F_{2x+y-z}A_{z}, en la que
x = 1 -30, preferiblemente 5 -15
y = 2; ó 0 ó -2, cuando x \geq 2; o -4 cuando x \geq 4,
z = cualquier número entero de 0 hasta (2x+y-1),
y
A se selecciona entre H, halógenos distintos de F, -CN, -OR, donde R es H, alquilo, fluoroalquilo, alquenilo, fluoroalquenilo, alquinilo, fluoroalquinilo, arilo, fluoroarilo, alcanoílo, fluoroalcanoílo, alquenoílo, fluoroalquenoílo, alquinoílo, fluoroalquinoílo,
(b)
[C_{x}F_{2x+y'-z}A_{z}]_{a}JR_{b-a}, en la que:
x, z, A y R son como se han definido anteriormente,
y' = +1; ó -1 ó -3, cuando x \geq 2; o -5 cuando x \geq 4,
J = O, S, N, P, Al o Si,
a = 1, 2, 3 ó 4, y
b = 2 para una J divalente, o
3 para una J trivalente,
4 para una J tetravalente,
(c)
A'-[(CF_{2})_{x}-O]_{c}-A'', en la que
x es como se ha definido anteriormente
A' se selecciona entre H, halógenos, -CN, -OR, donde R es H, alquilo, fluoroalquilo, alquenilo, fluoroalquenilo, alquinilo, fluoroalquinilo, arilo, fluoroarilo, alcanoílo, fluoroalcanoílo, alquenoílo, fluoroalquenoílo, alquinoílo, fluoroalquinoílo,
A'' se selecciona entre H o R, donde R es como se ha definido anteriormente,
C = 1 - 200, preferiblemente 2-50, o
(d)
2
en la que:
x es como se ha definido anteriormente, y
c' = 2 - 20, preferiblemente 2-8,
así como mezclas de cualquiera dos o más de los mismos.
Se incluyen dentro de las fórmulas genéricas anteriores compuestos con fórmulas tales como:
C_{x}F_{2x}, tales como, por ejemplo, perfluoro-1-hexeno (C_{6}F_{12}), perfluoro-2-hexeno (C_{6}F_{12}), perfluoro-3-hexeno
(C_{6}F_{12}) y similares,
ciclo-C_{x}F_{2x}, tales como, por ejemplo, perofluorociclohexano (C_{6}F_{12}), perofluorociclooctano (C_{8}F_{16}) y similares,
C_{x}F_{2x-2}, tales como, por ejemplo, perfluoro-1-hexino (C_{6}F_{10}), perfluoro-2-hexino (C_{6}F_{10}), perfluoro-3-hexino
(C_{6}F_{10}) y similares,
biciclo-C_{x}F_{2x-2}, tales como, por ejemplo, perfluorodecalina (C_{10}F_{18}) y similares,
C_{x}F_{2x+2}, tales como, por ejemplo, perfluorohexano (C_{6}F_{14}), perfluorooctano (C_{8}F_{18}), perfluorononano (C_{9}F_{20}), perfluorodecano (C_{10}F_{22}), perfluorododecano (C_{12}F_{26}) y similares,
C_{x}F_{2x-4}, tales como, por ejemplo, perfluoro-2,4-hexadieno y similares,
C_{x}F_{2x+1}A, tales como, por ejemplo, perfluorotriporpilamina [(C_{3}F_{7})_{3}N], perfluorotributilamina [(C_{4}F_{9})_{3}N], perfluoro-terc-tributilamina y similares,
C_{x}F_{2x-2}A_{2}, tales como, por ejemplo, C_{10}F_{18}H_{2} y similares,
así como compuestos altamente fluorados como perfluoroindano, perfluorometiladamantano, bromuro de perfluorooctilo, perfluorodimetilciclooctano, bromuro de perfluorociclooctilo, éteres corona de perfluoro y similares.
Además de los compuestos de cadena lineal, ramificada y cíclicos que contienen flúor mencionados anteriormente, los éteres corona fluorados (tales como, por ejemplo, perfluoro 12-corona-4-, perfluoro 15-corona-5, perfluoro 18-corona-6 y similares) también se contemplan para el uso en la práctica de la presente invención.
Para obtener buenas imágenes de resonancia magnética con relaciones señal/ruido altas, es ventajoso tener un alto número de equivalentes flúor. Como se usa en este documento, el término "equivalente flúor" se refiere a aquellos sustituyentes flúor de un compuesto que contiene flúor que existen en un microentorno sustancialmente similar (es decir, entorno magnético sustancialmente similar). Los equivalentes flúor producirán una señal en la imagen. Un alto número de equivalentes flúor producirá una señal fuerte, no diluida por señales competitivas de flúor "no equivalentes".
Como se usa en este documento, el término "flúor no equivalente" se refiere a aquellos sustituyentes flúor de un compuesto que contiene flúor que existen en un microentorno sustancialmente no similar (es decir, un entorno magnético sustancialmente no similar), en relación con otros sustituyentes flúor del mismo compuesto que contiene flúor. De esta forma, al contrario que los equivalentes flúor, los flúor no equivalentes darán múltiples señales debido a sus distintas orientaciones químicas. De esta forma, aunque los compuestos con un gran número de flúor no equivalente son satisfactorios para aplicaciones de MRI, tales compuestos no son ideales para aplicaciones de obtención máxima de imágenes.
Los recubrimientos poliméricos que contienen fluorocarbono con un tiempo de circulación prolongado son de interés particular para la aplicación en la obtención de imágenes vasculares. Las técnicas de angiografía usadas actualmente utilizan medios de contraste de rayos-X y son procedimientos invasivos. El potencial de ^{1}H-MRI en aplicaciones de angiografía se ha demostrado recientemente [Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328:785-791 (1993)]. De forma similar, la ^{19}F-MRI es útil para la angiografía, con varias ventajas, tales como la capacidad de conseguir alto contraste con relación al tejido circundante (que no contiene flúor nativo). Los ejemplos de aplicaciones de tal metodología incluyen el diagnóstico e identificación de aneurismos intracraniales, malformaciones arteriovenosas, oclusiones de la vena cava superior, vena cava inferior, vena portal, vena pélvica, vena renal, arteria mesentérica renal, arteria mesentérica periférica y similares.
Los compuestos que contienen flúor encapsulados en recubrimientos poliméricos de acuerdo con la presente invención pueden usarse para una diversidad de propósitos, por ejemplo, para obtener imágenes de resonancia magnética de distintos órganos y/o tejidos y también para medir la temperatura local. Los agentes de contraste de la invención no están limitados al uso en aplicaciones de MRI, sino que también pueden usarse para aplicaciones tales como ultrasonografía y radiología. El otro isótopo del flúor, ^{18}F, puede usarse como agente de contraste en tomografía de emisión de positrones (PET). De esta forma, con un agente de contraste que contenga flúor, puede realizarse una diagnosis PET y MRI. La encapsulación de otros agentes para la obtención de imágenes, tales como compuestos de tecnecio y talio que se usan el medio de radiocontraste, también es posible. Dos ejemplos de tales agentes de contraste incluyen Neurolyte y cardiolyte.
El uso de las composiciones de la invención para la detección de oxígeno se basa en los cambios bruscos en la velocidad de relajación RMN de ^{19}F en presencia de una especie paramagnética tal como oxígeno. Como el oxígeno es paramagnético, interactuará con el núcleo de flúor, aumentando la velocidad de relajación de ^{19}F del estado excitado al estado normal. Controlando este cambio en la velocidad de relajación, es posible determinar la concentración de oxígeno en un área local (calibrando la señal MRI a una concentración conocida de oxígeno).
La novedad de este sistema reside, por ejemplo, en 1) el uso de MRI para obtener información sobre oxígeno, 2) el uso de la influencia paramagnética del oxígeno en la señal de MRI con ^{19}F (NMR), 3) el uso de recubrimientos poliméricos para proporcionar un entorno constante y protector que además es permeable al oxígeno y similares.
Usando compuestos que contienen flúor que son sólidos los cuales experimentan una transición de fase sobre intervalos de temperatura fisiológica (por ejemplo, compuestos de alto peso molecular o combinaciones de compuestos que contienen flúor), la MRI también puede usarse para medir la temperatura local. Los tiempos de relajación son mucho más largos en sólidos que en líquidos, por tanto los tiempos de relajación se reducirán en gran medida al alcanzar la temperatura de transición (es decir, de sólido a líquido). Se observan cambios drásticos en el espectro de RMN durante la transición de fase de sólido a líquido. La forma de la señal MRI para un compuesto que contiene flúor dado puede calibrarse a una temperatura conocida. Usando un compuesto que contiene flúor de alto peso molecular dentro del recubrimiento polimérico (es decir, un compuesto que contiene flúor con un punto de fusión de \geq 15ºC), o usando una combinación de compuesto que contiene flúor con un compuesto no fluorado dentro del recubrimiento polimérico, el contenido del interior del recubrimiento polimérico puede seleccionarse de forma que proporcione un intervalo de temperatura deseada para que tenga lugar la transición de fase (típicamente en el intervalo de aproximadamente 22-55ºC). Los fluorocarbonos de dentro del recubrimiento experimentarán una transición de fase de sólido a líquido sobre el intervalo de temperatura deseado, alterando sustancialmente las velocidades de relajación observadas, permitiendo de esta forma la determinación de temperatura in vivo. La información de temperatura local sería especialmente útil, por ejemplo, para controlar pacientes de cáncer durante el tratamiento por hipertermia del cáncer o en la detección de células de cáncer (las células de cáncer están más frías que las células normales).
La composición que contiene flúor empleada determinará el intervalo de temperatura de la transición de fase. De esta forma, esta técnica se puede usar en un amplio intervalo de temperaturas, cambiando simplemente la composición de la composición que contiene flúor. Por ejemplo, el perfluorododecano puro (C_{12}F_{26}) encapsulado en un recubrimiento polimérico experimentará una transición de fase de sólido a líquido en el punto de fusión del fluorocarbono (75ºC). Sin embargo, esta transición sería muy rápida y solo se obtendría una pequeña cantidad de información sobre la temperatura. Para obtener más información, el punto de fusión de la composición que contiene flúor puede alargarse sobre un intervalo más amplio, por ejemplo, añadiendo simplemente otro componente a la composición pura que contiene flúor. En la técnica se conoce que una mezcla tendrá un intervalo de punto de fusión más pequeño y más amplio que los componentes puros correspondientes. Por consiguiente, por ejemplo, formular el perfluorododecano con un fluorocarbono de menor peso molecular ampliará el intervalo de punto de fusión de la composición encapsulada. De forma similar, una mezcla de un compuesto que contiene flúor (por ejemplo, perfluorododecano) con un alcano (por ejemplo, pentano), por ejemplo, ampliará el intervalo de punto de fusión de la composición encapsulada.
Además, los ácidos grasos de cadena larga modificados químicamente (por ejemplo, ácido heptadecanoico [C_{17}H_{34}
O_{2}], ácido nonadecanoico [C_{19}H_{38}O_{2}] y similares), alcoholes (por ejemplo, nonadecanol [C_{19}H_{40}O], docosanol [C_{22}H_{46}
O_{2}] y similares) a los cuales se les puede añadir químicamente átomos de flúor, también pueden usarse en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, una reacción de acoplamiento por deshidratación entre el perfluro-terc-butanol (t-C_{4}F_{9}-OH; PCR CHEMICALS) con cualquiera de los compuestos reactivos que contienen oxígeno descritos anteriormente producirá una molécula que experimenta una transición de fase de sólido a líquido y tiene nueve equivalentes flúor. De forma similar, una mezcla de ácido graso fluorado y colesterol, por ejemplo, ampliará el intervalo de punto de fusión en comparación con el ácido graso fluorado puro, permitiendo por tanto realizar mediciones de temperatura local.
La novedad de este sistema de detección de temperatura reside, por ejemplo, 1) en el uso de MRI para obtener información de temperatura obtenida espacialmente, 2) en el uso de la dependencia de temperatura de la señal MRI (RMN), 3) en el uso de una composición que contiene fluorocarbono que experimenta una transición de fase de sólido a líquido en el intervalo de temperatura deseado, 4) en el uso del recubrimiento polimérico para proporcionar una entorno constante y protector para el medio, y 5) para obtener información de temperatura de forma simultánea con información de morfología.
De acuerdo con la presente invención, las partículas de la composición que contiene flúor están contenidas dentro de un recubrimiento que tiene un diámetro transversal no mayor de aproximadamente 10 micrómetros (como se usa en este documento, el término "micrómetro" se refiere a una unidad de medida de una milésima de milímetro). Se prefiere más un diámetro transversal de menos de 5 micrómetros, aunque un diámetro transversal de menos de 1 micrómetro es actualmente el más preferido para la vía de administración intravenosa.
