CN103212094B

CN103212094B - 一种氧氟脂质微泡及其制备方法

Info

Publication number: CN103212094B
Application number: CN201310154479.XA
Authority: CN
Inventors: 杨春江; 唐毅; 肖欢; 王荞; 李攀; 王冬; 高洋
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103212094A

Abstract

本发明公开了一种氧氟脂质微泡补氧治疗剂，由微泡、和存在于微泡内的氧气和至少一种全氟化碳组成，气体核以氧气为主，全氟化碳为辅，其中，微泡主要由磷脂及其聚乙二醇衍生物构成。该氧氟脂质微泡补氧治疗剂在人体内可以通过静脉输送并靶向缺氧组织在超声辐照下控制释放氧气，治疗缺氧性疾病，同时作为造影剂用于超声增强显影，因此，该微泡既是显影剂，更是补氧治疗剂。

Description

一种氧氟脂质微泡及其制备方法

技术领域

本发明属医药领域，具体涉及一种氧氟脂质微泡（Microbubble，MB）及其作为补氧治疗剂。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemie encephalopathy，HIE)是指各种围产期窒息导致胎儿或新生儿脑的缺氧缺血性损伤，是新生儿死亡和儿童期伤残的主要原因，发病率约为活产儿的（1～8）／1000，其中10％～20％在新生儿期死亡，存活者中25％-30％可能留有某种类型的远期神经发育后遗症。

治疗新生儿缺氧或其它缺氧性疾病，目前采取给氧治疗的方式有多种：方法一，常规吸氧，也是最普遍常用的。对轻、中型缺氧的患儿，采用鼻导管浅插法给氧，氧流量的大小、浓度、压力，可间接影响血氧饱和度，当氧流量大、浓度高、压力大、在一定条件下，血氧饱和度可明显升高，但过高的氧流量，可造成肺损伤，甚至氧中毒。方法二，高压氧治疗。高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）疗法是目前有关HIE治疗的研究热点之一，该疗法是在高压环境下使用氧气治疗疾病，在国内外应用较广泛，但其在应用时间、适应证、压力选择及疗程等方面还存在分歧，尤其会引发很多并发症：减压病、神经性氧中毒、肺组织纤维化、晶状体后纤维化组织增生等，故而在一定程度上限制了其应用。方法三，静脉输入高氧液。光量子氧透射液体疗法是其中的一种，其是以5％～10％葡萄糖或生理盐水作为载体，经特定波长、特定强度的紫外线照射、充氧、磁极化后输入人体静脉血管内的一种特殊方法。它将量子能量、臭氧携入人体内，并被血液中各种细胞吸收，从而产生一系列光化学物理效应，以增加血氧饱和度，提高红细胞携氧和氧分压，降低二氧化碳压，从而改善组织缺氧缺血状态，提高组织摄氧能力。光量子疗法对人体多种疾病均有一定的治疗效果。

因此，在HIE临床治疗方面更有价值的是研究一种更有效更直接的静脉氧传递方式，即微泡造影剂作为氧载体传送氧气到达缺氧脑组织。这种方式可保证氧气不需要经过呼吸系统交换而可以直接进入血液，可以更快地补给氧气，改善大脑缺氧状态，可望成为一种新的治疗方式。

近几年来，超声微泡造影剂已成为国内外研究的热点。微泡造影剂目前被认为是最好的人体微管内的造影材料，在医学临床检测中得到了越来越多的应用。除了作为超声诊断药剂之外，更多的研究发现微泡造影剂是一种高效的载体，且超声辐照能使其定向爆破，将所载之基因或药物释放在靶组织内，在促进血栓溶解、基因转染及药物体内运输定点释放方面已取得一定的成效。

微泡载氧的研究目前尚处于起步阶段，而国外学者Bisazza A等（Int J Pharm. 2009,378(1-2):215-217）公开了一种壳聚糖外壳的氧气微泡，其气体核为单纯氧气，平均粒径2 μm，体外实验证实其可作为工具运载氧气到缺氧组织，具有渗透性、无毒性、无溶血性、扩散能力好，是一种安全、有效的载体，可运送氧气到缺氧组织。微泡的尺寸符合安全注射进入毛细血管网的要求，外壳能够将氧气释放出来。在2 MHz超声辐照下氧气释放加速，共聚焦激光扫描电镜及免疫荧光图像显示此种纳米造影剂能散播到细胞质区域内。