Los agentes de contraste de la presente invención pueden introducirse en el cuerpo de distintas formas dependiendo de las necesidades de la técnica de obtención de imágenes. Por ejemplo, puede introducirse suspensiones líquidas acuosas en el tracto gastrointestinal mediante ingestión oral o supositorio (por ejemplo, para obtener imágenes del estómago y tracto gastrointestinal), pueden insertarse con una jeringa en espacios no vasculares tales como la cavidad cerebro-espinal o inyectarse en el sistema vascular de forma general o en los vasos sanguíneos de un órgano específico tal como la arteria coronaria. Además, los agentes de contraste de la invención también pueden inyectarse en otros espacios del cuerpo tales como el espacio ocular anterior y posterior, el oído, la vejiga urinaria (por ejemplo, a través de la uretra), las cavidades peritoneales, uréter, uretra, pelvis renal, espacios en las articulaciones de los huesos, vasos linfáticos, espacios subaracnoides, cavidades ventriculares y similares.
El recubrimiento polimérico que contiene núcleos sólidos o líquidos de la composición que contiene flúor permite la administración directa de altas dosis de agente de composición que contiene flúor en volúmenes relativamente pequeños. Esto minimiza las molestias al paciente al recibir grandes volúmenes de líquido.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una solución al problema de la administración de fármacos sustancialmente insolubles en agua tales como taxol que no se ha descrito en la bibliografía. De esta forma, se ha descubierto que la administración de tales fármacos puede realizarse en forma de suspensión acuosa de partículas con un tamaño de micrómetros o en forma de suspensión acuosa que contiene partículas de tal fármaco o el fármaco disuelto en un líquido no acuoso biocompatible. Esta solución facilitaría la administración de tales fármacos a concentraciones relativamente altas y por lo tanto obvia el uso de emulsionantes y sus efectos secundarios tóxicos asociados.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, el modo de administración descrito anteriormente se facilita con las nuevas composiciones que contienen fármaco en las que se un fármaco sustancialmente insoluble en agua tal como paclitaxel se suspende en un líquido biocompatible y en la que la suspensión resultante contiene partículas de tal fármaco (por ejemplo, paclitaxel) con una dimensión transversal no mayor de aproximadamente 10 micrómetros. El tamaño de partícula deseado de menos de 10 micrómetros puede conseguirse de una diversidad de formas, por ejemplo, triturando, secando con nebulizador, por precipitación, irradiación ultrasónica y similares.
Debido al tamaño de cristal de los fármacos sustancialmente insolubles en agua obtenidos de forma convencional tales como paclitaxel que es mayor de 20 micrómetros, las partículas sólidas de tales fármacos (por ejemplo paclitaxel) no se han administrado en forma de suspensión en un vehículo tal como solución salina normal. Sin embargo, la presente invención describe la administración de una suspensión particulada de fármacos sustancialmente insolubles en agua (tal como paclitaxel) triturado a un tamaño menor de aproximadamente 10 micrómetros, preferiblemente menor de aproximadamente 5 micrómetros y más preferiblemente menor de aproximadamente 1 micrómetro, que permite la administración intravenosa en forma de suspensión sin riesgo de bloqueo en la microcirculación de órganos y tejidos.
Debido a la naturaleza microparticular del fármaco administrado, la mayor parte del fármaco se elimina de la circulación en los órganos que tienen sistemas reticuloendoteliales tales como el bazo, hígado y pulmones. Esto permite dirigir específicamente a los agentes farmacológicamente activos a tales sitios dentro del cuerpo.
Los líquidos biocompatibles contemplados para el uso en esta realización son los mismos que se han descrito anteriormente. Además, los agentes nutricionales parenterales tales como Intralipid (nombre comercial de una emulsión de grasa disponible en el mercado usada como agente de nutrición parenteral; disponible en Kabi Vitrum, Inc., Clayton, North Carolina), Nutralipid (nombre comercial de una emulsión de grasa disponible en el mercado usada como agente de nutrición parenteral; disponible en McGaw, Irvine, California), Liposyn III (nombre comercial de una emulsión de grasa disponible en el mercado usada como agente de nutrición parenteral (contiene 20% de aceite de soja, 1,2% de fosfatidas de huevo y 2,5% de glicerina; disponible en Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) y similares pueden usarse como vehículo de las partículas de fármaco. Como alternativa, si el líquido biocompatible contiene un material que solubiliza fármacos tal como aceite de soja (por ejemplo, como en el caso de Intralipid), el fármaco puede estar parcial o completamente solubilizado dentro del vehículo líquido, ayudando a su administración. Un ejemplo de tal caso es la administración de taxol en Intralipid como vehículo. Los líquidos biocompatibles preferidos actualmente para el uso en esta realización son agentes de nutrición parenteral, tales como aquellos que se han descrito anteriormente.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una composición para la administración in vivo de paclitaxel en la que el paclitaxel se disuelve en un agente de nutrición parenteral.
A continuación la invención se describirá más detalladamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 Preparación de recubrimiento de proteínas que contiene aceite
Tres ml de una solución de albúmina de suero humano (Alpha Therapeutic Corporation) USP (United States Pharmacopoeia) al 5% se introdujeron en un recipiente cilíndrico que se podía unir a una sonda de sonicación (Heat Systems, Modelo XL2020). La solución de albúmina de cubrió con 6,5 ml de aceite de soja calidad USP (aceite de soja). El extremo de la sonda de sonicación se introdujo en la interfaz entre las dos soluciones y el montaje se mantuvo en un baño de refrigeración a 20ºC. El sistema se dejó equilibrar y el sonicador se encendió durante 30 segundos. Se mezcló enérgicamente y se obtuvo una solución blanca lechosa. La suspensión se diluyó 1:5 con solución salina normal. Se utilizó un contador de partículas (Particle Data Systems, Elzone, Modelo 280PC) para determinan la distribución de tamaño y la concentración de recubrimientos de proteínas que contienen aceite. Se determinó que los recubrimientos de proteínas resultantes tenían una dimensión transversal máxima de aproximadamente 1,35 \pm 0,73 micrómetros y que la concentración total era de \sim 10^{9} recubrimientos/ml en la suspensión original.
Como control, los componentes anteriores, en ausencia de proteína, no formaron una microemulsión estable al someterse a irradiación ultrasónica. Este resultado sugiere que la proteína es esencial para la formación de las microesferas. Esto se confirma con los estudios de micrografo de barrido electrónico y micrografo de transmisión de electrones tal y como se describe a continuación.
Ejemplo 2 Parámetros que afectan a la formación del recubrimiento polimérico
Se ensayaron diversas variables tales como concentración de proteína, temperatura, tiempo de sonicación, concentración de agente farmacológicamente activo e intensidad acústica para optimizar la formación de recubrimiento polimérico. Estos parámetros se determinaron para recubrimientos de albúmina de suero bovina reticulada que contienen tolueno.
Los recubrimientos poliméricos fabricadas con soluciones que tienen concentraciones de proteína de 1%, 2,5%, 5% y 10% se contaron con el contador de partículas para determinar un cambio en el tamaño y cantidad de recubrimientos poliméricos producidas. Se descubrió que el tamaño de los recubrimientos poliméricos no variaba de forma amplia con la concentración de proteína pero la cantidad de recubrimientos poliméricos formadas por ml de "suspensión lechosa" aumentó al aumentar la concentración de proteína hasta el 5%. Por encima de esa concentración no se observó un cambio significativo en la cantidad de recubrimientos poliméricos.
Se descubrió que la temperatura inicial del recipiente era importante para la preparación óptima de recubrimientos poliméricos. Típicamente, las temperaturas iniciales del recipiente se mantuvieron entre 0ºC y 45ºC. La tensión de la interfaz agua-aceite de los aceites usados para la formación del recubrimiento polimérico era un parámetro importante, que también variaba en función de la temperatura. Se observó que la concentración de agente farmacológicamente activo no afectaba de forma significativa al rendimiento de recubrimientos de proteína. Es relativamente poco importante si el agente farmacológicamente activo se incorpora en estado disuelto o suspendido en el medio de dispersión.
El tiempo de sonicación era un factor importante que determinaba la cantidad de recubrimientos poliméricos producidas por ml. Se descubrió que un tiempo de sonicación mayor de tres minutos producía una reducción en el recuento total de recubrimientos poliméricos, indicando una posible destrucción de recubrimientos poliméricos debido a una sonicación excesiva. Se descubrió que los tiempos de sonicación menores de tres minutos producían cantidades adecuadas de recubrimientos poliméricos.
De acuerdo con el nomógrafo proporcionado por el fabricante del sonicador, la potencia acústica del sonicador empleado en este experimento es aproximadamente 150 watios/cm^{2}. Se usaron tres niveles de potencia en orden creciente y se descubrió que la cantidad máxima de recubrimientos poliméricos se obtenía con el nivel de potencia más alto.
Ejemplo 3 Preparación de recubrimientos poliméricos que contienen taxol disuelto
Se disolvió taxol en aceite de soja de calidad USP a una concentración de 2 mg/ml. Se introdujeron 3 ml de una solución de albúmina de suero humano USP al 5% en un recipiente cilíndrico que se podía unir a una sonda de sonicación (Heat Systems, Modelo XL2020). La solución de albúmina se cubrió con 6,5 ml de solución aceite de soja/taxol. El extremo de la sonda de sonicación se introdujo en la interfaz entre las dos soluciones y el montaje se mantuvo en equilibrio y el sonicador se encendió durante 30 segundos. Se mezcló enérgicamente y se obtuvo una solución blanca lechosa que contenía recubrimientos poliméricos con paredes de proteínas que contenían a la solución de aceite/taxol.
Para obtener una mayor carga de fármaco en el recubrimiento de proteína reticulada, se puede mezclar con el aceite un disolvente mutuo para el aceite y el fármaco (en el cual el fármaco tiene una solubilidad considerablemente mayor). Siempre que este disolvente sea relativamente no tóxico (por ejemplo acetato de etilo), puede inyectarse junto con el vehículo original. En otros casos, puede retirarse por evaporación del líquido al vacío después de la preparación de los recubrimientos poliméricos.
Ejemplo 4 Estabilidad de los recubrimientos poliméricos
Se analizó la estabilidad de suspensiones de recubrimientos poliméricos a concentraciones conocidas a tres temperaturas distintas (es decir, 4ºC, 25ºC y 38ºC). La estabilidad se midió con el cambio en el recuento de partículas en el tiempo. Se prepararon recubrimientos de proteína (albúmina) reticulada que contenían aceite de soja (SBO) como se ha descrito anteriormente (véase Ejemplo 1), se diluyeron en solución salina hasta una concentración final de aceite del 20% y se almacenaron a las temperaturas indicadas anteriormente. Los recuentos de partículas (Elzone) obtenidos para cada una de las muestras en función del tiempo se resumen en la Tabla 2.
TABLA 2
3
Como se demuestra con los datos anteriores, la concentración de partículas contadas (es decir, recubrimientos poliméricos) permanece relativamente constante durante la duración del experimento. El intervalo es relativamente constante y permanece entre aproximadamente 7-9\cdot10^{10}/ml, indicando una buena estabilidad de las recubrimiento poliméricos en una diversidad de condiciones de temperatura durante casi cuatro semanas.
Ejemplo 5 Biodistribución in vivo de recubrimientos de proteína reticulada que contienen un fluoróforo
Para determinar la absorción y biodistribución del líquido encapsulado dentro de los recubrimientos poliméricos de proteína después de una inyección intravenosa, se introdujo un pigmento fluorescente (rubrene, disponible en Aldrich) dentro de un recubrimiento polimérico de proteína con albúmina de suero humano (HSA) y se uso como marcador. De esta forma, el rubrene se disolvió en tolueno y los recubrimientos de albúmina reticulada que contenían toleno/rubrene se prepararon como se ha descrito anteriormente por irradiación ultrasónica. La suspensión lechosa resultante se diluyó cinco veces en solución salina normal. Después, se inyectaron 2 ml de suspensión diluida en la vena de la cola de una rata durante 10 minutos. Un animal se sacrificó una hora después de la inyección y otro 24 horas después de la inyección.
Se examinaron secciones congeladas de 100 micrómetros de pulmón, hígado, riñón, bazo y médula ósea en un microscopio de fluorescencia para detectar la presencia del pigmento fluorescente encapsulado en el recubrimiento polimérico o de pigmento liberado. En una hora, la mayoría de los recubrimientos poliméricos parecían estar intactos (es decir, aparecían como partículas claramente fluorescentes de aproximadamente 1 micrómetro de diámetro) y estaban localizadas en los pulmones e hígado. A las 24 horas, el pigmentó se observó en el hígado, pulmones, bazo y médula ósea. También se observó una pigmentación general del tejido, indicando que la pared del recubrimiento de los recubrimientos poliméricos se había digerido y que se había liberado el pigmento. Este resultado fue consistente con los resultados esperados y demuestra el uso potencial de composiciones de la invención para la liberación retrasada o controlada de un agente farmacéutico encapsulado tal como taxol.
Ejemplo 6 Toxicidad de los recubrimientos poliméricos que contienen aceite de soja (SBO)
Se prepararon recubrimientos poliméricos que contenían aceite de soja como se ha descrito en el Ejemplo 1. La suspensión resultante se diluyó en solución salina normal para producir dos soluciones diferentes, una que contenía 20% de BSO y la otra que contenía 30% de SBO.
Intralipid, una agente TPN disponible en el mercado, contiene 20% de SBO. La LD_{50} de Intralipid en ratones es 120 ml/kg, o aproximadamente 4 ml para un ratón de 30 g, cuando se inyecta a 1 cc/min.
Dos grupos de ratones (tres ratones en cada grupo; cada ratón pesa aproximadamente 30 g) se trataron con la composición de la invención que contenía SBO como se indica a continuación. A cada ratón se le inyectaron 4 ml de la suspensión preparada de recubrimientos poliméricos que contienen SBO. Cada miembro de un grupo recibió la suspensión que contenía 20% de SBO mientras que cada miembro del otro grupo recibió la suspensión que contenía 30% de SBO.
Los tres ratones del grupo que recibía la suspensión que contenía 20% de SBO sobrevivieron a tal tratamiento y no mostraron una gran toxicidad en ningún tejido u órgano en una observación una semana después del tratamiento con SBO. Solo uno de los ratones del grupo que recibía la suspensión que contenía 30% de SBO murió después de la inyección. Estos resultados demuestran claramente que el aceite contenido en los recubrimientos poliméricos de acuerdo con la presente invención no es tóxico para su dosis LD_{50}, en comparación con una formulación de SBO disponible en el mercado (Intralipid). Este efecto puede atribuirse a la lenta liberación (es decir, velocidad controlada para hacerse biodisponible) del aceite de dentro del recubrimiento polimérico. Tal liberación lenta evita alcanzar una dosis letal de aceite, en contraste con las altas dosificaciones de aceite alcanzadas con las emulsiones disponibles en el mercado.
Ejemplo 7 Biodisponibilidad in vivo del aceite de soja liberado de recubrimientos poliméricos
Se realizó un ensayo para determinar la liberación lenta o sostenida del material encapsulado en el recubrimiento polimérico después de la inyección de una suspensión de recubrimientos poliméricos en el flujo sanguíneo de ratas. Los recubrimientos poliméricos con paredes de proteína (albúmina) reticulada que contenían aceite de soja (SBO) se prepararon por sonicación como se ha descrito anteriormente. La suspensión resultante de recubrimientos poliméricos que contenían aceite se diluyó en solución salina a una suspensión final que contenía 20% de aceite. Se inyectaron 5 ml de esta suspensión en la vena yugular externa canulada de ratas durante un periodo de 10 minutos. Se tomaron muestras de sangre de estas ratas en varios momentos después de la inyección y se determinó el nivel de triglicéridos (el aceite de soja es principalmente triglicéridos) en la sangre mediante un análisis convencional.
Como control se usaron 5 ml de una emulsión de grasa disponible en el mercado (Intralipid, un agente acuoso de nutrición parenteral - - - contiene 20% de aceite de soja, 1,2% de fosfolípidos de yema de huevo y 2,25% de glicerina). El control utiliza fosfatida de huevo como emulsionante para estabilizar la emulsión. Una comparación de los niveles en suero de triglicéridos en los dos casos daría una comparación directa de la biodisponibilidad del aceite en función del tiempo. Además de la suspensión de recubrimientos poliméricos que contenían 20% de aceite, también se inyectaron 5 ml de una muestra que recubrimientos poliméricos que contenían aceite en solución salina a una concentración final de 30% de aceite. Se usaron dos ratas en cada uno de los tres grupos. Los niveles en sangre de triglicéridos en cada caso están tabulados en la Tabla 3, dados en unidades de mg/dl.
TABLA 3
4
Los niveles en sangre antes de la inyección se muestran en la columna marcada "Pre". Claramente, para el control con Intralipid, se observan niveles muy altos de triglicéridos después de la inyección. Se observa que los niveles de triglicéridos tardan aproximadamente 24 horas en volver a los niveles pre-inyección. De esta forma, se observa que el aceite está inmediatamente biodisponible para el metabolismo después de la inyección.
La suspensión de recubrimientos poliméricos que contienen aceite que contienen la misma cantidad total de aceite que de Intralipid (20%) muestran una disponibilidad muy distinta de triglicéridos detectables en suero. El nivel aumenta a aproximadamente dos veces su valor normal y se mantiene a este nivel durante muchas horas, indicando una liberación lenta o sostenida de triglicérido en sangre a niveles relativamente cercanos a los normales. El grupo que recibe los recubrimientos poliméricos que contienen aceite con un 30% de aceite muestran un mayor nivel de triglicéridos (consistente con la mayor dosis administrada) que vuelve al nivel normal a las 48 horas. Una vez más, los niveles en sangre de triglicéridos no aumentan astronómicamente en este grupo, en comparación con el grupo de control que recibe Intralipid. Este indica otra vez la disponibilidad lenta y sostenida del aceite de la composición de la invención, lo que tiene las ventajas de evitar niveles peligrosamente altos de material contenido en los recubrimientos poliméricos y la disponibilidad en un periodo de tiempo extendido a niveles aceptables. Claramente, los fármacos administrados dentro de los recubrimientos poliméricos de la presente invención conseguirían estas mismas ventajas.
Tal sistema de recubrimientos poliméricos que contienen aceite soja podría suspenderse en una solución acuosa de aminoácidos, esencialmente electrolitos, vitaminas y azúcares para formar un agente de nutrición parenteral (TPN). Tal TPN no puede formularse con las emulsiones de grasa disponibles en la actualidad (por ejemplo, Intralipid) debido a la inestabilidad de la emulsión en presencia de electrolitos.
Ejemplo 8 Preparación de recubrimientos poliméricos con paredes de proteína reticulada que contienen un núcleo sólido de agente farmacológicamente activo
Otro método para administrar un fármaco poco soluble en agua tal como taxol dentro de un recubrimiento polimérico es preparar un recubrimiento de material polimérico alrededor de un núcleo sólido de fármaco. Tal partícula de fármaco "recubierta con proteína" puede obtenerse como se indica a continuación. Se repite el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 usando un disolvente orgánico para disolver el taxol a una concentración relativamente alta. Los disolventes usados generalmente son disolventes orgánicos tales como benceno, tolueno, hexano, éter etílico y similares. Los recubrimientos poliméricos se producen como se ha descrito en el Ejemplo 3. Cinco ml de suspensión lechosa de recubrimientos poliméricos que contienen taxol disuelto se diluyen a 10 ml en solución salina. Esta suspensión se introduce en un evaporador rotatorio a temperatura ambiente y el material volátil orgánico se retira al vacío. Después de aproximadamente 2 horas en el evaporador rotatorio, estas recubrimientos poliméricos se examinan en un microscopio para revelar núcleos opacos, que indican la retirada de sustancialmente todo el disolvente orgánico y la presencia de taxol sólido dentro de un recubrimiento de proteína.
Como alternativa, los recubrimientos poliméricos con núcleos de fármaco disuelto que contiene disolvente orgánico se liofilizan para obtener un polvo seco deleznable que se puede resuspender en solución salina (u otro líquido adecuado) en el momento de uso. En el caso de otros fármacos que no pueden estar en fase sólida a temperatura ambiente, se obtiene un recubrimiento polimérico con núcleo líquido. Este método permite la preparación de un recubrimiento con paredes de proteína reticulada que contiene fármaco no diluido dentro de si misma. Los análisis de tamaño de partícula muestran que estos recubrimientos poliméricos son más pequeños que aquellos que contienen aceite. Aunque la proteína preferida actualmente para usar en la formación del recubrimiento polimérico es la albúmina, pueden usarse otras proteínas tales como \alpha-2-macroglobulina, una conocida opsonina, para mejorar la absorción de los recubrimientos poliméricos por parte de las células de tipo macrófago. Como alternativa, se podría añadir un PEG-sulfhidrilo (descrito a continuación) durante la formación del recubrimiento polimérico para producir un recubrimiento polimérico con un mayor tiempo de circulación in vivo.
Ejemplo 9 Circulación y cinética de liberación in vivo de recubrimientos poliméricos
Se prepararon recubrimientos poliméricos de núcleo sólido que contenían taxol como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Ejemplo 3) y se suspendieron en solución salina normal. La concentración de taxol en la suspensión se midió por HPLC como se indica a continuación. En primer lugar, el taxol del recubrimiento polimérico se liberó con la adición de mercaptoetanol 0,1M (teniendo como resultado el intercambio de reticulaciones disulfuro de la proteína y ruptura de la reticulación del recubrimiento polimérico), después el taxol liberado se extrajo de la suspensión con acetonitrilo. La mezcla resultante se centrifugó y el sobrenadante se liofilizó. El material liofilizado se disolvió en metanol y se inyectó en una HPLC para determinar la concentración de taxol en la suspensión. Se descubrió que la concentración de taxol era de aproximadamente 1,6 mg/ml.
Se inyectó a ratas con 2 ml de esta suspensión a través de un catéter yugular. El animal se sacrificó a las dos horas y se midió la cantidad de taxol presente en el hígado mediante HPLC. Esto requirió una homogeneización del hígado, seguida de la extracción con acetonitrilo y liofilización del sobrenadante después de la centrifugación. El material liofilizado se disolvió en metanol y se inyectó en una HPLC. Aproximadamente el 15 de la dosis administrada se recuperó del hígado a las dos horas, indicando una dosificación significativa en el hígado. Este resultado es consistente con la función conocida del sistema reticuloendotelial del hígado en la liberación de partículas pequeñas de la sangre.
Ejemplo 10 Preparación de recubrimientos poliméricos con paredes de PEG reticulado
Como alternativa al uso de proteínas que contienen tiol (sulfhidrilo) en la formación de, o como aditivo a, los recubrimientos poliméricos de la invención, se preparó un PEG que contenía tiol. Se sabe que el PEG no es tóxico, ni inflamatorio, ni adhesivo a células y en general es biológicamente inerte. Se ha unido a proteínas para reducir su antigenicidad y a lípidos que forman liposomas para aumentar su tiempo de circulación in vivo. De esta forma, se espera que la incorporación de PEG en un recubrimiento esencialmente proteica aumente el tiempo de circulación así como la estabilidad del recubrimiento polimérico. Variando la concentración de PEG-tiol añadida a la solución de albúmina al 5%, fue posible obtener recubrimientos poliméricos con distintas estabilidades in vivo. El PEG-tiol se preparó con técnicas disponibles en la bibliografía (tales como la técnica de Harris y Herati, como se describe en Polymer Preprints Vol. 32:154-155 (1991)).
El PEG-tiol de peso molecular 2000 g/mol se disolvió a una concentración de 1% (0,1 g añadido a 10 ml) en una solución de albúmina al 5%. Esta solución de proteína/PEG se overlayered con aceite como se describe en el Ejemplo 1 y se sonicó para producir recubrimientos poliméricos que contienen aceite con paredes que comprenden proteína reticulada y PEG. La estabilidad de estos recubrimientos poliméricos se comprobó como se describe en el Ejemplo 4.
Otros polímeros sintéticos solubles en agua que pueden modificarse con grupos tiol y utilizarse en lugar de PEG incluyen, por ejemplo, alcohol de polivinilo, polihidroxietilmetacrilato, ácido poliacrílico, poletiloxazolina, poliacrilamida, polivinil pirrolidona, polisacáridos (tales como quitosano, alginatos, ácido hialurónico, dextranos, almidón, pectina y similares) y similares.
Por ejemplo, se descubrió que los recubrimientos de proteínas que contienen fluorocarbonos con mayores tiempos de circulación in vivo eran particularmente beneficiosos para la obtención de imágenes del sistema vascular. Estos recubrimientos permanecían en la circulación durante largos periodos en relación a los recubrimientos que no contenían PEG en las paredes del recubrimiento. Esto permitía, por ejemplo, la visualización de la circulación cardiaca y proporcionaba un medio no invasivo para evaluar la circulación coronaria en lugar de usar técnicas invasivas convencionales tales como la angiografia.