现研究表明，微泡联合超声辐照能可逆开放血脑屏障（BBB），并未引起急性神经细胞的损伤，通过脑微血管运送微泡将治疗化合物到大脑组织，再经超声诱导微泡破裂在大动物模型中渗透传递药物。这种诱导BBB开放的方法是可逆的，能作为一种安全的非侵入性的方法经BBB完成药物或基因的传递。

微泡造影剂发展过程中曾仅以氧气为核心，这样看似载氧量极高，其实因氧气的分子量小，易受动脉压力影响，微球里的气体很快扩散，球壁塌陷而迅速失去声反射性，并且不能随血流分布至全身，所以限制了其使用范围。而氟碳气体作为大分子惰性气体，表现出了较小的弥散度，其在微球中不易穿过球壁而扩散，能耐受33 330.5Pa以上的动脉压力，它在血管内停留的时间足以满足实际应用所需要的最大值。其中全氟化碳的独特特性包括疏水性、疏脂性、极惰性、衍生性，可预报性、氟原子的电子结构和空间需求等，其低水溶性是其在体内长时间存在的关键，全氟化碳具有氧气的高溶解特性，如果能将氧气和氟碳气体结合一起作为气体核，具有既可以维持微泡的稳定性和体内的长循环存在，也可以传递氧气到靶组织的优势。

脂质微泡的优良载药性能和靶向性能，脂质微泡在载药、载基因及靶向显像方面已相当成熟，脑组织内显像效果好，联合一定能量的超声辐照能够可逆地开放血脑屏障。

CN200810217176公开了一种超声造影剂,由合成磷脂或其聚二乙醇衍生物10-90%和糖脂成分10-90%主要组成复合脂膜,脂膜内充有全氟碳气体,该造影剂稳定,耐压性好,载药量大。

CN200310122421.2公开了一种以磷脂成分为成膜材料的超声造影剂组合物,该组合物由磷脂成分1%-10%/起泡剂5%-15%聚合物70-90%0稳定剂0.5%-10%和氟碳气体组成。

CN200448002975.2公开了一种冻干基质的脂质造影剂,由磷脂稳定的充气微泡的液体水溶性混悬液,制备一种水溶性介质/磷脂和水不溶性有机溶剂组成的乳剂,冻干,然后在充气微泡的水溶性混悬液中重建而成。

本发明人在脂质微泡基础上，通过将超声、化学等技术相结合，在微泡核中溶入氧气，构建出一种新型的、稳定的氧氟脂质微泡，其在超声仪可视监控下，被超声辐照破坏，将氧气释放在缺氧脑组织，以实现直接、定点且高效供氧、满足神经细胞的需氧要求，达到保护神经细胞，避免由于缺氧未及时纠正而导致细胞不可逆转损伤的目的。本发明的脂质微泡以载氧治疗为目的研究国内外尚无相关报道，这种将超声造影剂技术与生物化学治疗技术相结合的新兴技术，具有良好的应用开发前景，可为临床HIE患儿的早期纠正缺氧治疗提供一个新思路和新手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效载氧、性能稳定、粒径均匀的氧氟脂质微泡，该氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂、天然磷脂或氢化磷脂和它们的聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳的体积比为4：1～8：1。

在一实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂及其聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳的体积比为4：1～8：1，其中合成磷脂与其（合成磷脂的）聚乙二醇衍生物的重量比为1：9－9：1，优选为5：2。

在上述实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油一种或几种，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；所述合成磷脂为聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的一种，优选甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000），所述氧气与全氟化碳的体积比优选为5：1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。

在上述实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，脂质微泡的平均粒径为0.5～4.0μm, 优选平均粒径为0.9～2.0 μm。

在一具体实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000）构成，其重量比为1：9－9：1，优选为5：2，氧气与全氟化碳的体积比为4：1-8：1，优选5：1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。

在一优选实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟丙烷气体组成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000）构成，其重量比为5：2，氧气与全氟丙烷的体积比为5：1。

在上述具体和优选实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡，脂质微泡的平均粒径为0.5～4.0μm, 优选平均粒径为0.9～2.0 μm。