Ejemplo 11 Uso específico de un agente inmunosupresor en órganos transplantados usando administración intravenosa de recubrimientos poliméricos que contienen tales agentes
Los agentes inmunosupresores se usan habitualmente después de los transplantes de órganos para la prevención de episodios de rechazo. En particular, la ciclosporina, un potente agente inmunosupresor, prolonga la supervivencia de los transplantes alógenos que implican piel, corazón, riñón, páncreas, médula ósea, intestino delgado y pulmón en animales. Se ha demostrado que la ciclosporina suprime parte de la inmunidad humoral y en mayor medida, las reacciones mediadas con células tales como el rechazo de transplante, hipersensibilidad retrasada, encefalomielitis alérgica experimental, artritis de adyuvante de Freund y enfermedad de transplante contra anfitrión en muchas especies de animales en una diversidad de órganos. Se han realizado transplantes alógenos satisfactorios de riñón, hígado y corazón en seres humanos usando ciclosporina.
La ciclosporina se administra actualmente en forma oral como cápsulas que contienen una solución de ciclosporina en alcohol, y aceites tales como aceite de maíz, glicéridos polioxietilados y similares, o como solución en aceite de oliva, glicéridos polioxietilados y similares. También se administra por inyección intravenosa en cuyo caso se disuelve en una solución de etanol (aproximadamente 30%) y Cremaphor (aceite de ricino polioxietilado) que debe diluirse 1:20 a 1:100 en solución salina normal o dextrosa al 5% antes de la inyección. Comparada con una infusión intravenosa (i.v.), la biodisponibilidad absoluta de la solución oral es aproximadamente del 30% (Sandoz Pharmaceutical Corporation, Publicación SDI-Z10 (A4), 1990). En general, la administración i.v. de ciclosporina sufre problemas similares a la práctica actual de administración i.v. de taxol, es decir, reacciones anafilácticas y alérgicas que se cree que de deben al Cremaphor, el vehículo de administración empleado para la formulación i.v. Además, la administración intravenosa de fármaco (por ejemplo, ciclosporina) encapsulado como se ha descrito anteriormente evita peligrosos niveles máximos en sangre inmediatamente después de la administración del fármaco. Por ejemplo, una comparación de formulaciones disponibles actualmente para la ciclosporina con la forma encapsulada descrita anteriormente de ciclosporina mostró una reducción en cinco veces de los niveles máximos en sangre de ciclosporina inmediatamente después de la inyección.
Para evitar los problemas asociados con el Cremaphor, la ciclosporina contenida dentro de los recubrimientos poliméricos como se han descrito anteriormente puede administrarse por inyección i.v. Puede disolverse en un aceite biocompatible o en varios otros disolventes después de lo cual puede dispersarse en recubrimientos poliméricos por sonicación como se ha descrito anteriormente. Además, una ventaja importante para administrar ciclosporina (u otro agente inmunosupresor) en recubrimientos poliméricos en la administración específica local debido a la absorción del material inyectado por el sistema RES del hígado. Esto puede evitar, hasta cierto punto, la toxicidad sistémica y reducir las dosificaciones eficaces debido a la administración específica local. En el Ejemplo 9 se demuestra la eficacia de la administración y de la administración específica al hígado de taxol contenido dentro de recubrimientos poliméricos después de una inyección intravenosa. Se espera una resultado similar para la administración de ciclosporina (u otro agente inmunosupresor putativo) de acuerdo con la presente invención.
Ejemplo 12 Administración específica a anticuerpos de recubrimientos poliméricos
La naturaleza de los recubrimientos poliméricos de la invención permite la unión de anticuerpos monoclonales o policlonales al recubrimiento polimérico o la incorporación de anticuerpos en el recubrimiento polimérico. Los anticuerpos pueden incorporarse en el recubrimiento polimérico al formarse el recubrimiento con microcápsula polimérica o pueden unirse al recubrimiento con microcápsula polimérica después de la preparación de la misma. Pueden usarse técnicas convencionales de inmovilización de proteínas para este propósito. Por ejemplo, con microcápsulas de proteínas preparadas con una proteína tal como albúmina, un gran número de grupos amino en los restos lisina de la albúmina están disponibles para la unión de anticuerpos modificados de forma apropiada. Como ejemplo, se pueden administrar agentes antitumorales en un tumor incorporando anticuerpos contra el tumor en el recubrimiento polimérico al formarse, o los anticuerpos contra el tumor pueden unirse al recubrimiento con microcápsula polimérica después de la preparación de la misma. Como otro ejemplo, pueden administrarse productos genéticos a células específicas (por ejemplo, hepatocitos o ciertas células madre de la médula ósea) incorporando anticuerpos contra los receptores de las células diana al formarse el recubrimiento polimérico o los anticuerpos contra los receptores de las células diana pueden unirse al recubrimiento con microcápsula polimérica después de la preparación de la misma. Además, pueden usarse anticuerpos monoclonales contra receptores nucleares para dirigir el producto encapsulado al núcleo de ciertos tipos de células.
Ejemplo 13 Recubrimientos poliméricos como vehículos para construcciones de polinucleótidos, enzimas y vacunas
Al aceptarse cada vez más ampliamente la terapia génica como opción terapéutica viable (en la actualidad, más de 40 propuestas de transferencia de genes humanos han sido aprobadas por los comités de supervisión de la NIH y/O FDA), una de las barreras a superar en la implementación de esta solución terapéutica es la reluctancia a usar vectores virales para la incorporación de material genético en el genoma de una célula humana. Los virus son inherentemente tóxicos. De esta forma, los riesgos implicados en el uso de vectores virales en la terapia genética, especialmente para el tratamiento de enfermedades no letales no genéticas, son inaceptables. Desafortunadamente, los plásmidos traspasados sin usar un vector viral no se incorporan generalmente en el genoma de la célula diana. Además, al igual que con los fármacos convencionales, tales plásmidos tienen una vida media finita en el cuerpo. De esta forma, una limitación general en la implementación de la terapia genética (así como la terapia antisentido, que es una forma inversa de terapia genética, en la que un ácido nucleico u oligonucleótido se introduce para inhibir la expresión de un gen) ha sido la incapacidad para administrar de forma eficaz ácidos nucleicos u oligonucleótidos que son demasiado grandes para traspasar la membrana celular.
La encapsulación de ADN, ARN, plásmidos, oligonucleótidos, enzimas y similares en recubrimientos con microcápsulas de proteínas como se ha descrito en este documento puede facilitar su administración específica al hígado, pulmón, bazo, nódulos linfáticos y médula ósea. De esta forma, de acuerdo con la presente invención, tales compuesto biológicos pueden administrarse en sitios intracelulares sin el riesgo asociado con el uso de vectores virales. Este tipo de formulación facilita la absorción no específica de endocitosis de los recubrimientos poliméricos directamente del flujo sanguíneo a las células del RES, en las células del músculo por inyección intramuscular o por inyección directa en tumores. Además, pueden usarse anticuerpos monoclonales contra receptores nucleares para administrar específicamente el producto encapsulado al núcleo de ciertos tipos de células.
Las enfermedades diana de tales construcciones incluyen diabetes, hepatitis, hemofilia, fibrosis quística, esclerosis múltiple, cáncer en general, gripe, SIDA y similares. Por ejemplo, el gen del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1) puede encapsularse en los recubrimientos con microcápsulas de proteínas para la administración para el tratamiento de la neuropatía diabética periférica y caquexia. Los genes que codifican al Factor IX y Factor VIII (útiles para el tratamiento de la hemofilia) pueden administrarse específicamente al hígado por encapsulación en los recubrimientos con microcápsulas de proteína de la presente invención. De forma similar, el gen del receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL) puede administrarse específicamente al hígado para el tratamiento de la aterosclerosis por encapsulación en recubrimientos con microcápsulas de proteínas de la presente invención.
Otros genes útiles en la práctica de la presente invención son los genes que re-estimulan la respuesta inmune del cuerpo contra células de cáncer. Por ejemplo, los antígenos tales como HLA-B7, codificados por el ADN contenido en un plásmido, pueden incorporarse a un recubrimiento con microcápsulas de proteínas de la presente invención para inyectarlos directamente en un tumor (tal como un cáncer de piel). Una vez están en el tumor, el antígeno promocionará células específicas del tumor lo que aumenta el nivel de citoquinas (por ejemplo IL-2) que hacen al tumor una diana para el ataque del sistema inmune.
Como ejemplo adicional, los plásmidos que contienen porciones del genoma del virus adeno-asociado están contemplados para la encapsulación en recubrimientos con microcápsulas de proteínas de la presente invención. Además, los recubrimientos con microcápsulas de proteínas de la presente invención pueden usarse para administrar genes terapéuticos a células CD8+ T, para la inmunoterapia adoptiva frente a una diversidad de tumores y enfermedades infecciosas.
Los recubrimientos con microcápsulas de proteínas de la presente invención también pueden usarse como sistema de administración para hacer frente a enfermedades infecciosas mediante la administración específica de un nucleótido antisentido, por ejemplo, contra el virus de la hepatitis B. Un ejemplo de tal oligonucleótido sin sentido es el fosforotioato 21-mer contra la señal de poliadenilación del virus de la hepatitis B.
Los recubrimientos con microcápsulas de proteínas de la presente invención también pueden usarse para la administración del gen regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Los humanos que carecen de este gen desarrollan fibrosis quística, que puede tratarse nebulizando recubrimientos con microcápsulas de proteína de la presente invención que contienen el gen CFTR e inhalando directamente en los pulmones.
Las enzimas también pueden administrarse usando los recubrimientos con microcápsulas de proteína de la presente invención. Por ejemplo, la enzima ADNasa puede encaspularse y administrarse al pulmón. Igualmente, las ribozimas pueden encapsularse y administrarse específicamente a proteínas del recubrimiento de los virus o a células infectadas con virus uniendo anticuerpos adecuados al exterior del recubrimiento polimérico. Las vacunas también pueden encapsularse en las microcápsulas poliméricas de la presente invención y usarse para administración subcutánea, intramuscular o intravenosa.
Ejemplo 14 Preparación de construcciones de hemoglobina insoluble (IHC) para su uso como sustituto de glóbulos rojos
Se lavó un recipiente de reacción de vidrio de 20 ml, con brazo y manguito de titanio con alcohol y solución salina estéril antes de la síntesis al igual que todo el equipo usado. En una reacción típica, 3,5 ml de hemoglobina al 5% p/v (humana o bovina) se añadió a un recipiente de reacción que se unió al brazo ultrasónico (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W potencia máxima). Después, el brazo y el recipiente se sumergieron en un baño de control de temperatura fijado a 55ºC. Las reacciones ensayadas a 55ºC parecían ser óptimas, sin embargo, el producto puede sintetizarse en un amplio intervalo de temperaturas (0 a 80ºC). El pH era 6,8. El control de temperatura es crítico para obtener altos rendimientos de material y la temperatura óptima depende de la configuración experimental específica. La fuente ultrasónica se encendió con un nivel de potencia de 7. El uso del nomógrafo del fabricante sugería una potencia de salida de aproximadamente 150 W/cm^{2}. La reacción se completa en aproximadamente 30 segundos. Los rendimientos con tiempos de reacción más cortos y más largos parecen ser menores. Para la hemoglobina bovina, la solución al 2,5% p/v se pasó a través de una columna de permeación en gel Sephadex G-25 para retirar aniones tales como fosfatos. En una síntesis típica de hemoglobina humana IHC, el brazo ultrasónico se situó en la interfaz aire-agua. La suspensión homogénea producida contiene glóbulos rojos proteicos. Después, la suspensión acuosa puede almacenarse en un recipiente estéril a 4ºC.
Una reacción típica produce una solución que contiene aproximadamente 3 X 10^{8} recubrimientos de IHC por ml con un diámetro medio de recubrimiento de 3 micrómetros con una desviación estándar de 1 micrómetro. Este procedimiento sintético produce altas concentraciones de biomaterial con tamaño de micrómetros con distribuciones de tamaño estrechas.
Después de la síntesis, la IHC permanece en suspensión en la solución de proteína nativa. Para preparar la IHC con la proteína que no ha reaccionado se usaron varios métodos: filtración, centrifugación y diálisis. El primer método incluyó filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa Anotop con tamaño de poro de 0,2 \mum de diámetro (Whatman, Inc.). El filtro se lavó con varios volúmenes de agua hasta que el filtrado contenía muy poco o nada de proteína (determinado por espectroscopia UV-visible). La IHC se "reextrajo" del filtro y se resuspendió en un volumen equivalente de solución salina. El segundo procedimiento de purificación implicó el uso de un filtro de centrifugación Centricon con un corte de peso molecular de 100 kilodaltons (kD). El filtro centrífugo es un tubo de centrifugado separado por una membrana de filtración en el medio. La centrifugación de la solución IHC a 1000 G durante 5 minutos permitió que la mayor parte de la hemoglobina no reaccionada (64,5 kD) pasase a través de la membrana. Finalmente, la diálisis con una membrana de alto peso molecular (300 kD) también se usó para purificar la IHC. Sin embargo, este método requirió aproximadamente 2 días de diálisis. El método preferido para la purificación de la IHC es con la centrifugación Centricon.
Ejemplo 15 Preparación de una construcción de hemoglobina insoluble/albúmina como un sustituto de glóbulo rojo
Se lavó un recipiente de reacción de vidrio de 20 ml, con brazo y manguito de titanio con alcohol y solución salina estéril antes de la síntesis al igual que todo el equipo usado. En una reacción típica, se añadieron 3,5 ml de hemoglobina al 5% p/v y albúmina (humana o bovina; la relación de hemoglobina/albúmina variaba de 0,5 a 2) a un recipiente de reacción que se unió al brazo ultrasónico (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W potencia máxima). Después, el brazo y el recipiente se sumergieron en un baño de control de temperatura fijado a 55ºC. Las reacciones ensayadas a 55ºC parecían ser óptimas, sin embargo, el producto puede sintetizarse en un amplio intervalo de temperaturas (0 a 80ºC). El pH era 6,8. El control de temperatura es crítico para obtener altos rendimientos de material y la temperatura óptima depende de la configuración experimental específica. La fuente ultrasónica se encendió con un nivel de potencia de 7. El uso del nomógrafo del fabricante sugería una potencia de salida de aproximadamente 150 W/cm^{2}. La reacción se completa en aproximadamente 30 segundos. Los rendimientos con tiempos de reacción más cortos y más largos parecen ser menores. La suspensión homogénea producida contiene glóbulos rojos proteicas. La suspensión acuosa se filtró, se lavó, se resuspendió en solución salina estéril y se almacenó en un recipiente estéril a 4ºC.
Como se ha descrito anteriormente, una reacción típica produce una solución que contiene aproximadamente 3 X
10^{8} recubrimientos de IHC por ml con un diámetro medio de recubrimiento de 3 micrómetros con una desviación estándar de 1 micrómetro. Este procedimiento sintético produce altas concentraciones de biomaterial con tamaño de micrómetros con distribuciones de tamaño estrechas.
Como alternativa, puede utilizarse un sistema de "flujo a través" que permite el procesamiento continuo de la IHC. Tal sistema consiste en bombas peristálticas que bombean continuamente corrientes de hemoglobina y opcionalmente un aceite o fluorocarbono biocompatible en un recipiente de reacción con una sonda sonicadora. Se mantiene durante un tiempo de residencia apropiado en el recipiente y la IHC se recupera por desbordamiento del recipiente en un tanque de recuperación. La solución de hemoglobina no reaccionada se recicla en el recipiente de reacción.
Ejemplo 16 Preparación de construcciones de hemoglobina insoluble que contienen fluorocarbonos encapsulados
Se lavó un recipiente de reacción de vidrio de 20 ml, con brazo y manguito de titanio con alcohol y solución salina estéril antes de la síntesis al igual que todo el equipo usado. En una reacción típica, 3,5 ml de hemoglobina al 5% p/v) se añadió a un recipiente de reacción que se unió al brazo ultrasónico (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W potencia máxima). Se añadió un fluorocarbono, perfluorodecalina 3,5 ml, al recipiente de reacción. Después, el brazo y el recipiente se sumergieron en un baño de control de temperatura fijado a 20ºC. El pH de la fase acuosa era 6,8. La fuente ultrasónica se encendió con un nivel de potencia de 7. El uso del nomógrafo del fabricante sugería una potencia de salida de aproximadamente 150 W/cm^{2}. La reacción se completa en aproximadamente 30 segundos. La suspensión homogénea producida contiene las microcápsulas o microesferas de recubrimientos de hemoglobina reticulada insoluble con perfluorodecalina encapsulada en el interior. La suspensión lechosa se filtra, se lava, se resuspende en solución salina estéril como se ha descrito anteriormente y se almacena en un recipiente estéril a 4ºC.
Como se ha descrito anteriormente, una reacción típica produce una solución que contiene aproximadamente 10^{8} recubrimientos por ml con un diámetro medio de recubrimiento de 3 micrómetros con una desviación estándar de 1 micrómetro. Este procedimiento sintético produce altas concentraciones de biomaterial con tamaño de micrómetros con distribuciones de tamaño estrechas.
Ejemplo 17 Preparación de construcciones de albúmina insoluble que contienen fluorocarbonos encapsulados
Se lavó un recipiente de reacción de vidrio de 20 ml, con brazo y manguito de titanio con alcohol y solución salina estéril antes de la síntesis al igual que todo el equipo usado. En una reacción típica, 3,5 ml de albúmina al 5% p/v (humana o bovina) se añadió a un recipiente de reacción que se unió al brazo ultrasónico (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W potencia máxima). Se añadió un fluorocarbono, perfluorodecalina 3,5 ml, al recipiente de reacción. Después, el brazo y el recipiente se sumergieron en un baño de control de temperatura fijado a 20ºC. El pH de la fase acuosa era 6,8. La fuente ultrasónica se encendió con un nivel de potencia de 7. El uso del nomógrafo del fabricante sugería una potencia de salida de aproximadamente 150 W/cm^{2}. La reacción se completa en aproximadamente 30 segundos. La suspensión homogénea producida contiene las microcápsulas o microesferas de recubrimientos de albúmina insoluble reticulada con perfluorodecalina (o perfluorotripropil amina) encapsulada en el interior. La suspensión lechosa se filtra, se lava, se resuspende en solución salina estéril como se ha descrito anteriormente y se almacena en un recipiente estéril a 4ºC.
Como se ha descrito anteriormente, una reacción típica produce una solución que contiene aproximadamente 10^{8} recubrimientos por ml con un diámetro medio de recubrimiento de 3 micrómetros con una desviación estándar de 1 micrómetro. Este procedimiento sintético produce altas concentraciones de biomaterial con tamaño de micrómetros con distribuciones de tamaño estrechas.
Ejemplo 18 Construcciones de hemoglobina insoluble modificadas adicionalmente con modificadores alostéricos tales como piridoxal 5'-fosfato (PLP)
Para obtener construcciones de hemoglobina con afinidades variables al oxígeno (es decir, P_{50} variable), las IHC se hicieron reaccionar adicionalmente con PLP, un conocido modulador alostérico. Una suspensión de IHC (obtenida como en el Ejemplo 14) en tampón tris se desoxigenó a 10ºC en una atmósfera de nitrógeno. Se tomaron 10 ml de la suspensión desoxigenada de IHC en cada uno de los seis recipientes de reacción distintos. Se añadieron distintas relaciones molares de PLP/Hb a cada uno de los recipientes. Fueron 0,1/,30, 0,75/3,0,1,5/3,0, 3,0/3,0, 4,2/3,0, 6,0/3,0. Después de 30 minutos, se añade un exceso de diez veces de borohidruro sódico para reducir la base de Schiff durante otros 30 minutos. Después, la suspensión se filtra por centrifugación, se lava tres veces con solución salina tamponada, se resuspende en solución salina tamponada y se almacena a 4ºC. Esta modificación actúa específicamente en los grupos amino terminales de la cadena b-globina de la desoxihemoglobina. En este caso, la modificación imita fielmente la acción de 2,3-DPG (que se une a la lisina EF6(82)b) en la estabilización de la confirmación desoxi.
Los seis grados de modificación diferentes tendrán como resultado IHC con mayores P_{50} (menores afinidades al oxígeno) con mayores grados de sustitución PLP.
Ejemplo 19 Construcciones insolubles con recubrimientos reticuladas de hemoglobina y polietilenglicol
Se conoce que el polietilenglicol no es tóxico, ni inflamatorio, ni adhesivo a células y en general, es biológicamente inerte. Se ha descubierto que las proteínas que se unen a PEG son menos antigénicas. Con los liposomas, se descubrió que la circulación aumentaba con la unión / incorporación de PEG. De esta forma, se espera que la incorporación de PEG en la RBC aumente el tiempo de circulación. Variando la concentración de PEG-tiol añadida a la proteína (por ejemplo, hemoglobina), fue posible preparar RBC con PEG-hemoglobina que tenía distintas estabilidades. El PEG-tiol se preparó con técnicas de la bibliografía (tal como Harris y Heart Polymer Preprints 32:154 (1991).
El PEG-tiol de peso molecular 2000 g/mol se disolvió a una concentración del 1% (0,1 g añadido a 10 ml) en una solución de hemoglobina al 5%. La solución de proteína-peg se sonicó para formar el sustituto de glóbulo rojo como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Ejemplo 20 Construcciones de hemoglobina insoluble con polietilenglicol unido covalentemente al exterior del recubrimiento
La IHC se preparó como se describe en el Ejemplo 14. Se hizo reaccionar polietilenglicol de peso molecular 10.000 (PEG 10k) con 1,1'-carbonil diimidazol CDI de acuerdo con técnicas disponibles en la bibliografía (Beauchamp et al. Analytical Biochemistry 131: 25-33, 1983). La IHC se suspendió en tampón borato 50 mM pH 8,0 y se añadió PEG-CDI (exceso 2 molar en relación a las lisinas totales de la hemoglobina) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La PEG-IHC resultante se separó por filtración, se lavó en solución salina y se resuspendió en solución salina tamponada estéril.
Ejemplo 21 Parámetros que afectan a la formación de construcciones de hemoglobina insoluble
Se analizaron diversas variables tales como concentración de proteína, temperatura, tiempo de sonicación, intensidad acústica y pH para optimizar la formación de la IHC.
Estos materiales se prepararon con soluciones de hemoglobina al 1%, 2,5%, 5% y 10%. También se prepararon con una solución de proteína mixta tal como hemoglobina y albúmina de suero humano con concentraciones de nuevo en el intervalo entre 1 y 10%. El tamaño y la concentración se determinaron y con aparato de recuento de partículas. Se descubrió que el tamaño no variaba de forma significativa con una mayor concentración de proteína. La cantidad preparada aumentó con la concentración de proteína de partida hasta aproximadamente un 5%. No se observo un cambio significativo en la cantidad por encima de esa concentración.
Se descubrió que la temperatura inicial del recipiente era importante para la preparación óptima de IHC. Típicamente, las temperaturas iniciales de reacción se mantuvieron entre 0 y 80ºC. La temperatura de partida óptima era de aproximadamente 70ºC.
El tiempo de sonicación también fue un factor importante que determinaba la cantidad de IHC producidas por ml. Se descubrió que un tiempo de sonicación de aproximadamente 30 segundos era bueno para sintetizar una alta concentración de IHC. Los tiempos de sonicación más cortos o más largos produjeron menor cantidad de IHC aunque aún adecuada.
De acuerdo con el nomógrafo proporcionado por el fabricante del sonicador, el nivel de potencia acústica del sonicador usado en estos experimentos es de aproximadamente 150 watios/cm^{2}. Se descubrió que otros niveles de potencia también producían una gran cantidad de IHC.
Ejemplo 22 Construcciones de hemoglobina insoluble como vehículos de fármaco de fármacos solubles en aceite
Los efectos citotóxicos de diversos fármacos antineoplásicos se potencian en gran medida en presencia de oxígeno. Por lo tanto es deseable administrar un fármaco en un sitio con un tumor mientras se aumenta la concentración de oxígeno en ese sitio. Las microesferas de hemoglobina de la presente invención permiten esa capacidad. El Ejemplo 16 anterior describe la encapsulación de un líquido de fluorocarbono en un recubrimiento de hemoglobina insoluble. Los fármacos citotóxicos tales como ciclofosfamida, BCNI, Melphalan, taxol, camptotecina, adriamicina, etoposida y similares, pueden disolverse en el fluorocarbono u otro aceite adecuado tal como aceite de soja y encapsularse en la construcción de hemoglobina.
Se disolvió taxol en aceite de soja (SBO) a una concentración de 5 mg/ml. Se introdujeron 3,5 ml de una solución de hemoglobina al 5% en un recipiente de reacción y se añadieron 3,5 ml del SBO/taxol al recipiente. La mezcla de dos fases se sonicó como se ha descrito en el Ejemplo 16 para obtener recubrimientos de hemoglobina insoluble reticulada que contenían SBO/Taxol.
Ejemplo 23 Recubrimientos poliméricos como vehículos de fármaco de fármacos solubles en agua
Varios fármacos solubles en agua son candidatos para la encapsulación en recubrimientos poliméricos. Como ejemplo, se disolvió metotrexato en agua a una concentración de 5 mg/ml. Un ml de esta solución acuosa se emulsionó con 4 ml de aceite de soja usando Pluronic-65 (un copolímero en bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno) para formar una microemulsión estable de agua en aceite (W/O). 3,5 ml de una solución de hemoglobina al 3,5% se cubrieron con 3,5 ml de esta microemulsión W/O y se sonicó durante 30 segundos para obtener construcciones de hemoglobina insoluble que contenían una microemulsión encapsulada con metotrexato.