本发明还提供了一种氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤：

a）在合成磷脂、天然磷脂或氢化磷脂和它们的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液；

b ）在步骤a的溶液中排除空气，加压通入含有氧气和全氟碳的混合气体，其中，氧气与全氟化碳的体积比为4：1-8：1；

c ）利用超声或机械振荡步骤b的溶液，形成得到白色乳液状脂质微泡混悬液，获得氧氟脂质微泡。

上述本发明的方法，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰甘油，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，所述合成磷脂为聚乙二醇衍生物为聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、或甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，优选甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000），所述氧气与全氟化碳的体积比为5：1，所述全氟化碳选自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种，优选全氟丙烷。

在一具体实施方案中，本发明的氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤：

a）在二硬脂酰磷脂酰胆碱和甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(重量比5：2)中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液；

b ）在步骤a的溶液中排除空气，加压通入含有氧气和全氟丙烷的混合气体，其中，氧气与全氟丙烷的体积比为5：1；

本发明的氧氟脂质微泡性能稳定、粒径均匀，能用于超声增强显影，同时高效、稳定载氧，克服单气体氧易损失的缺点。

本发明的氧氟脂质微泡联合超声辐照对缺氧神经细胞提供了供氧治疗效果，为新生儿缺氧缺血性脑病在早期及时、安全、高效供氧，改良预后提供了一个新手段。

同时，本发明的氧氟脂质微泡中氧气成分具有两种功效：一作为显像成分即用作超声造影剂，二作为“治疗药物”，为缺氧细胞靶向供氧，即作补氧治疗剂，一举两得。

附图说明

图1、微泡光镜图（×400）

图2、氧氟脂质微泡粒径分布图

图3、氧氟脂质微泡对缺氧神经细胞毒性百分比

图4、氧氟脂质微泡对细胞HIF-1а蛋白表达百分比

图5、兔肝显影的时间强度曲线图

具体实施方式

实施例1 氧氟脂质微泡的制备

1）精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS；2）在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3）用封口膜将胶囊瓶密封；4）用注射器分别抽取3体积的氧气及1体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5）利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6）利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

2）实施例2 氧氟脂质微泡的制备

1)精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS；2)在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取4体积的氧气及1体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

实施例3 氧氟脂质微泡的制备

1)精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS；2)在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取5体积的氧气及1体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡(MB(5:1))，放于4℃冰箱保存。

实施例4-7 氧氟脂质微泡的制备

其它组分和制备方法同实施例3。

实施例8 氧氟脂质微泡的制备

1)精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS；2)在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜将胶囊瓶密封；4)用注射器分别抽取10体积的氧气及1体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6)利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

实施例9 氧氟脂质微泡的制备

1）精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS； 2）在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3）用封口膜将胶囊瓶密封；4）用注射器分别抽取1体积的氧气及1体积的全氟丙烷，利用三通管在负压条件下将氧气及全氟丙烷混合；5）利用三通管，在负压条件下用混合气体置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6）利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得氧氟脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

实施例10 全氧脂质微泡的制备

1）精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS； 2）在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3）用封口膜将胶囊瓶密封；4）利用三通管，在负压条件下用氧气置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态；6）利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得全氧脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

实施例11 全氟脂质微泡的制备

1）精密称量器称取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于胶囊瓶中，加入50μl甘油及450μlPBS； 2）在55℃恒温水浴箱中加热30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3）用封口膜将胶囊瓶密封； 4）利用三通管，在负压条件下用全氟丙烷置换胶囊瓶中的空气，达到饱和状态； 6）利用银汞胶囊调和器机械震荡后，即得到白色乳液状脂质微泡混悬液，即得全氟脂质微泡，放于4℃冰箱保存。

实施例12 微泡在极度缺氧环境中释放氧气量的测定

微泡存放30min、3h、16h、24h、48h 时间点后，用溶解氧测定仪（HQ 30D）测定微泡在极度缺氧溶液中释放氧气的情况，观察微泡释放氧气的变化，测定方法：25℃室温下，取各时间点的实施例1-10的微泡混悬液3ml，注入密闭的20ml极度缺氧（DO=0.4mg/l）生理盐水，采用HQ 30D溶解氧测定仪测定溶液中氧的含量，每组实验重复三次，取平均值，分析氧含量（DO）的变化。结果见表1。