Ejemplo 24 Recubrimientos poliméricos como vehículos de proteínas
Varias proteínas son candidatas para la encapsulación en recubrimientos poliméricos, por ejemplo hemoglobina, albúmina y similares. Por ejemplo, como método para aumentar la carga de hemoglobina de la IHC, la hemoglobina podría encapsularse en la IHC en lugar del fármaco soluble en agua del Ejemplo 23. La hemoglobina se disolvió en agua a una concentración del 10%. Un ml de esta solución acuosa se emulsionó con 4 ml de aceite de soja usando Pluronic-65 (un copolímero en bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno) para formar una microemulsión estable de agua en aceite (W/O). 3,5 ml de una solución de hemoglobina al 3,5% se cubrió con 3,5 ml de esta microemulsión W/O que contenía hemoglobina. La mezcla de dos fases se sonicó durante 30 segundos para obtener construcciones de hemoglobina insoluble que contenían una microemulsión encapsulada que también contenía hemoglobina. Este método sirvió para aumentar la cantidad total de hemoglobina por microesfera de IHC y por lo tanto para aumentó la capacidad de transporte de oxígeno para el oxígeno unido.
Ejemplo 25 Administración in vivo de construcciones de albúmina/fluorocarbono-Resonancia magnética (^{19}F-MRI) para detectar biodistribución
Se prepararon construcciones de albúmina que contenían perfluorononano como en el Ejemplo 17. La suspensión final se preparó de forma que contenía 20% en volumen del fluorocarbono en solución salina estéril. Dos ml de esta suspensión se inyectaron mediante inyección en la vena de la cola de una rata Sprague Dawley anestesiada con ketamina. La distribución in vivo del fluorocarbono se controló por ^{19}F-MRI es un instrumento de RMN Bruker 500 MHz. La rata se introdujo en una bobina de ^{19}F de 10 cm y las imágenes se obtuvieron usando una secuencia con un peso T_{1} con TR=1 segundo, TE=20 milisegundos y una matriz de datos de 256x128.
Una hora después de la administración, se descubrió que la mayor parte del FC se acumulaba en el hígado, pulmones y bazo. Parte del FC también podía detectase en la médula ósea. Se espera que las construcciones de hemoglobina se comporten de forma idéntica en términos de localización y acumulación en tejidos. Estas observaciones tenían implicaciones importantes para el tratamiento de tumores en hígado y pulmón y posiblemente para el tratamiento de células neoplásicas en la médula con altas dosis de oxígeno junto con la administración local de un fármaco citotóxico o como adyuvante a la radioterapia.
Ejemplo 26 Administración in vivo de construcciones que transportan fármacos
Se prepararon construcciones de hemoglobina insoluble que contenían Taxol encapsulado (en SBO) como en el Ejemplo 22. La suspensión final se preparó de forma que contenía un 20% en volumen del SBO en solución salina estéril. Dos ml de esta suspensión se inyectaron mediante inyección en la vena de la cola de una rata Sprague Dawley anestesiada con ketamina.
La rata se sacrificó dos horas después de la inyección y el hígado se recuperó. El hígado se homogeneizó con un pequeño volumen de solución salina y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se liofilizó, se disolvió en metanol y se inyectó en una columna HPLC. Aproximadamente, el 15% de la dosis inicial de taxol no metabolizado se recuperó en el hígado. Esto determinó la posibilidad de administrar específicamente fármacos neoplásicos en el hígado junto con la administración de oxígeno a estos sitios.
Ejemplo 27 Modelo de sustitución de sangre aguda para sustituto de sangre de hemoglobina insoluble
Se cateterizaron ratas Sprague Dawley anestesiadas (350-400 g) mediante la vena yugular externa. Aproximadamente el 70% de su volumen de sangre se retiró durante un periodo de 10 minutos. Las ratas se mantuvieron en este estado durante 10 minutos más después de los cuales se les reinfunde una suspensión iso-oncótica de IHC oxigenada con una P_{50} de 28 mm Hg. Se controlan continuamente la presión arterial media, pulso y respiración. La supervivencia de estas ratas se sigue con el tiempo.
Ejemplo 28 Construcciones de hemoglobina insoluble para la recuperación del tejido isquémico
Se explota la capacidad de las IHC para administrar oxígeno de forma preferente en un sitio isquémico. Las IHC con "alta afinidad", es decir, P_{50} < 28 mm Hg son útiles para este propósito ya que liberarán oxígeno solo en sitios en los que los gradientes de oxígeno son mayores que los encontrados normalmente en la circulación, es decir, en un sitio isquémico. Para este propósito se utiliza una IHC con P_{50} de 20 mm Hg.
Se usa un modelo de oclusión carótida bilateral en una rata como modelo de "ictus" o isquemia cerebral. Ambas arterias carótidas se ocluyen mediante una ligadura temporal en una rata Sprague Dawley anestesiada con ketamina. En la rata de control, la ligadura se retira después de 15 minutos y se reanuda el flujo sanguíneo normal. En la rata del experimento, se infunde directamente 1 ml de suspensión IHC de alta afinidad en solución salina en cada arteria carótida después de la oxigenación externa de la suspensión IHC en un dispositivo de oxigenación. 24 horas después del tratamiento, las ratas se sacrifican, se recuperan sus cerebros, se fijan, se seccionan y se pigmentan con tetrazolio nitro azul (NBT) o azul de triptán para determinar el grado de muerte celular. Un bajo grado de muerte celular, determinado por la pigmentación con azul de triptán, se espera en la rata del experimento que recibió la IHC de la invención.
Ejemplo 29 Evaluación de vida media en circulación in vivo de construcciones de hemoglobina insoluble
Se cateterizó a ratas Sprague Dawley anestesiadas (350-400 g) mediante la vena yugular externa. A través del catéter se administra una inyección en embolada de una suspensión iso-oncótica de equivalente IHC al 20% del volumen de la sangre del animal. La sangre se retira en intervalos de muestra de 0,25 a 92 horas. Las muestras de sangre se centrifugan y se observa el plasma para detectar signos de hemólisis o presencia de hemoglobina soluble. Como las "microburbujas" de la IHC tienen un interior gaseoso (y por lo tanto son de menor densidad que el agua), suben a la superficie del plasma después de la centrifugación. Las microburbujas se separan, se resuspenden en solución salina y se cuentan en un contador de partículas. Después se determina la vida media de la IHC en circulación. En comparación con los sustitutos de sangre basados en hemoglobina de la técnica anterior, se espera que las IHC de la invención muestren una mejor vida media en circulación.
Ejemplo 30 IHC para conservación de órganos-Conservación del corazón de la rata
Se retira quirúrgicamente el corazón de una rata Sprague Dawley anestesiada y se le proporciona respiración artificial con aire ambiente. El corazón se sumerge en medio cristaloide ("medio Cardioplegia", CM) con la misma composición que el medio de conservación IHC (o IHC/FC, o Albúmina/FC) pero sin el componente hemoglobina. El corazón se perfunde con el CM durante varios minutos, refrigerándolo a 11ºC. Después el corazón se conserva con 140 ml de medio de conservación durante 12 horas a 12ºC. El medio IHC se perfunde continuamente con O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%. Después de 12 horas de conservación, se comprueba la función contráctil, de bombeo y energética del corazón usando un aparato de corazón de rata autónomo.
Ejemplo 31 Utilidad del medio IHC en cardioplegia para cirugía a corazón abierto
Se realiza un bypass cardiopulmonar y se administra "medio de cardioplegia" oxigenado que contiene IHC (o IHC/FC o Albúmina/FC) como vehículo para el oxígeno a 4ºC en forma de bolo de 500 a 100 ml en la raíz aórtica después del pinzamiento transversal y de ventilar apropiadamente la aorta. Se administran dosis adicionales de medio frío en la ostia coronaria izquierda y derecha y, en la caso de cirugías con bypass, el medio también se administra en los extremos de los implantes antes de la anastomosis final. El medio se administra cada 15 a 20 minutos en cantidades suficientes para mantener una temperatura fría en el miocardio. Después de completar el procedimiento, se retira el pinzamiento aórtico y se retoma el calentamiento del corazón.
Ejemplo 32 Utilidad del medio IHC en angioplastia o aterectomía
El medio IHC (o IHC/FC o Albúmina/FC) se administra durante los procedimientos de intervención emprendidos para restaurar el flujo en regiones obstruidas o poco irrigadas de un órgano. Algunos ejemplos de tales procedimientos son la angioplastia y la aterectomía. La isquemia regional puede mitigarse durante el inflado en globo del procedimiento de angioplastia percutánea transluminal coronaria administrando medio IHC oxigenado a una velocidad de aproximadamente 60 ml/min a través del lumen central del catéter del globo que dilata. El medio se administra a temperatura corporal y contiene, por ejemplo, electrolitos de Ringer y sustratos fisiológicamente compatibles. Una dosis de medio IHC equilibrada con oxígeno se infunde durante cada periodo de inflado del globo. Un procedimiento similar se usa durante el periodo de inflado de globo en procedimientos de aterectomía que se usan para retirar físicamente las obstrucciones en los vasos mediante un bisturí o un láser. La infusión del medio directamente en el vaso obstruido durante los procedimientos trombolíticos enzimáticos podría realizarse para proporcionar oxigenación distal a la obstrucciones mientras se lisa. Actualmente se usa Fluosol-DA durante algunos procedimientos de angioplastia; el medio IHC (o IHC/FC o Albúmina/FC) de la presente invención sustituiría a Fluosol-DA.
Ejemplo 33 Síntesis de dodecafluorononano (C_{9}F_{20}) encapsulado dentro de un recubrimiento polimérico
Se lavó un recipiente de reacción de vidrio de 20 ml, con brazo y manguito de titanio con alcohol y solución salina estéril antes de la síntesis al igual que todo el equipo usado. En una reacción típica, 3,5 ml de albúmina de suero humana al 5% p/v USP (Alpha Therapeutics Corporation) se añadió a un recipiente de reacción que se unió al brazo ultrasónico (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W potencia máxima). Después, el brazo y el recipiente se sumergieron en un baño de control de temperatura fijado a 22ºC. Las reacciones ensayadas a 22ºC parecían ser óptimas, sin embargo, el producto puede sintetizarse en un amplio intervalo de temperaturas (0 a 40ºC). El control de temperatura es crítico para obtener altos rendimientos de material y la temperatura óptima depende de la configuración experimental específica.
Después, se añadieron seis mililitros de dodecafluorononano (C_{9}F_{20}) y la fuente ultrasónica se encendió con un nivel de potencia de 7. La cantidad de fluorocarbono añadida puede variar de menos de un ml hasta aproximadamente 13 ml con buenos rendimientos de recubrimientos poliméricos de proteína. La reacción se completa en aproximadamente 30 segundos. Los rendimientos con tiempos de reacción más cortos y más largos parecen ser menores. La suspensión homogénea producida contiene el dodecafluorononano encapsulado en recubrimientos poliméricos de proteína y es aproximadamente 60% de perfluorononano en volumen. La suspensión acuosa puede almacenarse en un recipiente estéril a 4ºC.
Una reacción típica produce una solución que contiene aproximadamente 1 X 10^{9} recubrimientos por ml con un diámetro medio de 2 micrómetros con una desviación estándar de 1 micrómetro. Este procedimiento sintético produce altas concentraciones de biomaterial con tamaño de micrómetros con distribuciones de tamaño estrechas.
Ejemplo 34 Síntesis de perfluorotributilamina (C_{12}F_{27}N) o perfluorotripropilamina (C_{9}F_{21}N) encapsulada dentro de recubrimientos poliméricos
La albúmina de suero humana al 5% p/v USP (3,5 ml) y fluoroamina (6 ml) se añadieron a un recipiente de reacción de vidrio y se irradiaron con ultrasonidos de alta intensidad. Las condiciones de reacción fueron un nivel de potencia 7, una temperatura del baño de 22ºC y un tiempo de reacción de aproximadamente 30 segundos. Una vez más, se sintetiza una alta concentración de perfluorotripropilamina [C_{3}F_{7})_{3}N] y perfluorotributilamina [(C_{4}F_{9})_{3}N]
encapsuladas en recubrimientos poliméricos de proteína (1X10^{9} recubrimientos/ml) con un diámetro medio de 2 micrómetros.
Ejemplo 35 Síntesis de perfluorodecalina (C_{10}F_{18}) encapsulada dentro de un recubrimiento polimérico
La albúmina de suero humana al 5% p/v USP (3,5 ml) y perfluorodecalina (C_{10}F_{18}, 6 ml) se añadieron a un recipiente de reacción de vidrio y se irradiaron con ultrasonidos de alta intensidad. Las condiciones de reacción fueron un nivel de potencia 7, una temperatura del baño de 22ºC y un tiempo de reacción de aproximadamente 30 segundos. Se sintetizó una alta concentración de perfluorodecalina contenida dentro de un recubrimiento polimérico. Además, como la perfluordecalina y perfluorotriporpilamina son los constituyentes principales del fluorocarbono aprobado por la FDA, Fluosol DA, el uso medicinal de estos compuestos en la obtención de imágenes médicas debería ser aceptado fácilmente por las autoridades reguladoras.
Ejemplo 36 Síntesis de perfluoro 15-corona-5 (C_{10}F_{20}O_{5}) encapsulada dentro de un recubrimiento polimérico
La albúmina de suero humana al 5% p/v USP (3,5 ml) y éter corona de flúor (C_{10}F_{20}O_{5}; 6 ml) se añadieron a un recipiente de reacción de vidrio y se irradiaron con ultrasonidos de alta intensidad. Las condiciones de reacción fueron nivel de potencia 7, temperatura de baño de 22ºC y tiempo de reacción de aproximadamente 30 segundos. Al igual que antes, se sintetizó una alta concentración de éter corona de flúor contenido dentro de un recubrimiento polimérico con distribuciones de tamaño estrechas. De hecho, este procedimiento experimental para sintetizar recubrimientos poliméricos rellenos de fluorocarbono fue el típico para todos los fluorocarbonos investigados.
Ejemplo 37 Síntesis de perfluoro-t-butilbuteno (C_{10}F_{18}H_{2}) encapsulado dentro de un recubrimiento polimérico
La albúmina de suero humana al 5% p/v USP (3,5 ml) y éter de C_{10}F_{18}H_{2} (6 ml) se añadieron a un recipiente de reacción de vidrio y se irradiaron con ultrasonidos de alta intensidad. Las condiciones de reacción que comprenden un nivel de potencia 7, una temperatura del baño de 22ºC y un tiempo de reacción de aproximadamente 30 segundos se emplean típicamente. Con este procedimiento, se podrían sintetizar recubrimientos poliméricos de proteína con una alta concentración de fluoro-t-butilbuteno encapsulada dentro de la misma.
Ejemplo 38 Toxicidad de los fluorocarbonos contenidos dentro de los recubrimientos poliméricos
Se inyectó a cinco ratas 5 ml de una suspensión al 20% v/v de fluorocarbono (perfluorononano contenido en un recubrimiento polimérico de proteína HSA) durante 10 minutos a través de una vena yugular cateterizada. Los fluorocarbonos, en general, son no tóxicos debido a los fuertes enlaces flúor-carbono; de hecho, los fluorocarbonos se han usado satisfactoriamente como sustitutos artificiales de sangre aprobados por la FDA (Fluosol DA). Las ratas se recogieron en momentos específicos y se les realizó una autopsia. Además de observar la salud general de la rata, se observó detenidamente el hígado, bazo, pulmón y riñones. Las ratas examinadas a las 0,5, 2, 8 y 24 horas estaban sanas y no tenían tejidos u órganos inflamados. La quinta rata todavía está viva y sana después de 90 días. Como comparación, esta dosis de aceite de soja aprobado por la FDA en una rata es la cantidad LD_{50}, sugiriendo además que los fluorocarbonos son inocuos y seguros.
Ejemplo 39 Espectroscopia con resonancia magnética nuclear ^{19}F de un fluorocarbono puro y un fluorocarbono encapsulado dentro de un recubrimiento polimérico
Los espectros RMN de los fluorocarbonos contenidos dentro de un recubrimiento polimérico y de los fluorocarbonos puros se obtuvieron en un instrumento de RMN Bruker 500 MHz. El instrumento se ajustó para ^{19}F a su frecuencia de resonancia de 470,56 MHz. Se uso un disolvente de deuterio para el bloqueo y todos se espectros se referenciaron externamente a Freon (CCl_{3}F) a 0 ppm. El perfluorononano y CDCl_{3} se introdujeron en un tubo RMN de 5 mm. El espctro del perfluorononano puro se obtuvo con dos conjuntos de picos agudos, uno en -87 ppm y el segundo conjunto de picos en -127, -128 y -133 ppm.
Una suspensión de perfluorononano encapsulado dentro de recubrimientos poliméricos de proteína HSA se resuspendió en D_{2}O y se obtuvo un espectro RMN similar. Se obtuvieron señales fuertes de la suspensión de fluorocarbono al 20% v/v con picos o resonancias en -81, -121, -122 y -126 ppm. El encapsulado del fluorocarbono en el recubrimiento polimérico durante la irradiación ultrasónica no tuvo como resultado cambios químicos o estructurales en el perfluorononano. Por ejemplo, con C_{9}F_{20}se observaron dos resonancias distintas: una que correspondía al CF_{3} a aproximadamente -80 ppm y el segundo conjunto de resonancias a aproximadamente -125 ppm, que correspondía al grupo CF_{2}.
Ejemplo 40 Espectroscopia con resonancia magnética nuclear ^{19}F de fluorocarbonos para medir la temperatura local
Los espectros RMN a temperatura variable de los fluorocarbonos se obtuvieron en un instrumento de RMN Bruker 500 MHz. El instrumento se ajustó para ^{19}F a su frecuencia de resonancia de 470,56 MHz. Se usó un disolvente de deuterio (d_{6}-dimetilsulfóxido [d_{6}-DMSO]) para el bloqueo y todos se espectros se referenciaron externamente a Freon (CCl_{3}F) a 0 ppm. El perfluorododecano, que tiene un punto de fusión de 77ºC y el d_{6}-DMSO se introdujeron en un tubo RMN de 5 mm a temperatura ambiente. El espectro del flúor se recogió a distintas temperaturas y se midieron la amplitud de las líneas. Los datos de amplitud de las líneas a -81 ppm, en función de la temperatura, se muestran a continuación:
Amplitud de línea a -81 ppm (Hz) Temperatura (ºC)
51,1 102
57,0 82
64,65 60
El espectro amplio a menores temperaturas empieza a hacerse más estrecho al aumentar la temperatura, como resultado de la transición de fase de sólido a líquido que experimenta el perfluorododecano. El cambio es agudo y brusco con la temperatura, como se espera para un material puro.
Para ampliar y reducir la temperatura de fusión, se añadió pentano (aproximadamente 2% v/v) al perfluorododecano. Como se ha visto anteriormente, el espectro amplio a temperaturas bajas se hace más estrecho al realizarse la transición de fase sólida a líquida del perfluorododecano. A continuación se muestran los datos de amplitud de línea como función de la temperatura para la mezcla perfluorododecano/pentano:
Amplitud de Línea (Hz)
-82 ppm -123,3 ppm Temperatura (ºC)
21,26 87,17 77
165,89 280,50 67
216,6 341,2 57
290,77 436,15 47
578,27 451,33 37
577,62 525,11 27
La mezcla de perfluorododecano/pentano resultante tiene un menor punto de fusión que se ha ampliado tal y como se esperaba. Con este sistema, pueden realizarse mediciones de temperatura en el intervalo de 27ºC a 77ºC. De esta forma, dada una amplitud de línea, es posible determinar la temperatura local.
Un ejemplo de uso de esta técnica para determinar temperaturas localizadas in vivo implica la inyección de recubrimientos de proteínas que contienen mezclas de fluorocarbonos (por ejemplo, tales como las descritas anteriormente) con transiciones de fusión amplias (que pueden obtenerse empíricamente). Tal formulación se situará dentro del hígado o bazo y, además de servir como agente de contraste para MRI ^{19}F, puede utilizarse simultáneamente para determinar temperaturas localmente variantes dentro del órgano (permitiendo la elucidación de la patología de anormalidades significativas dentro de los tejidos).
Ejemplo 41 Obtención de imágenes por resonancia magnética ^{19}F de figurines
En este estudio de figurines se usaron dos tipos de fluorocarbonos contenidos en recubrimientos poliméricos. La perfluorononano y perfluorotributil amina contenidas en los recubrimientos poliméricos de proteína HSA se sintetizaron como se ha descrito en los Ejemplos 33 y 34. La suspensión sintetizada que era 60% de fluorocarbono en volumen se diluyó con solución salina y se introdujeron 2 mililitros en tubos de poliestireno. Después, los tubos de poliestireno se introdujeron en un instrumento de MRI Siemens 2T disponible en el mercado (bobina 10 cm ^{19}F) funcionando a 1,5 tesla. La imágenes por resonancia magnética ^{19}F se tomaron durante un periodo de 5 minutos con un tiempo de eco (TE) de 10 milisegundos y un tiempo de repetición (TR) de 300 segundos (matriz 256 x 256).
Perfluorononano contenido en los recubrimientos poliméricos
Dilución [conc], M Claridad de Imagen
1 1,8 excelente
1/2 0,9 excelente
1/4 0,45 buena
1/10 0,18 buena
1/50 0,09 buena
1/100 0,02 insignificante
Se observaron buenas imágenes de los figurines incluso a bajas concentraciones de perfluorononano encapsulado en recubrimientos poliméricos. Se observaron datos muy similares con los recubrimientos poliméricos que contenían perfluorotributilamina. Solo a alta dilución (1/100; 0,02 M) la imagen era de mala calidad y resolución.
Ejemplo 42 Obtención de imágenes por resonancia magnética ^{19}F de hígado y bazo in vitro
Se inyectó a ratas de 300 gramos con 2 ml de perfluorononano al 20% v/v contenido dentro de una suspensión de recubrimiento poliméricos de proteína HSA. A las 2 horas y 5 días, se sacrificó una rata y se retiraron el hígado, bazo, riñones y pulmones. Después, todo el hígado, por ejemplo, se introdujo en un instrumento de MRI a 4 tesla funcionando con una bobina de 10 cm ^{19}F. Las imágenes de resonancia magnética ^{19}F del hígado, bazo y riñón se obtuvieron usando una secuencia con peso T_{1} con un TR=1 segundo, TE = 20 milisegundos y una matriz de datos de 256x128 (es decir, 128 etapas de codificación de fase, 16 medias de señal).
Las imágenes MRI ^{19}F del hígado mostraron regiones de distinta intensidad en correlación con los distintos grados de absorción en el hígado de los recubrimientos poliméricos. Por ejemplo, se observaba una región oscura correspondiente a la vena portal donde no se esperaría la presencia de recubrimientos poliméricos que contienen perfluorononano ya que la mayor parte de los recubrimientos se concentran intracelularmente dentro del RES del hígado.
La intensidad media de la imagen de barrido del hígado dos horas después de la inyección fue aproximadamente un 20-30% mayor que la del barrido registrado 5 días después de la inyección, indicando una disipación parcial del perfluorononano, posiblemente debido a la ruptura de los recubrimientos poliméricos. En general, se obtuvieron imágenes de excelente calidad que mostraban la morfología del hígado, demostrando el potencial de esta técnica en el diagnóstico y localización de patologías anormales en el hígado.
Ejemplo 43 Obtención de imágenes por resonancia magnética ^{19}F de hígado y bazo in vivo
Una rata de 150 gramos se inyectó durante 10 minutos con 2 ml de perfluorononano al 20% v/v (C_{9}F_{20}) contenido dentro de una suspensión de recubrimiento poliméricos de proteína HSA. Toda la rata se introdujo en un instrumento de MRI a 4 tesla funcionando con una bobina de 10 cm ^{19}F. La rata se anestesió con ketamina antes de obtener las imágenes. Se obtuvieron imágenes de resonancia magnética ^{19}F de toda la rata, así como de órganos individuales tales como hígado, bazo y riñón usando una secuencia con peso T_{1} con un TR=1 segundo, TE = 20 milisegundos y una matriz de datos de 256x128 (es decir, 128 etapas de codificación de fase, 16 medias de señal).
Se obtuvieron imágenes de las ratas 15 minutos, 2 horas y 24 horas después de la inyección de recubrimientos poliméricos de proteína HSA que contenían perfluorononano. En general, se obtuvieron imágenes de excelente calidad que mostraban la morfología del hígado y bazo, demostrando el potencial de esta técnica en el diagnóstico y localización de patologías anormales en órganos que contienen RES del hígado.
Ejemplo 44 Determinación de temperatura local usando imágenes de resonancia magnética ^{19}F in vivo
Se inyecta a una rata de 300 gramos 5 ml de perfluorododecano al 20% v/v/pentano al 2% (o ácido perfluorononadecanoico y colesterol al 1%) contenido dentro de recubrimientos poliméricos de HSA durante 10 minutos. Después, la rata se introduce en una bobina de 15 cm (un imán MRI Siemens 1,5 tesla). Se uso un TE de 10 milisegundos y TR de 300 segundos para recoger las imágenes (matriz 256 x 256). La rata se anestesia con ketamina antes de recoger los datos. Se toman imágenes del hígado y bazo durante un periodo de 15 minutos, con un espesor de sección de 5 milímetros. Los datos se recogen a temperatura ambiente y a aproximadamente 37ºC envolviendo la rata en una manta calefactora.