表1氧氟脂质微泡在0.9%生理盐水中的氧含量（mg/L浓度）

由表1的结果表明，氧气与全氟丙烷体积比为4-8：1时，较其它比例的微泡的释放氧的浓度高，且稳定性好，尤其是体积比为5：1时，在极度缺氧环境中，微泡释氧量高，也最稳定，存放过程中氧损失较小。

实施例13 微泡在中度缺氧环境或超声辐照后释放氧气量的变化

微泡存放24h后，用溶解氧测定仪（HQ 30D）测定微泡在中度（DO=4.0mg/l）缺氧溶液中释放氧气的情况，超声辐照后观察微泡释放氧气变化，测定方法：25℃室温下，取实施例1-10的微泡混悬液3ml，注入密闭的20ml中度缺氧（DO=4.0mg/l）生理盐水，采用HQ 30D溶解氧测定仪测定溶液含氧量（DO）变化；取实施例1-10的微泡混悬液3ml，注入密闭的20ml中度缺氧（DO=4.0mg/l）生理盐水，同时采用功率为3.5W、发射频率为5KHz的低频超声基因转染仪进行辐照，采用HQ 30D溶解氧测定仪测定溶液DO，每组各测3次，分析DO变化，结果见表2。

表2 微泡在中度缺氧环境或超声辐照后释放氧气量（mg/L浓度）

由表2的结果表明，载氧微泡在中度缺氧环境中释氧量较在极度缺氧环境中释氧量低。超声辐照下能够增加氧气释放，溶液DO值增加，与无辐照组比较，P<0.001,两组之间具有显著性差异，表示超声辐照能够使微泡破裂，增加微泡释氧量。氧气与全氟丙烷体积比为4-8：1时，较其它比例的微泡的释放氧的浓度高，且超声辐照后溶液DO值增加更显著。

实施例14 微泡浓度测定

方法：将实施例1-10的混悬液（微泡），存放7天，分别在3h, 1天、3天、7天取等量混悬液用PBS稀释100倍后，利用计数板（ Buerker-Tuerk BLAU BRAND 德国）400倍光镜（Nikton ST100 日本）下计数4大格微泡的总数，利用公式：微泡数/ml ＝4 大格微泡总数/ 4×10⁴×稀释倍数（100）即得微泡浓度，每个时间点测量3次，取平均值，结果见表3。

表3 氧气与全氟丙烷不同体积比的混悬液的微泡的浓度（单位：个/ml）

表3的数据表明，氧气与全氟丙烷体积比为4-8：1时，微泡浓度较其他各组要高，且稳定性较好；只含有全氟丙烷气体的微泡的稳定性较好，但微泡浓度较含氧微泡低；含氧微泡随着氧气量的增多，微泡浓度有所提高，但是随着氧气含量的增加，微泡的稳定性下降，全氧微泡（Oxygen Microbubble ，MBO）为只含氧气的载氧微泡，其稳定性极差，1d后观察，微泡浓度既有大幅度下降，且全氧微泡制备即可后的浓度也不高。产生以上现象机理并不清楚，可能是由于氧气分子量小，且氟碳气体对氧气具有高溶解的特性，使混合气体较易形成气体核包裹于微泡内，但是随着氧气量的增加，氧气较大的弥散性，气体溢出微泡壁，或者由于Laplace压力作用，含氧量高的载氧微泡极不稳定，微泡破裂过多导致浓度较快下降。因此，氧气与全氟丙烷体积比为4-8：1的微泡具有高浓度和高稳定性的优点，尤其，氧气与全氟丙烷体积比5：1时尤为突出。

实施例15 微泡粒径的测定

微泡存放30min、3h、16h、24h、48h 时间点后，利用马尔文粒径测定仪测定各时间点的实施例1-10微泡粒径。测定方法：取100 μl实施例1-10的氧氟脂质微泡混悬液，加入2ml PBS稀释，取稀释液1.5ml装入比色皿，利用马尔文粒径测定仪进行检测。测定结果见表4和图2。

用显微镜(X400)观测实施例3的氧氟脂质微泡在存放3h后的粒径大小、分布，光镜下摄片，结果见图1。

由表4的数据表明：本发明的微泡粒径都比较小，能通过微循环，不会引起栓塞。同时通过图2也表明本发明的氧氟脂质微泡粒径分布比较好，平均粒径约924nm。

图1的结果也显示本发明的氧氟脂质微泡的制备3h后，其微泡形态好，大小、分布均匀。

表4 氧与氟碳不同体积比的微泡的平均粒径（nm）

实施例16 氧氟脂质微泡对缺氧神经细胞毒性分析

取胎鼠海马神经元细胞，37℃、10%CO₂的培养箱内培养10天，将其分为三组，?Triton X；?缺氧未处理组（C3%）；③缺氧+5:1氧氟脂质微泡（200μl）。各组细胞缺氧（3%O₂）孵箱中培养8h后，利用LDH细胞毒性试剂分析盒检测载氧微泡对海马神经元细胞的影响。?组Triton X对神经细胞毒性为100%，计算其他各组细胞相对毒性百分比；?组为58%；③组为32%。结果表明载氧微泡对缺氧神经细胞无明显毒性。实施例3毒性最低，结果见图3。

实施例17 氧氟脂质微泡对缺氧神经细胞氧传递的有效性

取胎鼠海马神经元细胞，37℃、10%CO₂的培养箱内培养10天，将其分为三组，?未缺氧组(20%O₂)；?缺氧未处理组（C3%O₂）；?缺氧+5:1氧氟脂质微泡（200μl）。各组细胞在不缺氧（20%O₂）孵箱或缺氧（3%O₂）孵箱中培养8h后，elisa法检测各组细胞HIF-1a蛋白表达情况。?组神经细胞HIF-1a蛋白表达为100%，计算其他各组细胞相对蛋白表达百分率；?组为12%；?组为50%。表明实施例3的氧氟微泡能够有效载氧并将氧气释放到缺氧神经细胞。见图4。

实施例18 氧氟脂质微泡兔肝显影增强

采用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为4ml／kg，用8％的硫化钠脱毛剂脱去兔肝区体毛，将其固定于实验台上。用5号头皮针经耳缘静脉建立静脉通道。按实验兔配制5：1比例氧氟脂质微泡，稀释20倍，2ml/kg，经耳缘静脉团注后，即刻追注1ml NS冲洗管道，选用Sequoia 512彩色超声诊断仪，15L8W线阵探头，发射频率为7MHz，CPS条件下进行显像观察。每次显像条件一致，机械指数(mechanicalindex，MI)设定为0．2，增益19 dB，TGC、聚焦范围等参数均调至最佳状态。观察兔肝造影后的显像时间和显像效果。采用SONOMATH-DFY软件（重庆医科大附属第二医院超声研究所）进行分析，绘制兔肝增强显影时间-强度曲线（见图5）。注射微泡3s-6s后，动脉血管首先增强， 2s-5s后，门脉开始增强，此后肝实质逐渐增强；造影后约15s-20s ，肝实质回声明显增强；1-8min达高峰，然后持续增强超过35min。

上述实施例1和实施例7-11可以作为对比实施例。

Claims

1.一种氧氟脂质微泡，由微泡、和存于微泡内的氧气和全氟化碳气体组成，其中，微泡主要由合成磷脂和它们的聚乙二醇衍生物构成，氧气与全氟化碳气体的体积比为4：1-8：1,微泡的平均粒径为0.9-2.0μm,其中，合成磷脂与合成磷脂聚乙二醇衍生物的重量比为1：9－9：1，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，所述合成磷脂聚乙二醇衍生物为甲氧基聚乙二醇5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000),所述全氟化碳气体为全氟丙烷。

2.如权利要求1所述的微泡，合成磷脂与合成磷脂聚乙二醇衍生物的重量比为5：2。

3.如权利要求1所述的微泡，所述氧气与全氟化碳的体积比为5：1。

4.一种权利要求1的氧氟脂质微泡的制备方法，包括以下步骤：

a在合成磷脂和它们的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加热溶解，得到溶液；

b步骤a的溶液排除空气，并加压通入含有氧气和全氟化碳的混合气体，其中，氧气与全氟化碳的体积比为4：1-8：1；

c利用超声或机械振荡步骤b的溶液，形成得到白色乳液状脂质微泡混悬液，获得载氧脂质微泡。

5.如权利要求4所述的方法，所述氧气与全氟化碳的体积比为5：1。

6.如权利要求4所述的方法，合成磷脂与合成磷脂聚乙二醇衍生物的重量比为5：2。