Ejemplo 45 Determinación de oxígeno in vivo usando imágenes de resonancia magnética ^{19}F
Se inyecta a una rata de 300 gramos 5 ml de perfluorononano al 20% v/v contenido dentro de recubrimientos poliméricos durante 10 minutos. Después, la rata se introduce en una bobina de 15 cm (un imán MRI Siemens 1,5 tesla). Se uso un TE de 70 milisegundos y TR de 3 segundos para recoger las imágenes (matriz 256 x 256). La rata se introduce en un arnés de inmovilización antes de recoger los datos. En primer lugar, la rata se introduce en una cámara de oxígeno para aumentar el metabolismo de oxígeno y se recogen la amplitud de líneas e imágenes. Después, se le inyecta ketamina a la rata para reducir el consumo de oxígeno y se toma otra vez la amplitud de líneas y la intensidad de la imagen. Se observa el cambio en la amplitud de línea e intensidad de imagen correspondiente a la cantidad de oxígeno disuelto en la rata. La mayor amplitud de línea se observa con mayores concentraciones de oxígeno. Se toman imágenes del hígado y bazo durante un periodo de 15 minutos, con un espesor de sección de 5 milímetros. Se recogen dos conjuntos de datos, uno a temperatura ambiente y otro a 37ºC, envolviendo la rata anestesiada en una manta calefactora.
Ejemplo 46 Preparación de partículas de paclitaxel
Se trituraron cristales de paclitaxel (Sigma Chemical) en un molino de bola hasta que se obtuvieron partículas de taxol sólido con un tamaño menor de 10 micrómetros. El tamaño de las partículas se determinó suspendiendo las partículas en solución salina isotónica y contando con la ayuda de un aparato de recuento de partículas (Elzone, Particle Data). La trituración continuó hasta que el 100% de las partículas tenía un tamaño menor de 5 micrómetros. El tamaño de partícula preferido para la administración intravenosa es menor de 5 micrómetros y más preferiblemente menor de 1 micrómetro.
Como alternativa, las partículas de paclitaxel se obtuvieron sonicando una suspensión de paclitaxel en agua hasta que todas las partículas tenían un tamaño por debajo de los 10 micrómetros.
Las partículas de paclitaxel menores de 10 micrómetros también se pueden obtener precipitando el paclitaxel de una solución de paclitaxel en etanol añadiendo agua hasta que se obtiene una suspensión turbia. Opcionalmente, la solución de paclitaxel puede sonicarse durante la adición de agua hasta que se obtiene una suspensión turbia. Después, la suspensión resultante se filtra y se seca para obtener partículas de paclitaxel puro en el intervalo de tamaño deseado.
Las partículas finas de paclitaxel se prepararon secando con nebulizador una solución de paclitaxel en un material orgánico volátil tal como etanol. La solución se pasó a través de una boquilla ultrasónica que formó gránulos de etanol que contenían paclitaxel. Al evaporarse el etanol en el secado con nebulizador, se obtuvieron partículas finas de paclitaxel. El tamaño de partícula puede variarse cambiando la concentración de paclitaxel en etanol, ajustando el caudal del líquido a través de la boquilla y la potencia de sonicación.

Claims (31)

1. Una composición para la administración in vivo de un compuesto biológico,
donde dicho compuesto biológico se selecciona entre:
un sólido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso, contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico,
un líquido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso, contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico,
o combinaciones de los dos,
donde la mayor dimensión transversal de dicho recubrimiento no es mayor de 10 micrómetros,
donde dicho recubrimiento polimérico comprende un material biocompatible que está sustancialmente reticulado por medio de enlaces disulfuro, y
donde dicho recubrimiento polimérico está opcionalmente modificado con un agente adecuado, donde dicho agente está asociado a dicho recubrimiento polimérico mediante un enlace covalente opcional.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho compuesto biológico se selecciona entre un agente farmacéuticamente activo, un agente de diagnóstico o un agente de valor nutricional.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho agente farmacéuticamente activo se selecciona entre agentes analgésicos, agentes anestésicos, agentes anti-asmáticos, antibióticos, agentes anti-depresivos, agentes anti-diabéticos, agentes anti-fúngicos, agentes anti-hipertensores, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-neoplásicos, agentes ansiolíticos, agentes enzimáticamente activos, construcciones de ácido nucleico, agentes inmunoestimuladores, agentes inmunosupresores o vacunas.
4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 en la que dichos agentes anti-neoplásicos son paclitaxel, análogos de paclitaxel, taxanos o taxotere.
5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 en la que dicho agente farmacéuticamente activo es una construcción de ácido nucleico.
6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho agente de diagnóstico se selecciona entre agentes de contraste de ultrasonidos, agentes de radiocontraste o agentes de contraste magnético.
7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 en la que dicho agente de contraste magnético es un agente para la obtención de imágenes por resonancia magnética que contiene flúor.
8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que dicho agente para la obtención de imágenes por resonancia magnética que contiene flúor se selecciona entre:
(a)
C_{x}F_{2x+y-z}A_{z}, en la que
x = 1 -30,
y = 2; ó 0 ó -2, cuando x \geq 2; o -4 cuando x \geq 4,
z = cualquier número entero de 0 hasta (2x+y-1),
y
A se selecciona entre H, halógenos distintos de F, -CN, -OR, donde R es H, alquilo, fluoroalquilo, alquenilo, fluoroalquenilo, alquinilo, fluoroalquinilo, arilo, fluoroarilo, alcanoílo, fluoroalcanoílo, alquenoílo, fluoroalquenoílo, alquinoílo, fluoroalquinoílo,
(b)
[C_{x}F_{2x+y'-z}A_{z}]_{a}JR_{b-a}, en la que:
x, z, A y R son como se han definido anteriormente,
y' = +1; ó -1 ó -3, cuando x \geq 2; o -5 cuando x \geq 4,
J = O, S, N, P, Al o Si,
a = 1, 2, 3 ó 4, y
b = 2 para una J divalente, o
3 para una J trivalente,
4 para una J tetravalente,
(c)
A'-[(CF_{2})_{x}-O]_{c}-A'', en la que
x es como se ha definido anteriormente
A' se selecciona entre H, halógenos, -CN, -OR, donde R es H, alquilo, fluoroalquilo, alquenilo, fluoroalquenilo, alquinilo, fluoroalquinilo, arilo, fluoroarilo, alcanoílo, fluoroalcanoílo, alquenoílo, fluoroalquenoílo, alquinoílo, fluoroalquinoílo,
A'' se selecciona entre H o R, donde R es como se ha definido anteriormente,
c = 1 - 300, o
(d)
5
en la que:
x es como se ha definido anteriormente, y
c' = 2 - 20,
así como mezclas de cualquiera dos o más de las mismas.
9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que dicho agente de diagnóstico puede experimentar un cambio en la velocidad de relajación debido a cambios en la concentración local de oxígeno.
10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7 en la que dicho agente de diagnóstico puede experimentar una transición de fase sólida a líquida en el intervalo de temperatura de aproximadamente 22 hasta 55ºC.
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho agente de valor nutricional se selecciona entre aminoácidos, azúcares, proteínas, carbohidratos, vitaminas liposolubles, lípidos o combinaciones de dos o más de los mismos.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho agente farmacológicamente activo dentro de dicho recubrimiento se disuelve o suspende en un agente de dispersión biocompatible.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12 en la que dicho agente de dispersión biocompatible se selecciona entre aceite de soja, aceite mineral, aceite de maíz, aceite de colza, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de cartamo, aceite de semilla de algodón, hidrocarburos alifáticos, cicloalfifáticos o aromáticos que tienen 4-30 átomos de carbono, alcoholes alifáticos o aromáticos que tienen 1-30 átomos de carbono, ésteres alifáticos o aromáticos que tienen 2-30 átomos de carbono, alquilo, arilo o ésteres cíclicos que tienen 2-30 átomos de carbono, haluros de arilo o alquilo que tienen 1-30 átomos de carbono, cetonas que tienen 3-30 átomos de carbono, polialquilenglicoles o combinaciones de dos o mas de los mismos.
14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho agente farmacológicamente activo está contenido dentro de dicho recubrimiento puro.
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho polímero reticulado es un polímero de origen natural, un polímero sintético o una combinación de los mismos,
\newpage
donde dicho polímero, antes de la reticulación, tiene unidos covalentemente a sí mismo grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro.
16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15 en la que dicho polímero de origen natural se selecciona entre proteínas que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro, polipéptidos que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro, lípidos que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro, ácidos polinucleicos que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro o polisacáridos que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro.
17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16 en la que dicha proteína se selecciona entre hemoglobina, mioglobina, albúmina, insulina, lisozima, inmunoglobulinas, \alpha-2-macroglobulina, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno y similares o combinaciones de cualquiera dos o más de las mismas.
18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17 en la que dicha proteína es albúmina.
19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17 en la que dicha proteína es hemoglobina.
20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17 en la que dicha proteína es una combinación de albúmina y hemoglobina.
21. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16 en la que dichos polisacáridos se seleccionan entre alginato, alginatos de alto contenido M, ácido polimanurónico, polimanuronatos, ácido hialurónico, hialuronato, heparina, dextrano, quitosano, quitina, celulosa, almidón, glicógeno, goma guar, goma de algarrobilla, dextrano, levano, inulina, ciclodextrano, agarosa, goma xantana, carrageno, heparina, pectina, goma gelano, escleroglucano o combinaciones de dos o mas de los mismos.
22. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15 en la que dicho polímero sintético se selecciona entre poliaminoácidos sintéticos que contienen restos cisteína y/o grupos disulfuro, polipéptidos sintéticos que contienen grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro, alcohol de polivinilo modificado para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, polihidroxietil metacrilato modificado para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, ácido poliacrílico modificado para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, polietiloxazolina modificada para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, poliacrilamida modificada para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, polivinil pirrolidona modificada para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres, polialquilen glicoles modificados para contener grupos sulfhidrilo y/o grupos disulfuro libres así como mezclas de dos o más de los mismos.
23. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que los enlaces disulfuro del polímero reticulado se forman por irradiación ultrasónica.
24. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho recubrimiento polimérico que contiene un compuesto biológico se suspende en un medio biocompatible, donde dicho medio biocompatible se selecciona entre agua, medio acuoso tamponado, solución salina, solución salina tamponada, soluciones de aminoácidos, soluciones de proteínas, soluciones de azúcares, soluciones de vitaminas, soluciones de carbohidratos, soluciones de polímeros sintéticos, emulsiones que contienen lípidos o combinaciones de dos o más de los mismos.
25. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho recubrimiento polimérico está modificado con un agente adecuado, donde dicho agente adecuado se selecciona entre un polímero sintético, un fosfolípido, una proteína, un polisacárido, un agente tensioactivo, un agente de modificación química o combinaciones de los mismos, donde dicho agente se asocia con dicho recubrimiento polimérico por medio de un enlace covalente opcional.
26. Un método para la preparación de un compuesto biológico para administración in vivo, comprendiendo dicho método someter a un medio acuoso que contiene material biocompatible que puede reticularse con enlaces disulfuro y un compuesto biológico a condiciones de ultrasonidos de alta intensidad durante un tiempo suficiente para reticular dicho material biocompatible con enlaces disulfuro;
donde dicho compuesto biológico está contenido sustancialmente completamente dentro de un recubrimiento polimérico,
donde la mayor dimensión transversal de dicho recubrimiento no es mayor de 10 micrómetros, y
donde el compuesto biológico es un sólido o líquido disperso en un agente de dispersión biocompatible no acuoso.
27. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la administración de compuestos biológicos a un sujeto, comprendiendo dicho medicamento una cantidad eficaz de dicha composición.
28. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 25 para la fabricación de un medicamento para la administración de compuestos biológicos a un sujeto, comprendiendo el medicamento una cantidad eficaz de dicha composición.
29. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 8 para la fabricación de un medicamento para la obtención de imágenes de resonancia magnética in vivo.
30. Una composición para la administración in vivo de paclitaxel en la que un derivado insoluble en agua de paclitaxel se suspende en un líquido biocompatible y en la que la suspensión resultante contiene partículas de paclitaxel con una dimensión transversal no mayor de 10 micrómetros.
31. Una composición de acuerdo con la reivindicación 30 en la que el paclitaxel y un medio adecuado se someten a condiciones de irradiación ultrasónica o triturado durante un tiempo suficiente para producir partículas con una dimensión transversal máxima no mayor de 10 micrómetros.
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